CN112961890B - 烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法 - Google Patents

烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112961890B
CN112961890B CN202110160981.6A CN202110160981A CN112961890B CN 112961890 B CN112961890 B CN 112961890B CN 202110160981 A CN202110160981 A CN 202110160981A CN 112961890 B CN112961890 B CN 112961890B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nicotinamide
cytidine
phosphoribosyl
acid
pyrophosphorylase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110160981.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112961890A (zh
Inventor
李钊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Xijiya Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Xijiya Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Xijiya Biotechnology Co ltd filed Critical Shenzhen Xijiya Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110160981.6A priority Critical patent/CN112961890B/zh
Publication of CN112961890A publication Critical patent/CN112961890A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112961890B publication Critical patent/CN112961890B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/305—Pyrimidine nucleotides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法。该酶促合成方法包括以下步骤：S1：以核糖‑5‑磷酸、胞苷酸、多聚磷酸盐、烟酰胺为原料，在磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化作用下，生成烟酰胺单核苷酸。申请人以多聚磷酸激酶催化胞苷酸利用多聚磷酸盐所提供的磷酸基团来循环得到胞苷三磷酸，并作为磷酸核糖焦磷酸化酶的焦磷酸供体，推动核糖‑5磷酸和烟酰胺的酶促反应的进行，从而避免了使用价格昂贵的ATP。此外，本申请所提供的酶促反应过程中的胞苷酸和胞苷三磷酸在酸性条件下几乎不溶于水，因此，反应结束后可以直接通过调节pH的方法快速简便地去除产物中的杂质，简化了纯化过程，降低了分离纯化的难度。

Description

烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法
技术领域
本申请涉及生物化工技术领域，尤其是涉及烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)是烟酰胺核糖激酶与烟酰胺核糖等反应的产物，同时是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide，NAD+)的关键前体之一。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。然而，NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，仅仅依赖于体内细胞的微量合成很难满足特定目标人群的需求。但随着对NMN的进一步研究发现，食用NMN可以有效提升体内NAD+的含量，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。
随着对NMN的药用和保健作用研究的增加，对NMN的市场需求日益增长。目前，NMN的体外制备方法，以化学合成为主，例如，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在三甲硅基三氟甲磺酸脂(TMSOTf)的催化下发生缩合反应；而Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应；这些化学合成方法制备得到的产品中杂质过多，分离纯化极其困难，存在成本高、收率低而且化学试剂污染严重等问题。因此，生物酶法制备NMN已经成为各大医药公司竞争的研究热点。酶法生产NMN是一种绿色环保的生物催化方法，现有报道的酶法生产NMN的工艺中大多使用ATP作为反应原料，然而，一方面，ATP的价格昂贵导致原料成本过高，不利于酶法生产NMN的工业化；另一方面，酶促反应结束后，产物与原料的分离难度较高。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种分离纯化难度较低、成本低廉的烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法。
本申请的第一方面，提供烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法，该酶促合成方法包括以下步骤：
S1：以核糖-5-磷酸、胞苷酸、多聚磷酸盐、烟酰胺为原料，在磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化作用下，生成烟酰胺单核苷酸。
根据本申请实施例的酶促合成方法，至少具有如下有益效果：
申请人以多聚磷酸激酶催化胞苷酸利用多聚磷酸盐所提供的磷酸基团来循环得到胞苷三磷酸，并作为磷酸核糖焦磷酸化酶的焦磷酸供体，推动核糖-5磷酸和烟酰胺的酶促反应的进行，从而避免了使用价格昂贵的ATP。此外，相比于AMP和ATP，本申请所提供的酶促反应过程中的胞苷酸和胞苷三磷酸在酸性条件下几乎不溶于水，因此，可以在反应结束后直接通过调节pH的方法快速简便地去除产物中的杂质，简化了纯化过程，降低了分离纯化的难度。
其中，多聚磷酸盐是指由三个以上磷酸基团组成的无机盐或其混合物，其中至少部分或全部磷酸基团之间以磷酸酐键相连，多聚磷酸盐的非限制性实例包括低聚磷酸盐(如三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、六偏磷酸盐)等，具体可以是多聚磷酸的碱金属盐，如钠盐、钾盐等。
磷酸核糖焦磷酸化酶(rpPk)是指能够在磷酸供体存在的条件下，使核糖-5-磷酸焦磷酸化、得到核糖-5-磷酸-1-焦磷酸(PRPP)的酶。本申请所提供的酶促合成反应中使用的rpPK可以是本领域所知晓的任一种野生型rpPK，或者对野生型PPK进行突变获得的酶活不发生下调的突变型rpPK。
多聚磷酸激酶(Polyphospate Kinase，PPK)是指能够催化胞苷酸的磷酸化，进而得到胞苷三磷酸的酶。具体而言，在本方案中，多聚磷酸激酶利用多聚磷酸盐(如三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、六偏磷酸盐)完成胞苷酸到胞苷酸磷酸的循环。多聚磷酸激酶在细菌等微生物中广泛存在，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、福氏志贺菌(Shigellaflexneri)、大肠杆菌(Escherichia coli)、红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)等。因此，本申请所提供的酶促合成反应中使用的PPK可以是本领域所知晓的任一种野生型PPK，或者对野生型PPK进行突变获得的酶活不发生下调的突变型PPK。
烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide Phosphoribosyltransferase，NAMPT)是指能够催化烟酰胺与核糖-5-磷酸-1焦磷酸缩合产生烟酰胺单核苷酸的酶。烟酰胺磷酸核糖转移酶在动物和细菌等多种生物体内均有发现，包括人(Homo sapiens)、小鼠(Musmusculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)、杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)等。因此，本申请所提供的酶促合成方法中使用的NAMPT可以是本领域所知晓的任一种野生型NAMPT。另外，野生型NAMPT的酶活普遍较低，因此，本申请中的NAMPT同样可以是对野生型NAMPT的一个或多个位点进行突变后所获得的酶活提高的突变型NAMPT。
因此，在本申请的酶促合成过程中，磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶等酶可以是从细胞纯化得到、或通过重组手段由重组工程菌表达得到，以粗酶液或干粉的形式参与酶促反应。另外，也可以进一步通过物理或化学方法固定到固相载体(如包埋柱、微珠等)上参与酶促反应。
在本申请的一些实施方式中，磷酸核糖焦磷酸化酶来源于火球菌(Pyrococcushorikoshii)。
在本申请的一些实施方式中，磷酸核糖焦磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本申请的一些实施方式中，多聚磷酸激酶来源于红色亚栖热菌(Meiothermusruber)。
在本申请的一些实施方式中，多聚磷酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
在本申请的一些实施方式中，烟酰胺磷酸核糖转移酶来源于杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)。在不同来源的野生型的NAMPT中，来源于H.ducreyi的NAMPT具有较高的酶活，因此，为提高NMN的产率，优选使用来源于H.ducreyi的NAMPT。
在本申请的一些实施方式中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。
在本申请的一些实施方式中，磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活力比例为(2-3)：(2-3)：1。
在本申请的一些实施方式中，S1前还包括S0：以胞苷酸为原料，在胞苷酸水解酶催化作用下，生成核糖-5-磷酸。为进一步降低原料成本，核糖-5-磷酸进一步由成本较低的胞苷酸通过水解得到。
其中，胞苷酸水解酶(phNn)是指能够将胞苷酸水解生成核糖-5-磷酸和胞嘧啶的酶。本申请所提供的酶促合成反应中使用的phNn可以是本领域所知晓的任一种野生型phNn，或者对野生型phNn进行突变获得的酶活不发生下调的突变型phNn。
在本申请的一些实施方式中，胞苷酸水解酶来源于宋内志贺菌(Shigellasonnei)。
在本申请的一些实施方式中，胞苷酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
在本申请的一些实施方式中，胞苷酸水解酶、磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活力比例为1：(2-3)：(2-3)：1。
在本申请的一些实施方式中，胞苷酸水解酶、磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活力比例为1：2：2：1。
在本申请的一些实施方式中，S0中，胞苷酸的浓度为100～150mM，胞苷酸水解酶的添加量为400～600U/L。
在本申请的一些实施方式中，S0中，胞苷酸的浓度为100mM，胞苷酸水解酶的添加量为500U/L。
在本申请的一些实施方式中，S1中，烟酰胺的浓度为100～150mM，多聚磷酸盐的浓度为60～80mM，胞苷酸的浓度为2～6mM，磷酸核糖焦磷酸化酶的添加量为1000～1500U/L，多聚磷酸激酶的添加量为1000～1500U/L，烟酰胺磷酸核糖转移酶的添加量为400～600U/L。
在本申请的一些实施方式中，S1中，烟酰胺的浓度为100mM，多聚磷酸盐的浓度为60mM，胞苷酸的浓度为2mM，磷酸核糖焦磷酸化酶的添加量为1000～1500U/L，多聚磷酸激酶的添加量为1000～1500U/L，烟酰胺磷酸核糖转移酶的添加量为500U/L。
其中，酶活的单位U为将1微摩尔底物在1分钟内完全转化为产物所需要的酶量。
在本申请的一些实施方式中，S1中还添加有Mg2+。
在本申请的一些实施方式中，S1中，Mg2+的浓度为50～100mM。
在本申请的一些实施方式中，S1中，Mg2+的浓度为50mM。
在本申请的一些实施方式中，S1的反应温度为35～37℃，反应pH为7.2～7.8，反应时间为8～12h。
在本申请的一些实施方式中，S1的反应温度为35℃，反应pH为7.5，反应时间为8h。
在本申请的一些实施方式中，还包括以下步骤：酶促反应结束后，调节pH至7以下，除去沉淀。由于胞苷酸和胞苷三磷酸在酸性条件下几乎不溶于水，酶促反应结束后可以直接通过调节pH的方法快速简便地去除产物中的杂质，简化了纯化过程，降低了分离纯化的难度。
在本申请的一些实施方式中，调节pH至2以下。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本申请中的具体含义。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
下述实施例中部分生物试剂来源如下：
宋内志贺菌(S.sonnei)、火球菌(P.horikoshii)、杜克雷氏嗜血杆菌(H.ducreyi)、红色亚栖热菌(M.ruber)，购于中国科学院微生物研究所。
pET24a载体，购于Novagene公司。
大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，购于南京金斯瑞生物科技有限公司。
实施例1
酶的制备
根据下述胞苷酸水解酶(phNn)、磷酸核糖焦磷酸化酶(rpPk)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)和多聚磷酸激酶(PPK)共4种酶基因的序列，采用本领域熟知的设计方法通过引物设计软件分别设计其扩增引物对。
提取宋内志贺菌(S.sonnei)基因组DNA，以其为模板，利用phNn扩增引物对扩增出宋内志贺菌的胞苷酸水解酶片段，并将其连接至pET24a载体；
提取火球菌(P.horikoshii)基因组DNA，以其为模板，利用rpPk扩增引物对扩增出火球菌的磷酸核糖焦磷酸化酶片段，并将其连接至pET24a载体；
提取杜克雷氏嗜血杆菌(H.ducreyi)基因组DNA，以其为模板，利用NAMPT扩增引物对扩增出杜克雷氏嗜血杆菌的烟酰胺磷酸核糖转移酶基因片段，并将其连接至pET24a载体；
提取红色亚栖热菌(M.ruber)基因组DNA，以其为模板，利用PPK扩增引物对扩增出红色亚栖热菌的聚磷酸激酶基因片段，并将其连接至pET24a载体。
4种基因片段连接成功经测序正确后，分别转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
其中，胞苷酸水解酶(phNn)的序列为：
TTGATTACACATATTAGCCCGCTTGGCTCCATGGATATGTTGTCGCAGCTGGAAGTGGATATGCTTAAACGCACCGCCAGCAGCGACCTCTATCAACTGTTTCGCAACTGTTCACTTGCCGTACTGAACTCCGGTAGTTTGACCGATAACAGCAAAGAATTGCTGTCTCGTTTTGAAAATTTCGATATTAACGTCCTGCGCCGTGAACGCGGCGTAAAGCTGGAACTGATTAATCCCCCGGAAGAGGCTTTTGTCGATGGGCGAATTATTCGCGCTTTGCAGGCCAACTTGTTCGCGGTTCTGCGAGACATTCTCTTCGTTTACGGGCAAATCCATAATACCGTTCGTTTTCCCAACCTGAATCTCGACAACTCCGTCCACATCACTAACCTGGTCTTTTCCATCTTGCGTAACGCTCGCGCGCTGCATGTGGGTGAAGCGCCAAATATGGTGGTCTGCTGGGGCGGTCACTCAATTAACGAAAATGAGTATTTGTATGCCCGTCGCGTCGGAAACCAGCTGGGCCTGCGTGAGCTGAATATCTGCACCGGCTGTGGTCCGGGAGCGATGGAAGCGCCGATGAAAGGTGCTGCGGTCGGACACGCGCAGCAGCGTTACAAAGACAGTCGTTTTATTGGTATGACAGAGCCGTCGATTATCGCCGCTGAACCGCCTAACCCGCTGGTCAACGAATTGATCATCATGCCGGATATCGAAAAACGTCTGGAAGCGTTTGTCCGTATCGCTCACGGCATCATTATCTTCCCTGGCGGTGTGGGTACGGCAGAAGAGTTGCTGTATTTGCTGGGAATTTTAATGAATCCGGCCAACAAAGATCAGGTTTTACCATTGATCCTCACCGGCCCGAAAGAGAGCGCCGACTACTTCCGCGTACTGGACGAGTTTGTCGTACATACGCTGGGTGAAAACGCGCGCCGCCATTACCGCATCATCATTGATGACGCCGCTGAAGTCGCTCGTCAGATGAAAAAATCGATGCCGCTGGTGAAAGAAAATCGCCGTGATACAGGCGATGCCTACAGCTTTAACTGGTCAATGCGCATTGCGCCAGATTTGCAAATGCCGTTTGAGCCGTCTCACGAGAATATGGCTAATCTGAAGCTTTACCCGGATCAACCTGTTGAAGTGCTGGCTGCCGACCTGCGCCGTGCGTTCTCCGGTATTGTGGCGGGTAACGTAAAAGAAGTCGGTATTCGCGCCATTGAAGAGTTTGGTCCTTACAAAATCAACGGCGATAAAGAGATTATGCGTCGTATGGACGACCTGCTACAGGGTTTTGTTGCCCAGCATCGTATGAAGTTGCCAGGCTCAGCCTACATCCCTTGCTACGAAATCTGCACGTAA(SEQ ID No.1)。
磷酸核糖焦磷酸化酶(rpPk)的序列为：
GTGAATAAGGTGTTTGTAATTGGTAGTGGAGCGAAACACCTTGAGGAGGAGATTTCAAAGAATGCCAAGATCCTCAAAACGGAGATTAAAAAATTTCCTGATGGTGAAAAATACGTGAGAATCCTGGAGCATGGAGAGGAAGTGATAGTAGTCCAATCGACGTACAGGCCCCAGGATGAGCATCTAATTGAAACGATAATTATAGGGGATGCATTGAAAGAAGCTGGATTCGAAAAACTTAAGCTGGTAGTTCCTTACTTGGCATATTCAAGACAGGATAGAGTCACAAAAGAGGGAGAACCCATTAGTGTGAGAGCGATAATGAAAATGCTCGGCTTATATTATGATGAACTATACGTCTTCGACATACATAATCCAAAGACATTAGATTTCTTTCCTGGTAAGGCCGTAAACATATACCCAGCTAAAGTGATAGCGGAATACTTTAGGGATAAGCTCGAGAATGGGCTAGTGTTAGCTCCAGATAGAGGGGCCCTAGAAAGAGCGAAGGAAGTTGCAAATATACTCGGACTGGAGTACAGTCACTTTGAAAAAGAAAGGATATCACCAACGGAAGTCAAGATGACGCCCGTAGACGTCAATGTAAAAGGAAGGAACGTGCTAATAGTCGACGATATAATAAGTACTGGAGGGACTATGATAAGGGCTGCAGAGATCCTAAAAGATCTCGGAGCTGAAAAAGTTTTCGTAGTAGCCACACATGGCGTTTTTGCCGAAGGGGCCATAGAGAGAGTCAGCAAAGCTGTAGATGAGCTAGCAGTTACAAACACGATACCGACTAAGGTATCAAAGATAAGCATAGTTCCCGAAATAATGAGATCTATCTTGGAGGTAAAGTCATGA(SEQ ID No.2)。
多聚磷酸激酶(PPK)的序列为：
ATGGGGTTCTGCAGCATAGAATTCCTGATGGGAGCCCAGATGAAAAAATACCGCGTTCAACCGGATGGTCGCTTTGAACTAAAGCGCTTCGATCCCGACGACACCAGCGCCTTTGAGGGGGGCAAGCAAGCGGCCCTGGAAGCCCTGGCTGTGCTCAACAGGCGTTTGGAGAAGCTGCAAGAGCTGCTGTATGCGGAAGGCCAGCACAAGGTACTGGTGGTGTTGCAGGCCATGGATGCGGGCGGCAAGGATGGCACCATCCGGGTGGTTTTCGACGGGGTAAACCCCAGCGGGGTGCGCGTGGCCAGTTTTGGTGTGCCCACCGAGCAGGAGCTGGCCCGCGACTACCTCTGGCGGGTGCACCAGCAGGTGCCCCGCAAGGGTGAGCTGGTGATTTTCAACCGCTCCCACTACGAGGACGTGCTGGTGGTGCGGGTTAAAAACCTGGTGCCCCAACAGGTTTGGCAGAAGCGCTACCGCCACATCCGCGAGTTCGAGCGCATGCTGGCCGATGAGGGAACCACCATCCTCAAATTCTTCCTGCATATCTCCAAAGACGAGCAGCGCCAGCGGTTGCAGGAGCGCTTAGATAACCCCGAGAAGCGCTGGAAATTTCGTATGGGCGACCTCGAGGATCGCCGGCTTTGGGACAGGTATCAAGAGGCCTATGAAGCAGCCATCCGCGAGACCAGCACCGAGTATGCCCCCTGGTATGTCATTCCGGCCAACAAGAACTGGTACCGCAACTGGCTGGTGAGCCACATCCTGGTAGAAACCCTGGAGGGCTTGGCGATGCAGTACCCCCAGCCCGAAACAGCCTCGGAGAAGATTGTGATCGAGTAG(SEQ ID No.3)。
烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)的序列为：
ATGGATAACCTATTAAATTATAGTAGTCGTGCTAGTGCTATACCATCATTATTATGCGATTTTTACAAAACATCTCATCGAATAATGTATCCCGAATGTTCACAAATTATTTATAGTACATTTACACCTCGTAGCAATGAACAAGCGCCTTATTTAACACAAGTTGTGTCATTTGGTTTTCAAGCCTTTATCATTAAATATTTAATTCATTATTTTAATGATAACTTTTTTTCTCGAGATAAACATGATGTTGTGACTGAATACTCTGCATTTATTGAGAAAACCTTACAGTTAGAGGATACGGGTGAACACATTGCAAAATTACATGAGTTGGGTTATTTGCCTATCCGGATTAAAGCTATTCCTGAAGGAAAAACGGTGGCAATTAAAGTTCCGGTGATGACGATTGAAAATACGCATTCTGATTTCTTTTGGCTTACTAACTATTTAGAAACATTAATTAATGTATCACTTTGGCAGCCGATGACTTCTGCCTCGATTGCTTTTGCTTATCGGACAGCATTAATTAAATTTGCTAATGAAACTTGTGATAATCAAGAACATGTGCCATTTCAATCGCATGATTTTTCAATGCGTGGTATGAGTTCTTTAGAATCCGCAGAAACTTCAGGTGCTGGCCATTTAACTTCTTTTTTAGGTACAGACACTATTCCTGCACTCTCTTTTGTTGAAGCGTATTATGGTTCAAGCAGTCTAATTGGCACGTCTATACCCGCTTCTGAGCATTCAGTAATGAGTTCACATGGTGTCGATGAATTATCAACATTTCGTTATTTAATGGCAAAATTTCCGCATAATATGTTGTCAATTGTGTCAGATACTACAGACTTTTGGCATAACATTACCGTTAATTTGCCGTTATTAAAGCAAGAAATTATAGCAAGGCCAGAAAATGCCCGTTTAGTCATTCGTCCAGATAGCGGTAACTTTTTTGCGATTATTTGTGGTGATCCAACCGCTGATACTGAGCATGAACGTAAAGGACTCATTGAATGTTTATGGGATATTTTTGGTGGTACAGTTAATCAGAAAGGTTATAAAGTGATCAATCCACATATTGGGGCAATTTATGGTGATGGCGTGACTTATGAAAAAATGTTTAAGATCTTAGAAGGATTACAAGCCAAAGGATTTGCCTCAAGTAATATTGTGTTTGGCGTTGGTGCACAAACCTATCAACGTAATACACGTGATACGTTGGGCTTTGCGCTTAAAGCGACATCTATCACTATTAATGGCGAAGAAAAAGCTATTTTCAAAAATCCTAAAACCGATGATGGTTTTAAAAAATCGCAAAAAGGTCGTGTTAAAGTGCTTTCTCGTGATACTTACGTTGATGGTTTAACTTCAGCGGATGATTTTAGTGATGATTTATTAGAGCTGTTATTTGAAGATGGTAAGTTATTACGCCAAACAGACTTTGATGAAATTCGGCAAAACTTGTTAGTTAGTCGCACTACGCTATGA(SEQ ID No.4)。
菌株在超净台接入种子培养基，培养至对数生长期后接入5L发酵培养基的发酵罐中，继续培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入5mMIPTG 20℃诱导20小时，离心收集菌体。收获的菌体加入5倍超纯水经超声或高压均质破碎后，离心收集上清，获得粗酶液。
采用下述方法对制备得到的各个粗酶液进行酶活检测：
胞苷酸水解酶酶活测定方法：反应体系如下：10mL水溶液含有100mM胞苷酸，加入1ml胞苷酸水解酶，37℃反应15分钟。采用HPLC检测胞苷酸的含量，具体为C18 HPLC色谱柱，250mm×4.6mm；流动相：含有4％甲醇的pH6.0 100mM磷酸缓冲液；紫外检测器，波长254nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量5μL。胞苷酸水解酶酶活定义：37℃下，1分钟内将1微摩尔胞苷酸完全转化为产物所需的酶量为1个活性单位(U)。
磷酸核糖焦磷酸化酶酶活测定方法：反应体系如下：10mL水溶液含有50mM核糖-5-磷酸、100mM胞苷三磷酸和50mM氯化镁，加入1ml磷酸核糖焦磷酸化酶，37℃反应15分钟。采用HPLC检测胞苷三磷酸的含量，具体为C18 HPLC色谱柱，250mm×4.6mm；流动相：含有4％甲醇的pH6.0 100mM磷酸缓冲液；紫外检测器，波长254nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量5μL。磷酸核糖焦磷酸化酶酶活定义：37℃下，1分钟内将1微摩尔胞苷三磷酸完全转化为产物所需的酶量为1个活性单位(U)。
烟酰胺磷酸核糖转移酶酶活测定方法：反应体系如下：10mL水溶液含有100mMPRPP、100mM烟酰胺和50mM氯化镁，加入1ml烟酰胺磷酸核糖转移酶，37℃反应15分钟。采用HPLC检测NMN的含量，具体为C18 HPLC色谱柱，250mm×4.6mm；流动相：含有4％甲醇的pH6.0100mM磷酸缓冲液；紫外检测器，波长254nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量5μL。烟酰胺磷酸核糖转移酶酶活定义：37℃下，1分钟内生成1微摩尔NMN所需的酶量为1个活性单位(U)。
多聚磷酸激酶酶活定义：反应体系如下：10mL水溶液含有100mM胞苷酸、50mM六偏磷酸钠和50mM氯化镁，加入1ml多聚磷酸激酶，37℃反应15分钟。采用HPLC检测胞苷三磷酸的含量，具体为C18 HPLC色谱柱，250mm×4.6mm；流动相：含有4％甲醇的pH6.0100mM磷酸缓冲液；紫外检测器，波长254nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量5μL。聚磷酸激酶酶活定义：37℃下，1分钟内生成1微摩尔胞苷三磷酸所需的酶量为1个活性单位(U)。
使用上述酶活检测方法测得，phNn活性为51U/ml，rpPk活性为75U/ml，NAMPT活性为26U/ml，PPK活性为43U/ml。
实施例2
本实施例提供一种烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法，该酶促合成方法的反应过程中具体发生的反应如下所示：
Figure BDA0002936617290000101
该酶促合成方法包括以下步骤：
S0：在1L纯水中加入终浓度为100mM的胞苷酸，用40％的氢氧化钠溶液调整pH为7.5，加入500U的胞苷酸水解酶，35℃搅拌反应2小时，加热至80℃，降温离心，得到核糖-5-磷酸溶液。
S1：在S0得到的核糖-5-磷酸溶液中加入终浓度为100mM的烟酰胺、50mM的MgCl2、60mM的六偏磷酸钠和4mM的胞苷酸，用40％的氢氧化钠溶液调整pH为7.5，加入1000U的磷酸核糖焦磷酸化酶、1000U的多聚磷酸激酶和500U的烟酰胺磷酸核糖转移酶，35℃搅拌反应6小时。
S3：酶促反应结束后，用10％HCl调整溶液pH至2.0，离心获得NMN溶液。
HPLC检测制得的NMN溶液中NMN的浓度为60mM。HPLC检测条件如下：C18 HPLC色谱柱，250mm×4.6mm；含有4％甲醇的pH6.0 100mM磷酸缓冲液；紫外检测器，波长254nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量5μL。
实施例3
本实施例提供一种烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法，包括以下步骤：
S0：在1L纯水中加入终浓度为100mM的胞苷酸，用40％的氢氧化钠溶液调整pH为7.5，加入500U的胞苷酸水解酶，35℃搅拌反应2小时，加热至80℃，降温离心，得到核糖-5-磷酸溶液。
S1：在S0得到的核糖-5-磷酸溶液中加入终浓度为100mM的烟酰胺、终浓度为50mM的MgCl2、终浓度为60mM的六偏磷酸钠和终浓度为4mM的胞苷酸，用40％的氢氧化钠溶液调整pH为7.5，加入1500U的磷酸核糖焦磷酸化酶、1500U的多聚磷酸激酶和500U的烟酰胺磷酸核糖转移酶，35℃搅拌反应6小时。
S3：酶促反应结束后，用10％HCl调整溶液pH至2.0，离心获得NMN溶液。
HPLC检测制得的NMN溶液中NMN浓度为65mM。
实施例4
NMN溶液除杂效率实验
在实施例3中S2制得的溶液中缓慢滴加10％HCl，将其pH调整至1.0～2.0，6000rpm离心10分钟，去除离心后的白色残渣。调节pH离心前后使用HPLC检测溶液中胞苷酸和胞苷三磷酸含量。HPLC检测条件：C18 HPLC色谱柱，250mm×4.6mm；含有4％甲醇的pH6.0100mM磷酸缓冲液；紫外检测器，波长254nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量5μL。
结果显示，调节pH离心后，溶液中的胞苷酸和胞苷三磷酸的浓度分别降为0.1mM和0.2mM，胞苷酸和胞苷三磷酸的去除率分别达97.5％和95％。
从上述实验结果可以看到，在一些实施例中，该酶促合成方法可以分为两步，第一步以胞苷酸为底物，加入胞苷酸水解酶制备中间物核糖-5-磷酸，第二步以核糖-5-磷酸为底物，添加烟酰胺、胞苷酸、六偏磷酸钠和氯化镁，并加入磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶组合物，催化生成烟酰胺单核苷酸。上述过程中，使用的原料胞苷酸售价约在150元/公斤，同时使用10元/公斤左右的六偏磷酸钠来代替售价在600～700元/公斤的ATP作为磷酸供体，从而以低成本制备烟酰胺单核苷酸，降低现有路线的成本，使其适应规模化生产，为烟酰胺单核苷酸在生物催化和药品领域的使用提供保证。另外，反应过程中的胞苷酸和胞苷三磷酸在酸性条件下的水不溶性，大大降低了分离纯化的难度。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳希吉亚生物技术有限公司
<120> 烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1365
<212> DNA
<213> 宋内志贺菌（Shigella sonnei）
<400> 1
ttgattacac atattagccc gcttggctcc atggatatgt tgtcgcagct ggaagtggat 60
atgcttaaac gcaccgccag cagcgacctc tatcaactgt ttcgcaactg ttcacttgcc 120
gtactgaact ccggtagttt gaccgataac agcaaagaat tgctgtctcg ttttgaaaat 180
ttcgatatta acgtcctgcg ccgtgaacgc ggcgtaaagc tggaactgat taatcccccg 240
gaagaggctt ttgtcgatgg gcgaattatt cgcgctttgc aggccaactt gttcgcggtt 300
ctgcgagaca ttctcttcgt ttacgggcaa atccataata ccgttcgttt tcccaacctg 360
aatctcgaca actccgtcca catcactaac ctggtctttt ccatcttgcg taacgctcgc 420
gcgctgcatg tgggtgaagc gccaaatatg gtggtctgct ggggcggtca ctcaattaac 480
gaaaatgagt atttgtatgc ccgtcgcgtc ggaaaccagc tgggcctgcg tgagctgaat 540
atctgcaccg gctgtggtcc gggagcgatg gaagcgccga tgaaaggtgc tgcggtcgga 600
cacgcgcagc agcgttacaa agacagtcgt tttattggta tgacagagcc gtcgattatc 660
gccgctgaac cgcctaaccc gctggtcaac gaattgatca tcatgccgga tatcgaaaaa 720
cgtctggaag cgtttgtccg tatcgctcac ggcatcatta tcttccctgg cggtgtgggt 780
acggcagaag agttgctgta tttgctggga attttaatga atccggccaa caaagatcag 840
gttttaccat tgatcctcac cggcccgaaa gagagcgccg actacttccg cgtactggac 900
gagtttgtcg tacatacgct gggtgaaaac gcgcgccgcc attaccgcat catcattgat 960
gacgccgctg aagtcgctcg tcagatgaaa aaatcgatgc cgctggtgaa agaaaatcgc 1020
cgtgatacag gcgatgccta cagctttaac tggtcaatgc gcattgcgcc agatttgcaa 1080
atgccgtttg agccgtctca cgagaatatg gctaatctga agctttaccc ggatcaacct 1140
gttgaagtgc tggctgccga cctgcgccgt gcgttctccg gtattgtggc gggtaacgta 1200
aaagaagtcg gtattcgcgc cattgaagag tttggtcctt acaaaatcaa cggcgataaa 1260
gagattatgc gtcgtatgga cgacctgcta cagggttttg ttgcccagca tcgtatgaag 1320
ttgccaggct cagcctacat cccttgctac gaaatctgca cgtaa 1365
<210> 2
<211> 864
<212> DNA
<213> 火球菌（Pyrococcus horikoshii）
<400> 2
gtgaataagg tgtttgtaat tggtagtgga gcgaaacacc ttgaggagga gatttcaaag 60
aatgccaaga tcctcaaaac ggagattaaa aaatttcctg atggtgaaaa atacgtgaga 120
atcctggagc atggagagga agtgatagta gtccaatcga cgtacaggcc ccaggatgag 180
catctaattg aaacgataat tataggggat gcattgaaag aagctggatt cgaaaaactt 240
aagctggtag ttccttactt ggcatattca agacaggata gagtcacaaa agagggagaa 300
cccattagtg tgagagcgat aatgaaaatg ctcggcttat attatgatga actatacgtc 360
ttcgacatac ataatccaaa gacattagat ttctttcctg gtaaggccgt aaacatatac 420
ccagctaaag tgatagcgga atactttagg gataagctcg agaatgggct agtgttagct 480
ccagatagag gggccctaga aagagcgaag gaagttgcaa atatactcgg actggagtac 540
agtcactttg aaaaagaaag gatatcacca acggaagtca agatgacgcc cgtagacgtc 600
aatgtaaaag gaaggaacgt gctaatagtc gacgatataa taagtactgg agggactatg 660
ataagggctg cagagatcct aaaagatctc ggagctgaaa aagttttcgt agtagccaca 720
catggcgttt ttgccgaagg ggccatagag agagtcagca aagctgtaga tgagctagca 780
gttacaaaca cgataccgac taaggtatca aagataagca tagttcccga aataatgaga 840
tctatcttgg aggtaaagtc atga 864
<210> 3
<211> 843
<212> DNA
<213> 红色亚栖热菌（Meiothermus ruber）
<400> 3
atggggttct gcagcataga attcctgatg ggagcccaga tgaaaaaata ccgcgttcaa 60
ccggatggtc gctttgaact aaagcgcttc gatcccgacg acaccagcgc ctttgagggg 120
ggcaagcaag cggccctgga agccctggct gtgctcaaca ggcgtttgga gaagctgcaa 180
gagctgctgt atgcggaagg ccagcacaag gtactggtgg tgttgcaggc catggatgcg 240
ggcggcaagg atggcaccat ccgggtggtt ttcgacgggg taaaccccag cggggtgcgc 300
gtggccagtt ttggtgtgcc caccgagcag gagctggccc gcgactacct ctggcgggtg 360
caccagcagg tgccccgcaa gggtgagctg gtgattttca accgctccca ctacgaggac 420
gtgctggtgg tgcgggttaa aaacctggtg ccccaacagg tttggcagaa gcgctaccgc 480
cacatccgcg agttcgagcg catgctggcc gatgagggaa ccaccatcct caaattcttc 540
ctgcatatct ccaaagacga gcagcgccag cggttgcagg agcgcttaga taaccccgag 600
aagcgctgga aatttcgtat gggcgacctc gaggatcgcc ggctttggga caggtatcaa 660
gaggcctatg aagcagccat ccgcgagacc agcaccgagt atgccccctg gtatgtcatt 720
ccggccaaca agaactggta ccgcaactgg ctggtgagcc acatcctggt agaaaccctg 780
gagggcttgg cgatgcagta cccccagccc gaaacagcct cggagaagat tgtgatcgag 840
tag 843
<210> 4
<211> 1488
<212> DNA
<213> 杜克雷氏嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）
<400> 4
atggataacc tattaaatta tagtagtcgt gctagtgcta taccatcatt attatgcgat 60
ttttacaaaa catctcatcg aataatgtat cccgaatgtt cacaaattat ttatagtaca 120
tttacacctc gtagcaatga acaagcgcct tatttaacac aagttgtgtc atttggtttt 180
caagccttta tcattaaata tttaattcat tattttaatg ataacttttt ttctcgagat 240
aaacatgatg ttgtgactga atactctgca tttattgaga aaaccttaca gttagaggat 300
acgggtgaac acattgcaaa attacatgag ttgggttatt tgcctatccg gattaaagct 360
attcctgaag gaaaaacggt ggcaattaaa gttccggtga tgacgattga aaatacgcat 420
tctgatttct tttggcttac taactattta gaaacattaa ttaatgtatc actttggcag 480
ccgatgactt ctgcctcgat tgcttttgct tatcggacag cattaattaa atttgctaat 540
gaaacttgtg ataatcaaga acatgtgcca tttcaatcgc atgatttttc aatgcgtggt 600
atgagttctt tagaatccgc agaaacttca ggtgctggcc atttaacttc ttttttaggt 660
acagacacta ttcctgcact ctcttttgtt gaagcgtatt atggttcaag cagtctaatt 720
ggcacgtcta tacccgcttc tgagcattca gtaatgagtt cacatggtgt cgatgaatta 780
tcaacatttc gttatttaat ggcaaaattt ccgcataata tgttgtcaat tgtgtcagat 840
actacagact tttggcataa cattaccgtt aatttgccgt tattaaagca agaaattata 900
gcaaggccag aaaatgcccg tttagtcatt cgtccagata gcggtaactt ttttgcgatt 960
atttgtggtg atccaaccgc tgatactgag catgaacgta aaggactcat tgaatgttta 1020
tgggatattt ttggtggtac agttaatcag aaaggttata aagtgatcaa tccacatatt 1080
ggggcaattt atggtgatgg cgtgacttat gaaaaaatgt ttaagatctt agaaggatta 1140
caagccaaag gatttgcctc aagtaatatt gtgtttggcg ttggtgcaca aacctatcaa 1200
cgtaatacac gtgatacgtt gggctttgcg cttaaagcga catctatcac tattaatggc 1260
gaagaaaaag ctattttcaa aaatcctaaa accgatgatg gttttaaaaa atcgcaaaaa 1320
ggtcgtgtta aagtgctttc tcgtgatact tacgttgatg gtttaacttc agcggatgat 1380
tttagtgatg atttattaga gctgttattt gaagatggta agttattacg ccaaacagac 1440
tttgatgaaa ttcggcaaaa cttgttagtt agtcgcacta cgctatga 1488

Claims (5)

1.烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S0：以胞苷酸为原料，在胞苷酸水解酶催化作用下，生成核糖-5-磷酸；
S1：以所述核糖-5-磷酸、胞苷酸、多聚磷酸盐、烟酰胺为原料，在磷酸核糖焦磷酸化酶、多聚磷酸激酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化作用下，生成烟酰胺单核苷酸；
其中，所述磷酸核糖焦磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述多聚磷酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，所述胞苷酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述胞苷酸水解酶、所述磷酸核糖焦磷酸化酶、所述多聚磷酸激酶和所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活力比例为1：(2-3)：(2-3)：1；
S0中，所述胞苷酸的浓度为100～150mM，所述胞苷酸水解酶的添加量为400～600U/L；
S1中，所述烟酰胺的浓度为100～150mM，所述多聚磷酸盐的浓度为60～80mM，所述胞苷酸的浓度为2～6mM，所述磷酸核糖焦磷酸化酶的添加量为1000～1500U/L，所述多聚磷酸激酶的添加量为1000～1500U/L，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的添加量为400～600U/L，S1的反应温度为35～37℃，反应pH为7.2～7.8，反应时间为8～12h。
2.根据权利要求1所述的酶促合成方法，其特征在于，S1中还添加有Mg2+。
3.根据权利要求2所述的酶促合成方法，其特征在于，S1中Mg2+的浓度为50～100mM。
4.根据权利要求1所述的酶促合成方法，其特征在于，S1后还包括S2：酶促反应结束后，调节pH至7以下，除去沉淀。
5.根据权利要求4所述的酶促合成方法，其特征在于，调节pH至2以下。
CN202110160981.6A 2021-02-05 2021-02-05 烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法 Active CN112961890B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110160981.6A CN112961890B (zh) 2021-02-05 2021-02-05 烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110160981.6A CN112961890B (zh) 2021-02-05 2021-02-05 烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112961890A CN112961890A (zh) 2021-06-15
CN112961890B true CN112961890B (zh) 2023-06-27

Family

ID=76274483

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110160981.6A Active CN112961890B (zh) 2021-02-05 2021-02-05 烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112961890B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113549663B (zh) * 2021-06-29 2022-09-16 康盈红莓(中山)生物科技有限公司 一种腺苷参与的全酶法nmn合成方法
CN114107160A (zh) * 2021-12-27 2022-03-01 浙江工业大学 一种烟酰胺核糖激酶基因工程菌及其应用
CN115227706B (zh) * 2022-06-08 2023-12-29 陈玉松 5’-单磷酸核苷酸组合物在制备消脂减肥功能食品和药物中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107922952A (zh) * 2016-07-30 2018-04-17 邦泰生物工程(深圳)有限公司 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
CN108949865A (zh) * 2018-08-17 2018-12-07 尚科生物医药（上海）有限公司 固定化全细胞一步酶法催化制备β-烟酰胺单核苷酸

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016198948A1 (en) * 2015-06-11 2016-12-15 Newsouth Innovations Pty Limited Enzymatic systems and methods for synthesizing nicotinamide mononucleotide and nicotinic acid mononucleotide
CN117887788A (zh) * 2017-09-29 2024-04-16 三菱化学株式会社 烟酰胺单核苷酸的制造方法
CN110643587B (zh) * 2019-10-29 2020-08-28 杭州唯泰生物药业有限公司 一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法
CN111187759A (zh) * 2020-01-19 2020-05-22 杭州唯泰生物药业有限公司 用于制备烟酰胺单核苷酸的酶组合物及酶法制备烟酰胺单核苷酸的方法
CN112159831B (zh) * 2020-09-30 2022-06-03 湖州颐盛生物科技有限公司 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107922952A (zh) * 2016-07-30 2018-04-17 邦泰生物工程(深圳)有限公司 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
CN108949865A (zh) * 2018-08-17 2018-12-07 尚科生物医药（上海）有限公司 固定化全细胞一步酶法催化制备β-烟酰胺单核苷酸

Also Published As

Publication number Publication date
CN112961890A (zh) 2021-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112961890B (zh) 烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法
JP6771644B2 (ja) 微生物発酵によるｎ−アセチル−ｄ−グルコサミン及び／又はｄ−グルコサミン塩の製造方法
TWI682998B (zh) 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法
WO2015016544A1 (ko) 알돌레이즈, 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법과 생산용 조성물
CN110643587B (zh) 一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的方法
AU2019101117A4 (en) Method for the enzymatic production of uridine monophosphate and cytidine monophosphate
CN113151198B (zh) 一种γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用
CN108018252B (zh) 一种中间体2’-脱氧鸟苷的制备方法
CN112608910A (zh) 烟酰胺核糖激酶及其应用
CN113005162A (zh) 酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法和用于该方法的转化体
WO2022217695A1 (zh) 烟酸或其衍生物的单核苷酸及其生物产物的制备方法
JP2024515083A (ja) β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物及びその応用
CN113755411B (zh) 高产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其生产β-烟酰胺单核苷酸的方法
TWI719140B (zh) 新型多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶與使用其製備葡萄糖-6-磷酸的方法
CN113106080A (zh) 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
JPH0630599B2 (ja) フルクトース―１，６―二リン酸の製造法
CN114075585A (zh) 一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法
Teng et al. Cell-free regeneration of ATP based on polyphosphate kinase 2 facilitates cytidine 5'-monophosphate production
JPWO2004009830A1 (ja) Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
CN113584104B (zh) 一种生物催化合成磷酸氟达拉滨的方法
CN113528562B (zh) 生产β-烟酰胺核糖的重组微生物及其构建方法和应用
WO2017174040A1 (zh) 微生物发酵生产n-乙酰-d-氨基葡萄糖和/或d-氨基葡萄糖盐的方法
JP3833584B2 (ja) Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
JP5140242B2 (ja) Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
CN102154360A (zh) 产透明质酸重组表达载体pQHK和pHK及其构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 518107, 3rd Floor, No. 229 Gongchang Road, Zhenmei Community, Xinhu Street, Guangming District, Shenzhen, Guangdong Province

Patentee after: Shenzhen xijiya Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 518101 Room 401, 41 Xiangyin Road, Nanlian community, Longgang street, Longgang District, Shenzhen City, Guangdong Province

Patentee before: Shenzhen xijiya Biotechnology Co.,Ltd.