CN118064394A - 一种亚胺还原酶突变体及其应用 - Google Patents

一种亚胺还原酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种亚胺还原酶突变体及其应用。本发明以亚胺为底物，通过筛选已有的亚胺还原酶库，筛选得到高(R)立体选择性的亚胺还原酶PmIR(Paenibacillus mucilaginosus)，通过对结构模型活性口袋周围和蛋白表面及亚基交界面的关键位点进行饱和突变和进一步组合突变，获得了高催化效率，高选择性的亚胺还原酶突变体，还拓展了底物谱，拓展了该酶在工业应用中的应用潜力。

Description

一种亚胺还原酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种亚胺还原酶突变体及其应用。
背景技术
手性胺及其衍生物是手性药物的重要分支，是众多生物活性分子、天然产物、中间体和分解剂的重要结构单元，在药物、农用化学品和材料的合成以及不对称催化中有着广泛应用。手性胺是众多医药中间体及农用化学品的结构单元，手性胺类药物包括神经类、抗高血压及心脑血管等药物。通过酶催化方法制备手性胺化合物，因具有高效性、环境友好性、经济效率高等优点，获得了学术及工业界的广泛关注，如转氨酶在西格列汀等药物中的应用。但由于反应机理的限制，转氨酶仅限于手性伯胺的合成。
亚胺还原酶(IREDs)是一类NAD(P)H依赖的氧化还原酶，可催化亚胺的不对称还原合成手性胺。IREDs具有催化效率高、区域选择性及立体选择性强等优异的特性，在众多合成手性胺方法中脱颖而出，吸引了科研工作者的研究目光。(R)-2-芳基取代吡咯烷常见于多种天然产物、药物分子及活性中间体中，功能化的手性2-芳基取代吡咯烷被证明具有多种生物活性，被广泛运用于多种药物中，如拉罗替尼手性中间体。目前合成(R)-2-芳基取代吡咯烷的方法多为化学法，合成步骤繁琐，经济效益低，且具有反应条件严苛，需要使用昂贵的贵金属催化剂等缺点。酶法由于其相对温和的反应条件广泛引起研究者的关注，但利用酶法合成(R)-2-芳基取代吡咯烷的相关研究较少。此外，目前已报道的IREDs普遍存在底物谱窄，稳定性差，酶活力低等问题，因此开发优良性能的IREDs逐渐引起人们的重视，如CN115927230A公开了一种亚胺还原酶突变体及其制备方法和在催化制备右美沙芬中间体的应用，在亚胺还原酶中引入突变，显著提高了酶的活性以及立体选择性。
综上所述，开发新型的优良性能的IREDs，提高底物谱、稳定性以及酶活力等，对于手性手性胺的生产及应用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种亚胺还原酶突变体及其应用，针对现有亚胺还原酶存在底物谱窄、稳定性差以及酶活力低等问题，开发新型的亚胺还原酶突变体，以期改善底物耐受性和催化性能，拓展亚胺还原酶的应用前景。
与现有技术相比，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种亚胺还原酶突变体，所述亚胺还原酶突变体的氨基酸序列包括以下序列中任意一种：
(1)在SEQ ID NO.1所示序列基础上发生T62A、V106T、A121M、N163H、R176L、S227R、M287E、N294D、Q138G、Y186H、Y186W、E224N、E224T或E224K突变中任意一种或至少两种组合的序列；或，
(2)由如(1)所述序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列；或，
(3)与(1)或(2)所述序列具有至少90％序列同源性，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列。
本发明通过对应用相对较多的来源于胶冻样类芽孢杆菌Paenibacillusmucilaginosus的亚胺还原酶PmIR进行定向进化，改善了底物耐受性和催化性能，还拓展了底物谱，拓展了亚胺还原酶的应用前景。
SED ID NO:1：
MKSSNRSENIRVGTENTVGKSKSVTVIGLGPMGKAMAAAFLEHGYKVTVWNRTSNKADELITKGAVRASTVHEALAANELVILSLTDYDAMYTILEPASENLSGKVLVNLSSDTPDKAREAAKWLANRGAGHITGGVQVPPSGIGKPESSTYYSGPKEVFEANKETLEVLTGTDYRGEDPGLAALYYQIQMDMFWTAMLSYLHATAVAQANGITAEQFLPYAAETMSSLPKFIEFYTPRINAGEYPGDVDRLAMGMASVEHVVHTTQDAGIDITLPTAVLEVFRRGMENGHAGNSFTSLIEIFKKSDIRP。
本发明中，在野生型亚胺还原酶中引入特定突变，获得亚胺还原酶突变体，能够提高其催化活性、底物耐受性以及拓展底物谱，可以理解，在所述亚胺还原酶突变体基础上，本领域技术人员能够利用本领域通用技术手段进行取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得功能相同或相似的其他序列。
优选地，(1)所述组合包括T62A和N163H的组合(本发明中为便于书写，可将组合写成“T62A+N163H”或“T62A/N163H”的形式，后续组合以此类推)、T62A和M287E的组合、T62A和N294D的组合、N163H和M287E的组合、N163H和N294D的组合、M287E和N294D的组合、T62A、N163H和M287E的组合、T62A、M287E和N294D的组合、N163H、M287E和N294D的组合、T62A、N163H和N294D的组合、T62A、N163H、M287E和N294D的组合、T62A、A121M、N163H和N294D的组合、T62A、N163H、N294D、A121M和S227的组合、T62A、N163H、R176L和N294D的组合、T62A、A121M、N163H、S227R和N294D的组合、T62A、N163H、N294D、R176L和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、R176L和E224T的组合、T62A、N163H、N294D、R176L和E224K的组合、T62A、N163H、N294D、R176L和Q138G的组合、T62A、N163H、N294D、R176L和Y186H的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Q138G和Y186H的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Q138G和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Q138G和E224T的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Q138G和E224K的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Y186H和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Y186H和E224T的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Y186H和E224K的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R和E224T的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R和E224K的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R和Q138G的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R和Y186H的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Q138G和Y186H的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Q138G和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Q138G和E224T的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Q138G和E224K的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Y186H和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Y186H和E224T的组合或T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Y186H和E224K的组合中任意一种。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的亚胺还原酶突变体。
本发明中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
第三方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述重组载体包括重组质粒。
优选地，所述重组质粒的出发质粒包括pET-21b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pPIC9k、pGAPZαA、pUC-18或pUC-19中任意一种。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的重组载体。
优选地，所述重组细胞的出发细胞包括真核细胞或原核细胞。
优选地，所述真核细胞包括酵母菌。
优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌。
优选地，所述大肠杆菌包括大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌BL21-DE3或大肠杆菌Rosetta-DE3中任意一种。
第五方面，本发明提供第一方面所述的亚胺还原酶突变体的制备方法，所述制备方法包括：
将编码第一方面所述的亚胺还原酶突变体的核酸分子插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞，得到重组细胞，进行培养及产物纯化，得到所述亚胺还原酶突变体。
本发明中，对重组细胞进行诱导培养的方法、从培养物中分离亚胺还原酶的方法均可采用本领域的常规方法。重组细胞表达亚胺还原酶时使用的培养基可以是本领域可使该重组细胞生长并产生本发明的亚胺还原酶突变体的培养基，例如LB培养基等。
第六方面，本发明提供第一方面所述的亚胺还原酶突变体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组细胞在生产手性胺中的应用。
应当理解的是，本发明所述的亚胺还原酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的亚胺还原酶突变体制备成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。
第七方面，本发明提供一种生产手性胺的方法，所述方法包括利用第一方面所述的亚胺还原酶突变体催化亚胺底物进行还原反应，所述亚胺底物的结构式如式I所示。
其中，所述n＝1、2、3；R选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、氟、氯或溴中的任意一种或至少两种的组合；Ar选自苯基、呋喃基、吡啶基或噻吩基中任意一种。
优选地，所述方法包括利用第一方面所述的亚胺还原酶突变体将5-芳基-3,4-二氢-2H-吡咯还原为(R)-2-芳基吡咯烷。
优选地，所述还原反应的体系中还包括辅酶或辅酶再生体系，所述辅酶选自由NADP、NAD、NADPH或NADH组成的组中的任意一种或至少两种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明以亚胺为底物，通过筛选已有的亚胺还原酶库，筛选得到高(R)立体选择性的亚胺还原酶PmIR(Paenibacillus mucilaginosus)，通过对结构模型活性口袋周围和蛋白表面及亚基交界面的关键位点进行饱和突变和进一步组合突变，获得了高催化效率，高选择性的亚胺还原酶突变体，还拓展了底物谱，拓展了该酶在工业应用中的应用潜力。
附图说明
图1为底物5-芳基-3,4-二氢-2H-吡咯HPLC图谱；
图2为(R)-2-芳基吡咯烷标准品HPLC图谱；
图3为实施例1中PmIR酶催化反应液的HPLC图谱；
图4为(R)-2-芳基吡咯烷标准品手性HPLC图谱；
图5为实施例1中PmIR酶催化反应液手性HPLC图谱。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
本发明通过筛选来源于Paenibacillus mucilaginosus，Mycolicibacteriummageritense，Paenibacillus elgii，Myxococcus stipitatus，Burkholderiacontaminans FFH2055的野生型亚胺还原酶，发现来源于芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)的亚胺还原酶立体选择性(R)相对较好，但对高浓度底物耐受性较差。因此，本发明以芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为本发明的出发基因，进一步运用定向进化改造，获得了一系列具有高底物耐受性，高催化效率和选择性的亚胺还原酶突变体。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种亚胺还原酶突变体。该亚胺还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点包括：E59，T62，V66，E96，V106，A121，Q138，V139，N163，R176，Y186，Q190，F194，E224，T225，S227，S228，K231，T237，N241，V249，T266，I273，M287，N294；或者亚胺还原酶突变体的氨基酸序列具有突变的氨基酸位点，且与SEQ ID NO:1所示序列具有90％、95％或99％以上同源性、具有亚胺还原酶催化活性的氨基酸序列。本发明提供的亚胺还原酶突变体能够高效、立体选择性地合成(R)-2-芳基吡咯烷，适合工业化生产。
本文使用的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有改进的亚胺还原酶对底物的耐受性。在上述实施方式中，领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下获得这样的变体序列。
突变为如下单位点突变或组合突变之一：T62A、V106T、A121M、N163H、R176L、S227R、M287E、N294D、Q138G、Y186H、Y186W、E224N、E224T、E224K、T62A+N163H、T62A+M287E、T62A+N294D、N163H+M287E、N163H+N294D、M287E+N294D、T62A+N163H+M287E、T62A+M287E+N294D、N163H+M287E+N294D、T62A+N163H+N294D、T62A+N163H+M287E+N294D、T62A+A121M+N163H+N294D、T62A+N163H+N294D+A121M+S227、T62A+N163H+R176L+N294D、T62A+A121M+N163H+S227R+N294D、T62A+N163H+N294D+R176L+E224N、T62A+N163H+N294D+R176L+E224T、T62A+N163H+N294D+R176L+E224K、T62A+N163H+N294D+R176L+Q138G、T62A+N163H+N294D+R176L+Y186H、T62A+N163H+N294D+R176L+Q138G+Y186H、T62A+N163H+N294D+R176L+Q138G+E224N、T62A+N163H+N294D+R176L+Q138G+E224T、T62A+N163H+N294D+R176L+Q138G+E224K、T62A+N163H+N294D+R176L+Y186H+E224N、T62A+N163H+N294D+R176L+Y186H+E224T、T62A+N163H+N294D+R176L+Y186H+E224K、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+E224N、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+E224T、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+E224K、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+Q138G、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+Y186H、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+Q138G+Y186H、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+Q138G+E224N、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+Q138G+E224T、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+Q138G+E224K、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+Y186H+E224N、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+Y186H+E224T、T62A+N163H+N294D+A121M+S227R+Y186H+E224K。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述任一种亚胺还
原酶突变体。该DNA分子编码的上述亚胺还原酶突变体具有较高的催化活力及选择性。
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒为pET-21b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pPIC9k、pGAPZαA、pUC-18或pUC-19。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞或真核细胞。优选的，原核细胞为大肠杆菌DH5α、Top10、BL21-DE3或大肠杆菌Rosetta-DE3细胞；真核细胞为酵母细胞。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性胺的方法。该方法包括采用亚胺还原酶对亚胺底物还原的步骤，亚胺还原酶为本申请的上述任一种亚胺还原酶突变体。
进一步地，亚胺类底物的结构式如下：
其中所述n＝1、2、3；R选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、氟、氯、溴中的一种或几种；Ar选自苯基、呋喃基、吡啶基或噻吩基中的一种。
根据本发明一种典型的实施方式，采用亚胺还原酶对亚胺类底物的反应体系中还包括辅酶，辅酶或辅酶再生体系为选自由NADP、NAD、NADPH或NADH组成的组中的一种或多种。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
本实施例进行亚胺还原酶筛选。
本发明通过筛选来源于Paenibacillus mucilaginosus，Mycolicibacteriummageritense，Paenibacillus elgii，Myxococcus stipitatus，Burkholderiacontaminans FFH2055野生型亚胺还原酶(分别为PmIR,MmIR,PeIR,MsIR和BcIR)，筛选步骤如下，筛选数据见表1，以5-芳基-3,4-二氢-2H-吡咯(1a)为底物经亚胺还原酶催化得到(R)-2-芳基吡咯烷(1b)反应式如下所示。
筛选底物与操作：
分别称取10.0mg亚胺还原酶(PmIR,MmIR,PeIR,MsIR和BcIR)于对应5.0mL离心管中，分别添加2.0mg GDH、40.0mg葡萄糖、2.0mgNADP+，底物1a(5-芳基-3,4-二氢-2H-吡咯，5.0g/L)及20.0μL的DMSO溶液于0.1M pH 7.0磷酸缓冲液，定容至1.0mL。随后放入30℃摇床反应24h后经超高效液相色谱(C18柱，流动相：乙腈和水，流速0.4mL/min)和手性高效液相色谱HPLC(AY柱，正己烷：乙醇(0.1％二乙胺)＝98：2，流速1mL/min)，底物5-芳基-3,4-二氢-2H-吡咯HPLC图谱如图1所示，(R)-2-芳基吡咯烷标准品HPLC图谱如图2所示，PmIR酶催化反应液的HPLC图谱如图3所示，图4为(R)-2-芳基吡咯烷标准品手性HPLC图谱；图5为PmIR酶催化反应液手性HPLC图谱。检测转化率(产物和原料峰面积百分比)和ee值(分别R和S构型百分比差值)如下表：
表1不同菌株来源亚胺还原酶筛选结果(底物上载量5g/L)
从表1可以看出来PmIR,MmIR,PeIR可获得R型2-芳基吡咯烷(1b)，其中PmIR催化效率最好，MsIR和BcIR虽高效催化但获得相反构型。但PmIR尝试提高底物上载量时(如8.0g/L,10.0g/L)，催化活性大大降低，判断为底物耐受性和催化活性不足。因此，以来源于芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)的亚胺还原酶(具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)为本发明的出发酶，进行定向进化，提高目标基因的底物耐受性和催化活性。
实施例2
本实施例进行芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)亚胺还原酶突变体库的构建
选取芽孢杆菌亚胺还原酶(PmIR)底物结合口袋附近9个非保守残基位点和蛋白表面及亚基交界面的16个位点进行定点饱和突变，并将以上两个策略获得阳性突变体进行组合提高酶催化活性。通过全质粒PCR获得完整的线性片段，将上述PCR产物经DpnⅠ消化除去出发基因的母本模版后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50.0μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜，96孔板诱导表达后经超高效液相色谱高通量筛选，挑选活性较母本提高的突变子，后通过基因测序确定突变位点。
具体操作流程如下：以pET28a-PmIR(含PmIR编码基因(SEQ ID NO:2)的pET28a质粒)作为模板，用高保真聚合酶PrimeSTAR进行PCR。PCR反应条件如下：总体积为50.0μL的PCR反应体系中，加入模板0.5～20.0ng，25μL 2×PrimeSTAR(Premix)，一对突变引物各1.0μL(10μM)，加无菌蒸馏水至50.0μL。PCR反应程序：(1)98℃变性10sec，(2)55℃退火30sec，(3)72℃延伸6min，步骤(1)～(3)共进行30个循环，12℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后加入DpnI在37℃消化1h。将消化产物转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞并涂布于含有卡那抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。
SED ID NO:2：
atgaagagcagcaatcgtagtgaaaatattcgcgtgggtacagaaaataccgttggcaaaagcaaaagcgttaccgtgattggtctgggcccgatgggcaaagcaatggcagccgcatttctggaacatggctataaagtgaccgtgtggaatcgcaccagcaataaggccgatgaactgattaccaaaggtgccgttcgtgcaagcaccgttcatgaagcactggcagcaaatgaactggttattctgagcctgaccgattatgatgccatgtataccattctggaaccggccagtgaaaatctgagtggtaaagttctggtgaatctgagtagtgataccccggataaagcccgtgaagccgcaaaatggctggcaaatcgcggtgccggccatattaccggcggcgtgcaggtgccgccgagtggtattggtaaaccggaaagcagtacctattatagtggtccgaaagaagtgtttgaagcaaataaggaaaccctggaagttctgaccggcaccgattatcgcggcgaagatccgggcctggccgcattatattatcagattcagatggatatgttctggaccgccatgctgagttatctgcatgccaccgccgtggcccaggcaaatggtattaccgccgaacagtttctgccgtatgcagcagaaaccatgagcagcctgccgaaattcattgaattttataccccgcgcattaatgccggcgaatatccgggcgatgttgatcgcctggcaatgggtatggcaagtgtggaacatgttgttcataccacccaggatgcaggtattgatattaccctgccgaccgcagtgctggaagtgtttcgtcgtggcatggaaaatggccatgcaggtaatagttttaccagtctgattgaaattttcaagaagagtgatattcgcccgtaactcgag。
饱和突变文库培养及投反应的具体操作流程如下：将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板600.0μL的LB中进行培养，37℃振荡培养至OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，在25℃下进行诱导表达过夜。次日96孔板离心去上清培养基，每孔加入100.0μL溶菌酶溶液(溶菌酶1.0mg/mL，pH＝7.0)，30℃保温破碎2h。随后加入每孔量投料量分别是底物1a 1.6mg，4.0μL DMSO，8.0mg葡萄糖，0.4mg GDH，0.4mg NADP+，并用PBS缓冲液定容至200.0μL于30℃反应24h，次日加入1.0mL/孔乙腈溶液终止反应。4000rpm/min低速离心15min，吸取上清液1.0mL过滤经超高效液相色谱检测转化率，结果如表2所示
表2亚胺还原酶PmIR及其突变体催化底物1a结果
注：a:1a底物上载量为8g/L，b:1a底物上载量为10g/L。
由表2数据可知，亚胺底物浓度为8.0g/L时，T62A、V106T、A121M、N163H、R176L、S227R、M287E和N294D突变酶较PmIR野生型活性提高，较PmIR野生型活性提高1.5倍的6个位点分别为T62A，A121M，N163H，R176L，S227R，N294D，其中T62A，N163H，R176L和N294D转化率>90.0％。但当浓度提高为10.0g/L时，野生型及其突变体转化率下降至<10.0％，因此下一轮突变尝试采用组合突变的方式将以上6个位点组合，期望获得耐受更高底物浓度的阳性突变体，组合突变测试结果如表3所示。
表3亚胺还原酶PmIR及其突变体催化1a结果
突变位点 转化率(％)a 转化率(％)b ee(％) 主要构型
未突变PmIR 64.3 5.2 >99.0 R
T62A/N163H >99.0 6.5 >99.0 R
T62A/M287E 6.8 0 0 0
T62A/N294D >99.0 6.1 >99.0 R
N163H/M287E 6.3 1.0 >99.0 R
N163H/N294D 0 0 0 0
M287E/N294D 11.9 3.5 >99.0 R
A121M/S227R 3.4 0.9 >99.0 R
A121M/R176L 2.5 0.5 >99.0 R
A121M/R176L/S227R 3.4 0.9 >99.0 R
T62A/N163H/M287E 5.5 0.8 0 0
T62A/N163H/N294D >99.0 6.8 >99.0 R
T62A/M287E/N294D 19.8 3.5 0 0
N163H/M287E/N294D 11.2 1.1 0 0
T62A/N163H/M287E/N294D 17.0 3.1 >99.0 R
T62A/A121M/N163H/N294D >99.0 21.9 >99.0 R
T62A/N163H/R176L/N294D >99.0 27.6 >99.0 R
T62A/N163H/S227R/N294D 88.2 11.7 >99.0 R
T62A/A121M/N163H/R176L/N294D 21.3 4.9 >99.0 R
T62A/A121M/N163H/S227R/N294D >99.0 29.2 >99.0 R
T62A/N163H/R176L/S227R/N294D 76.5 9.3 >99.0 R
注：a:1a底物上载量为8.0g/L，b:1a底物上载量为10.0g/L。
表3数据显示，当1a上载量为8.0g/L时，T62A/N163H，T62A/N294D和T62A/N163H/N294D转化率>99.0％，且立体选择性保持不变。说明位点T62，N163和N294是提高活性的关键位点，后又将位点121，163和176融入T62A/N163H/N294D中，1a上载量提高为10.0g/L时，T62A/A121M/N163H/N294D，T62A/N163H/R176L/N294D和T62A/A121M/N163H/S227R/N294D较野生型活性提高4-6倍，接下来试图融入另一策略的阳性突变体，期望进一步提高酶的催化活性。
选取芽孢杆菌亚胺还原酶(PmIR)底物结合口袋附近非保守残基9个位点，(Q138，V139，Y186，Q190，F194，E224，T225，S228，K231)构建饱和突变文库共792个突变体，采用8.0g/L底物1a从饱和文库中共筛选到22个阳性突变子Q138K，Q138G，V139S，V139C，V139I，Y186L，Y186V，Y186H，Y186W，Q190K，E224V，E224N，E224A，E224T，E224S，E224K，T225V，S228I，S228G，S228K，S228F，K231S。结果如表4所示，其中Q138G，Y186H，E224N，E224T和E224K可耐受10.0g/L底物载量，E224N，E224T和E224K反应24h后转化率高达90％以上，遗憾的是其余位点突变体转化率均<20.0％。
表4亚胺还原酶PmIR及其突变体催化1a结果
突变位点 转化率(％)a 转化率(％)b ee(％) 主要构型
未突变PmIR 64.3 5.2 >99.0 R
Q138G 85.1 50.8 >99.0 R
Y186H 95.3 53.6 >99.0 R
Y186W 94.2 8.1 >99.0 R
E224N >99.0 97.4 >99.0 R
E224T >99.0 86.5 >99.0 R
E224K >99.0 98.2 >99.0 R
a:1a底物上载量为8.0g/L，b:1a底物上载量为10.0g/L。
表5亚胺还原酶PmIR及其突变体催化1a(10.0g/L)
注：将“T62A/N163H/N294D”记为M1。
根据表5数据可知，224位点突变为N、T或K时融入到M1模板中并与R176L，Y186H，R176L/Q138G和A121M/S227R/Y186H结合后，反应速率明显提高，反应8h就可几乎将底物转化完毕。而母本只含有224突变位点N，T和K时，反应24h转化率才可达到90.0％以上。
表6亚胺还原酶PmIR及其突变体催化1a催化性能比较
酶编号 底物上载(g/L) 反应时间(h) 转化率(％) ee(％)
PmIR 5.0 24 >99.0 >99.0(R)
PmIR 8.0 24 64.3 >99.0(R)
PmIR 10.0 24 5.2 >99.0(R)
M1 8.0 24 >99.0 >99.0(R)
M1/R176L/Q138G/E224T/N 10.0 8 >99.0 >99.0(R)
结果如表6所示，野生酶在5.0g/L的底物上载量情况下，24h后转化率>99.0％，随着底物上载量增加至10.0g/L时，转化率仅有5.2％。而对于突变体M1上载量增加到8.0g/L时，24h后转化率仍>99.0％。值得注意的是，同样的底物上载量下(10.0g/L)时，M1/R176L/Q138G/E224T/N(T或N)在8h内就可将底物全部转化完毕，这充分说明突变体的催化性能相比于母本有了大幅提升。
实施例3
本实施例进行(R)-2-芳基吡咯烷酶法百毫克级规模制备。
在3个50.0mL四口瓶中依次加入300.0mg底物1a及2％v.v-1 DMSO，50.0mg NADP+，50.0mg GDH，2.0g葡萄糖，0.1M pH 7.0磷酸缓冲液定容至30.0mL，搅拌开始反应，恒温水浴锅控制温度30℃，滴定仪以3N碳酸钠溶液控pH＝7.0，最后分别向3个反应体系中加入100％w.w-1含PmIR、M1/R176L/Q138G/E224N突变或M1/R176L/Q138G/E224T突变的亚胺还原酶的干菌粉，其中M1/R176L/Q138G/E224N突变的亚胺还原酶和M1/R176L/Q138G/E224T突变的亚胺还原酶，8h后检测Conv(％)>99.0％和ee>99.0％(R)，24h后PmIR反应才检测Conv(％)>99.0％和ee>99.0％(R)，表明本发明构建的亚胺还原酶突变体的酶活显著提高，有效缩短反应时间。
实施例4
本实施例探究突变体M1/R176L/Q138G/E224T/N底物谱。
为探究突变体M1/R176L/Q138G/E224T/N底物谱，选择芳基取代卤素原子(Cl和F)，吡啶的吡咯和哌啶(2a-5a)。称取原料2a-5a和10.0mg的含突变体M1/R176L/Q138G/E224T/N干菌粉于对应5.0mL离心管中，分别添加2.0mg GDH、40.0mg葡萄糖、2.0mg NADP+和20.0μLDMSO到pH＝7.0PBS缓冲液溶液中并定容至1.0mL。放于30℃摇床中反应24h，取样经乙腈稀释分别检测转化率和ee值。
表7突变体M1/R176L/Q138G/E224T/N酶法合成2b-5b
a:底物上载量为10g/L，M1/R176L/Q138G/E224N转化率；b:底物上载量为10g/L，M1/R176L/Q138G/E224T转化率。
在本实施例中，突变体M1/R176L/Q138G/E224T/N对2a-5a均表现出较好的催化活性和选择性，说明本发明通过对PmIR定向进化，不仅改善了底物耐受性和催化性能，还拓展了底物谱，使得该酶在工业生产中的应用发展愈加成熟。
综上所述，本发明通过筛选来源于Paenibacillus mucilaginosus，Mycolicibacteriummageritense，Paenibacillus elgii，Myxococcus stipitatus，Burkholderia contaminans FFH2055的野生型亚胺还原酶，发现来源于芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)的亚胺还原酶立体选择性(R)相对较好。因此，本发明以芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为本发明的出发酶，进一步运用定向进化改造，获得了一系列具有高底物耐受性，高催化效率和选择性以及底物谱的亚胺还原酶突变体。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述亚胺还原酶突变体的氨基酸序列包括以下序列中任意一种：
(1)在SEQ ID NO.1所示序列基础上发生T62A、V106T、A121M、N163H、R176L、S227R、M287E、N294D、Q138G、Y186H、Y186W、E224N、E224T或E224K突变中任意一种或至少两种组合的序列；或，
(2)由如(1)所述序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列；或，
(3)与(1)或(2)所述序列具有至少90％序列同源性，且与(1)所述序列功能相同或相似的序列。
2.根据权利要求1所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于，(1)所述组合包括T62A和N163H的组合、T62A和M287E的组合、T62A和N294D的组合、N163H和M287E的组合、N163H和N294D的组合、M287E和N294D的组合、T62A、N163H和M287E的组合、T62A、M287E和N294D的组合、N163H、M287E和N294D的组合、T62A、N163H和N294D的组合、T62A、N163H、M287E和N294D的组合、T62A、A121M、N163H和N294D的组合、T62A、N163H、N294D、A121M和S227的组合、T62A、N163H、R176L和N294D的组合、T62A、A121M、N163H、S227R和N294D的组合、T62A、N163H、N294D、R176L和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、R176L和E224T的组合、T62A、N163H、N294D、R176L和E224K的组合、T62A、N163H、N294D、R176L和Q138G的组合、T62A、N163H、N294D、R176L和Y186H的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Q138G和Y186H的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Q138G和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Q138G和E224T的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Q138G和E224K的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Y186H和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Y186H和E224T的组合、T62A、N163H、N294D、R176L、Y186H和E224K的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R和E224T的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R和E224K的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R和Q138G的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R和Y186H的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Q138G和Y186H的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Q138G和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Q138G和E224T的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Q138G和E224K的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Y186H和E224N的组合、T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Y186H和E224T的组合或T62A、N163H、N294D、A121M、S227R、Y186H和E224K的组合中任意一种。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3所述的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括重组质粒；
优选地，所述重组质粒的出发质粒包括pET-21b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pPIC9k、pGAPZαA、pUC-18或pUC-19中任意一种。
6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述的核酸分子或权利要求4或5所述的重组载体。
7.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的出发细胞包括真核细胞或原核细胞；
优选地，所述真核细胞包括酵母菌；
优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌；
优选地，所述大肠杆菌包括大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌BL21-DE3或大肠杆菌Rosetta-DE3中任意一种。
8.权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6或7所述的重组细胞在生产手性胺中的应用。
9.一种生产手性胺的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体催化亚胺底物进行还原反应；
所述亚胺底物的结构式如式I所示；
其中，所述n＝1、2、3；R选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、氟、氯或溴中的任意一种或至少两种的组合；Ar选自苯基、呋喃基、吡啶基或噻吩基中任意一种。
10.根据权利要求9所述的生产手性胺的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体将5-芳基-3,4-二氢-2H-吡咯还原为(R)-2-芳基吡咯烷；
优选地，所述还原反应的体系中还包括辅酶或辅酶再生体系，所述辅酶选自由NADP、NAD、NADPH或NADH组成的组中的任意一种或至少两种。
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