CN117070494A - 酯酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酯酶突变体及其应用。该酯酶突变体为SEQ ID NO:1突变的序列，突变包括I245S；或酯酶突变体包括I245S突变，且与SEQ ID NO:1具有99%以上的同源性，具有酯酶催化活性。本发明的酯酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的酯酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的酯酶，因此这些酯酶突变体具有酶反应活性和特异性大幅度提高的优势，从而大幅度降低了酶的使用量，降低了工业生产中的成本；并且酯酶对有机溶剂的耐受性增强、反应温度及pH值范围广，具有更强的应用优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种酯酶突变体及其应用。
背景技术
随着医药、农药及其他精细化工工业的发展，有机合成面临着越来越大的挑战。例如，由于生物体内的手性识别能力，药物分子中往往只有一个立体异构体有治疗作用，另外的立体异构体则没有治疗作用或甚至有副作用。因此，要合成有治疗作用的立体异构体，在传统的有机合成中通常需要引入保护和去保护步骤来弥补反应的化学和区域选择性的不足，但是如此的操作，一方面增加了工艺的流程，增加了生产成本，另一方面，还需要使用较多的有机溶剂，甚至有毒或挥发性溶剂，容易造成环境污染。
生物催化反应条件温和，通常在中性和室温，或接近这样的条件下进行；多数情况下生物催化反应在水相中进行，因而环境污染少；而且生物催化反应通常具有高化学选择性、区域选择性和立体选择性等特点，可以免除不必要的保护和去保护步骤，大大优化生产工艺过程，从而降低生产成本。因此，生物催化技术在有机合成方面的应用具有非常重大的科学意义和实际应用价值。
酯酶是指具有水解酯键能力的一类酶的统称，广泛存在于动物、植物和微生物中，其可以应用于有机合成，也是基因工程改造研究的最多的酶类。
虽然酶对于其天然底物通常具有较好的反应活性和选择性，但是对于非天然底物，它们的反应活性、稳定性和选择性一般是不太好的，通常情况下，可以通过定向进化的手段进行改造，以提高其对非天然底物的反应活性、稳定性和选择性，从而可以应用在生产中。
发明内容
本发明旨在提供一种酯酶突变体及其应用，以提高酶的反应活性。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种酯酶突变体。该酯酶突变体为SEQ ID NO: 1突变的序列，突变包括I245S；或酯酶突变体包括I245S突变，且与SEQ IDNO: 1具有99%以上的同源性，具有酯酶催化活性。
进一步地，突变还包括如下任意一个或多个：C33A、A46G、S48N、L65V、T71V、T71M、T87E、L131S、L131N、L131H、R184E、R210Y、K212R、K212M、S230Q、P231T、S235Q、T240F、T240L、T240C、S248D、S248M、K251T、K251L、H262A、H262S、H262C、P336C或L365M。
进一步地，突变包括如下任一种组合突变：I245S+C33A、I245S+A46G、I245S+S48N、I245S+L65V、I245S+T71V、I245S+T71M、I245S+T87E、I245S+L131N、I245S+R184E、I245S+R210Y、I245S+K212R、I245S+S230Q、I245S+P231T、I245S+T240F、I245S+T240L、I245S+S248D、I245S+K251T、I245S+K251L、I245S+H262A、I245S+H262S、I245S+P336C、I245S+L365M、I245S+L65V+T71V、I245S+L65V+T71M、I245S+L65V+T87E、I245S+L65V+R210Y、I245S+L65V+K212R、I245S+L65V+P231T、I245S+L65V+T240F、I245S+L65V+T240L、I245S+L65V+K251T、I245S+L65V+L365M、I245S+L65V+H262A、I245S+L65V+H262S、I245S+T71V+C33A、I245S+T71V+L65V、I245S+T71V+T87E、I245S+T71V+L131N、I245S+T71V+T240F、I245S+T71V+T240L、I245S+T71V+K251T、I245S+T71V+H262A、I245S+T71V+H262S、I245S+T71V+L365M、I245S+L65V+H262A+T87E、I245S+L65V+H262A+R210Y、I245S+L65V+H262A+K212R、I245S+L65V+H262A+K212M、I245S+L65V+H262A+T240F、I245S+L65V+H262A+T240L、I245S+L65V+H262A+T240C、I245S+L65V+H262A+S248D、I245S+L65V+H262A+S248M、I245S+L65V+H262A+K251T、I245S+L65V+H262A+K251L、I245S+L65V+H262A+P336C、I245S+L65V+H262A+L365M、I245S+T71V+T240L+C33A、I245S+T71V+T240L+L65V、I245S+T71V+T240L+T87E、I245S+T71V+T240L+L131N、I245S+T71V+T240L+S235Q、I245S+T71V+T240L+K251T、I245S+T71V+T240L+H262A、I245S+T71V+T240L+H262S、I245S+T71V+T240L+P336C、I245S+T71V+T240L+L365M、I245S+T71V+T240F+L131N+S48N、I245S+T71V+T240L+K251T+L131N、I245S+T71V+T240L+K251T+R210Y、I245S+T71V+T240L+K251T+K212R、I245S+T71V+T240L+K251T+K212M、I245S+T71V+T240L+K251T+S235Q、I245S+T71V+T240L+K251T+H262A、I245S+T71V+T240L+K251T+H262S、I245S+T71V+T240L+K251T+P336C、I245S+T71V+T240L+K251T+L365M、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+R210Y、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K212M、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+H262A、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+H262S、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+H262C、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+K212M、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+H262A、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+L365M、I245S+L65V+H262A+T240F+L131S、I245S+L65V+H262A+T240F+L131H、I245S+L65V+H262A+T240F+L131N、I245S+L65V+H262A+T240F+R210Y、I245S+L65V+H262A+T240F+K212M、I245S+L65V+H262A+T240F+P231T、I245S+L65V+H262A+T240F+K251T或I245S+L65V+H262A+T240F+L365M。
根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述任一种酯酶突变体。
根据本发明的另一方面，提供了一种重组质粒。该重组质粒连接有上述任一种DNA分子。
进一步地，重组质粒为pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。
根据本发明的另一方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞，真核细胞为酵母。
根据本发明的另一方面，提供了一种生产手性酸的方法。该方法包括采用酯酶对酯类化合物进行催化反应的步骤，酯酶为上述任一种酯酶突变体。
进一步地，酯类化合物为，反应产物为，其中，R1代表-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH2CH3CH3；R2代表卤原子，氮原子，氧原子，碳链，具有卤素原子、氮原子、氧原子、碳链的不同取代基的杂环或萘环中的一种或多种；优选的，酯类化合物为
、、、、或。
进一步地，酯酶突变体催化反应的pH为7.0~9.0，反应温度为20~50℃。
本发明的酯酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的酯酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的酯酶，因此这些酯酶突变体具有酶反应活性和特异性大幅度提高的优势，从而大幅度降低了酶的使用量，降低了工业生产中的成本；并且酯酶对有机溶剂的耐受性增强、反应温度及pH值范围广，具有更强的应用优势。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
本发明通过定向进化的方法提高酯酶的特异性，降低酯酶的使用量。本发明的模板氨基酸的序列为SEQ ID NO：1（MQIQGHYELKFEAVRETFAALFDDPQERGAALCIQVGGETVVDLWAGSADKDGQQAWHSDTIANLFSCTKTFTAVTALQLVGEGKLTLDAPVANYWPEFAQAGKQAITLRQLLSHRAGLPAIRELLPAEALYDWQAMVDALAAETPWWTPGTEHGYAVNTYGWLIGELIRRADGRGPGDSIVARTARPLGLDFHVGLADDEFYRVAHIARGKGNAGDAAAQRLLQVTMREPEALSTRAFTNPPAILTSTNKPEWRRMQQPAHNGHGNARSLAGFYAGLLDGSLLESELLDELTREHSLGQDRTLLTQTRFGLGCMLDQPDVANATFGLGARAFGHPGVGGSVGFADPEHDVAFGFVVNTLGPYILMDPRAQKLVRVLASCL*），对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：2（ATGCAGATCCAAGGCCACTATGAGCTGAAGTTCGAGGCAGTGCGCGAGACGTTCGCAGCGCTGTTCGACGACCCGCAAGAGCGTGGTGCTGCACTGTGTATCCAGGTCGGTGGCGAAACCGTAGTCGACCTGTGGGCAGGTAGCGCAGATAAGGACGGTCAGCAAGCGTGGCATAGCGACACCATCGCAAACCTGTTCTCCTGCACCAAAACCTTCACCGCGGTTACCGCTCTGCAGCTGGTGGGCGAAGGCAAACTGACCCTGGACGCGCCTGTGGCAAACTACTGGCCAGAATTCGCGCAGGCAGGTAAACAGGCTATCACTCTGCGCCAGCTGCTGAGCCACCGTGCCGGTCTGCCAGCAATCCGTGAACTGCTGCCGGCTGAAGCACTGTACGACTGGCAAGCAATGGTGGATGCCCTGGCAGCAGAAACCCCGTGGTGGACTCCGGGTACTGAACATGGTTACGCCGTTAATACCTACGGCTGGCTGATCGGCGAACTGATCCGTCGTGCGGACGGTCGTGGTCCTGGTGACTCTATTGTGGCCCGTACTGCTCGTCCGCTGGGTCTGGATTTCCATGTCGGTCTGGCCGATGACGAATTCTATCGCGTTGCGCACATTGCGCGTGGCAAAGGCAACGCGGGCGATGCTGCGGCTCAGCGTCTGCTGCAGGTTACTATGCGTGAACCGGAAGCTCTGTCTACCCGTGCTTTCACCAACCCGCCGGCGATTCTGACTTCCACGAACAAACCGGAATGGCGCCGTATGCAGCAGCCGGCGCATAACGGTCACGGTAATGCTCGCTCTCTGGCTGGTTTTTACGCGGGTCTGCTGGACGGTAGCCTGCTGGAATCTGAGCTGCTGGATGAACTGACGCGCGAACACTCCCTGGGCCAGGATCGCACCCTGCTGACCCAGACTCGCTTTGGTCTGGGTTGTATGCTGGACCAGCCGGATGTTGCTAATGCCACGTTTGGCCTGGGCGCGCGTGCGTTCGGCCACCCAGGCGTGGGCGGCTCTGTTGGCTTCGCTGATCCGGAACACGATGTTGCGTTTGGCTTTGTTGTAAACACCCTGGGTCCGTATATTCTGATGGATCCGCGTGCCCAGAAACTGGTACGTGTACTGGCCTCCTGCCTGTAA）。本发明的模板为来源自Pseudomonas putida菌的酯酶的突变体。
首先通过定点突变的方式在酯酶上引入突变位点，对突变体进行活性和特异性检测，挑选活性和特异性提高的突变体。其中突变体I245S相较于起始模板活性和特异性提高幅度较大。后续，以具有I245S突变的突变体为模板继续进行突变，以期得到催化活性和特异性提高的突变体。
其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
利用全质粒 PCR 引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物（正、反向），和模板质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物 5’ 端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对 Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。
上述得将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在大肠杆菌中过量表达。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。酯酶诱导表达最佳条件：25 oC，0.1 mM IPTG 诱导16 h。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种酯酶突变体。该酯酶突变体为SEQ IDNO: 1突变的序列，该突变包括I245S；或酯酶突变体包括I245S突变，且与SEQ ID NO: 1具有80%以上的同源性，优选85%、86%、87%、88%、89%以上的的同源性，更优选95%、96%、97%、98%、99%以上的同源性。
优选的，发生氨基酸突变的位点还包括如下任意一个或多个：C33A、A46G、S48N、L65V、T71V、T71M、T87E、L131S、L131N、L131H、R184E、R210Y、K212R、K212M、S230Q、P231T、S235Q、T240F、T240L、T240C、S248D、S248M、K251T、K251L、H262A、H262S、H262C、P336C或L365M。
更优选的，发生氨基酸突变的位点包括如下任一种组合突变位点：I245S+C33A、I245S+A46G、I245S+S48N、I245S+L65V、I245S+T71V、I245S+T71M、I245S+T87E、I245S+L131N、I245S+R184E、I245S+R210Y、I245S+K212R、I245S+S230Q、I245S+P231T、I245S+T240F、I245S+T240L、I245S+S248D、I245S+K251T、I245S+K251L、I245S+H262A、I245S+H262S、I245S+P336C、I245S+L365M、I245S+L65V+T71V、I245S+L65V+T71M、I245S+L65V+T87E、I245S+L65V+R210Y、I245S+L65V+K212R、I245S+L65V+P231T、I245S+L65V+T240F、I245S+L65V+T240L、I245S+L65V+K251T、I245S+L65V+L365M、I245S+L65V+H262A、I245S+L65V+H262S、I245S+T71V+C33A、I245S+T71V+L65V、I245S+T71V+T87E、I245S+T71V+L131N、I245S+T71V+T240F、I245S+T71V+T240L、I245S+T71V+K251T、I245S+T71V+H262A、I245S+T71V+H262S、I245S+T71V+L365M、I245S+L65V+H262A+T87E、I245S+L65V+H262A+R210Y、I245S+L65V+H262A+K212R、I245S+L65V+H262A+K212M、I245S+L65V+H262A+T240F、I245S+L65V+H262A+T240L、I245S+L65V+H262A+T240C、I245S+L65V+H262A+S248D、I245S+L65V+H262A+S248M、I245S+L65V+H262A+K251T、I245S+L65V+H262A+K251L、I245S+L65V+H262A+P336C、I245S+L65V+H262A+L365M、I245S+T71V+T240L+C33A、I245S+T71V+T240L+L65V、I245S+T71V+T240L+T87E、I245S+T71V+T240L+L131N、I245S+T71V+T240L+S235Q、I245S+T71V+T240L+K251T、I245S+T71V+T240L+H262A、I245S+T71V+T240L+H262S、I245S+T71V+T240L+P336C、I245S+T71V+T240L+L365M、I245S+T71V+T240F+L131N+S48N、I245S+T71V+T240L+K251T+L131N、I245S+T71V+T240L+K251T+R210Y、I245S+T71V+T240L+K251T+K212R、I245S+T71V+T240L+K251T+K212M、I245S+T71V+T240L+K251T+S235Q、I245S+T71V+T240L+K251T+H262A、I245S+T71V+T240L+K251T+H262S、I245S+T71V+T240L+K251T+P336C、I245S+T71V+T240L+K251T+L365M、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+R210Y、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K212M、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+H262A、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+H262S、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+H262C、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+K212M、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+H262A、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+L365M、I245S+L65V+H262A+T240F+L131S、I245S+L65V+H262A+T240F+L131H、I245S+L65V+H262A+T240F+L131N、I245S+L65V+H262A+T240F+R210Y、I245S+L65V+H262A+T240F+K212M、I245S+L65V+H262A+T240F+P231T、I245S+L65V+H262A+T240F+K251T或I245S+L65V+H262A+T240F+L365M。
本发明的酯酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的酯酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的酯酶，因此这些酯酶突变体具有酶反应活性和特异性大幅度提高的优势，从而大幅度降低了酶的使用量，降低了工业生产中的成本；并且酯酶对有机溶剂的耐受性增强、反应温度及pH值范围广，具有更强的应用优势。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。上述DNA编码得到的酯酶，提高了酶活性和酶的稳定性，在氨基酸的工业生产中可以减少加入的酶量，降低后处理难度。
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b（+）。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞或真核细胞。优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞，真核细胞为酵母。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性酸的方法。该方法包括采用酯酶对酯类化合物进行催化反应的步骤，酯酶为上述任一种酯酶突变体。由于本发明的上述酯酶具有更好的特异性，甚至更高的酶催化活性，因而利用本发明的酯酶突变体制备手性酸不仅能够降低生产成本，而且所获得的氨基酸ee值更高。
根据本发明一种典型的实施方式，酯类化合物为，反应产物为，其中，R1代表-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH2CH3CH3；R2代表卤原子，氮原子，氧原子，碳链，具有卤素原子、氮原子、氧原子、碳链的不同取代基的杂环或萘环中的一种或多种；
优选的，酯类化合物为
、、、、或。
优选的，酯酶突变体催化反应的pH范围为7.0~9.0，反应温度为20~50℃。
下面将结合具体的实施例进一步说明本发明的有益效果。
底物1 底物2 底物3
底物4 底物5 底物6
实施例1
1 mL反应体系，底物1、底物2、底物3、底物4、底物5或底物6加入5 mg （0.2 mLDMSO溶解），酯酶加入5 mg，0.3 M KPB（磷酸钾缓冲液） pH 7.5，40oC反应2 h后，在0.5 mL反应体系中加入3 mL无水乙醇后充分震荡，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行液相检测，检测转化率和e.e.值。结果见表1。
表1
活性（转化率的高低代表了酶活性的高低）相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍，+++++提高大于70倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例2
继续进行突变，提高酶活和产物ee值。
1 mL反应体系，底物1、底物2、底物3、底物4、底物5或底物6加入5 mg （0.2 mLDMSO溶解），酯酶加入2 mg，0.3 M KPB pH 7.5 缓冲液，40oC反应2 h后，在0.5 mL反应体系中加入3 mL无水乙醇后充分震荡，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行液相检测，检测转化率和e.e.值。结果见表2。
表2
活性（转化率的高低代表了酶活性的高低）相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍，+++++提高大于70倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****.
实施例3
继续进行突变，提高酶活和产物ee值，以及提高底物浓度，降低反应体积。
0.5 mL反应体系，底物1、底物2、底物3、底物4、底物5或底物6加入5 mg（0.1 mLDMSO溶解），酯酶加入 1 mg，0.3 M KPB pH 7.5 缓冲液，40oC反应2 h后，在0.5 mL反应体系中加入3 mL无水乙醇后充分震荡，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行液相检测，检测转化率和e.e.值。结果见表3。
表3
活性（转化率的高低代表了酶活性的高低）相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍，+++++提高大于70倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例4
基于反应条件，优化反应体系。
0.5 mL反应体系，底物1加入5 mg （0.1 mL DMSO溶解），酯酶加入 1 mg，0.3 MKPB pH 7.5 缓冲液。基于反应条件，优化反应体系，不同溶度助溶剂DMSO （0%~25%），不同浓度的缓冲液（0.1 M~1 M KPB pH 7.5）, 不同pH的缓冲液 （0.3 M KPB pH 7~8, 0.3 MTris-HCl pH 8~9）, 反应温度（20oC~50oC）。反应2 h后，在0.5 mL反应体系中加入3 mL无水乙醇后充分震荡，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行液相检测，检测转化率和e.e.值。结果见表4-7。
表4
表5
表6
表7
活性（转化率的高低代表了酶活性的高低）相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍，+++++提高大于70倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例5
根据优化的反应体系，进行底物1 g的放大反应。
基于优化的反应体系，对底物1进行放大反应，20 mL反应体系，底物1加入1 g（4mL DMSO溶解），酯酶（I245S+L65V+H262A+T240F）加入50 mg，0.3 M Tris-HCl pH 8.0 缓冲液。在40oC下反应，跟踪反应时间取样检测，并调节pH在8.0左右，直到其中一种构型的底物转化完全。取样检测：取反应体系100 μL加入3 mL无水乙醇后充分震荡，12000 rpm离心3min，取上清液体进行液相检测，检测转化率和e.e.值。结果见表8。
表8
随着反应时间，转化率逐渐提高，+转化率0~10%，++转化率10~45%，+++转化率45%~50%。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例6
有益突变位点进一步进行组合，进一步提高底物浓度，降低反应体积。
0.5 mL反应体系，底物2、底物3、底物4、底物5或底物6加入10 mg（0.1 mL DMSO溶解），酯酶加入 1 mg，0.3 M KPB pH 7.5 缓冲液，40oC反应2 h后，在0.5 mL反应体系中加入3 mL无水乙醇后充分震荡，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行液相检测，检测转化率和e.e.值。结果见表9。
表9
活性（转化率的高低代表了酶活性的高低）相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍，+++++提高大于70倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例7
基于反应条件，优化反应体系。
0.5 mL反应体系，底物2或者底物4加入5 mg（0.1 mL DMSO溶解），酯酶加入 0.5mg，0.3 M KPB pH 7.5 缓冲液。基于反应条件，优化反应体系，不同溶度助溶剂DMSO （0%~25%），不同浓度的缓冲液（0.1 M~1 M KPB pH 7.5）, 不同pH的缓冲液 （0.3 M KPB pH 7~8, 0.3 M Tris-HCl pH 8~9）, 反应温度（20oC~50oC）。反应2 h后，在0.5 mL反应体系中加入3 mL无水乙醇后充分震荡，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行液相检测，检测转化率和e.e.值。结果见表10-13。
表10
表11
表12
表13
活性（转化率的高低代表了酶活性的高低）相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍，+++++提高大于70倍，++++++提高大于100倍，
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例8
根据优化的反应体系，进行底物1 g的放大反应。
20 mL反应体系，底物2加入1 g （4 mL DMSO溶解），酯酶（I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+K212M）加入25 mg，0.3 M Tris-HCl pH 8.0 缓冲液。在40oC下反应，跟踪反应时间取样检测，并调节pH在8.0左右，直到其中一种构型的底物转化完全。取样检测：取反应体系100 μL加入3 mL无水乙醇后充分震荡，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行液相检测，检测转化率和e.e.值。结果见表14。
表14
随着反应时间，转化率逐渐提高，+转化率0~10%，++转化率10~45%，+++转化率45%~50%。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例9
根据优化的反应体系，进行底物1 g的放大反应。
20 mL反应体系，底物4加入1 g （4 mL DMSO溶解），酯酶（I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+K212M）加入25 mg，0.3 M Tris-HCl pH 8.0 缓冲液。在40oC下反应，跟踪反应时间取样检测，并调节pH在8.0左右，直到其中一种构型的底物转化完全。取样检测：取反应体系100 μL加入3 mL无水乙醇后充分震荡，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行液相检测，检测转化率和e.e.值。结果见表15。
表15
随着反应时间，转化率逐渐提高，+转化率0~10%，++转化率10~45%，+++转化率45%~50%。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种酯酶突变体，其特征在于，所述酯酶突变体为SEQ ID NO: 1突变的序列，所述突变包括I245S；或所述酯酶突变体包括I245S突变，且与SEQ ID NO: 1具有99%以上的同源性，具有酯酶催化活性。
2.根据权利要求1所述的酯酶突变体，其特征在于，所述突变还包括如下任意一个或多个：C33A、A46G、S48N、L65V、T71V、T71M、T87E、L131S、L131N、L131H、R184E、R210Y、K212R、K212M、S230Q、P231T、S235Q、T240F、T240L、T240C、S248D、S248M、K251T、K251L、H262A、H262S、H262C、P336C或L365M。
3.根据权利要求1所述的酯酶突变体，其特征在于，所述突变包括如下任一种组合突变：I245S+C33A、I245S+A46G、I245S+S48N、I245S+L65V、I245S+T71V、I245S+T71M、I245S+T87E、I245S+L131N、I245S+R184E、I245S+R210Y、I245S+K212R、I245S+S230Q、I245S+P231T、I245S+T240F、I245S+T240L、I245S+S248D、I245S+K251T、I245S+K251L、I245S+H262A、I245S+H262S、I245S+P336C、I245S+L365M、I245S+L65V+T71V、I245S+L65V+T71M、I245S+L65V+T87E、I245S+L65V+R210Y、I245S+L65V+K212R、I245S+L65V+P231T、I245S+L65V+T240F、I245S+L65V+T240L、I245S+L65V+K251T、I245S+L65V+L365M、I245S+L65V+H262A、I245S+L65V+H262S、I245S+T71V+C33A、I245S+T71V+L65V、I245S+T71V+T87E、I245S+T71V+L131N、I245S+T71V+T240F、I245S+T71V+T240L、I245S+T71V+K251T、I245S+T71V+H262A、I245S+T71V+H262S、I245S+T71V+L365M、I245S+L65V+H262A+T87E、I245S+L65V+H262A+R210Y、I245S+L65V+H262A+K212R、I245S+L65V+H262A+K212M、I245S+L65V+H262A+T240F、I245S+L65V+H262A+T240L、I245S+L65V+H262A+T240C、I245S+L65V+H262A+S248D、I245S+L65V+H262A+S248M、I245S+L65V+H262A+K251T、I245S+L65V+H262A+K251L、I245S+L65V+H262A+P336C、I245S+L65V+H262A+L365M、I245S+T71V+T240L+C33A、I245S+T71V+T240L+L65V、I245S+T71V+T240L+T87E、I245S+T71V+T240L+L131N、I245S+T71V+T240L+S235Q、I245S+T71V+T240L+K251T、I245S+T71V+T240L+H262A、I245S+T71V+T240L+H262S、I245S+T71V+T240L+P336C、I245S+T71V+T240L+L365M、I245S+T71V+T240F+L131N+S48N、I245S+T71V+T240L+K251T+L131N、I245S+T71V+T240L+K251T+R210Y、I245S+T71V+T240L+K251T+K212R、I245S+T71V+T240L+K251T+K212M、I245S+T71V+T240L+K251T+S235Q、I245S+T71V+T240L+K251T+H262A、I245S+T71V+T240L+K251T+H262S、I245S+T71V+T240L+K251T+P336C、I245S+T71V+T240L+K251T+L365M、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+R210Y、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K212M、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+H262A、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+H262S、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+H262C、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+K212M、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+H262A、I245S+T71V+T240L+T87E+L65V+K251T+L365M、I245S+L65V+H262A+T240F+L131S、I245S+L65V+H262A+T240F+L131H、I245S+L65V+H262A+T240F+L131N、I245S+L65V+H262A+T240F+R210Y、I245S+L65V+H262A+T240F+K212M、I245S+L65V+H262A+T240F+P231T、I245S+L65V+H262A+T240F+K251T或I245S+L65V+H262A+T240F+L365M。
4.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1至3中任一项所述的酯酶突变体。
5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求4所述的DNA分子。
6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组质粒。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选所述原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞，所述真核细胞为酵母。
9.一种生产手性酸的方法，包括采用酯酶对酯类化合物进行催化反应的步骤，其特征在于，所述酯酶为权利要求1至3中任一项所述的酯酶突变体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酯类化合物为，反应产物为，其中，R1代表-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH2CH3CH3；R2代表卤原子，氮原子，氧原子，碳链，具有卤素原子、氮原子、氧原子、碳链的不同取代基的杂环或萘环中的一种或多种；
优选的，所述酯类化合物为、、、、或。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酯酶突变体催化反应的pH为7.0~9.0，反应温度为20~50℃。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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