CN114807246A - 一种生产手性醇的方法 - Google Patents
一种生产手性醇的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114807246A CN114807246A CN202210317424.5A CN202210317424A CN114807246A CN 114807246 A CN114807246 A CN 114807246A CN 202210317424 A CN202210317424 A CN 202210317424A CN 114807246 A CN114807246 A CN 114807246A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- heteroaryl
- group
- ketoreductase
- aryl
- alkyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 101001110310 Lentilactobacillus kefiri NADP-dependent (R)-specific alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- -1 ketone compound Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 64
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 50
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 50
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 24
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 21
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical group C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 18
- 102220603841 Cytohesin-4_V14E_mutation Human genes 0.000 claims description 17
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 17
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 16
- 102220230052 rs80357163 Human genes 0.000 claims description 16
- 102220491967 High mobility group protein B1_I262A_mutation Human genes 0.000 claims description 15
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 14
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 13
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 13
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000004452 carbocyclyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000001313 C5-C10 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 10
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 9
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical group CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000000172 C5-C10 aryl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 7
- 125000004209 (C1-C8) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 4
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 claims description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- OTNVGWMVOULBFZ-UHFFFAOYSA-N sodium;hydrochloride Chemical compound [Na].Cl OTNVGWMVOULBFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 8
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 7
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- OHLRLMWUFVDREV-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)CCl OHLRLMWUFVDREV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 102200157824 rs7764472 Human genes 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 3
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- YGZWVPBHYABGLT-KJEVXHAQSA-N Thr-Pro-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YGZWVPBHYABGLT-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- PMDOQZFYGWZSTK-LSJOCFKGSA-N Val-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C(C)C PMDOQZFYGWZSTK-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000011916 stereoselective reduction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1 BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- BQMPVGMHZKZPBH-BYZBDTJCSA-N (3r)-3-hydroxy-4-(trimethylazaniumyl)butanoate Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O.C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O BQMPVGMHZKZPBH-BYZBDTJCSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ODWSTKXGQGYHSH-FXQIFTODSA-N Ala-Arg-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ODWSTKXGQGYHSH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- DECCMEWNXSNSDO-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DECCMEWNXSNSDO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BGNLUHXLSAQYRQ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O BGNLUHXLSAQYRQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Val Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(C)N)CCCCN MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N Ala-Val-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Arg Chemical compound N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N Arg-Leu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N Arg-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZSVJVIOVABDTTL-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ZSVJVIOVABDTTL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MFTVXYMXSAQZNL-DJFWLOJKSA-N Asp-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N MFTVXYMXSAQZNL-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 1
- QPDUWAUSSWGJSB-NGZCFLSTSA-N Asp-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N QPDUWAUSSWGJSB-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- CVLIHKBUPSFRQP-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CVLIHKBUPSFRQP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YWEHYKGJWHPGPY-XGEHTFHBSA-N Cys-Thr-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O YWEHYKGJWHPGPY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UFNSPPFJOHNXRE-AUTRQRHGSA-N Gln-Gln-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UFNSPPFJOHNXRE-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- FTIJVMLAGRAYMJ-MNXVOIDGSA-N Gln-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O FTIJVMLAGRAYMJ-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- BYKZWDGMJLNFJY-XKBZYTNZSA-N Gln-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O BYKZWDGMJLNFJY-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N Glu-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- KQDMENMTYNBWMR-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KQDMENMTYNBWMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- STVHDEHTKFXBJQ-LAEOZQHASA-N Gly-Glu-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O STVHDEHTKFXBJQ-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- ORXZVPZCPMKHNR-IUCAKERBSA-N Gly-His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CNC=N1 ORXZVPZCPMKHNR-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- SCWYHUQOOFRVHP-MBLNEYKQSA-N Gly-Ile-Thr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SCWYHUQOOFRVHP-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- YIFUFYZELCMPJP-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O YIFUFYZELCMPJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UUYBFNKHOCJCHT-VHSXEESVSA-N Gly-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN UUYBFNKHOCJCHT-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- WZSHYFGOLPXPLL-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WZSHYFGOLPXPLL-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N Gly-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(O)=O ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N Gly-Val-Thr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- VCDNHBNNPCDBKV-DLOVCJGASA-N His-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N VCDNHBNNPCDBKV-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVEWRQXNISSYFO-ZPFDUUQYSA-N Ile-Arg-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N FVEWRQXNISSYFO-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- GYAFMRQGWHXMII-IUKAMOBKSA-N Ile-Asp-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N GYAFMRQGWHXMII-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- XQLGNKLSPYCRMZ-HJWJTTGWSA-N Ile-Phe-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N XQLGNKLSPYCRMZ-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- HXIDVIFHRYRXLZ-NAKRPEOUSA-N Ile-Ser-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N HXIDVIFHRYRXLZ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 102220581616 Iron-sulfur cluster co-chaperone protein HscB_I42M_mutation Human genes 0.000 description 1
- KUEVMUXNILMJTK-JYJNAYRXSA-N Leu-Gln-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KUEVMUXNILMJTK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VBZOAGIPCULURB-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N VBZOAGIPCULURB-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WXZOHBVPVKABQN-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N WXZOHBVPVKABQN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N Leu-Thr-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N Leu-Thr-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- ONGCSGVHCSAATF-CIUDSAMLSA-N Met-Ala-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ONGCSGVHCSAATF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FBQMBZLJHOQAIH-GUBZILKMSA-N Met-Asp-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O FBQMBZLJHOQAIH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UNPGTBHYKJOCCZ-DCAQKATOSA-N Met-Lys-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UNPGTBHYKJOCCZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- DJPXNKUDJKGQEE-BZSNNMDCSA-N Phe-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DJPXNKUDJKGQEE-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- QRUOLOPKCOEZKU-HJWJTTGWSA-N Phe-Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N QRUOLOPKCOEZKU-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- DXTOOBDIIAJZBJ-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DXTOOBDIIAJZBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AJBQTGZIZQXBLT-STQMWFEESA-N Pro-Phe-Gly Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 AJBQTGZIZQXBLT-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N Pro-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- DMNANGOFEUVBRV-GJZGRUSLSA-N Pro-Trp-Gly Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 DMNANGOFEUVBRV-GJZGRUSLSA-N 0.000 description 1
- XDKKMRPRRCOELJ-GUBZILKMSA-N Pro-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XDKKMRPRRCOELJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSWXBJCBYSWBPT-GUBZILKMSA-N Ser-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)C(O)=O HSWXBJCBYSWBPT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000228393 Sporidiobolus salmonicolor Species 0.000 description 1
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- DGDCHPCRMWEOJR-FQPOAREZSA-N Thr-Ala-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 DGDCHPCRMWEOJR-FQPOAREZSA-N 0.000 description 1
- XSLXHSYIVPGEER-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XSLXHSYIVPGEER-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- JMGJDTNUMAZNLX-RWRJDSDZSA-N Thr-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JMGJDTNUMAZNLX-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- XOTBWOCSLMBGMF-SUSMZKCASA-N Thr-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOTBWOCSLMBGMF-SUSMZKCASA-N 0.000 description 1
- RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- WTMPKZWHRCMMMT-KZVJFYERSA-N Thr-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WTMPKZWHRCMMMT-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- OGXQLUCMJZSJPW-LYSGOOTNSA-N Trp-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O OGXQLUCMJZSJPW-LYSGOOTNSA-N 0.000 description 1
- YMUQBRQQCPQEQN-CXTHYWKRSA-N Tyr-Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N YMUQBRQQCPQEQN-CXTHYWKRSA-N 0.000 description 1
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039634 Untranslated RNA Human genes 0.000 description 1
- YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N Val-Ala-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- LTFLDDDGWOVIHY-NAKRPEOUSA-N Val-Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LTFLDDDGWOVIHY-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- JTWIMNMUYLQNPI-WPRPVWTQSA-N Val-Gly-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N JTWIMNMUYLQNPI-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N Val-Gly-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- MDYSKHBSPXUOPV-JSGCOSHPSA-N Val-Gly-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N MDYSKHBSPXUOPV-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- UKEVLVBHRKWECS-LSJOCFKGSA-N Val-Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N UKEVLVBHRKWECS-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229960002298 aminohydroxybutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZAJNMXDBJKCCAT-RXMQYKEDSA-N ethyl (3r)-4-chloro-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)C[C@@H](O)CCl ZAJNMXDBJKCCAT-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- ZAJNMXDBJKCCAT-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(O)CCl ZAJNMXDBJKCCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- YQGDEPYYFWUPGO-UHFFFAOYSA-N gamma-amino-beta-hydroxybutyric acid Chemical compound [NH3+]CC(O)CC([O-])=O YQGDEPYYFWUPGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 108010026364 glycyl-glycyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000001273 protein sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 102220020921 rs80357163 Human genes 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及医药化工技术领域，具体涉及一种生产手性醇的方法，所述方法包括采用酮还原酶突变体催化潜手性酮类化合物进行还原反应生产所述手性醇，其中所述酮还原酶突变体为SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％以上同一性的氨基酸序列。采用本发明中的方法能够高效生产手性醇，且立体选择性较高，利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及医药化工技术领域，具体涉及一种生产手性醇的方法。
背景技术
酮还原酶是一种多用途催化剂，通过醛或酮的对映体选择性还原成对应醇。(R)特异性酮还原酶与(S)特异性酮还原酶具有不同特性，并且这些催化剂在光学活性醇的合成中被频繁使用。在酮还原酶催化的反应中，需要辅因子的参与，包括还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，氧化型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，氧化型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)。
(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate,(R)-CHBE)作为一种重要的有机中间体，具有如下结构：
其可用于很多医药的合成，如L-肉碱(L-carnitine)和R-Y-氨基-β-羟基丁酸(GABOB)等。
目前，关于酮还原酶不对称还原制备(R)-CHBE主要有两种方法，即化学法和生物法。化学法是使用催化剂铑、钌等金属，需要一定的氢气压进行不对称还原，其产物的光学纯度较低。
而生物法具有反应条件温和，专一性强，转化率高等优点，因此受到广泛关注。日本学者Kataoka等人对来源于Sporobolomyces salmonicolor的酮还原酶进行相关研究，对该酶进行了异源表达，最终催化4-氯-乙酰乙酸乙酯的浓度高达0.3kg/L，手性纯度在91％-93％。中国专利申请CN103160547A将来源于Candida albicans的醇脱氢酶不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯，以静息细胞为催化剂，NADH为辅因子，催化制备(R)-CHBE，其催化底物浓度为25-50g/L，底物转化率偏低。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种酶活提高的酮还原酶突变体及其应用。
根据本发明的一个方面，提供一种生产手性醇的方法。所述方法包括采用酮还原酶催化潜手性酮类化合物进行还原反应生产手性醇的步骤，所述酮还原酶为上述任一种的酮还原酶突变体。由于本发明的上述酮还原酶突变体具有很好的活力特性，因而利用本发明的酮还原酶突变体制备的手性醇可以提高反应速率，提高底物浓度，减少酶用量，降低后处理的难度。
进一步地，手性酮类化合物具有如下式I结构：
其中R’和R”各自独立地为烷基、烷芳基、烷杂芳基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R’和R”与羰基上的碳共同形成杂环基、碳环基或杂芳基，所述杂环基和杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述烷芳基中的芳基、芳基中的芳基、烷杂芳基中的杂芳基、杂芳基中的杂芳基、碳环基中的碳环基或杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基、硝基或烷基中的至少一个基团所取代。
优选的，R’和R”各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R’和R”与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基、硝基或烷基中的至少一个基团所取代。
优选地，所述酮类化合物的结构式如式I-1所示：
其中R1或R2选自氢、卤素、C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，其中所述烷基、环烷基、芳基或杂芳基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基、硝基或烷基中的至少一个基团所取代；R3选自氢、卤素、C1～C3烷基。
更优选地，所述酮类化合物为
进一步地，采用酮还原酶对酮类化合物进行还原反应生产手性醇的反应体系中还包括辅酶、辅酶再生体系和缓冲液。
进一步地，反应体系中酮类化合物的浓度为1g/L～200g/L。
进一步地，反应体系的pH值为5.0～9.0，反应体系的反应温度为4～60℃。
进一步地，辅酶为NADH、NADPH或NAD+。
进一步地，辅酶再生体系选自但不限于以下几种：一是异丙醇，辅酶NADH或NAD+；二是葡萄糖(示例性的如D-葡萄糖)，辅酶NADH或NAD+，葡萄糖脱氢酶(GDH)；三是甲酸根化合物(示例性的如甲酸盐)，辅酶NADH或NAD+，甲酸脱氢酶(FDH)。在使用纯化的酮还原酶的一些实施方式中，此类辅因子和任选地此类辅因子再生系统，通常与底物和酮还原酶一起添加到反应介质中。与酮还原酶类似，包含辅因子再生系统的任何酶可以是此类细胞的提取物或溶解产物形式，或作为纯化的酶加入反应混合物中。在使用细胞提取物或细胞溶解产物的实施方案中，用于产生提取物或溶解产物的细胞可以是表达仅含有辅因子再生系统或含有辅因子再生系统和酮还原酶的酶。在使用全细胞的实施方案中，该细胞可以表达含有辅因子再生系统和酮还原酶的酶。
进一步优选的，不论用全细胞、细胞提取物或纯化的酮还原酶，可以使用单一酮还原酶，或可选地，可使用两种或更多种酮还原酶的混合物。
进一步地，缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠-HCl缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
根据本发明的另一个方面，提供了一种酮还原酶的突变体。所述酮还原酶突变体为：
MKALQYTEIGSVPVVVDVPTPAPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAEQYIYGLPLTLGHEGVGRVAELGAGVTGFETGDAVAVYGPWGCGACHACARGRENYCTRAAELGITPPGLGSPGSMAEYMIVDSARHLVPIGDLDPVAAVPLTDAGLTPYHAISRVLPLLGPGSTAVVIGVGGLGHVGIQILRAVSAARVIAVDLDDDRLALAREVGADAAVKSGAGAADAIRELTGGEGATAVFDFVGAQSTIDTAQQVVAIDGHISVVGIHAGAHAKVGFFMIPFGASVVTPYWGTRSELMDVVDLARAGRLDIHTETFTLDEGPTAYRRLREGSIRGRGVVVPG(SEQ ID NO:1)所示氨基酸序列的突变体，突变位点包括T67。进一步的，所述酮还原酶的突变包括与SEQ ID NO:1具有80％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67；优选的，所述酮还原酶的突变包括与SEQ ID NO:1具有85％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67；进一步优选的，所述酮还原酶的突变包括与SEQ ID NO:1具有90％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67；更为优选的，所述酮还原酶的突变包括与SEQ ID NO:1具有95％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67；最优选的，所述酮还原酶的突变包括与SEQ ID NO:1具有98％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67。
本发明突变得到的突变体，可以以酮类化合物为原料，通过立体选择性的还原作用，高效生产手性醇，适合推广用于手性醇的工业生产。
进一步地，突变的位点还至少包括如下任一位点或两个及以上位点的组合：V14、I42、A97、G170、A242、I262和F286；或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有95％以上同一性的氨基酸序列。进一步的，所述酮还原酶的突变包括与Y(为了方便描述，突变位点包括T67，且包括以下任一位点或两个及以上位点的组合：V14、I42、A97、G170、A242、I262、F286的突变体，定义为Y)具有80％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67，和V14、I42、A97、G170、A242、I262、F286中的一个或两个及以上突变位点的组合物；优选的，所述酮还原酶的突变包括与Y具有85％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67，和V14、I42、A97、G170、A242、I262、F286中的一个或两个及以上突变位点的组合物；进一步优选的，所述酮还原酶的突变包括与Y具有90％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67，和V14、I42、A97、G170、A242、I262、F286中的一个或两个及以上突变位点的组合物；更为优选的，所述酮还原酶的突变包括与Y具有95％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67，和V14、I42、A97、G170、A242、I262、F286中的一个或两个及以上突变位点的组合物；最优选的，所述酮还原酶的突变包括与Y具有98％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67，和V14、I42、A97、G170、A242、I262、F286中的一个或两个及以上突变位点的组合物。
优选地，突变的位点进一步还至少包括如下突变中的一个或两个以上的组合：V14E、I42L、A97H、G170R、A242L、I262A和F286S。进一步优选的，为了方便描述，突变位点包括T67，且包括以下任一位点或两个及以上位点的组合：V14E、I42L、A97H、G170R、A242L、I262A和F286S的突变体，定义为Y’。优选的，所述酮还原酶的突变包括与Y’具有80％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67，和V14E、I42L、A97H、G170R、A242L、I262A、F286S中的一个或两个及以上突变位点的组合物；优选的，所述酮还原酶的突变包括与Y’具有85％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67，和V14E、I42L、A97H、G170R、A242L、I262A、F286S中的一个或两个及以上突变位点的组合物；优选的，所述酮还原酶的突变包括与Y’具有90％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67，和V14E、I42L、A97H、G170R、A242L、I262A、F286S中的一个或两个及以上突变位点的组合物；更为优选的，所述酮还原酶的突变包括与Y’具有95％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67，和V14E、I42L、A97H、G170R、A242L、I262A、F286S中的一个或两个及以上突变位点的组合物；最优选的，所述酮还原酶的突变包括与Y’具有98％以上同一性的氨基酸序列，且所述同一性序列含有突变位点T67，和V14E、I42L、A97H、G170R、A242L、I262A、F286S中的一个或两个及以上突变位点的组合物。
优选的，
示例性地，所述酮还原酶的突变进一步包括如下任一种位点组合突变：V14E+I42L、V14E+A97H、V14E+G170R、V14E+A242L、V14E+I262A、V14E+F286S、V14E+I42L+A97H、V14E+I42L+G170R、V14E+I42L+A242L、V14E+I42L+I262A、V14E+I42L+F286S、V14E+I42L+A97H+G170R、V14E+I42L+A97H+A242L、V14E+I42L+A97H+I262A、V14E+I42L+A97H+F286S、V14E+I42L+A97H+G170R+A242L、V14E+I42L+A97H+G170R+I262A、V14E+I42L+A97H+G170R+F286S、V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+I262A、V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+F286S、V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+I262A+F286S。
根据本发明的另一个方面，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述酮还原酶突变体或同一性序列。
根据本发明的另一个方面，提供一种重组质粒。该重组质粒连接有上述DNA分子。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒。
优选的，所述重组质粒选自pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwinl、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18和pUC-19。
根据本发明的又一个方面，提供一种宿主细胞。所述宿主细胞含有上述任一重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞。
优选的原核细胞为细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，BL21 Star(DE3)，TunerTM(DE3)，RosettaTM 2(DE3)，BLR(DE3)，NovaBlue(DE3)，OrigamiTM(DE3)，Origami B(DE3)。
本发明突变得到的突变体，可以以酮类化合物为原料，通过立体选择性地还原作用，高效生产手性醇，适合推广用于手性醇的工业生产。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例4中野生型酶和突变体酶催化底物4-氯乙酰乙酸乙酯的转化率结果；
图2示出了实施例4中野生型在不同温度下酶催化产物的ee值结果；
图3示出了实施例4中突变体在不同温度下酶催化产物的ee值结果；
图4示出了实施例4中突变体的ee值图谱。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
名称解释：
酮还原酶指能够将酮基还原为其对应的醇的多肽。具体地，本申请的酮还原酶多肽能够立体选择性地将酮化合物还原为相应的醇产物。该多肽通常利用辅因子还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或氧化型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为还原剂。在本申请中，酮还原酶包括天然存在的(野生型)酮还原酶以及由人工处理产生的非天然存在的酮还原酶突变体。
“天然存在的”或“野生型”与“突变体”相对，指在自然界中发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体的序列，它可以从自然界中的来源中分离，并且没有被人工所特意地修饰或改变。
本申请中，涉及例如，细胞、核酸或多肽“重组”时，是指已经以自然界中未存在的方式进行修饰的，或与自然界中存在的形式相同，但是由合成材料和/或通过使用重组技术的处理制备或衍生而得到，或对应于天然或固有形式的细胞、核酸或多肽。其中，非限制性的实施包括在细胞中表达固有(非重组)形式之外的基因或以不同水平表达固有基因的重组细胞。
“序列同一性的百分比”是指多核苷酸之间的对比，并且通过跨比较窗比较两条最佳比对的序列来确定，其中，多核苷酸序列在比较窗中的部分与参考序列相比可以包括添加或缺失(即，空位)，以用于两个序列的最佳比对。百分比可以如下计算：通过确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。可选地，百分比可以如下计算：通过确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基与空白位置对齐的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。其中，“参考序列”指用作序列比较的基础的指定序列。参考序列可以是更大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的区段。
定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
饱和突变技术：是通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。利用点饱和突变鉴定蛋白质功能位点，提高酶比活力，改善酶热稳定性、底物结合特异性及立体异构特异性等多方面性质。
来源于Rhodococcus ruber的酮还原酶突变体，示例性的如T67R(在本发明中，以“T67R”为例，表示“原氨基酸+位点+突变后的氨基酸”，即第67位的T变为R)可以催化目标底物得到产物，但是其稳定性有待进一步提高。本发明力图通过定向进化的方法提高底物转化率和立体选择性。
在本申请中，首先通过定点突变的方式在酮还原酶上引入突变位点，对突变体进行活性检测，挑选活性提高的突变体。示例性的，其中突变体T67R相较于起始模板，酶活有所提高。
利用全质粒PCR引入定点突变简单有效，是目前使用较多的手段。其原理是：一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模板质粒退火后用聚合酶“循环延伸”(循环延伸是指聚合酶按照模板延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝，)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经过dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。突变质粒转化至宿主细胞，诱导表达出目标蛋白，然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶液。酮还原酶诱导表达最佳条件：25℃，0.1mM IPTG诱导16h。
本发明所述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
实施例1
重组大肠杆菌E.coli Rosetta(pET-28a-RR)的构建
1.1酮还原酶基因的获取
对赤红球菌Rhodococcus ruber(购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC 1.10360)进行菌种扩培，30℃培养1天，种子培养基(g/L)：甘油10，蛋白胨5，麦芽浸粉3，酵母粉3，pH 7.0。
将处于对数生长期的赤红球菌Rhodococcus ruber进行离心，使用基因组DNA提取试剂盒(北京天为生物工程有限公司)按照说明书进行基因组的提取。
结合NCBI数据库上的酮还原酶基因信息进行设计上游和下游引物，引物序列如下：
上游引物(含Nde I位点)：
5’-GGAATTCCATATGAAAGCCCTCCAGTACACCGAGA-3’(SEQ NO:2)；
下游引物(含Xho I位点)：
5’-CCCCTCGAGTCAACCCGGAACCACAACGCCGCG-3’(SEQ NO:3)
所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
基因PCR扩增条件：
98℃变性3min，按如下参数循环30次：98℃变性10sec，58℃退火5sec，72℃延伸1.5min。最后72℃延伸4min。
1.2菌株的构建
用Nde I及Xho I双酶切表达载体pET-28a(载体购自Novagen(默克中国))及所扩增含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-28a与目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将10μL的连接产物pET-28a-RR加入Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激90sec。冰上放置2min。加入1mL LB培养基，在37℃，200rpm摇床振荡培养0.5h。吸取菌液涂布至含50mM卡那霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，得到重组菌E.coli Rosetta(pET-28a-RR)。
1.3蛋白质序列比对
将构建的重组菌E.coli Rosetta(pET-28a-RR)进行抽提质粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果分析显示，目的基因扩增序列与GenBanK库中序列号MW808991.1序列高度同源，序列在第199位至第201位处发生突变，密码子ATT突变为CGC。
1.4酶活检测
在本申请中，酶活检测方法如下：
1.4.1试剂配制：
底物母液100mM：4-氯乙酰乙酸乙酯称取6.76mg，溶于异丙醇中，搅拌混匀，溶解完全；
NADH母液10mM：称取33.17mg的NADH溶于5mL的0.1M PB pH7.0 buffer中。
1.4.2酶活体系：
首先加入酶，然后加入底物4-氯乙酰乙酸乙酯，NADH和buffer的混合物，放入酶标仪，在30℃，340nM波长下检测酶活。
检测体系配制见表1
表1
| 体系 | 加入量 | 终浓度 |
| 酶突变体 | 20μL | N/A |
| 底物 | 150μL | 50mM |
| NADH | 10μL | 0.33mM |
| pH 7.0缓冲液 | 120μL | 0.1M |
酮还原酶突变体T67R，在本发明中简称“模板”，所列突变位点为在该“模板”基础上进行的突变。
高通量筛选中酶液的制备方法：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200μL酶解溶液(溶菌酶2mg/mL，多黏菌素0.5mg/mL，pH为7.0)，37℃处理2h。
酶催化和检测方法：首先加入酶，然后加入底物4-氯乙酰乙酸乙酯，NADH和buffer的混合物，催化一定时间。将催化样品转移至酶检测板中，放入酶标仪中，在30℃，340nM波长检测酶活。
实施例2
非理性改造重组菌E.coli Rosetta(pET-28a-RR)
2.1赤红球菌Rhodococcus ruber密码子优化
对来源于赤红球菌Rhodococcus ruber的酮还原酶交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行密码子优化，优化宿主为大肠杆菌，DNA2的基因序列即为原始序列DNA1密码子优化结果。
2.2引物设计
对酮还原酶基因信息进行设计上游引物，引物序列如下：
上游引物(含Nde I位点)：
5’-GGAATTCCATATGAAAGCACTGCAGTACACTGAA-3’(SEQ NO:4)
下游引物(含Xho I位点)：
5’-CCCCTCGAGTCAACCCGGAACCACAACGCCGCG-3’(SEQ NO:5)
2.3菌株突变库的构建与筛选
2.3.1菌株突变库的构建：对密码子优化后的重组菌E.coli Rosetta(pET-28a-RR)进行扩增培养，使用生工生物工程(上海)股份有限公司质粒抽提试剂盒进行质粒抽提，获得的质粒作为突变扩增模板。使用北京天恩泽生物科技有限公司即用型易错PCR试剂盒进行扩增的同时引入碱基突变。按照实施例1中1.2进行菌株构建，最终获得的所有突变株即为菌株的突变库。
2.3.2菌株突变库的筛选：对上述获得的突变库在96深孔板中扩增培养，蛋白诱导表达，按照实施例1中1.4进行酶活测定，挑取酶活比重组菌E.coli Rosetta(pET-28a-RR)酶活高的突变株进入摇瓶培养和蛋白表达，酶活测定。
实施例3
理性改造重组菌E.coli Rosetta(pET-28a-RR)
3.1定点突变
对实施例2中酶活提高的突变株进行抽提质粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果与原始序列进行分析比对，将突变的氨基酸位点设计引物，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。按照实施例2进行定点突变，构建突变株。最终确定突变位点V14、I42、T67、A97、G170、A242、I262和F286对酶活有显著提高。
表2
| 突变体 | 酶活力(％) |
| V14E | + |
| I42M | ++ |
| T67R | + |
| A97H | + |
| G170R | + |
| A242S | + |
| I262S | ++ |
| F286S | + |
+代表酶活，+越多酶活越高。
3.2饱和突变
对突变位点V14、I42、T67、A97、G170、A242、I262和F286进行饱和突变，使用生工生物工程(上海)股份有限公司提供的兼并碱基进行设计引物并合成。按照实施例2进行饱和突变，构建突变株，筛选突变株。结果显示V14、T67、A97、G170、A242和F286氨基酸位点饱和突变后酶活并没有较大变化，而I42和I262经过突变后筛选获得I42L、I42V、I262A和I262G，四株突变株酶活有所提高。
3.3突变组合
进一步地，对突变位点进行了相应的组合，筛选高酶活的突变株：分别将“模板”和突变体在30℃进行催化反应，然后测定其活性，所有突变体的酶活力结果见表3。
表3
+代表酶活，+越多酶活越高。
组合饱和突变可以获得几个突变位点之间具有协同作用的突变体，而且可以对其氨基酸的组成进行优化组合。以T67R为模板，进行突变组合，此时酶液检测温度为30℃反应17h，然后终止反应，测定活性。
实施例4
4.1最佳突变体酶催化
使用突变体V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+I262A进行不同底物反应验证，结果见表4。
100mL的反应瓶中加入底物(I-1)0.5g，加入0.1M的PB pH 7.0，0.2g异丙醇，20mg的NAD+，0.05g酮还原酶突变体，混匀，总体积为20mL，于30℃、200rpm摇床，反应1h；
其中R1或R2选自氢、卤素、C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，其中所述烷基、环烷基、芳基或杂芳基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基、硝基或烷基中的至少一个基团所取代；R3选自氢、卤素、C1～C3烷基。
表4
4.2最佳突变体酶催化
以重组菌E.coli Rosetta(pET-28a-RR)为对照，突变体V14E+G170R，突变体V14E+I42L+I262A和突变体V14E+I42L+A97H+G170R+F286S在25℃-35℃内对底物4-氯乙酰乙酸乙酯的转化率如图1，突变体V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+I262A(SEQ NO:6)在不同温度下对底物4-氯乙酰乙酸乙酯的转化率和产物ee值。催化结果如图1、图2、图3和图4，与重组菌E.coli Rosetta(pET-28a-RR)相比，突变体V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+I262A的催化时间从17h缩短至1h，且催化转化率大于99％。在25℃-35℃内，重组菌E.coli Rosetta(pET-28a-RR)重组菌随着温度的升高，ee值出现大幅度的降低，而对于突变体V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+I262A，温度的升高对ee值没有明显的变化。
综上，突变体V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+I262A有以下几个优势：一是在一定的催化时间内能够催化0.8-1mol/L的底物，且ee值高于99％以上，时空转化率为1440g/L/d，催化效率极高。二是催化体系作用条件温和，基本上在常温、中性、水等环境中完成，较少使用有机溶剂，反应过程中危险性较低，对环境友好，符合目前生产要求，商业价值潜力巨大。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 海南普利制药股份有限公司
<120> 一种生产手性醇的方法
<130> hnpoly001
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 346
<212> PRT
<213> Rhodococcus ruber
<400> 1
Met Lys Ala Leu Gln Tyr Thr Glu Ile Gly Ser Val Pro Val Val Val
1 5 10 15
Asp Val Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Gly Glu Ile Leu Leu Lys Val
20 25 30
Thr Ala Ala Gly Leu Cys His Ser Asp Ile Phe Val Met Asp Met Pro
35 40 45
Ala Glu Gln Tyr Ile Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly
50 55 60
Val Gly Arg Val Ala Glu Leu Gly Ala Gly Val Thr Gly Phe Glu Thr
65 70 75 80
Gly Asp Ala Val Ala Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Ala Cys His
85 90 95
Ala Cys Ala Arg Gly Arg Glu Asn Tyr Cys Thr Arg Ala Ala Glu Leu
100 105 110
Gly Ile Thr Pro Pro Gly Leu Gly Ser Pro Gly Ser Met Ala Glu Tyr
115 120 125
Met Ile Val Asp Ser Ala Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp
130 135 140
Pro Val Ala Ala Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His
145 150 155 160
Ala Ile Ser Arg Val Leu Pro Leu Leu Gly Pro Gly Ser Thr Ala Val
165 170 175
Val Ile Gly Val Gly Gly Leu Gly His Val Gly Ile Gln Ile Leu Arg
180 185 190
Ala Val Ser Ala Ala Arg Val Ile Ala Val Asp Leu Asp Asp Asp Arg
195 200 205
Leu Ala Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Asp Ala Ala Val Lys Ser Gly
210 215 220
Ala Gly Ala Ala Asp Ala Ile Arg Glu Leu Thr Gly Gly Glu Gly Ala
225 230 235 240
Thr Ala Val Phe Asp Phe Val Gly Ala Gln Ser Thr Ile Asp Thr Ala
245 250 255
Gln Gln Val Val Ala Ile Asp Gly His Ile Ser Val Val Gly Ile His
260 265 270
Ala Gly Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Met Ile Pro Phe Gly Ala
275 280 285
Ser Val Val Thr Pro Tyr Trp Gly Thr Arg Ser Glu Leu Met Asp Val
290 295 300
Val Asp Leu Ala Arg Ala Gly Arg Leu Asp Ile His Thr Glu Thr Phe
305 310 315 320
Thr Leu Asp Glu Gly Pro Thr Ala Tyr Arg Arg Leu Arg Glu Gly Ser
325 330 335
Ile Arg Gly Arg Gly Val Val Val Pro Gly
340 345
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
Claims (8)
1.一种生产手性醇的方法，所述方法包括采用酮还原酶突变体催化潜手性酮类化合物进行还原反应生产所述手性醇，
其中所述酮还原酶突变体为SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％以上同一性的氨基酸序列；
所述手性酮类化合物具有如下式I结构：
其中R’和R”各自独立地为烷基、烷芳基、烷杂芳基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R’和R”与羰基上的碳共同形成杂环基、碳环基或杂芳基，所述杂环基和杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述烷芳基中的芳基、芳基中的芳基、烷杂芳基中的杂芳基、杂芳基中的杂芳基、碳环基中的碳环基或杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基、硝基或烷基中的至少一个基团所取代；优选的，R’和R”各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R’和R”与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基、硝基或烷基中的至少一个基团所取代。
2.根据权利要求1所述的方法，所述手性酮类化合物结构如式(I-1)所示：
其中R1或R2选自氢、卤素、C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，其中所述烷基、环烷基、芳基或杂芳基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基、硝基或烷基中的至少一个基团所取代；R3选自氢、卤素、C1～C3烷基。
更优选地，所述酮类化合物为
3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括在反应体系中加入辅酶、辅酶再生体系和缓冲液；
进一步地，反应体系中酮类化合物的浓度为1g/L～200g/L；
进一步地，反应体系的pH值为5.0～9.0，反应体系的反应温度为4～60℃；
进一步地，辅酶为NADH、NADPH或NAD+；
进一步地，缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠-HCl缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
4.根据权利要求3所述的方法，所述辅酶再生体系选自但不限于以下几种：一是异丙醇，辅酶NADH或NAD+；二是葡萄糖，辅酶NADH或NAD+，葡萄糖脱氢酶；三是甲酸根化合物，辅酶NADH或NAD+，甲酸脱氢酶。
5.根据权利要求1所述的方法，可使用两种或两种以上酮还原酶突变体的混合物。
6.根据权利要求1所述的方法，所述的酮还原酶的突变体，进一步地，突变的位点还至少包括如下任一位点或两个及以上位点的组合：V14、I42、A97、G170、A242、I262和F286；或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有95％以上同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述突变的位点为以下一个或两个以上的组合：V14E、I42L、A97H、G170R、A242L、I262A和F286S。
8.根据权利要求6所述的方法，所述酮还原酶的突变进一步包括如下任一种位点组合突变：V14E+I42L、V14E+A97H、V14E+G170R、V14E+A242L、V14E+I262A、V14E+F286S、V14E+I42L+A97H、V14E+I42L+G170R、V14E+I42L+A242L、V14E+I42L+I262A、V14E+I42L+F286S、V14E+I42L+A97H+G170R、V14E+I42L+A97H+A242L、V14E+I42L+A97H+I262A、V14E+I42L+A97H+F286S、V14E+I42L+A97H+G170R+A242L、V14E+I42L+A97H+G170R+I262A、V14E+I42L+A97H+G170R+F286S、V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+I262A、V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+F286S、V14E+I42L+A97H+G170R+A242L+I262A+F286S。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210317424.5A CN114807246A (zh) | 2022-03-29 | 2022-03-29 | 一种生产手性醇的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210317424.5A CN114807246A (zh) | 2022-03-29 | 2022-03-29 | 一种生产手性醇的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114807246A true CN114807246A (zh) | 2022-07-29 |
Family
ID=82530082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210317424.5A Pending CN114807246A (zh) | 2022-03-29 | 2022-03-29 | 一种生产手性醇的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114807246A (zh) |
-
2022
- 2022-03-29 CN CN202210317424.5A patent/CN114807246A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108048417B (zh) | 酮还原酶突变体及其应用 | |
| EP2034026A1 (en) | Process for production of optically active alcohol | |
| CN110257351B (zh) | 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 | |
| NL2020823B1 (en) | NAD+ dependent 7ß-hydroxysteroid dehydrogenase | |
| CN110777125B (zh) | 一种杂环类药物中间体的高效制备方法 | |
| CN111394324B (zh) | 酮还原酶突变体及其应用 | |
| CN112877307B (zh) | 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用 | |
| US11162081B2 (en) | Ketoreductase mutant and application thereof | |
| EP4276178A1 (en) | Esterase mutant and use thereof | |
| EP4261280A1 (en) | Amino acid dehydrogenase mutant and application thereof | |
| Machielsen et al. | Laboratory evolution of Pyrococcus furiosus alcohol dehydrogenase to improve the production of (2S, 5S)-hexanediol at moderate temperatures | |
| CN113652407B (zh) | 羰基还原酶突变体及其不对称合成双手性化合物的应用 | |
| CN110713992B (zh) | 酮还原酶突变体及生产手性醇的方法 | |
| EP2796548A1 (en) | Stereoselective production of (R)-3-quinuclidinol | |
| CN113913399B (zh) | 来源于Candida maltosa Xu316的酮基泛解酸内酯还原酶 | |
| CN114085820B (zh) | 来源于Candida viswanathii的酮基泛解酸内酯还原酶 | |
| CN115747183A (zh) | 一种酮还原酶突变体及其应用 | |
| WO2006074194A2 (en) | Engineered phosphite dehydrogenase mutants for nicotinamide cofactor regeneration | |
| CN114807246A (zh) | 一种生产手性醇的方法 | |
| US9416350B2 (en) | Enzyme function modification method and enzyme variant thereof | |
| CN114807066A (zh) | 一种酮还原酶突变体 | |
| KR101479133B1 (ko) | 신규 ｄ－솔비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ－소르보스의 생산방법 | |
| JP7375052B2 (ja) | ケトレダクターゼ突然変異体及びキラルアルコールの生産方法 | |
| US20220403421A1 (en) | Ketoreductase mutant and method for producing chiral alcohol | |
| CN115975964A (zh) | 一种高活性酮基泛解酸内酯还原酶突变体及其编码基因和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240201 Address after: 246004 No. 58, xiahong Road, high tech Industrial Development Zone, Anqing City, Anhui Province Applicant after: Anhui Puli Pharmaceutical Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 571127 Guilin Ocean Economic Development Zone, Meilan District, Haikou City, Hainan Province Applicant before: HAINAN POLY PHARM. Co.,Ltd. Country or region before: China Applicant before: ZHEJIANG POLY PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Applicant before: Anhui Puli Pharmaceutical Co.,Ltd. |