JP5140242B2 - Cmp−n−アセチルノイラミン酸の製造法 - Google Patents
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Description
(1)高純度のCMP−NeuAcの製造法であって、以下の工程1〜4の各工程を適宜組み合わせて行うことを特徴とする、CMP−NeuAcの製造法。
工程1:CMP−NeuAc含有液に2価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、
工程2:CMP−NeuAc含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、
工程3:有機溶媒を添加し、CMP−NeuAcを沈殿させる工程
工程4:沈殿したCMP−NeuAcを回収する工程
(3)工程2、工程1、工程3、工程4の順に実施する、上記(1)記載の方法。
(4)工程1と工程2を同時に行う、上記(1)記載の方法。
(5)工程3と工程4を複数回実施する、上記(1)記載の方法。
(6)2価カチオンがカルシウムイオン又はマンガンイオンである、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)ホスファターゼが大腸菌アルカリホスファターゼである、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(8)有機溶媒が、炭素数5以下のアルコールである、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(9)工程4のCMP−NeuAcの回収後、さらに塩交換反応に付し、CMP−NeuAcの塩を置換する、上記(1)記載の製造法。
(10)イオン交換樹脂を用いる塩交換反応である、上記(9)記載の製造法。
(工程1)
工程1は、CMP−NeuAc含有液に2価カチオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程である。
工程2は、CMP−NeuAc含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程である。
工程3は、有機溶媒を添加し、CMP−NeuAcを沈殿させる工程である。
工程4は、沈殿したCMP−NeuAcを回収する工程である。
上記工程4終了後、CMP−NeuAcはカルシウム塩、マンガン塩等の塩となっているため、必要に応じて、例えばナトリウム塩等に変換することも可能である。
このようにして得られたCMP−NeuAcはHPLCよる純度が95%以上で、5’−CMP等の夾雑物が極めて少ない高純度の製品である。
(1)CMP−NeuAcシンセターゼの調製
Haemophilus.influenzae Rd株の染色体DNA(ATCC51907D)をテンペレートとして、以下に示す2種類のプライマーDNAを常法に従って合成した。得られたプライマーを用いて、PCR法によりH.influenzaeのCMP−NeuAcシンセターゼ(neuA)遺伝子を増幅した。
プライマー(A):5’−TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAGAA−3’(配列番号1)
プライマー(B):5’−AACTGCAGTGCAGATCAAAAGTGCGGCC−3’(配列番号2)
PCR法によるneuA遺伝子の増幅は、100μL中に、50mM 塩化カリウム、10mMトリス塩酸(pH8.3)、1.5mM塩化マグネシウム、0.001%ゼラチン、テンペレートDNA0.1μg、プライマーDNA(A)及び(B)各々0.2μM、及びAmpliTaq DNAポリメラーゼ2.5ユニットを含む反応液を用い、Perkin−Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerで、熱変性(94℃、1分)、アニーリング(55℃、1.5分)、伸長反応(72℃、3分)のステップを25回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール/クロロホルム(1:1)混合液で処理し、水溶性画分を得た。得られた水溶性画分に2倍容のエタノールを添加しDNAを沈殿させた。沈殿回収したDNAを文献(「Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition」(Sambrookら編、Cold spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989))の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、720b相当のDNA断片を精製した。該DNAを制限酵素NcoI及びPstIで切断しDNA断片を得た。得られたDNA断片と、同じく制限酵素NcoII及びPstIで消化したプラスミドpTrc99AとをT4DNAリガーゼを用いて連結した。連結したDNAを含有する反応液を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドpTrcsiaBNPを単離した。pTrcsiaBNPは、pTrc99Aのtrcプロモーター下流のNcoI−PstI切断部位にneuA遺伝子の構造遺伝子を含有するDNA断片が挿入されたものである。
プラスミドpTrcsiaBNPを保持する大腸菌JM109菌を、100μg/mLのアンピシリンを含有する2×YT培地100mLに植菌し、37℃で振とう培養した。菌数が4×108個/mLに達した時点で、培養液に最終濃度0.25mMになるようにIPTGを添加し、さらに37℃で6時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離(9,000×g,10分)により菌体を回収し、5mLの緩衝液(100mM トリス塩酸(pH7.8)、10mMMgCl2)に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離(20,000×g、10分)により菌体残渣を除去した。
このように得られた上清画分を酵素液とし、この酵素液におけるCMP−NeuAcシンセターゼ活性を測定した。その結果を対照菌(pTrc99Aを保持する大腸菌K−12株JM109)と共に下記表1に示す。なお、本発明におけるCMP−NeuAcシンセターゼ活性の単位(ユニット)は、以下に示す方法で5’−CTPとN−アセチルノイラミン酸からのCMP−NeuAcの合成活性を測定、算出したものである。
50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0)、20mM 塩化マグネシウム、5mM CTPおよび10mM N−アセチルノイラミン酸に、CMP−NeuAcシンセターゼを添加して37℃で5分反応させる。また、CMP−NeuAcシンセターゼの代わりにpTrc99Aを保持する大腸菌JM109株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロールとした。
反応液に2倍量の70%エタノールを添加して反応を停止し、これを希釈した後、HPLCによる分析を行った。分離にはYMC社製HS−302カラムを用い、溶出液として50mM酢酸マグネシウム水溶液と1mMテトラブチルアンモニウム水溶液の混合液を用いた。HPLC分析結果から反応液中のCMP−NeuAcの量を算出し、37℃で1分間に1μmoleのCMP−NeuAcを合成する活性を1単位(ユニット)としてCMP−NeuAcシンセターゼ活性を算出した。
大腸菌JM105株(タカラバイオ(株))の染色体DNAを斉藤と三浦の方法(Biochemica et Biophysica Acta.,72,619(1963))に従って調製した。このDNAを鋳型として、以下に示す2種類のプライマーDNAを常法に従って合成した。得られたプライマーを用いて、PCR法により大腸菌phoA遺伝子(EMBL/GENEBANK/DDBJ DATA BANKS、Accession No.AE000145.1)を増幅した。
プライマー(C):5’−AAGGATCCAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCC−3’(配列番号3)
プライマー(D):5’−TTCTGCAGCCCGTGATCTGCCATTAAGTCTGGTT−3’(配列番号4)
PCR法によるphoA遺伝子の増幅は、100μL中に、50mM塩化カリウム、10mMトリス塩酸(pH8.3)、1.5mM塩化マグネシウム、0.001%ゼラチン、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、鋳型DNA0.1μg、プライマーDNA(C)及び(D)各々0.2mM、及びAmpliTaqDNAポリメラーゼ2.5ユニットを含む反応液を用いてPerkin−Elmer Cetus Instrument社製DNAThermal Cyclerで、熱変性(94℃、1分)、アニーリング(55℃、1分)、伸長反応(72℃、3分)のステップを25回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、反応液をフェノール/クロロホルム(1:1)混合液で処理し水溶性画分を得た。得られた水溶性画分に2倍容のエタノールを添加しDNAを沈殿させた。沈殿回収したDNAを文献(Molecular cloning)の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、1.5kb相当のDNA断片を精製した。当該DNAを制限酵素BamHI及びPstIで切断しDNA断片を得た。得られたDNA断片と同じく制限酵素BamHI及びPstIで消化したプラスミドpTrc99A(Pharmacia Biotech.社)とをT4DNAリガーゼを用いて連結した。連結したDNAを含有する反応液を用いて大腸菌JM109株(タカラバイオ(株))を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドpTrc−phoAを単離した。
pTrc−phoAは、pTrc99Aのtrcプロモーター下流の切断部位に大腸菌phoA構造遺伝子およびリボソーム結合部位を含有するBamHI−PstIDNA断片が挿入されたものである。
プラスミドpTrc−phoAを保持する大腸菌JM109株を、100μg/mLのアンピシリンを含有する2xYT培地500mLに植菌し、37℃で振とう培養した。菌数が4×108個/mLに達した時点で、培養液に最終濃度0.2mMになるようにIPTGを添加し、さらに37℃で22時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離(9,000×g,10分)により菌体を回収し、25mLの緩衝液(20mMトリス塩酸(pH8.0)、5mM塩化マグネシウム)に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離(20,000xg、10分)により菌体残渣を除去した。
続いて得られた上清画分を80℃、15分間の熱処理を行った後に遠心分離(20,000xg、10分)により菌体残渣を除去し、これを合計2Lの緩衝液(20mMトリス塩酸塩(pH8.0)、1mM塩化マグネシウム)を用いて4℃、一晩の透析を行い、さらに遠心分離(20,000xg、10分)により菌体残渣を除去した。
このようにして得られた上清画分を酵素液とし、酵素液におけるアルカリホスファターゼ活性を測定した。その結果を対照菌(pTrc99Aを保持する大腸菌JM109株)と共に下記表2に示す。なお、本発明におけるアルカリホスファターゼ活性の単位(ユニット)は、以下に示す方法で測定、算出したものである。
400mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)及び20mMウリジン5’−モノリン酸を含む溶液に酵素液を添加して,40℃で5〜15分反応させる。また、アルカリホスファターゼの代わりにpTrc99Aを保持する大腸菌JM109株の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロールとした。反応液に等量の0.5Mリン酸2水素カリウム溶液を添加することで反応を停止させた後、HPLCによる分析を行い、反応液中のウリジン量を定量した。37℃で1分間に1μmoleのウリジンを生成する活性を1単位(ユニット)としてアルカリホスファターゼ活性を算出した。
0.2M NeuAc溶液を5mL、0.25M CTP・3Na溶液を4mL、及び1M塩化マグネシウム溶液を混合後、2M水酸化ナトリウム溶液でpHを10に調整し、蒸留水で50mLにフィルアップした。40℃に加温した後、70ユニットのCMP−NeuAcシンセターゼを添加し、攪拌しながら反応を開始した。反応中、反応液のpHを8.5付近を維持するために1M水酸化ナトリウム溶液を適時滴下した。
CMP−NeuAc・2ナトリウム塩粉末70mg(シグマ社製)を蒸留水で溶解し、500μLに調製した(約0.2M溶液)。これを100μLずつ分取した後、それぞれA.1M塩化カルシウム溶液、B.1M塩化マンガン溶液、C.蒸留水を50μL添加した。続いてそれぞれに300μLのエタノールを添加し、4℃で一晩静置した後、121,000xg、4℃、10分間の遠心分離を行い、得られた上清の270nmにおける吸光度を測定した。得られた測定値から沈殿画分としての回収率を算出したところ、表4に示す結果が得られた。
このCMP−NeuAcのHPLCの分析結果は以下の通りである。
<分析条件>
カラム:ODS−HS302(YMC社製)
溶離液:0.1Mトリエチルアミン−リン酸(pH6.0)
<分析結果>
CMP−NeuAc 98.8%
5’−CMP 1.2%
Claims (3)
- HPLC純度95%以上のCMP−N−アセチルノイラミン酸(CMP−NeuAc)を製造する方法であって、5'−CTPとNeuAcを基質としてCMP−NeuAcシンターゼの触媒反応により合成されたCMP−NeuAc含有液に対し、以下の工程(1)〜(4)の各工程を、工程(1)次いで工程(2)、又は工程(1)と工程(2)を同時に行った後、工程(3)、工程(4)、次いで工程(5)の順で行うことを特徴とする、CMP−NeuAcの製造法。
工程(1):CMP−NeuAc含有液にカルシウムイオン又はマンガンイオンを添加し、共存するリン酸、ピロリン酸、ヌクレオチドを沈殿させる工程、
工程(2):CMP−NeuAc含有液にホスファターゼを添加し、共存するヌクレオチドをヌクレオシドに変換する工程、
工程(3):炭素数5以下のアルコールを添加し、CMP−NeuAcを沈殿させる工程、
工程(4):沈殿したCMP−NeuAcを回収する工程
工程(5):CMP−NeuAcの回収後、カチオン交換樹脂に接触させて塩交換し、次いでカーボン粉末処理する工程 - 工程(3)と工程(4)を複数回実施する、請求項1記載の方法。
- ホスファターゼが大腸菌アルカリホスファターゼである、請求項1又は2記載の方法。
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