CN110643587B - 一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法 - Google Patents

一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药和生物化工技术领域，公开了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生产用酶组合物及一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法。本发明所述酶组合物由腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶组成。四种酶合理组合可以高效催化制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。本发明所述酶组合物可循环利用，成本低，节能环保。本发明所述酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法以腺苷酸为底物，通过添加所述酶组合物，可以低成本、安全可靠制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，降低现有路线的成本，使其适应规模化生产，为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在生物催化和药品领域的使用提供保证。

Description

一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，又名氧化型辅酶II，(NADP+)是一种重要的辅酶，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物。氧化型辅酶II通过氧化还原反应的形式传递质子、电子及能量，并且参与到细胞很多代谢反应中，脂类、脂肪酸和核苷酸的合成，能活化多酶系统，促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢，提高物质转运和调节控制，改善代谢功能。研究表明，氧化型辅酶II能促进物质代谢、能量代谢、抵抗细胞衰老和抗氧化作用(ying,W.2008:Antioxid Redox Signal 10(2):179-206)。
Figure BDA0002251349450000011
NADPH是一种辅酶，叫还原型辅酶Ⅱ，学名还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。NADPH是NADP+的还原形式。NADPH是最终电子受体NADP+接受电子后的产物。NADP+是NADPH的氧化形式。
辅酶Ⅱ在科研、酶催化不对称合成、医疗保健领域具有广泛的应用。首先，NADP+/NADPH的浓度的改变不仅会影响产物形成，还会使代谢流发生广泛变化，定向改变和优化微生物细胞代谢功能及氧化还原酶催化的产物构成，从而实现代谢流最大化、快速化地导向目标代谢产物。其次，辅酶Ⅱ在药物代谢模型的研究中具有重要作用，NADP+/NADPH参与细胞色素P450加氧酶的羟基化反应，进而影响大部分药物及一些进入到人体中的有毒有害物质(大分子有机物质)的多步羟基化，增加物质的亲水性，以利于其分解代谢或排出体外。再次，不对称合成在手性药物和手性中间体生产中几乎50％左右的反应涉及到辅酶的酶催化参与，生产上需要添加辅酶以满足对反应速率的要求。
辅酶Ⅱ在生物中广泛存在，但含量极低，从生物中提取的辅酶Ⅱ以氧化型的形式存在，每公斤市场价格在数万元。工业化生产中使用氧化型辅酶Ⅱ，即NADP+，但其生产方法较少。目前NADP+的化学酶法和生物发酵法。化学酶法以烟酰胺核糖为原料，同样会用到昂贵试剂和易爆试剂，成本高还会发生事故。生物发酵法工艺技术成熟，但是原料耗费巨大，消耗能源大，产量有限。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种酶组合物，由腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶组成。
本发明所述酶组合物中腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(NmPRT)、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)和多聚磷酸依赖型NAD激酶(ppnk)四种酶合理组合可以用于酶解催化合成NADP+。
在一些实施方案中，所述的酶组合物中所述腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶的质量比为1:(1-3):(1-2):1。
在一些具体实施例中，所述腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶的比例为1:2:1:1。在一些具体实施例中，所述腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶的比例为1:1:1:1。在一些具体实施例中，所述腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶的比例为1:3:1:1。在一些具体实施例中，所述腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶的比例为1:2:2:1。
本发明所述酶组合物中所述腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶为通过基因工程技术通过PCR扩增目的片段、与载体连接转入宿主菌后诱导蛋白表达获得的相关酶制剂。所述酶制剂可以是粗酶液或者干粉，也可以是再经固定化处理后的固定化酶或者固定化重组细胞。
所述固定化的酶制剂或固定化重组细胞可以通过离心方式分利，也可通过过滤方式分离回收。回收的固定化酶或固定化重组细胞可重复利用，用于酶促反应。
本发明还提供了利用上述酶组合物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法。
一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法，在pH 7.0磷酸缓冲溶液中加入腺苷酸、六偏磷酸钠、ATP、MgCl2·6H2O混匀，加入上述的酶组合物，催化制得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
本发明所述方法以腺苷酸为底物，通过添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生产用酶组合物，在生物催化体系中进行酶促反应，可以低成本、安全可靠制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。具体反应式如下：
Figure BDA0002251349450000041
在一些实施方案中，本发明所述酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法中，所述腺苷酸的终浓度为18g/l～22g/l，六偏磷酸钠的终浓度为56g/l～64g/l，ATP的终浓度为15g/l～17g/l，MgCl2·6H2O的终浓度为5.5g/l～6.5g/l。在一些具体实施例中，所述腺苷酸的终浓度为20g/L，六偏磷酸钠的终浓度为60g/L，ATP的终浓度为16g/L，MgCl2·6H2O的终浓度为6g/L。
作为优选，本发明所述酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法中，所述催化反应条件为在pH 7.0、反应温度30-35℃条件下反应9～15小时。
催化反应后分离的反应液可通过离子交换层析、浓缩、结晶和干燥等制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸成品。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生产用酶组合物及一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法。本发明所述酶组合物由腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶组成。四种酶合理组合可以高效催化制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。本发明所述酶组合物可循环利用，成本低，节能环保。本发明所述酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法以腺苷酸为底物，通过添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生产用酶组合物，可以低成本、安全可靠制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，降低现有路线的成本，使其适应规模化生产，为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在生物催化和药品领域的使用提供保证。
具体实施方式
本发明公开了一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)酶活测定方法：酶反应体系及反应条件如下：100mMTris-HCl(pH7.0)，20mM MgCl2，1mM AMP，1mM六偏磷酸钠，30℃反应15min，沸水煮5min灭酶，离心，上清液过膜。采用HPLC检测腺嘌呤的含量，具体为C18 HPLC色谱柱，250mm×4.6mm；流动相：磷酸三乙胺水溶液(其中磷酸含量0.6％(v/v)，用三乙胺调节pH至6.6)：甲醇＝90:10；紫外检测器，波长254nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量5μL。
烟酰胺磷酸核糖转移酶(NmPRT)酶活测定方法：酶反应体系及反应条件如下：100mM Tris-HCl(pH7.0)，1mM ATP，1mM烟酰胺，1mM 5-phospho-α-D-ribose 1-diphosphate，30℃反应15min，用盐酸水灭酶，离心，上清液过膜。采用HPLC检测NMN的含量，具体为C18 HPLC色谱柱，250mm×4.6mm；流动相：0.1％TFA，甲醇；紫外检测器，波长260nm，柱温25℃，流速0.8mL/min，进样量5μL。
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)酶活测定方法：酶反应体系及反应条件如下：100mM Tris-HCl(pH 7.0)，300mM MgCl2，5mM ATP，5mM NMM，37℃反应10min，用盐酸水灭酶，离心，上清液过膜。采用HPLC检测NAD的含量，具体为C18 HPLC色谱柱，150mm×4.6mm；流动相：25mM pH＝7.0Tris-HAC,甲醇；紫外检测器，波长260nm，柱温30℃，流速0.8mL/min，进样量5μL。
多聚磷酸依赖型NAD激酶(ppnk)酶活测定方法：加入1mol/L PH7.5的Tris-HCl缓冲液、1mM NAD+、1mM六偏磷酸钠以及1mMMn2+，混匀后置于30℃的水浴锅中反应15min，沸水浴5min终止反应，离心5min，去除沉淀，取上清液；采用HPLC检测NADP的含量，具体为C18HPLC色谱柱，150mm×4.6mm；流动相：25mM pH＝7.0 Tris-HAC，甲醇；紫外检测器，波长260nm，柱温30℃，流速0.8mL/min，进样量5μL。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，种子培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。发酵培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 8g/L，甘油10g/L，磷酸一氢钾1.2g/L，磷酸二氢钾1.8g/L，硫酸镁1g/L。
实施例1、制备NADP+生产用酶
根据4种酶基因的序列，设计4对扩增引物。提取大肠杆菌(Escherichia coli)菌株基因组DNA，以其为模板，PCR扩增APRT(AK酶基因)片段，并将其连接至pET28a载体(购于Novagene公司)；提取杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)(购于上海捷瑞生物工程有限公司)基因组DNA，以其为模板，PCR扩增NmPRT基因片段，并将其连接至pET 28a载体(购于Novagene公司)；提取詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)菌株基因组DNA，以其为模板，PCR扩增NMNAT基因片段，并将其连接至pET28a载体(购于Novagene公司)；提取结合分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)菌株基因组DNA，以其为模板，PCR扩增ppnk基因片段，并将其连接至pET28a载体(购于Novagene公司)。4种基因片段连接成功经测序正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株(上海唯地生物技术有限公司)。
其中，腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)的序列为ATGACCGCGACTGCACAGCAGCTTGAGTATCTCAAAAATAGCATCAAAAGCATTCAGGACTACCCAAAACCCGGCATTCTTTTCCGCGATGTCACCAGCTTACTGGAAGACCCGAAAGCTTACGCTCTCAGCATCGACTTGCTGGTTGAGCGTTACAAAAATGCGGGCATTACCAAAGTTGTCGGCACCGAAGCGCGTGGCTTCTTGTTTGGCGCTCCGGTAGCTCTGGGTCTGGGCGTTGGCTTTGTACCGGTCCGTAAACCGGGCAAACTGCCGCGTGAAACCATCAGTGAAACTTACGACCTGGAATACGGCACCGATCAGCTGGAGATCCACGTTGATGCCATCAAACCGGGCGACAAAGTTCTGGTGGTGGACGACCTGCTGGCAACCGGCGGCACTATCGAAGCGACCGTTAAACTGATCCGTCGTCTGGGTGGTGAAGTGGCTGACGCTGCGTTCATTATCAACCTGTTCGATCTCGGCGGCGAACAGCGTCTCGAAAAACAGGGCATTACCAGCTACAGCCTTGTCCCGTTCCCGGGCCATTAA；扩增引物序列为APRT-F:5’-3’:agtcgcatcatATGACCGCGACTGCACAG，划线为酶切位点NdeI；APRT-R:3’-5’:gcgcgataGAATTC TTAATGGCCCGGGAACGGG，划线为酶切位点EcoRI。
烟酰胺磷酸核糖转移酶(NmPRT)的序列为atggataacctattaaattatagtagtcgtgctagtgctataccatcattattatgcgatttttacaaaacatctcatcgaataatgtatcccgaatgttcacaaattatttatagtacatttacacctcgtagcaatgaacaagcgccttatttaacacaagttgtgtcatttggttttcaagcctttatcattaaatatttaattcattattttaatgataactttttttctcgagataaacatgatgttgtgactgaatactctgcatttattgagaaaaccttacagttagaggatacgggtgaacacattgcaaaattacatgagttgggttatttgcctatccggattaaagctattcctgaaggaaaaacggtggcaattaaagttccggtgatgacgattgaaaatacgcattctgatttcttttggcttactaactatttagaaacattaattaatgtatcactttggcagccgatgacttctgcctcgattgcttttgcttatcggacagcattaattaaatttgctaatgaaacttgtgataatcaagaacatgtgccatttcaatcgcatgatttttcaatgcgtggtatgagttctttagaatccgcagaaacttcaggtgctggccatttaacttcttttttaggtacagacactattcctgcactctcttttgttgaagcgtattatggttcaagcagtctaattggcacgtctatacccgcttctgagcattcagtaatgagttcacatggtgtcgatgaattatcaacatttcgttatttaatggcaaaatttccgcataatatgttgtcaattgtgtcagatactacagacttttggcataacattaccgttaatttgccgttattaaagcaagaaattatagcaaggccagaaaatgcccgtttagtcattcgtccagatagcggtaacttttttgcgattatttgtggtgatccaaccgctgatactgagcatgaacgtaaaggactcattgaatgtttatgggatatttttggtggtacagttaatcagaaaggttataaagtgatcaatccacatattggggcaatttatggtgatggcgtgacttatgaaaaaatgtttaagatcttagaaggattacaagccaaaggatttgcctcaagtaatattgtgtttggcgttggtgcacaaacctatcaacgtaatacacgtgatacgttgggctttgcgcttaaagcgacatctatcactattaatggcgaagaaaaagctattttcaaaaatcctaaaaccgatgatggttttaaaaaatcgcaaaaaggtcgtgttaaagtgctttctcgtgatacttacgttgatggtttaacttcagcggatgattttagtgatgatttattagagctgttatttgaagatggtaagttattacgccaaacagactttgatgaaattcggcaaaacttgttagttagtcgcactacgctatga；扩增引物序列为NmPRT-F:5’-3’:agtcgcatcatATGgataacctattaaattatag，划线为酶切位点NdeI；NmPRT-R:3’-5’:gcgcgataGAATTC tcatagcgtagtgcgactaactaac，划线为酶切位点EcoRI。
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)的序列为atgagagggtttataattggtaggtttcagccattccataagggacatttagaagtaataaaaaagatagctgaggaggttgatgaaataattattggaataggtagtgctcaaaaaagtcataccttagaaaatccattcacagctggtgagagaatcttaatgataacacaatcgcttaaagattatgatttaacctattatccaatccctataaaagatattgagttcaactctatctgggtttcttatgttgaatctttaacccctccatttgatattgtgtatagtggaaacccattagttagagttttgtttgaggagaggggatatgaggtaaaaaggccagagatgtttaataggaaagaatattcaggaactgaaattaggagaaggatgttaaatggagagaaatgggagcatttggttcctaaagcagttgttgatgttattaaagaaataaaaggtgttgaacggcttagaaaattagctcagacagacaaataa；扩增引物序列为NMNAT-F:5’-3’agtcgcatcatATGagagggtttataattggtag:，划线为酶切位点NdeI；NMNAT-R:3’-5’:gcgcgataGAATTCttatttgtctgtctgagctaattttc，划线为酶切位点EcoRI。
NAD激酶(ppnk)的序列为atgaccgctcatcgcagtgttctgctggtcgtccacaccgggcgcgacgaagccaccgagaccgcacggcgcgtagaaaaagtattgggcgacaataaaattgcgcttcgcgtgctctcggccgaagcagtcgaccgagggtcgttgcatctggctcccgacgacatgcgggccatgggcgtcgagatcgaggtggttgacgcggaccagcacgcagccgacggctgcgaactggtgctggttttgggcggcgatggcacctttttgcgggcagccgagctggcccgcaacgccagcattccggtgttgggcgtcaatctgggccgcatcggctttttggccgaggccgaggcggaggcaatcgacgcggtgctcgagcatgttgtcgcacaggattaccgggtggaagaccgcttgactctggatgtcgtggtgcgccagggcgggcgcatcgtcaaccggggttgggcgctcaacgaagtcagtctggaaaagggcccgaggctcggcgtgcttggggtggtcgtggaaattgacggtcggccggtgtcggcgtttggctgcgacggggtgttggtgtccacgccgaccggatcaaccgcctatgcattctcggcgggaggcccggtgctgtggcccgacctcgaagcgatcctggtggtccccaacaacgctcacgcgctgtttggccggccgatggtcaccagccccgaagccaccatcgccatcgaaatagaggccgacgggcatgacgccttggtgttctgcgacggtcgccgcgaaatgctgataccggccggcagcagactcgaggtcacccgctgtgtcacgtccgtcaaatgggcacggctggacagtgcgccattcaccgaccggctggtgcgcaagttccggttgccggtgaccggttggcgcggaaagtag；扩增引物序列为ppnk-F:5’-3’:agtcgcatcatATGaccgctcatcgcagtgttctgctggtcgtc，划线为酶切位点NdeI；ppnk-R:3’-5’:gcgcgataGAATTC ctactttccgcgccaaccggtc，划线为酶切位点EcoRI。
菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入5L发酵培养基的发酵罐中，继续培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mMIPTG 25℃诱导20小时，离心收集菌体。
收获的菌体分别经超声或高压均质破碎后，离心收集上清并用镍离子亲和柱进行纯化，获得高质量纯化的酶。
制备固定化生产用酶或细胞：将4.0克聚乙二醇溶解在45m1的水中，加入6.0克聚乙烯醇(PVA)并将温度升到90-95℃溶解。待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至25-30℃，加入重组细胞或纯化的酶，混合均匀，用一次性吸管吸取混合液，并注在平面上形成圆片状，并在30℃温浴1小时。移入0.1M硫酸钠溶液稳定2-3小时，滤干并用灭菌水洗涤两次，置于磷酸缓冲液中待用。
使用上述测定酶活性的方法，检测到1mg/ml腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(NmPRT)、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)和多聚磷酸依赖型NAD激酶(ppnk)酶液活性分别约为20U、10U、50U和550U，其中1个活性单位(U)定义为将1μm底物在1分钟内完全转化为产物所需要的酶量。
实施例2、制备NADP+
底物腺苷酸100g、六偏磷酸钠300g、ATP 80g、MgCl2·6H2O 30g，加入5L pH 7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节pH至7.0。在反应液中加入APRT、NmPRT、NMNAT和ppnk四种酶组成的酶组合物，其中酶组合物中APRT:NmPRT:NMNAT:ppnk的质量比为1:2:1:1，反应期间控制pH保持在7.0，反应温度30-35℃，振荡反应12小时后，HPLC检测反应上清液中NADP+生成量为38.5g/L，纯度80％，腺苷酸转化率为96％。
HPLC检测条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A相为25mMTris-HAC，B相为甲醇，检测波长260nm，柱温25℃，洗脱程序如表1所示。
表1洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 流速(ml/min)
0.01 100 0 0.8
4.00 96 4 0.8
7.8 82 18 1
8.5 82 18 1
9.0 100 0 1.2
12.0 100 0 Stop
过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品NADP+192g，纯度99.0％，总收率85％。
实施例3、制备NADP+
底物腺苷酸100g、六偏磷酸钠300g、ATP 80g、MgCl2·6H2O 30g，加入5L pH 7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节pH至7.0。在反应液中加入APRT、NmPRT、NMNAT和ppnk四种酶组成的酶组合物，其中酶组合物中APRT:NmPRT:NMNAT:ppnk的质量比为1:1:1:1，反应期间控制pH保持在7.0，反应温度30-35℃，振荡反应12小时后，HPLC检测反应上清液中NADP+生成量为34g/L，纯度72％，腺苷酸转化率为90％。HPLC检测条件同实施例2。
过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品NADP+170g，纯度98.5％，总收率75％。
实施例4、制备NADP+
底物腺苷酸100g、六偏磷酸钠300g、ATP 80g、MgCl2·6H2O 30g，加入5L pH 7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节pH至7.0。在反应液中加入APRT、NmPRT、NMNAT和ppnk四种酶组成的酶组合物，其中酶组合物中APRT:NmPRT:NMNAT:ppnk的质量比为1:3:1:1，反应期间控制pH保持在7.0，反应温度30-35℃，振荡反应12小时后，HPLC检测反应上清液中NADP+生成量为36/L，纯度75％，腺苷酸转化率为92％。HPLC检测条件同实施例2。
过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品NADP+180g，纯度98.5％，总收率80％。
实施例5、制备NADP+
底物腺苷酸100g、六偏磷酸钠300g、ATP 80g、MgCl2·6H2O 30g，加入5L pH 7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节pH至7.0。在反应液中加入APRT、NmPRT、NMNAT和ppnk四种酶组成的酶组合物，其中酶组合物中APRT:NmPRT:NMNAT:ppnk的质量比为1:2:2:1，反应期间控制pH保持在7.0，反应温度30-35℃，振荡反应12小时后，HPLC检测反应上清液中NADP+生成量为37g/L，纯度76％，腺苷酸转化率为92％。HPLC检测条件同实施例2。
过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品NADP+185g，纯度98.5％，总收率82％。
实施例6、固定化酶或固定化细胞活性检测
NADP+的四种生产用酶的固定化酶或固定化细胞可以循环使用，按照现有技术记载的公知的测定酶活性的方法对NADP+的四种生产用固定化酶按1:1:1的质量比混合循环反应20次进行跟踪检测，结果如表2。
表2固定化酶循环反应或4℃储存的酶活性变化
固定化酶使用次数/4℃存储时间 酶活性U/mg
固定化酶酶活 10
固定化酶使用5次 9.6
固定化酶使用10次 9.0
固定化酶使用15次 8.4
固定化酶使用20次 7.5
未使用存储15天 9
未使用存储30天 7.8
结果显示NADP+的四种生产用固定化酶随着循环次数的增加，酶活性逐渐降低。循环反应20次，酶活性仅降低约25％。NADP+的四种生产用固定化酶在4℃储存时间一月以上的酶活性也仅降低约20-25％。按1:2:1:1、1:3:1:1、1:2:2:1的质量比混合后循环反应20次酶活性也仅降低20-25％。
此外，NADP+的四种生产用酶的固定化细胞的活性随着循环次数的增加或4℃储存时间的延长也仅降低20-25％。
序列表
<110> 杭州唯泰生物药业有限公司，马鞍山唯泰生物技术有限公司
<120> 一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法
<130> MP1918558
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 552
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atgaccgcga ctgcacagca gcttgagtat ctcaaaaata gcatcaaaag cattcaggac 60
tacccaaaac ccggcattct tttccgcgat gtcaccagct tactggaaga cccgaaagct 120
tacgctctca gcatcgactt gctggttgag cgttacaaaa atgcgggcat taccaaagtt 180
gtcggcaccg aagcgcgtgg cttcttgttt ggcgctccgg tagctctggg tctgggcgtt 240
ggctttgtac cggtccgtaa accgggcaaa ctgccgcgtg aaaccatcag tgaaacttac 300
gacctggaat acggcaccga tcagctggag atccacgttg atgccatcaa accgggcgac 360
aaagttctgg tggtggacga cctgctggca accggcggca ctatcgaagc gaccgttaaa 420
ctgatccgtc gtctgggtgg tgaagtggct gacgctgcgt tcattatcaa cctgttcgat 480
ctcggcggcg aacagcgtct cgaaaaacag ggcattacca gctacagcct tgtcccgttc 540
ccgggccatt aa 552
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
agtcgcatca tatgaccgcg actgcacag 29
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
gcgcgataga attcttaatg gcccgggaac ggg 33
<210> 4
<211> 1488
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
atggataacc tattaaatta tagtagtcgt gctagtgcta taccatcatt attatgcgat 60
ttttacaaaa catctcatcg aataatgtat cccgaatgtt cacaaattat ttatagtaca 120
tttacacctc gtagcaatga acaagcgcct tatttaacac aagttgtgtc atttggtttt 180
caagccttta tcattaaata tttaattcat tattttaatg ataacttttt ttctcgagat 240
aaacatgatg ttgtgactga atactctgca tttattgaga aaaccttaca gttagaggat 300
acgggtgaac acattgcaaa attacatgag ttgggttatt tgcctatccg gattaaagct 360
attcctgaag gaaaaacggt ggcaattaaa gttccggtga tgacgattga aaatacgcat 420
tctgatttct tttggcttac taactattta gaaacattaa ttaatgtatc actttggcag 480
ccgatgactt ctgcctcgat tgcttttgct tatcggacag cattaattaa atttgctaat 540
gaaacttgtg ataatcaaga acatgtgcca tttcaatcgc atgatttttc aatgcgtggt 600
atgagttctt tagaatccgc agaaacttca ggtgctggcc atttaacttc ttttttaggt 660
acagacacta ttcctgcact ctcttttgtt gaagcgtatt atggttcaag cagtctaatt 720
ggcacgtcta tacccgcttc tgagcattca gtaatgagtt cacatggtgt cgatgaatta 780
tcaacatttc gttatttaat ggcaaaattt ccgcataata tgttgtcaat tgtgtcagat 840
actacagact tttggcataa cattaccgtt aatttgccgt tattaaagca agaaattata 900
gcaaggccag aaaatgcccg tttagtcatt cgtccagata gcggtaactt ttttgcgatt 960
atttgtggtg atccaaccgc tgatactgag catgaacgta aaggactcat tgaatgttta 1020
tgggatattt ttggtggtac agttaatcag aaaggttata aagtgatcaa tccacatatt 1080
ggggcaattt atggtgatgg cgtgacttat gaaaaaatgt ttaagatctt agaaggatta 1140
caagccaaag gatttgcctc aagtaatatt gtgtttggcg ttggtgcaca aacctatcaa 1200
cgtaatacac gtgatacgtt gggctttgcg cttaaagcga catctatcac tattaatggc 1260
gaagaaaaag ctattttcaa aaatcctaaa accgatgatg gttttaaaaa atcgcaaaaa 1320
ggtcgtgtta aagtgctttc tcgtgatact tacgttgatg gtttaacttc agcggatgat 1380
tttagtgatg atttattaga gctgttattt gaagatggta agttattacg ccaaacagac 1440
tttgatgaaa ttcggcaaaa cttgttagtt agtcgcacta cgctatga 1488
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
agtcgcatca tatggataac ctattaaatt atag 34
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
gcgcgataga attctcatag cgtagtgcga ctaactaac 39
<210> 7
<211> 507
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
atgagagggt ttataattgg taggtttcag ccattccata agggacattt agaagtaata 60
aaaaagatag ctgaggaggt tgatgaaata attattggaa taggtagtgc tcaaaaaagt 120
cataccttag aaaatccatt cacagctggt gagagaatct taatgataac acaatcgctt 180
aaagattatg atttaaccta ttatccaatc cctataaaag atattgagtt caactctatc 240
tgggtttctt atgttgaatc tttaacccct ccatttgata ttgtgtatag tggaaaccca 300
ttagttagag ttttgtttga ggagagggga tatgaggtaa aaaggccaga gatgtttaat 360
aggaaagaat attcaggaac tgaaattagg agaaggatgt taaatggaga gaaatgggag 420
catttggttc ctaaagcagt tgttgatgtt attaaagaaa taaaaggtgt tgaacggctt 480
agaaaattag ctcagacaga caaataa 507
<210> 8
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
agtcgcatca tatgagaggg tttataattg gtag 34
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
gcgcgataga attcttattt gtctgtctga gctaattttc 40
<210> 10
<211> 924
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
atgaccgctc atcgcagtgt tctgctggtc gtccacaccg ggcgcgacga agccaccgag 60
accgcacggc gcgtagaaaa agtattgggc gacaataaaa ttgcgcttcg cgtgctctcg 120
gccgaagcag tcgaccgagg gtcgttgcat ctggctcccg acgacatgcg ggccatgggc 180
gtcgagatcg aggtggttga cgcggaccag cacgcagccg acggctgcga actggtgctg 240
gttttgggcg gcgatggcac ctttttgcgg gcagccgagc tggcccgcaa cgccagcatt 300
ccggtgttgg gcgtcaatct gggccgcatc ggctttttgg ccgaggccga ggcggaggca 360
atcgacgcgg tgctcgagca tgttgtcgca caggattacc gggtggaaga ccgcttgact 420
ctggatgtcg tggtgcgcca gggcgggcgc atcgtcaacc ggggttgggc gctcaacgaa 480
gtcagtctgg aaaagggccc gaggctcggc gtgcttgggg tggtcgtgga aattgacggt 540
cggccggtgt cggcgtttgg ctgcgacggg gtgttggtgt ccacgccgac cggatcaacc 600
gcctatgcat tctcggcggg aggcccggtg ctgtggcccg acctcgaagc gatcctggtg 660
gtccccaaca acgctcacgc gctgtttggc cggccgatgg tcaccagccc cgaagccacc 720
atcgccatcg aaatagaggc cgacgggcat gacgccttgg tgttctgcga cggtcgccgc 780
gaaatgctga taccggccgg cagcagactc gaggtcaccc gctgtgtcac gtccgtcaaa 840
tgggcacggc tggacagtgc gccattcacc gaccggctgg tgcgcaagtt ccggttgccg 900
gtgaccggtt ggcgcggaaa gtag 924
<210> 11
<211> 44
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agtcgcatca tatgaccgct catcgcagtg ttctgctggt cgtc 44
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
gcgcgataga attcctactt tccgcgccaa ccggtc 36

Claims (3)

1.一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法，在pH 7.0磷酸缓冲溶液中加入腺苷酸、六偏磷酸钠、ATP、MgCl2·6H2O混匀，加入酶组合物，催化制得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；
所述酶组合物，由腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶组成；所述腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和多聚磷酸依赖型NAD激酶的质量比为1:（1-3）:（1-2）:1；
其制备方法包括：
根据4种酶基因的序列，设计4对扩增引物；提取大肠杆菌(Escherichia coli)菌株基因组DNA，以其为模板，PCR扩增APRT片段，并将其连接至pET28a载体；提取杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi) 基因组DNA，以其为模板，PCR扩增NmPRT基因片段，并将其连接至pET 28a载体；提取詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii) 菌株基因组DNA，以其为模板，PCR扩增NMNAT基因片段，并将其连接至pET28a载体；提取结合分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis) 菌株基因组DNA，以其为模板，PCR扩增ppnk基因片段，并将其连接至pET28a载体；4种基因片段连接成功经测序正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株；
其中，腺嘌呤磷酸核糖转移酶的序列如SEQ ID No.1所示扩增引物序列为APRT-F:5’-3’，如SEQ ID No.2所示：agtcgcatcatATGACCGCGACTGCACAG，划线为酶切位点NdeI；APRT-R:3’-5’如SEQ ID No.3所示：gcgcgataGAATTC TTAATGGCCCGGGAACGGG，划线为酶切位点EcoRI；
烟酰胺磷酸核糖转移酶的序列如SEQ ID No.4所示扩增引物序列为NmPRT-F:5’-3’，如SEQ ID No.5所示：agtcgcatcatATGgataacctattaaattatag，划线为酶切位点NdeI; NmPRT-R:3’-5’，如SEQ ID No.6所示：gcgcgataGAATTCtcatagcgtagtgcgactaactaac，划线为酶切位点EcoRI；
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的序列如SEQ ID No.7所示扩增引物序列为NMNAT-F:5’-3’，如SEQ ID No.8所示：agtcgcatcatATGagagggtttataattggtag:，划线为酶切位点NdeI;NMNAT-R:3’-5’，如SEQ ID No.9所示：gcgcgataGAATTCttatttgtctgtctgagctaattttc，划线为酶切位点EcoRI；
NAD激酶的序列如SEQ ID No.10所示；扩增引物序列为ppnk -F:5’-3’，如SEQ IDNo.11所示：agtcgcatcatATGaccgctcatcgcagtgttctgctggtcgtc，划线为酶切位点NdeI;ppnk-R:3’-5’如SEQ ID No.12所示：gcgcgataGAATTCctactttccgcgccaaccggtc，划线为酶切位点EcoRI；
重组菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入5L发酵培养基的发酵罐中，继续培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mMIPTG 25℃诱导20小时，离心收集菌体；
收获的菌体分别经超声或高压均质破碎后，离心收集上清并用镍离子亲和柱进行纯化，获得高质量纯化的酶。
2.根据权利要求1所述的方法，所述腺苷酸的终浓度为18g/l~22g/l，六偏磷酸钠的终浓度为56g/l~64g/l，ATP 的终浓度为15g/l~17g/l，MgCl2·6H2O 的终浓度为5.5g/l~6.5g/l。
3.根据权利要求2所述的方法，所述催化反应条件为在pH 7.0、反应
温度30-35℃条件下反应9~15小时。
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