KR100468979B1 - 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

수성 반응 매체 중에서 펜토스-1-인산과 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 금속 양이온 존재하에 반응시킴으로써 뉴클레오시드 화합물을 제조할 때에 이들 성분의 1종 이상에 대하여 그 수성 반응 매체 중으로의 첨가 시기나 첨가 방법을 변경함으로써 그대로 이용했을 경우에 반응액의 고점도화나 고화가 발생하는 양으로 이들을 이용하여도 반응액의 고점도화나 고화를 발생시키지 않고 뉴클레오시드 화합물을 고수량이며 효율적으로 생산한다. 이 방법에 의해, 펜토스-1-인산과 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 존재하에 반응시키는 공정을 포함하며, 동 반응에서의 뉴클레오시드 화합물의 전화율이 향상되어 있는 범용성이 높은 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법을 제공할 수가 있다.

Description

뉴클레오시드 화합물의 제조 방법 {Process for Producing Nucleoside Compound}

뉴클레오시드 포스포릴라아제는 인산 존재하에 뉴클레오시드의 N-글리코시드 결합을 가인산 분해하는 효소의 총칭으로, 리보뉴클레오시드를 예로 들면 다음 식으로 표시되는 반응을 촉매한다.

리보뉴클레오시드 + 인산(염) → 핵산 염기 + 리보스1-인산

푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제와 피리미딘뉴클레오시드 포스포릴라아제로 대별되는 이 효소는 널리 생물계에 분포하며 포유류, 조류, 어류 등의 조직, 효모, 세균에 존재한다. 이 효소 반응은 가역적이며, 역반응을 이용한 각종 뉴클레오시드 화합물의 합성이 이전부터 알려져 있다.

예를 들면 2'-데옥시리보스1-인산과 핵산 염기(티민, 아데닌 또는 구아닌)로부터 티미딘(일본 특허 공개 (평)01-104190호 공보), 2'-데옥시아데노신(일본 특허 공개 (평)11-137290호 공보) 또는 2'-데옥시구아노신(일본 특허 공개 (평)11-137290호 공보)를 제조하는 방법이 알려져 있다. 또한, 문헌[Agric., Biol., Chem., Vol.50(1)., PP.121 내지 126,(1986)]에서는 이노신을 인산 존재하에 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 유래의 푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제를 이용한 반응에 의해 리보스1-인산과 히포크산틴으로 분해한 후, 이온 교환 수지로 단리한 리보스1-인산과 1,2,4-트리아졸-3-카르복스아미드로부터 마찬가지로 엔테로박터 아에로게네스 유래의 푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제에 의해 항바이러스제인 리바비린을 제조하는 기술이 보고되어 있다.

그러나, 이 효소의 역반응을 이용하여 펜토스-1-인산 또는 그의 염과 핵산 염기로부터 뉴클레오시드 화합물을 생성시키는 반응은 평형 반응이기 때문에 전화율이 향상되지 않는다고 하는 기술적 결점을 가지고 있었다.

<발명의 개시>

본 발명이 해결하여야 할 과제는 공업적으로 뉴클레오시드 화합물을 제조함에 있어서, 높은 전화율로 반응을 진행시키며 또한 간편한 방법 및 원료 비용의 저감화 및 제품 순도의 향상에 기여하는 수단을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명의 목적은 펜토스-1-인산과 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 존재하에 반응시키는 공정을 포함하며, 이 반응에서의 뉴클레오시드 화합물의 전화율이 향상되는 간편하며 범용성이 높은 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 이들 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 반응액에 인산 이온과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온을 존재시키면 반응의 부생성물인 인산 이온이 난수용성 염으로서 침전되어 반응계 밖으로 제외됨으로써 반응의 평형이 뉴클레오시드 화합물 합성 방향으로 이동하여 반응 전화율이 향상된다는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온을 펜토스-1-인산의 염으로서 반응액 중에 존재시킴으로써 상기한 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온 또는 그의 염을 첨가했을 경우와 동등한 효과가 얻어진다는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은 펜토스-1-인산을 뉴클레오시드 포스포릴라아제 존재하에 인산기와 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체와의 교환 반응에 의해 뉴클레오시드 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 일반적으로 용해도가 낮아 반응성이 부족한 핵산 염기 유사체를 알칼리 금속 수용액으로서 반응계에 도입함으로써 반응시의 기질 농도를 향상시킬 수 있기 때문에 고전화율로 뉴클레오시드 화합물이 얻어진다는 것을 발견하였다.

또한, 이 뉴클레오시드 화합물의 제조에 있어서, 알칼리 금속 수용액으로서 리튬 이온 또는 마그네슘 이온을 함유하는 금속 양이온 염의 수용액을 이용하면 반응으로 생성되는 인산이 인산 리튬 또는 인산 마그네슘으로서 불용화되기 때문에 효소 반응의 평형이 뉴클레오시드 화합물의 합성측으로 기울어짐으로써 종래 기술에서는 이룰 수 없었던 고선택성, 고수율로 뉴클레오시드 화합물이 얻어진다는 것을 발견하였다.

또한, 특히 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온의 염으로서수산화 마그네슘 등의 물에 난용성인 금속 양이온의 염을 이용하면 반응액의 염 농도가 상승하지 않기 때문에 반응액의 상승에 의해서 초래되는 반응 속도의 저하가 방지된다는 것, 또한 그와 같은 금속 양이온의 염은 반응전에 전량 첨가할 수 있기 때문에 마그네슘을 금속 수용액으로서 첨가하는 경우에 비하여 조작이 간편해지는 데다가 얻어진 반응액의 여과성이 현저히 향상되는 등의 이점이 있다는 것도 발견하였다.

또한, 금속 양이온의 염으로서 수산화마그네슘을 이용하면 반응에 의해 얻어지는 난수용성의 인산염인 인산마그네슘의 결정이 비교적 반응액의 여과에 적합한 크기·형상이기 때문에 반응 종료 후의 반응액의 여과가 신속히 이루어지는 이점이 있다는 것을 본 발명자들은 발견하였다.

또한, 공업적으로 뉴클레오시드 화합물을 생산하기 위해서는 용적 효율 또는 정제시의 회수율을 향상시킬 필요에서 반응액 중에 고농도로 뉴클레오시드 화합물을 축적시키는 것이 바람직하다. 상기한 바와 같이 반응액 중에 금속 양이온을 존재시켜 반응의 진행에 따라 발생하는 인산 이온과 반응시켜 난수용성 염으로서 침전시키는 경우에 뉴클레오시드 화합물의 고축적 농도를 얻기 위해서 각 성분의 양을 높이면 인산과 금속 양이온이 대응하는 난수용성 염을 형성하여 침전됨에 따라 반응액의 pH가 지나치게 저하되면 반응 전화율이 낮아진다. 이 반응액의 pH 저하에 의한 반응 전화율의 저하는 생성된 뉴클레오시드 화합물의 분해 또는 효소 활성의 부분적인 실활 등에 의한 것이라고 생각된다.

이러한 경우에 목적으로 하는 반응 전화율을 유지하기 위해서는 반응액의 pH를 조정하는 것이 바람직하다. 그런데, 뉴클레오시드 화합물의 고축적 농도를 얻기 위하여 초기(반응 개시시)의 공급량을 많게 하면 반응의 진행에 따라 반응액의 점도가 상승하고, 나아가 반응액의 고화가 발생하는 경우가 있었다. 그리고, 이러한 반응액의 점도 상승이나 고화가 발생하면 상술한 목적으로 하는 pH 조정이 곤란해진다. 또한, 반응액의 점도가 상승하면 반응액의 혼합 교반에 걸리는 동력이 과대해져 설비 고장의 원인이 되기도 한다.

본 발명자들은 뉴클레오시드 화합물의 반응액 중에서의 고축적 농도를 얻기위한 공급량을 이용했을 경우에 펜토스-1-인산, 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체 및 금속 양이온으로부터 선택된 1종 이상의 공급량의 전부 또는 일부를 반응 개시 후의 소정의 시기에 첨가함으로써 반응액의 고점도화 또는 고화를 방지할 수가 있다는 것을 발견하였다.

즉, 상기한 각 발견에 기초하여 이루어진 본원 발명에는 이하의 각 태양이 포함된다.

[1] 수성 반응 매체 중에서, 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 존재하에 펜토스-1-인산과 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 인산 이온과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온 존재하에 반응시켜 뉴클레오시드 화합물을 생성시키는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법으로서, 반응 개시 후에 상기 펜토스-1-인산, 상기 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체, 및 상기 금속 양이온으로부터 선택한 1종 이상의 성분을 반응 도중의 수성 반응 매체 중에 첨가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[2] 제1항에 있어서, 상기 펜토스-1-인산이 리보스-1-인산 또는 2-데옥시리보스-1-인산인 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[3] 제1 또는 2항에 있어서, 상기 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온이 칼슘 이온, 바륨 이온, 알루미늄 이온, 리튬 이온 및 마그네슘 이온 중에서 선택되는 1종 이상인 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[4] 제3항에 있어서, 상기 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온을 염소 이온, 질산 이온, 탄산 이온, 황산 이온, 아세트산 이온 및 수산화 이온 중에서 선택되는 1종류 이상의 음이온과의 금속염으로서 수성 반응 매체 중에 첨가하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[5] 제3항에 있어서, 상기 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온을 펜토스-1-인산의 염으로서 수성 반응 매체 중에 첨가하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[6] 제1항에 있어서, 상기 반응 개시 후에 상기 수성 반응 매체에 첨가되는 1종 이상의 성분 중 1종 이상에 대하여, 그 반응 종료까지 첨가하는 양을 2회 이상으로 분할하거나 연속적으로 서서히 상기 수성 반응 매체에 첨가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[7] 제1 또는 6항에 있어서, 상기 펜토스-1-인산, 상기 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체 및 상기 금속 양이온의 3종 성분의 반응 종료까지 첨가하는 양이 이들 성분을 수성 반응 매체에 일괄적으로 첨가·반응시켰을 경우에 수성 반응 매체에 고점도화 또는 고화가 발생하며, 또한 상기 반응 개시 후의 1종 이상 성분의 반응종료까지의 첨가량의 일부 또는 전부를 상기 반응 개시 후에 분할 첨가함으로써 상기 반응액의 고점도화 또는 고화가 방지되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[8] 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 알칼리 수용액으로서 첨가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[9] 제8항에 있어서, 상기 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 용해하는 알칼리 수용액이 수산화리튬, 탄산리튬 및 탄산수소리튬 중 하나 이상을 함유하는 용액인 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[10] 수성 반응 매체 중에서 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 존재하에 펜토스-1-인산과 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 인산과 난수용성 염을 형성하는 금속 양이온의 염의 존재하에 pH를 조정하지 않고 반응시켜 뉴클레오시드 화합물을 생성시키는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법으로서, 상기 금속 양이온의 염이 난수용성 염인 것을 특징으로 하는 제조 방법.

[11] 제10항에 있어서, 금속 양이온의 염이 수산화마그네슘, 산화마그네슘, 탄산마그네슘 및 염기성 탄산마그네슘으로부터 선택된 1종 이상인 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[12] 제11항에 있어서, 반응시의 수성 반응 매체의 pH가 7.5 내지 10.0의 범위인 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

[13] 제11항에 있어서, 반응에 의해 얻어진 반응액을 여과하여 반응액 중의불용성 물질을 제거하고 뉴클레오시드 화합물을 함유하는 여과액을 얻는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.

<발명을 실시하기 위한 최량의 형태>

본 발명에서의 펜토스-1-인산이란 폴리히드록시알데히드 또는 폴리히드록시케톤 및 그 유도체의 1 위치에 인산이 에스테르 결합한 것을 말한다. 그 대표예로서는, 예를 들면 리보스1-인산, 2'-데옥시리보스1-인산, 2',3'-디데옥시리보스1-인산, 아라비노스1-인산 등을 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

여기에서 말하는 폴리히드록시알데히드 또는 폴리히드록시케톤이란 천연물유래의 것으로서는 D-아라비노스, L-아라비노스, D-크실로스, L-릭소스, D-리보스와 같은 알도펜토스, D-크실룰로스, L-크실룰로스, D-리불로스와 같은 케토펜토스, D-2-데옥시리보스, D-2,3-디데옥시리보스와 같은 데옥시당류를 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

이들 펜토스-1-인산은 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 작용에 의해 뉴클레오시드 화합물의 가인산 분해 반응을 행하여 제조하는 방법(J.Biol.Chem.Vol.184,437,1950) 또는 애노머 선택적인 화학 합성법 등에 의해서도 제조할 수가 있다.

본 발명에 사용되는 핵산 염기란 DNA 또는 RNA의 화합 구조 형식 요소로 되어 있는 질소 원자를 포함하는 복소환식 화합물을 말하며 피리미딘, 푸린 또는 염기 유사체로 이루어지는 군으로부터 선택된 천연 또는 비천연형의 핵산 염기를 나타내고, 이들 염기는 할로겐 원자, 알킬기, 할로알킬기, 알케닐기, 할로알케닐기,알키닐기, 아미노기, 알킬아미노기, 수산기, 히드록시아미노기, 아미노옥시기, 알콕시기, 머캅토기, 알킬머캅토기, 아릴기, 아릴옥시기 또는 시아노기에 의해 치환될 수도 있다.

치환기로서의 할로겐 원자로는 염소, 불소, 요오드, 브롬이 예시된다. 알킬기로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기 등의 탄소수 1 내지 7의 알킬기가 예시된다. 할로알킬기로서는 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 브로모메틸, 브로모에틸 등의 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 갖는 할로알킬기가 예시된다. 알케닐기로서는 비닐, 알릴 등의 탄소수 2 내지 7의 알케닐기가 예시된다. 할로알케닐기로서는 브로모비닐, 클로로비닐 등의 탄소수 2 내지 7의 알케닐을 갖는 할로알케닐기가 예시된다. 알키닐기로서는 에티닐, 프로피닐 등의 탄소수 2 내지 7의 알키닐기가 예시된다. 알킬아미노기로서는 메틸아미노, 에틸아미노 등의 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 갖는 알킬아미노기가 예시된다. 알콕시기로서는 메톡시, 에톡시 등의 탄소수 1 내지 7의 알콕시기가 예시된다. 알킬머캅토기로서는 메틸머캅토, 에틸머캅토 등의 탄소수 1 내지 7의 알킬기를 갖는 알킬머캅토기가 예시된다. 아릴기로서는 페닐기; 메틸페닐, 에틸페닐 등의 탄소수 1 내지 5의 알킬기를 갖는 알킬페닐기; 메톡시페닐, 에톡시페닐 등의 탄소수 1 내지 5의 알콕시기를 갖는 알콕시페닐기; 디메틸아미노페닐, 디에틸아미노페닐 등의 탄소수 1 내지 5의 알킬아미노기를 갖는 알킬아미노페닐기; 클로로페닐, 브로모페닐 등의 할로게노페닐기 등이 예시된다.

피리미딘 골격을 갖는 핵산 염기를 구체적으로 예시하면 시토신, 우라실, 5-플루오로시토신, 5-플루오로우라실, 5-클로로시토신, 5-클로로우라실, 5-브로모시토신, 5-브로모우라실, 5-요오드시토신, 5-요오드우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실(티민), 5-에틸시토신, 5-에틸우라실, 5-플루오로메틸시토신, 5-플루오로우라실, 5-트리플루오로시토신, 5-트리플루오로우라실, 5-비닐우라실, 5-브로모비닐우라실, 5-클로로비닐우라실, 5-에티닐시토신, 5-에티닐우라실, 5-프로피닐우라실, 피리미딘-2-온, 4-히드록시아미노피리미딘-2-온, 4-아미노옥시피리미딘-2-온, 4-메톡시피리미딘-2-온, 4-아세톡시피리미딘-2-온, 4-플루오로피리미딘-2-온, 5-플루오로피리미딘-2-온 등을 들 수 있다.

푸린 골격을 갖는 핵산 염기를 구체적으로 예시하면 푸린, 6-아미노푸린(아데닌), 6-히드록시푸린, 6-플루오로푸린, 6-클로로푸린, 6-메틸아미노푸린, 6-디메틸아미노푸린, 6-트리플루오로메틸아미노푸린, 6-벤조일아미노푸린, 6-아세틸아미노푸린, 6-히드록시아미노푸린, 6-아미노옥시푸린, 6-메톡시푸린, 6-아세톡시푸린, 6-벤조일옥시푸린, 6-메틸푸린, 6-에틸푸린, 6-트리플루오로메틸푸린, 6-페닐푸린, 6-머캅토푸린, 6-메틸머캅토푸린, 6-아미노푸린-1-옥시드, 6-히드록시푸린-1-옥시드, 2-아미노-6-히드록시푸린(구아닌), 2,6-디아미노푸린, 2-아미노-6-클로로푸린, 2-아미노-6-요오드푸린, 2-아미노푸린, 2-아미노-6-머캅토푸린, 2-아미노-6-메틸머캅토푸린, 2-아미노-6-히드록시아미노푸린, 2-아미노-6-메톡시푸린, 2-아미노-6-벤조일옥시푸린, 2-아미노-6-아세톡시푸린, 2-아미노-6-메틸푸린, 2-아미노-6-시클로프로필아미노메틸푸린, 2-아미노-6-페닐푸린, 2-아미노-8-브로모푸린, 6-시아노푸린, 6-아미노-2-클로로푸린(2-클로로아데닌), 6-아미노-2-플루오로푸린(2-플루오로아데닌) 등을 들 수 있다.

염기 유사체를 구체적으로 예시하면 6-아미노-3-데아자푸린, 6-아미노-8-아자푸린, 2-아미노-6-히드록시-8-아자푸린, 6-아미노-7-데아자푸린, 6-아미노-1-데아자푸린, 6-아미노-2-아자푸린 등을 들 수 있다.

본 발명에서 뉴클레오시드 화합물이란 상술한 폴리히드록시알데히드 또는 폴리히드록시케톤 및 그 유도체의 1 위치에 피리미딘 골격을 갖는 핵산 염기, 푸린 골격을 갖는 핵산 염기 또는 염기 유사체가 N-글루코시드 결합한 것을 말하며, 구체적으로는 티미딘, 데옥시시티딘, 데옥시우리딘, 데옥시구아노신, 데옥시아데노신, 디데옥시아데노신, 트리플루오로티미딘, 리바비린, 오로티딘, 우라실아라비노시드, 아데닌아라비노시드, 2-메틸-아데닌아라비노시드, 2-클로로-히포크산틴아라비노시드, 티오구아닌아라비노시드, 2,6-디아미노푸린아라비노시드, 시토신아라비노시드, 구아닌아라비노시드, 티민아라비노시드, 에노시타빈, 젬시타빈, 아지도티미딘, 이독스우리딘, 디데옥시아데노신, 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘, 디데히드로데옥시티미딘, 티아디데옥시시티딘, 소리비딘, 5-메틸우리딘, 피라졸, 티오이노신, 테가푸르, 독시플루리딘, 브레디닌, 네불라린, 알로푸리놀우라실, 5-플루오로우라실, 2'-아미노우리딘, 2'-아미노아데노신, 2'-아미노구아노신, 2-클로로-2'-아미노이노신 등을 들 수 있다.

본 발명에서의 뉴클레오시드 포스포릴라아제란 인산 존재하에 뉴클레오시드 화합물의 N-글리코시드 결합을 분해하는 효소의 총칭을 말하며, 본 발명에서는 역반응을 이용할 수가 있다. 반응에 사용하는 효소는 상당하는 펜토스-1-인산과 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체로부터 목적으로 하는 뉴클레오시드 화합물을 생성할 수 있는 활성을 가지고 있으면 어떠한 종류 및 기원의 것이어도 상관없다. 이 효소는 푸린형과 피리미딘형으로 대별되는데, 공지된 것으로서는, 예를 들면 푸린형으로서 푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제(EC2.4.2.1), 구아노신포스포릴라아제(EC2.4.2.15), 피리미딘형으로서 피리미딘뉴클레오시드 포스포릴라아제(EC2.4.2.2), 우리딘포스포릴라아제(EC2.4.2.3), 티미딘포스포릴라아제(EC2.4.2.4), 데옥시우리딘포스포릴라아제(EC2.4.2.23) 등을 들 수 있다.

본 발명에서의 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성을 갖는 미생물이란 푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제(EC2.4.2.1), 구아노신포스포릴라아제(EC2.4.2.15), 피리미딘뉴클레오시드 포스포릴라아제(EC2.4.2.2), 우리딘 포스포릴라아제(EC2.4.2.3), 티미딘포스포릴라아제(EC2.4.2.4), 데옥시우리딘포스포릴라아제(EC2.4.2.23)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일종 이상의 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 발현하고 있는 미생물이면 특별히 한정되지 않는다.

이러한 미생물의 구체예로서는 노카르디아(Nocardia)속, 미크로박테리움(Microbacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 브레비박테리움속(Brevibacterium)속, 셀룰로모나스(Cellulomonas)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 클루이베라(Kluyvere)속, 미코박테리움(Micobacterium)속, 헤모필라스(Haemophilus)속, 미코플라나(Micoplana)속, 프로타미노박터(Protaminobacter)속, 칸디다(Candida)속, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 바실루스(Bacillus)속, 호열성의 바실루스속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 미크로코카스(Micrococcus)속, 하프니아(Hafnia)속, 프로테우스(Proteus)속, 비브리오(Vibrio)속, 스타피로코카스(Staphyrococcus)속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속, 사르티나(Sartina)속, 플라노코카스(Planococcus)속, 에세리시아(Escherichia)속, 쿠르티아(Kurthia)속, 로도코카스(Rhodococcus)속, 아시네토박터(Adinetobacter)속, 크산토박터(Xanthobacter)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 리조븀(Rhizobium)속, 살모넬라(Salmonella)속, 클레브시엘라(Klebsiella)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 에르위니아(Erwinia)속, 에로모나스(Aeromonas)속, 시트로박터(Citrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아스로박터(Arthrobacter)속 또는 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속에 포함되는 미생물주를 적합한 예로서 들 수 있다.

최근의 분자 생물학 및 유전자 공학의 진보에 의해 상술한 미생물주의 뉴클레오시드 포스포릴라아제의 분자 생물학적인 성질 또는 아미노산 서열 등을 해석함으로써 상기 단백질의 유전자를 상기 미생물주로부터 취득하여 상기 유전자 및 발현에 필요한 제어 영역이 삽입된 재조합 플라스미드를 구축하고, 이것을 임의의 숙주에 도입하여 상기 단백질을 발현시킨 유전자 재조합균을 만들어 내는 것이 가능해지고, 또한 비교적 용이해지기도 하였다. 이러한 기술 수준에 비추어 이러한 뉴클레오시드 포스포릴라아제 유전자를 임의의 숙주에 도입한 유전자 재조합균도 본 발명의 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 발현하고 있는 미생물에 포함되는 것으로 한다.

여기에서 말하는 발현에 필요한 제어 영역이란 프로모터 서열(전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함한다) ·리보좀 결합 서열(SD 서열) ·전사 종결 서열 등을 나타내고 있다. 프로모터 서열의 구체예로서는 대장균 유래의 트립토판오페론의 trp 프로모터 ·락토스오페론의 lac 프로모터 ·람다 파지 유래의 P_L프로모터 및 P_R프로모터 또는 고초균 유래의 글루콘산 합성 효소 프로모터(gnt) ·알칼리 프로테아제 프로모터(apr) ·중성 프로테아제 프로모터(npr) ·α-아밀라제 프로모터(amy) 등을 들 수 있다. 또, tac 프로모터와 같이 독자적으로 개변·설계된 서열도 이용할 수 있다. 리보좀 결합 서열로서는 대장균 유래 또는 고초균 유래의 서열을 들 수 있지만 대장균이나 고초균 등의 목적으로 하는 숙주내에서 기능하는 서열이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 16S 리보좀 RNA의 3' 말단 영역에 상보적인 서열이 4염기 이상 연속된 콘센서스 서열을 DNA 합성에 의해 제조하여 이것을 이용하여도 좋다. 전사 종결 서열은 반드시 필요한 것은 아니지만 ρ 인자 비의존성인 것, 예를 들면 리포프로테인 터미네이터 ·trp 오페론 터미네이터 등을 이용할 수 있다. 이들 제어 영역의 재조합 플라스미드상에서의 서열 순서는 5' 말단측 상류부터 프로모터 서열, 리보좀 결합 서열, 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 코드하는 유전자, 전사 종결 서열의 순으로 배열하는 것이 바람직하다.

여기에서 말하는 플라스미드의 구체예로서는 대장균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 가지고 있는 pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pKK223-3, pSC101또는 고초균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 가지고 있는 pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1ㅡ φ105 등을 벡터로서 이용할 수가 있다. 또한, 2종류 이상의 숙주내에서의 자율 복제가 가능한 플라스미드의 예로서 pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7을 벡터로서 이용할 수가 있다.

여기에서 말하는 임의의 숙주로는 후술하는 실시예와 같이 대장균(Escherichia coli)을 대표예로서 들 수 있지만 특별히 대장균으로 한정되는 것은 아니며, 고초균(Bacillus subtilis) 등의 바실루스속균, 효모나 방선균 등의 다른 미생물 균주도 포함된다.

본 발명에서의 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 이 효소 활성을 갖는 미생물로서는 시판 중인 효소, 이 효소 활성을 갖는 미생물 균체 및 균체 처리물 또는 이들의 고정화물 등을 사용할 수 있다. 균체 처리물이란, 예를 들면 아세톤 건조균체나 기계적 파괴, 초음파 파쇄, 동결 융해 처리, 가압 감압 처리, 침투압 처리, 자기 소화, 세포벽 분해 처리, 계면 활성제 처리 등에 의해 제조한 균체 파쇄물 등이고, 또한 필요에 따라 황산암모늄 침전 또는 아세톤 침전, 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제를 거듭한 것을 이용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 인산 이온과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온이란 반응에서 부생한 인산 이온과 난수용성 염을 형성하여 반응액 중에 침전할 수 있는 것이면 한정되지 않는다. 그와 같은 것으로서 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 바륨, 철, 코발트, 니켈, 구리, 은, 몰리브덴, 납, 아연, 리튬 등의 금속 양이온을 들 수 있다. 이들 중 공업적으로 범용성이나 안전성이 높으며 반응에 영향을 주지 않은 금속염이 특히 바람직하고, 그와 같은 것의 예로서 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 바륨 이온 또는 알루미늄 이온을 들 수 있다. 금속 양이온은 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위내에서 2종 이상을 조합하여 이용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 인산 이온과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온은 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온을 염소 이온, 질산 이온, 탄산 이온, 황산 이온, 아세트산 이온 또는 수산 이온 중으로부터 선택되는 1종류 이상의 음이온과의 금속염으로서 반응액 중에 첨가할 수가 있다. 구체적으로는 염화칼슘, 질산칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘, 아세트산칼슘, 염화바륨, 질산바륨, 탄산바륨, 황산바륨, 아세트산바륨, 염화알루미늄, 질산알루미늄, 탄산알루미늄, 황산알루미늄, 아세트산알루미늄, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산칼륨, 수산화칼륨, 탄산수소리튬, 탄산리튬, 수산화리튬, 수산화마그네슘 등이 예시된다.

본 발명에서의 금속 양이온은 펜토스-1-인산의 염으로서 반응액 중에 존재시킬 수도 있다. 구체적으로는 리보스-1인산·칼슘염, 2-데옥시리보스-1-인산·칼슘염, 2,3-디데옥시리보스-1-인산·칼슘염, 아라비노스1-인산·칼슘염, 리보스-1-인산·바륨염, 2-데옥시리보스-1-인산·바륨염, 2,3-디데옥시리보스-1-인산·바륨염, 아라비노스-1-인산·바륨염, 리보스-1-인산·알루미늄염, 2-데옥시리보스-1-인산·알루미늄염, 2,3-디데옥시리보스-1-인산·알루미늄염, 아라비노스-1-인산·알루미늄염 등을 들 수 있다.

인산 이온과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온의 염을 핵산 염기또는 핵산 염기 유사체의 수용액 중에 함유시켜 반응 매체 중에 첨가하는 경우에는 수용액 중의 금속 양이온의 첨가량은 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체에 대하여 0.5 내지 20배 몰량, 바람직하게는 1 내지 4배 몰량이다.

금속 양이온의 염을 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체의 수용액에 함유시켜 반응 매체 중에 첨가하는 경우에는 당해 수용액을 반응전에 일괄적으로 반응 매체 중에 첨가할 수도 있고, 당해 수용액을 순차적으로 반응 매체에 첨가하여 반응시킬 수도 있다. 여기에서, 순차적 첨가란 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 금속 양이온의 염의 수용액에 용해 또는 현탁하여 2이상으로 분할 또는 1분 내지 24 시간, 바람직하게는 30분 내지 24 시간에 걸쳐 연속하여 반응계에 첨가하는 것을 나타낸다.

또한, 반응에 필요한 성분을 일괄해서 혼합했을 경우에, 그 사용량에 따라서는 반응액의 고화 등이 발생하는 경우가 있고, 이러한 경우에는 반응 개시 후에 (1)펜토스-1-인산, (2)핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체 및 (3) 금속 양이온으로부터 선택한 1종 이상의 성분을 반응 도중의 수성 반응 매체 중에 첨가함으로써 이러한 고화 등의 문제를 회피할 수가 있다. 여기에서 반응 개시란 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 존재하에 펜토스-1-인산 및 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체가 첨가되어야 하는 양의 적어도 일부가 첨가된 상태를 말한다.

또한, 반응 개시 후에 첨가하는 성분은 상기한 바와 같이 한번에 일괄해서 첨가하는 방법, 2회 이상으로 나눈 회분법 또는 연속법 또는 회분법과 연속법의 조합으로 이루어지는 첨가 방법으로 첨가할 수가 있다. 반응 개시 후에 첨가하는 성분이 복수일 때는 상기한 3 성분으로부터 선택된 1종 이상 성분의 1종 이상에 대하여 분할하여 첨가하는 방법을 채용할 수가 있다. 즉, 반응 개시 후에 첨가하는 성분이 복수일 때에는 각 성분별로 첨가 방법을 선택할 수 있다.

금속 양이온의 염의 수용액을 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체와 혼합하여 이용하는 경우에는 금속 양이온의 염의 수용액의 사용량은 금속 양이온이 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체에 대하여 0.5 내지 20배 몰량, 바람직하게는 1 내지 4배 몰량이 되는 양이다.

인산과 난수용성 염을 형성하는 금속 양이온의 염 중 특히 그것 자체가 물에 난수용성인 것은 반응 개시전에 그 반응 종료까지 첨가되는 양을 수성 반응 매체에 첨가하는 것이 가능하고, 또한 반응액의 pH를 조정할 필요가 없는 경우가 있기 때문에 본 발명에서 사용되는 금속 양이온의 염으로서 적당하다. 그와 같은 금속 양이온의 염의 대표적인 것으로서 각종 금속 양이온의 수산화물, 특히 수산화 마그네슘을 예시할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 수성 반응 매체는 물을 주체로 하여 구성되는 반응 매체로, 본 발명에서 목적으로 하는 효소 활성을 이용한 반응이 진행되어 금속 양이온을 첨가하는 효과가 얻어지는 것이면 좋다. 그와 같은 수성 반응 매체로서는 물 또는 물에 수용성인 유기 용제를 첨가한 수성 반응 매체를 들 수 있다. 이 유기 용매로서는, 예를 들면 메탄올, 에탄올 등의 저급 알코올, 아세톤, 디메틸술폭시드 및 이들의 혼합물 등을 예시할 수 있다. 용매의 사용량에 특별히 제한은없고 반응이 양호하게 진행될 정도로 사용하면 되지만, 물에 대한 수용성 유기 용매의 양은 바람직하게는 0.1 내지 70 중량%의 범위로 할 수 있다. 또한, 반응의 안정성을 확보하기 위하여 수성 반응 매체를 이용한 반응액은 완충액으로서 제조할 수도 있다. 이 완충액으로서는 본 발명에 따른 효소 반응용으로서 이용할 수 있는 공지된 완충액을 이용할 수가 있다.

본 발명에서의 뉴클레오시드 화합물의 합성 반응은 목적으로 하는 뉴클레오시드 화합물, 기질인 펜토스-1-인산과 핵산 염기, 반응 촉매인 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 이 효소 활성을 갖는 미생물, 그리고 인산을 반응계로부터 제외시키기 위한 금속염의 종류와 그 특성에 의해 적절한 pH나 온도 등의 반응 조건을 선택하면 되지만, 통상은 pH 5 내지 11, 바람직하게는 pH 7.5 내지 10.0, 보다 바람직하게는 8.0 내지 10의 범위이고, 온도는 빙온 내지 80 ℃, 바람직하게는 10 내지 60 ℃의 범위에서 행할 수 있다. pH에 관하여 그 관리 범위를 벗어났을 경우, 목적물이나 기질의 안정성, 효소 활성의 저하, 인산과의 난수용성염의 미형성 등이 원인으로 반응 전화율의 저하를 초래할 가능성이 있다. 반응 도중, pH의 변화가 발생하는 듯하면 필요에 따라 염산, 황산 등의 산이나 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리를 적시에 첨가하면 좋다. 물론, 금속 양이온의 염으로서 난수용성인 것, 특히 금속 양이온의 수산화물을 사용하면 반응액의 pH를 조정할 필요가 없는 경우가 있다.

반응에 사용하는 펜토스-1-인산과 핵산 염기의 농도는 0.1 내지 1000 mM 정도가 적당하고, 양자의 몰비는 첨가하는 핵산 염기의 비율을 펜토스-1-인산 또는그의 염에 대하여 O.1 내지 10배몰량으로 행할 수 있다. 반응 전화율을 생각하면 0.95배몰량 이하가 바람직하다.

반응 시간은 원료, 수성 용매의 종류, 반응 온도에 따라 다르지만 1분 내지 78 시간, 바람직하게는 30분 내지 24 시간이다.

또한, 첨가하는 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속염은 반응에 사용하는 펜토스-1-인산에 대하여 0.1 내지 10배 몰량, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5배 몰량 첨가하는 것이 좋다. 또한, 고농도의 반응에서는 기질의 핵산 염기나 생성물의 뉴클레오시드 화합물이 완전히 용해되지 않고 반응액 중에 존재하는 경우도 있지만 이러한 경우에도 본 발명은 적용된다.

본 발명에서의 펜토스-1-인산 또는 그의 염, 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온 또는 그의 염, 핵산 염기 중으로부터 선택되는 1종류 이상을 반응액이 고화되지 않도록 첨가하는 방법은 대표예로서 이하와 같은 것을 들 수 있다. 또한, 본 발명은 이하의 예로 한정된 것이 아니며, 반응액이 고화되지 않으면 펜토스-1-인산 또는 그의 염, 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온 또는 그의 염, 핵산 염기 중에서 선택되는 1종류 이상의 첨가 시기 또는 분할 횟수는 특별히 제한되지 않는 것으로 한다.

1. 펜토스-1-인산 또는 그의 염과 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 일괄적으로 넣어 반응을 개시시켜 적당한 농도까지 뉴클레오시드 화합물을 축적시킨 후에 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온 또는 그의 염을 일괄 첨가하는 방법. 이 경우의 뉴클레오시드 화합물의 축적 농도는 바람직하게는 10 mM 이상, 보다 바람직하게는 30 mM 이상이다.

2. 펜토스-1-인산 또는 그의 염과 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 일괄적으로 넣어 반응을 개시시킨 후에 뉴클레오시드 화합물의 축적 농도에 맞추어 단계적 또는 연속적으로 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온 또는 그의 염을 첨가하는 방법. 이 경우, 금속 양이온의 첨가는 뉴클레오시드 화합물이 바람직하게는 10 mM 이상, 보다 바람직하게는 30 mM 이상 축적되었을 때 개시하면좋다.

3. 펜토스-1-인산 또는 그의 염과, 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온 또는 그의 염을 일괄 첨가한 후, 반응액이 고화되지 않도록 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 단계적 또는 연속적으로 첨가하는 방법. 이 경우, 시초의 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체의 첨가량은 바람직하게는 30 mM 이하, 보다 바람직하게는 10 mM 이하이다.

4. 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체와, 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온 또는 그의 염을 일괄 첨가한 후, 반응액이 고화되지 않도록 펜토스-1-인산 또는 그의 염을 단계적 또는 연속적으로 첨가하는 방법. 이 경우, 시초의 펜토스-1-인산 또는 그의 염의 첨가량은 바람직하게는 30 mM 이하, 보다 바람직하게는 10 mM 이하이다.

5. 펜토스-1-인산 또는 그의 염, 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온 또는 그의 염, 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 효소 용액 중에 단계적 또는 연속적으로 첨가하는 방법. 이 경우, 반응 개시 시점의 펜토스-1-인산 또는그의 염, 또는 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체의 첨가량은 바람직하게는 30 mM 이하, 보다 바람직하게는 10 mM 이하이다.

이와 같이 하여 제조한 뉴클레오시드 화합물을 반응액으로부터 단리하기 위해서는 농축, 정석, 용해, 전기 투석 처리, 이온 교환 수지 또는 활성탄에 의한 흡탈착 처리 등의 통상법을 적용할 수 있다.

본 발명은 뉴클레오시드 포스포릴라아제를 이용한 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 각종 뉴클레오시드 및 그 유사체 화합물은 항바이러스의약품, 항암 의약품 또는 안티센스 의약품 등의 원료 또는 원체로서 사용된다.

이하에 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예들에 의해 전혀 제한되지 않는다.

(분석법)

생성된 뉴클레오시드 화합물은 전부 고속 액체 크로마토그래피로 정량하였다. 분석 조건은 이하에 따른다.

컬럼; YMC-Pack ODS-A312 150×6.0 mm I.D.(YMC Co., Ltd)

컬럼 온도; 40 ℃

펌프 유속; 0.75 ml/min

검출; UV 260 nm

용리액; 10 mM 인산: 아세토니트릴= 95:5(V/V)

실시예 1

2.5 mM의 2'-데옥시리보스1-인산디(모노시클로헥실암모늄)염(SIGMA 제품), 2.5 mM의 아데닌(와코 쥰야꾸 제품, 특급), 12 units/ml의 푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제(후나고시 제품), 10 mM의 염화칼슘(와코 쥰야꾸, 특급), 10 mM 트리스염산 완충액(pH 7.4)으로 이루어지는 반응액 1 ml을 30 ℃에서 24 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 백색의 침전물이 생성되어 있었다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 2.40 mM의 데옥시아데노신이 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 96.0 %이었다.

비교예 1

염화칼슘을 첨가하지 않은 것 이외에는 전부 실시예 1과 동일 순서와 조건으로 반응을 행하였다. 반응 종료 후 침전물은 생성되지 않았다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 2.01 mM의 데옥시아데노신이 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 80.4 % 이었다.

실시예 2

염화칼슘 농도를 2.5 mM으로 하는 것 이외에는 전부 실시예 1과 동일 순서와 조건으로 반응을 행하였다. 반응 종료 후 백색의 침전물이 생성되어 있었다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 2.27 mM의 데옥시아데노신이 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 90.8 %이었다.

실시예 3

염화칼슘 대신에 염화알루미늄을 첨가하는 것 이외에는 전부 실시예 1과 동일 순서와 조건으로 반응을 행하였다. 반응 종료 후 백색의 침전물이 생성되어 있었다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 2.31 mM의 데옥시아데노신이 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 93.3 % 이었다.

실시예 4

염화칼슘 대신에 염화바륨을 첨가하는 것 이외에는 전부 실시예 1과 동일 순서와 조건으로 반응을 행하였다. 반응 종료 후 백색의 침전물이 생성되어 있었다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 2.31 mM의 데옥시아데노신이 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 92.4 % 이었다.

실시예 5

염화바륨 농도를 2.5 mM으로 하는 것 이외에는 전부 실시예 4와 동일 순서와 조건으로 반응을 행하였다. 반응 종료 후 백색의 침전물이 생성되어 있었다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 2.27 mM의 데옥시아데노신이 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 90.2 % 이었다.

실시예 6

문헌[Journal of Biological Chemistry, Vol.184, pp 449-459, 1950]에 기재된 방법에 따라 2-데옥시리보스1-인산바륨염을 제조하였다. 2.5 mM의 2-데옥시리보스-1-인산바륨염, 2.5 mM의 아데닌(와코 쥰야꾸 제품, 특급), 12 units/ml의 푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제(후나고시 제품), 10 mM의 염화칼슘(와코 쥰야꾸, 특급), 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 이루어지는 반응액 1 ml을 30 ℃, 24 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 백색의 침전물이 생성되어 있었다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 2.40 mM의 데옥시아데노신이 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 91.1 % 이었다.

실시예 7

2.5 mM의 2-데옥시리보스-1-인산디(모노시클로헥실암모늄)염(SIGMA 제품),2.5 mM의 티민(와코 쥰야꾸 제품, 특급), 12 units/ml의 티미딘포스포릴라아제(SIGMA 제품), 10 mM의 질산칼슘(와코 쥰야꾸, 특급), 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 이루어지는 반응액 1 ml을 30 ℃, 24 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 백색의 침전물이 생성되어 있었다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 2.28 mM의 티미딘이 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 91.2 % 이었다.

비교예 2

질산 칼슘을 첨가하지 않은 것 이외에는 전부 실시예 7과 동일 순서와 조건으로 반응을 행하였다. 반응 종료 후 침전물은 생성되지 않았다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 1.88 mM의 티미딘이 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 75.2 % 이었다.

실시예 8

2.5 mM의 리보스-1-인산시클로헥실암모늄염(SIGMA 제품), 2.5 mM의 2,6-디아미노푸린(알드리치 제품), 12 units/ml의 푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제(후나고시 제품), 10 mM의 염화칼슘(와코 쥰야꾸, 특급), 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 이루어지는 반응액 1 ml을 30 ℃, 24 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 백색의 침전물이 생성되어 있었다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 1.94 mM의 2,6-디아미노푸린리보시드가 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 77.6 % 이었다.

비교예 3

염화칼슘을 첨가하지 않은 것 이외에는 전부 실시예 8과 동일 순서와 조건으로 반응을 행하였다. 반응 종료 후 침전물은 생성되지 않았다. 반응액을 희석한 후 분석했더니 1.54 mM의 2,6-디아미노푸린리보시드가 생성되어 있었다. 그 때의 반응 수율은 61.6 % 이었다.

실시예 9

대장균 염색체 DNA를 다음과 같이 하여 제조하였다. 대장균 K-12/XL-10주(Stratagene 사)를 50 ml의 LB 배지에 접종하고, 37 ℃에서 하룻 밤 배양한 후 집균하여 리소자임 1 mg/ml를 포함하는 용균액으로 용균하였다. 용균액을 페놀 처리한 후, 통상의 방법으로 에탄올 침전에 의해 DNA를 침전시켰다. 발생한 DNA의 침전은 유리 막대에 감아 회수한 후, 세정하여 PCR에 이용하였다.

PCR용의 프라이머에는 대장균의 공지된 deoD 유전자의 염기 서열(GenBank accession No. AE000508(코드 영역은 염기 번호 11531-12250)에 기초하여 설계한 서열 번호 1 및 2에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(호까이도 시스템·사이언스 가부시끼 가이샤)에 위탁하여 합성하였다)를 이용하였다.

서열 번호 1:

gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc

서열 번호 2:

tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt

이러한 프라이머의 5'말단 부근 및 3'말단 부근에는 각각 EcoRI 및 Hind III의 제한 효소 인식 서열을 갖는다.

제한 효소 Hind III로 완전히 소화된 상기 대장균 염색체 DNA 6ng/μl 및 프라이머 각 3 μM을 포함하는 0.1 ml의 PCR 반응액을 이용하여 변성: 96 ℃, 1분간, 어닐링: 55 ℃, 1분간, 신장 반응: 74 ℃, 1 분간으로 이루어지는 반응 사이클을, 30 사이클의 조건으로 PCR을 행하였다.

상기 반응 산물 및 플라스미드 pUC18(다까라 주조(주))를 EcoRI 및 Hind III로 소화하고, 라이게이션·하이(도요보(주))를 이용하여 연결한 후, 얻어진 재조합플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α를 형질 전환하였다. 형질 전환주를 암피실린(Am) 50 μg/ml 및 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함하는 LB 한천 배지에서 배양하여 Am 내성이며 또한 백색 콜로니가 된 형질 전환주를 얻었다.

이와 같이 하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 추출하여 목적으로 하는 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 pUC-PNP73이라 명명하였다. 이렇게 하여 얻어진 형질 전환체를 대장균 MT-10905라 이름 붙였다.

대장균 MT-10905주 Am 50 μg/ml을 포함하는 LB 배지 100 mL에서 37 ℃·하룻밤 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액을 13000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 균체를 모았다. 균체를 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 8.0) 10 mL에 현탁하여 초음파로 파쇄한 것을 효소원으로서 이용하였다.

100 mM의 2'-데옥시리보스1-인산디(모노시클로헥실암모늄)염(SIGMA 제품), 10 내지 80 mM의 아데닌(와코 쥰야꾸 제품, 특급), 100 mM의 트리스 염산 완충액(pH 8.0), 20 units/ml의 상술한 푸린뉴클레오시드 포스포릴라아제로 이루어지는 반응액 1.0 ml을 50 ℃에서 20 시간 반응시켰다. 반응 개시 8 시간 후에150 mM이 되도록 염화 칼슘을 첨가하였다. 결과를 표 1에 나타냈다.

(실시예 9)

아데닌 농도(mM)	반응액의 상태	데옥시아데노신 농도(mM)
10	액상	10
20	액상	18
40	액상	38
60	액상	56
80	액상	79

비교예 4

효소원의 첨가와 동시에 염화칼슘을 첨가하여 실시예 9와 동일하게 반응을 행하였다. 결과를 표 2에 나타냈다.

(비교예 4)

아데닌 농도(mM)	반응액의 상태	데옥시아데노신 농도(mM)
10	액상	10
20	고화	19
40	고화	39
60	고화	58
80	고화	78

비교예 5

완충액을 첨가하지 않고 80 mM의 아데닌의 반응을 실시예 9와 동일하게 행하였다. 결과를 표 3에 나타냈다.

(비교예 5)

아데닌 농도(mM)	반응액의 상태	데옥시아데노신 농도(mM)
80	고화	29

실시예 10

100 mM의 2'-데옥시리보스1-인산디(모노시클로헥실암모늄)염(SIGMA 제품), 10 내지 80 mM의 티민(와코 쥰야꾸 제품, 특급), 100 mM의 트리스 염산 완충액(pH 8.0), 20 units/ml의 티미딘포스포릴라아제(SIGMA 제품)로 이루어지는 반응액 1.0 ml을 50 ℃에서 20 시간 반응시켰다. 반응 개시 8 시간 후에 150 mM이 되도록 염화 칼슘을 첨가하였다. 결과를 표 4에 나타냈다.

(비교예 10)

티민 농도(mM)	반응액의 상태	티미딘 농도(mM)
10	액상	9
20	액상	19
40	액상	38
60	액상	59
80	액상	78

비교예 6

효소원의 첨가와 동시에 염화칼슘을 첨가하여 실시예 10과 동일하게 반응을 행하였다. 결과를 표 5에 나타냈다.

(비교예 6)

티민 농도(mM)	반응액의 상태	티미딘 농도(mM)
10	액상	10
20	고화	19
40	고화	38
60	고화	58
80	고화	79

비교예 7

완충액을 첨가하지 않고 80 mM의 티민의 반응을 실시예 10과 동일하게 행하였다. 결과를 표 6에 나타냈다.

(비교예 7)

티민 농도(mM)	반응액의 상태	티미딘 농도(mM)
80	고화	26

실시예 11

200 mM의 티민(와코 쥰야꾸 제품, 특급), 200 mM의 트리스 염산 완충액(pH 8.0), 20 units/ml의 티미딘포스포릴라아제(SIGMA 제품)로 이루어지는 반응액 0.5 ml을 50 ℃로 보온하고, 2'-데옥시리보스1-인산디(모노시클로헥실암모늄)염(SIGMA 제품)의 200 mM 용액을 효소액 첨가 후 1 시간 간격으로 0.1 mL씩 5회로 나누어 첨가하였다. 그 결과, 반응액은 액상 그대로였다.

비교예 8

트리스 염산 완충액을 존재시키지 않고 효소원의 첨가와 동시에 200 mM의 2-데옥시리보스1-인산디(모노시클로헥실암모늄)염(SIGMA 제품) 0.5 mL을 첨가하여 실시예 11과 동일하게 반응을 행하였다. 그 결과, 반응액은 고화되었다.

실시예 12

200 mM의 2'-데옥시리보스1-인산디(모노시클로헥실암모늄)염(SIGMA 제품), 200 mM의 트리스 염산 완충액(pH 8.0), 20 units/ml의 티미딘포스포릴라아제(SIGMA 제품), 150 mM의 염화칼슘으로 이루어지는 반응액 0.5 ml을 50 ℃로 보온하고, 200 mM의 티민(와코 쥰야꾸 제품, 특급) 용액을 1 시간 간격으로 0.1 mL씩 5회로 나누어 첨가하였다. 그 결과, 반응액은 액상 그대로였다.

비교예 9

트리스 염산 완충액을 존재시키지 않고 효소원의 첨가와 동시에 200 mM의 티민 용액 0.5 mL을 첨가하여 실시예 12와 동일하게 반응을 행하였다. 그 결과, 반응액은 고화되었다.

이후의 실시예 등에서 생성된 뉴클레오시드 화합물은 전부 이하의 분석 조건으로 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정량하였다.

컬럼: YMC-Pack ODS-A514 300×6.0 mm I.D. (YMC Co., Ltd)

컬럼 온도: 40 ℃

펌프 유속: 1 ml/분

검출 파장: UV 254 nm

용리액: 20 mmol의 아세트산 암모늄 수용액(2700 ml)에 인산을 첨가하여 pH 3.5으로 조정하고, 메탄올(300 ml)을 첨가하여 혼합, 탈기한다.

내표준 물질: 니코틴산

참고예 1

2-데옥시리보스1-인산디(암모늄)염의 합성

2-데옥시리보스1-인산디(모노시클로헥실암모늄)염(1 g, 2.42 mmol, SIGMA 제품)을 메탄올(10 g)에 현탁하여 암모니아 가스(0.62 g, 36.5 mmol)를 불어 넣고, 50 ℃에서 2 시간 교반한다. 얻어진 반응 매스를 30 ℃에서 여과 후, 메탄올(5 g)로 2회 세정, 건조하여 목적으로 하는 2'-데옥시리보스1-인산디(암모늄)염(0.57 g)을 수율 95 %로 얻었다.

¹H-NMR(D₂O, 270 MHz) d 5.56(s,1H), 4.03(m,2H), 3.52(dd,J= 3.3,12.2 Hz, 1H), 3.41(dd,J=5.3,12.2Hz,1H), 2.17(m,1H), 1.87(d,J=13.9Hz,1H), MS(APCI) m/z 213(M-H)

실시예 13

2'-데옥시구아노신의 합성(1)

2-데옥시리보스1-인산디(모노시클로헥실암모늄)염(3.22 g, 7.72 mmol, SIGMA 제품)을 물(47.1 g)에 용해하고, 실시예 9에서 얻은 효소액(0.1 ml)을 첨가한 반응액에, 4.02 중량%의 수산화 나트륨 수용액(16.45 g, 16.5 mmol)에 구아닌(1 g, 6.62 mmol)을 용해한 액을 50 ℃에서 1 시간에 걸쳐 적하하였다. 반응 매스를 동일 온도에서 2 시간 반응 후, 반응 매스를 HPLC로 분석했더니 목적으로 하는 2'-데옥시구아노신이 반응 수율 80 %로 얻어졌다.

실시예 14

2'-데옥시구아노신의 합성(2)

참고예 1에서 합성한 2-데옥시리보스1-인산디(암모늄)염(2.0 g, 7.72 mmol)을 물(47.1 g)에 용해하고, 실시예 9에서 얻은 효소액(0.1 ml)을 첨가한 반응액에, 4.02 중량%의 수산화나트륨 수용액(16.45 g, 16.5 mmol)에 구아닌(1 g, 6.62 mmol)을 용해한 액을 50 ℃에서 1 시간에 걸쳐 적하하였다. 반응 매스를 동일 온도에서 2 시간 반응 후, 반응 매스를 HPLC로 분석했더니 목적으로 하는 2'-데옥시구아노신이 반응 수율 81 %로 얻어졌다.

실시예 15

2'-데옥시구아노신의 합성(3)

참고예 1에서 합성한 2-데옥시리보스1-인산디(암모늄)염(2.0 g, 7.72 mmol)을 물(47.1 g)에 용해하고, 실시예 9에서 얻은 효소액(0.1 ml)을 첨가한 반응액에, 5.6 중량%의 수산화칼륨 수용액(16.5 g, 16.5 mmol)에 구아닌(lg, 6.62 mmol)을 용해한 액을 50 ℃에서 1 시간에 걸쳐 적하하였다. 반응 매스를 동일 온도에서 2 시간 반응후, 반응 매스를 HPLC로 분석했더니 목적으로 하는 2'-데옥시구아노신이 반응 수율 79 %로 얻어졌다.

실시예 16

2'-데옥시구아노신의 합성(4)

참고예 1에서 합성한 2-데옥시리보스1-인산디(암모늄)염(2.0 g, 7.72 mmol)을 물(47.1 g)에 용해하고, 실시예 9에서 얻은 효소액(0.1 ml)을 첨가한 반응액에, 2.4 중량%의 수산화리튬 수용액(16.5 g, 16.5 mmol)에 구아닌(1 g, 6.62 mmol)을용해한 액을 50 ℃에서 1 시간에 걸쳐 적하하였다. 반응 매스를 동일 온도에서 2 시간 반응후, 반응 매스를 HPLC로 분석했더니, 목적으로 하는 2'-데옥시구아노신이 반응 수율 96 %로 얻어졌다.

실시예 17

2'-데옥시아데노신의 합성

참고예 1에서 합성한 2-데옥시리보스1-인산디(암모늄)염(2.0 g, 7.72 mmol)을 물(30 g)에 용해하고, 실시예 9에서 얻은 효소액(0.05 ml)을 첨가한 반응액에, 2.4 중량%의 수산화리튬 수용액(16.5 g, 16.5 mmol)에 아데닌(0.89 g, 6.62 mmol)을 용해한 액을 50 ℃에서 1 시간에 걸쳐 적하하였다. 반응 매스를 동일 온도에서 2 시간 반응 후, 반응 매스를 HPLC로 분석했더니 목적으로 하는 2'-데옥시아데노신이 반응 수율 98 %로 얻어졌다.

실시예 18

2'-데옥시아데노신의 합성

순수한 물(13 g)에 2-데옥시리보스1-인산2암모늄염(1.67 g, 6.7 mmol), 아데닌(0.87 g, 6.4 mmol)과 수산화마그네슘(0.59 g, 10.1 mmol)를 첨가하였다. 상기매스에 0.05 ml의 효소액을 첨가하여 45 ℃, 3시간 교반하에 반응시켰다. 그 때의 반응 수율은 98 % 이었다. 얻어진 반응 매스를 70 ℃로 가열하여 2'-데옥시아데노신을 용해한 후, 반응으로 생성된 불용인 인산마그네슘을 5 A 여과지를 이용하여 여과, 물(5 g)로 세정하여 맑은 여과액(18.2 g)을 반응 매스로부터 99 %의 수율로 얻었다. 이 여과 속도는 1000 kg/m3/hr이고, 여과케이크로의 2'-데옥시아데노신의손실율은 1 % 이었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 5 ℃에서 2 시간 정석하여 석출된 결정을 여과, 물(5 g)로 세정, 감압 건조하여 목적으로 하는 2'-데옥시아데노신(1.6 g)을 수율 93 %로 얻었다.

비교예 10

2'-데옥시아데노신의 합성

순수한 물(13 g)에 2-데옥시리보스1-인산2암모늄염(1.67 g, 6.7 mmol), 아데닌(0.87 g, 6.4 mmol) 및 0.05 ml의 효소액을 현탁한 액에 45 ℃에서 염화칼슘 1수화물(1.48 g)을 녹인 수용액(3.7 g) 및 4 % 수산화나트륨 수용액(20.1 g)을 동시에 2 시간에 걸쳐 적하하였다. 적하 종료 후, 반응 매스를 동일 온도에서 3 시간 반응시켰다. 그 때의 반응 수율은 97 % 이었다. 얻어진 반응 매스를 70 ℃로 가열하여 2'-데옥시아데노신을 용해한 후, 반응으로 생성된 불용인 인산 칼슘을 5 A 여과지를 이용하여 여과, 물(5 g)로 세정하여 맑은 여과액(28.2 g)을 반응 매스로부터 85 %의 수율로 얻었다. 이 여과 속도는 50 kg/m3/hr이고, 여과 케이크로의 2'-데옥시아데노신의 손실율은 15 % 이었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 5 ℃에서 2시간 정석하여 석출된 결정을 여과, 물(5 g)로 세정, 감압 건조하여 목적으로 하는 2'-데옥시아데노신(1.3 g)을 수율 75 %로 얻었다.

실시예 19

2'-데옥시아데노신의 합성

순수한 물(13 g)에 2-데옥시리보스1-인산2암모늄염(1.67 g, 6.7 mmol), 아데닌(0.87 g, 6.4 mmol)과 수산화마그네슘(0.59 g, 10.1 mmol)을 첨가하였다. 상기매스에 실시예 9에서 얻은 효소액(0.05 ml)을 첨가하여 45 ℃, 3 시간 교반하에 반응시켰다. 3 시간 후에 반응 매스를 HPLC로 분석했더니 목적으로 하는 2'-데옥시아데노신이 반응 수율 98 %로 얻어졌다. 이 때의 반응 중의 pH는 8 내지 10을 나타냈다.

실시예 20

2'-데옥시구아노신의 합성

순수한 물(15 g)에 2-데옥시리보스1-인산2암모늄염(1.67 g, 6.7 mmol), 구아닌(0.92 g, 6.1 mmol)과 수산화마그네슘(0.59 g, 10.1 mmol)을 첨가하였다. 상기매스에 실시예 9에서 얻은 효소액(0.2 ml)을 첨가하여 50 ℃, 6시간 교반하에 반응시켰다. 6 시간 후에 반응 매스를 HPLC로 분석했더니 목적으로 하는 2'-데옥시구아노신이 반응 수율 98 %로 얻어졌다. 이 때의 반응 중의 pH는 8 내지 10을 나타냈다.

실시예 21

2'-데옥시아데노신의 합성

순수한 물(13 g)에 2-데옥시리보스1-인산2암모늄염(1.67 g, 6.7 mmol), 아데닌(0.87 g, 6.4 mmol)과 수산화마그네슘(0.59 g, 10.1 mmol)을 첨가하였다. 상기매스에 실시예 9에서 얻은 효소액(0.05 ml)을 첨가하고, 아세트산으로 pH를 8.5로 조정하면서 45 ℃, 3 시간 교반하에 반응시켰다. 3 시간 후에 반응 매스를 HPLC로 분석했더니 목적으로 하는 2'-데옥시아데노신이 반응 수율 98 %로 얻어졌다.

비교예 11

2'-데옥시아데노신의 합성

순수한 물(13 g)에 2-데옥시리보스1-인산2암모늄염(1.67 g, 6.7 mmol), 아데닌(0.87 g, 6.4 mmol)과 염화마그네슘6수염(2.05 g, 10.1 mmol)을 첨가하였다. 상기 매스에 실시예 9에서 얻은 효소액(0.05 ml)을 첨가하여 45 ℃, 3시간 교반하에 반응시켰다. 3 시간 후에 반응 매스를 HPLC로 분석했더니 목적으로 하는 2'-데옥시아데노신이 반응 수율 65 %로 얻어졌다. 이 때의 반응 중의 pH는 6 내지 7.5를 나타냈다.

비교예 12

2'-데옥시구아노신의 합성

순수한 물(15 g)에 2-데옥시리보스1-인산2암모늄염(1.67 g, 6.7 mmol), 구아닌(0.92 g, 6.1 mmol)과 염화마그네슘6수염(2.05 g, 10.1 mmol)을 첨가하였다. 상기 매스에 실시예 9에서 얻은 효소액(0.2 ml)을 첨가하여 50 ℃, 3 시간 교반하에 반응시켰다. 3 시간 후에 반응 매스를 HPLC로 분석했더니 목적으로 하는 2'-데옥시구아노신이 반응 수율 65 %로 얻어졌다. 이 때의 반응 중의 pH는 6 내지 7.5를 나타냈다.

비교예 13

2'-데옥시아데노신의 합성

실시예 21과 동일하게 반응 pH를 아세트산 또는 암모니아, NaOH를 사용하여 조정하면서 반응을 행했을 때의 수율을 하기의 표 7에 나타냈다. 결과로부터 pH가 7.5미만이든 10.5 이상이든 수율이 저하된다는 것을 알 수 있었다.

pH에 의한 수율의 변화

반응 pH	7.2	8.0	9.0	9.5	10.6
반응 수율	83	99	99	99	22

비교예 14

2'-데옥시아데노신의 합성

실시예 19, 비교예 11의 반응 방법에서 반응 pH를 암모니아를 사용하여 9.0으로 조정하면서, 첨가하는 순수한 물의 양을 변화시켰을 때의 반응 수율의 변화를 하기의 표 8에 나타냈다. 이 표로부터 염화물의 염에서는 생성되는 염화암모늄의 영향으로 반응 농도를 낮게 해야 수율이 향상된다는 것을 알 수 있었다.

마그네슘염	염화 마그네슘	수산화 마그네슘
순수한 물 첨가량	30 g	20 g	13 g	30 g	20 g	13 g
반응 수율	98	90	80	99	99	98

본 발명에 따르면, 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 이 효소 활성을 갖는 미생물을 이용한 펜토스-1-인산과 핵산 염기로부터의 뉴클레오시드 화합물의 제조에 있어서, 인산과 난수용성염을 형성할 수 있는 금속염을 첨가함으로써 부생하는 인산이 반응계로부터 제외되어 종래 기술에서는 달성되지 않았던 반응 수율의 향상이 달성된다. 또한, 반응액의 고점도화나 고화를 발생시키지 않고 뉴클레오시드화합물을 고수율이며 효율적으로 생산하는 것이 가능해진다. 이러한 것은 공업적 견지에서 본 발명은 커다란 비용 절감으로 이어져 그 의의는 크다.

핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 수산화리튬 등의 알칼리 수용액에 용해하여 첨가하면 반응 조작이 간편해진다.

인산 이온과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온의 염으로서 수산화마그네슘을 이용하면 수산화마그네슘의 물에 대한 용해도가 낮기 때문에

(1) 반응 중에 반응액의 pH가 거의 변화하지 않아서 효소의 실활이 방지된다(수산화마그네슘 이외의 수용성 금속 양이온의 염을 이용하면 반응 중에 반응액의 pH는 약간 알칼리성 쪽으로 변화한다),

(2) 반응에 따른 반응액의 염 농도의 상승이 없어서 염 농도의 상승에 의한 반응 저해가 방지되고, 덧붙여 보다 고농도의 반응이 가능해진다,

(3) 금속 양이온을 반응전에 일괄적으로 첨가 가능하다는 등의 이점이 있다. 또한, 금속 양이온으로서 마그네슘 이온을 이용하면 반응 종료 후에 반응액을 여과하는 공정에서 그 여과 속도가 현저히 향상되기 때문에 공업상 매우 유용하다.

<110> MITSUI CHEMICALS, INC. <120> Method of producing a nucleoside compound <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of purine nucleoside phosphorylase of E.coli K-12 <400> 1 gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer for cloning of purine nucleoside phosphorylase of E.coli K-12 <400> 2 tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt 29

Claims (13)

1. 수성 반응 매체 중에서 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 존재하에 펜토스-1-인산과 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 인산 이온과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온 존재하에 반응시켜 뉴클레오시드 화합물을 생성시키는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법으로서, 반응 개시 후에 상기 펜토스-1-인산, 상기 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체, 및 상기 금속 양이온으로부터 선택한 1종 이상의 성분을 반응 도중의 수성 반응 매체 중에 첨가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 펜토스-1-인산이 리보스-1-인산 또는 2-데옥시리보스-1-인산인 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
3. 제1 또는 2항에 있어서, 상기 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온이 칼슘 이온, 바륨 이온, 알루미늄 이온, 리튬 이온 및 마그네슘 이온 중에서 선택되는 1종 이상인 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온을 염소 이온, 질산 이온, 탄산 이온, 황산 이온, 아세트산 이온 및 수산화 이온 중에서 선택되는 1종류 이상의 음이온과의 금속염으로서 수성 반응 매체 중에 첨가하는뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 인산과 난수용성 염을 형성할 수 있는 금속 양이온을 펜토스-1-인산의 염으로서 수성 반응 매체 중에 첨가하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 반응 개시 후에 상기 수성 반응 매체에 첨가되는 1종 이상의 성분 중의 1종 이상에 대하여, 그 반응 종료까지 첨가하는 양을 2회 이상으로 분할하거나 연속적으로 서서히 상기 수성 반응 매체에 첨가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
7. 제1 또는 6항에 있어서, 상기 펜토스-1-인산, 상기 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체 및 상기 금속 양이온의 3종 성분의 반응 종료까지 첨가하는 양이 이들 성분을 수성 반응 매체에 일괄해서 첨가·반응시켰을 경우에 수성 반응 매체에 고점도화 또는 고화가 발생하며, 또한 상기 반응 개시 후의 1종 이상 성분의 반응 종료까지의 첨가량의 일부 또는 전부를 상기 반응 개시 후에 분할 첨가함으로써 상기 반응액의 고점도화 또는 고화가 방지되는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
8. 제1 또는 2항에 있어서, 상기 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 알칼리 수용액으로서 첨가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 용해하는 알칼리 수용액이 수산화리튬, 탄산리튬 및 탄산수소리튬 중 하나 이상을 함유하는 용액인 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
10. 수성 반응 매체 중에서 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 존재하에 펜토스-1-인산과 핵산 염기 또는 핵산 염기 유사체를 인산과 난수용성 염을 형성하는 금속 양이온의 염의 존재하에 pH를 조정하지 않고 반응시켜 뉴클레오시드 화합물을 생성시키는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법으로서, 상기 금속 양이온의 염이 난수용성 염인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
11. 제10항에 있어서, 금속 양이온의 염이 수산화마그네슘, 산화마그네슘, 탄산마그네슘 및 염기성 탄산마그네슘으로부터 선택된 1종 이상인 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
12. 제11항에 있어서, 반응시의 수성 반응 매체의 pH가 7.5 내지 10.0의 범위인 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.
13. 제11항에 있어서, 반응에 의해 얻어진 반응액을 여과하여 반응액 중의 불용성 물질을 제거하고 뉴클레오시드 화합물을 함유하는 여과액을 얻는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 화합물의 제조 방법.