JPH0763385B2 - チミジンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） チミジンは医薬原料、特に最近世界的に問題になってい
るエイズ（AIDS）に対する最も効果のある治療約として
知られているアジドチミジンの原料であり大重合成法の
確立が望まれている。

本発明は微生物を利用したこのチミジンの製造方法に関
するものである。

（従来の技術） チミジンの製造法としては２′−デオキシリボースとチ
ミンからの化学合成法が良く知られているが収率が非常
に悪い為にチミジンの工業的製造方法はDMA（デオキシ
リボ核酸）の加水分解物よりの抽出に限られている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、従来の抽出法においては、DNAの加水分解中に
目的のチミジン以外に２′−デオキシアデノシン、２′
−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジン、更に
は２′−デオキシアデノシンの脱アミノ化された２′−
デオキシイノシンが含まれており抽出工程が繁雑しかも
コスト高の方法である為に、更に効率の良い方法の開発
が望まれているのが現状である。

（問題点を解決する為の手段） 本発明者はこのような目的を達成するべく鋭意検討の結
果、DNAの加水分解生成物であるチミジン以外の２′−
デオキシリボヌクレオシド（２′−デオキシアデノシ
ン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジ
ンあるいは２′−デオキシアデノシンが脱アミノ化され
た２′−デオキシイノシン）又は２′−デオキシリボー
ス−１−リン酸に、化学合成法で安価に供給されるチミ
ンを微生物の存在下に作用させることにより、これらの
物質がチミジンに変換されることを見い出し本発明を完
成させるに至った。

尚、２′−デオキシリボース１−リ酸は市販の試薬を用
いてもよく、またDNAの加水分解生成物の２′−デオキ
シリボヌクレオシドを更に加リン酸分解して得てもよ
い。

本発明を簡単に記すと以下の通りである。

即ち本発明は２′−デオキシリボース−１−リン酸と
チミンからチミジンを生成せしめる方法、２′−デオ
キシアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′−デ
オキシシチジン及び２′−デオキシイノシン等の２′−
デオキシリボヌクレオシドと無機リン酸またはその塩と
チミンからチミジンを生成せしめる方法である。

本発明の更に有利な点は、上記２′−デオキシリボヌク
レオシドを混合して用いても効率良く反応が進行するの
でDNAを加水分解して得られる２′−デオキシリボヌク
レオシド溶液に、本発明に使用される微生物（単独でも
複数の微生物を混合しても良い）の存在下、チミンを作
用させれば上記加水分解物中のチミジン以外の２′−デ
オキシリボヌクレオシドがチミジンに変換されるためチ
ミジン含量の極めて高い反応液が得られることにある。

本発明に用いる微生物はアクロモバクター属、アグロバ
クテリウム属、アースロバクター属、バチルス属、ブレ
ビバクテリウム属、セルロモナス属、コリネバクテリウ
ム属、フラボバクテリウム属、ロドコッカス属、クルイ
ヘラ属、ミコバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミコ
プラナ属、プラノコッカス属、プロタミノバクター属、
シュードモナス属、リゾビウム属、サルモネラ属、ザル
チナ属、ストレプトマイセス属、ビブリオ属、スタフィ
ロコッカス属、ヘモフィラス属、ハフニア属、クルチア
属、ミクロバクテリウム属、ノカルディア属、プロピオ
ニバクテリウム属、エルビニア カロトボラ又はプロテ
ウス レッテゲリに属する。

尚、反応基質の種類により、使用する微生物は異なる。
即ち、２′−エドキシリボース−１−リン酸とチミンよ
りチミジンを生成する場合及び２′−デオキシアデノシ
ンあるいは２′−デオキシグアノシンあるいは２′−デ
オキシイノシンと無機リン酸またはその塩とチミンから
チミジンを生成する場合に用いる微生物としては以下の
ものがある。

アクロモバクター ビスコサス ATCC−12448 （Achromobacter viscosus） アグロバクテリウム ラジオバクターATCC−4718 （Agrobacterium radiobacter） アースロバクター シンプレクス ATCCM6949 （Arhrobacter simplex） バチルス ズブチリス ATCC−6633 （Bacillus subtilis） ブレビバクテリウム アセチリカム ATCC−954 （Brevibacterium acetylicum） セルロモナス フラヴィゲナ ATCC−488 （Cellulomonas flavigens） コリネバクテリウム キセロシス ATCC−373 （Corynebacterium xerosis） エルビニア カロトボラ ATCC−7403 （Erwinia carotovora） フラボバクテリウム アクアタイレ ATCC−8375 （Flavobacterium aquatile） ロドコッカス ロドクラウス ATCC−19149 （Rhodococcus rhodochraus） クルイヘラ シトロフィラ FERM−P 3149 （Kluyvera citrophila） ミコバクテリウム ラクチクム ATCC−8180 （Mycobacterium lacticum） ミクロコッカス ロゼウス ATCC−9815 （Micrococcus roseus） ミコプラナ ディモルファ ATCC−4279 （Mycoplana dimorpha） プラノコッカス シトレウス ATCC−15234 （Planococcus citreus） プロタミノバクター アルボフラブス ATCC−8458 （Protaminobacter alboflavus） プロテウス レッテゲリ FERM−P 4796 （Proteus rettegeri） シュードモナス ローゼオブバリア FERM−P 9471 （Pseudomonas roseobubalia） リゾビウム メリロッティ FERM−P 8197 （Rhizobium meliloti） サルモネラ チフムリウム FERM−P 9470 （Salmonella typhimurium） ザルチナ アルビダ FERM−P 7048 （Sartina albida） ストレプトマイセス フミファー FERM−P 8195 （Streptomyces fumifer） ビブリオ メチュニコビ ATCC−7708 （Vibrio metschnikovii） スタフィロコッカス シトレウス IFO 3332 （Staphyrococcus citreus） 一方、２′−デオキシシチジンと無機リン酸またはその
塩とチミンからチミジンを生成する場合の微生物として
は アグロバクテリウム ラジオバクター ATCC−4718 （Agrobacterium radiobacter） アースロバクター シトレウス ATCC−11624 （Arthrobacter citreus） バチルス スフェリカス FERM−P 9468 （Bacillus sphericus） ブレビバクテリウム テスタシウム FERM−P 9469 （Brevibacterium testaceum） コリネバクテリウム キセロシス ATCC−373 （Corynebacterium xerosis） フラボバクテリウム アクアタイレ ATCC−8375 （Flavobacterium aquatile） プラノコッカス シトレウス ATCC−15234 （Planococcus citreus） シュードモナス ローゼオブバリア FERM−P 9471 （Pseudomonas roseobubalia） ザルチナ アルビダ FERM−P 7048 （Sartina albida） ヘモフィラス インフルエンザエ FERM BP−1863 （Haemophilus influenzae） スタフィロコッカス シトレウス IFO 3332 （Staphyrococcus citreus） ストレプトマイセス アンチビオティクス FERM−P 94
72 （Streptomyces antibioticus） アクロモバクター ビスコサス ATCC−12448 （Achromobacter viscosus） セルロモナス フラビゲナ ATCC−488 （Cellulomonas flavigena） ハフニア アルベイ ATCC−9760 （Hafnia alvei） クルイヘラ シトロフィラ FERM−P 8193 （Kluyvera citrophila） クルチア ゾフィー ATCC−6900 （Kurthia zophii） ミクロバクテリウム インペリアブル ATCC−8365 （Microbacterium imperiable） ミクロコッカス ルテウス ATCC−11880 （Micrococcus luteus） ミコプラナ ディモルファ ATCC−4279 （Mycoplana dimorpha） ノカルディア アステロイデス ATCC−19247 （Nocardia asteroides） プロタミノバクター アルボフラブス ATCC−8458 （Protaminobacter alboflavus） プロピオニバクテリウム シエルマニー FERM−P9737 （Propipnibacterium shermanii） リゾビウム メリロティ FERM−P 8197 （Rhizobium meliroti） ロドコッカス エリスロポリス ATCC−11048 （Rhodococcus erythropolis） サルモネラ チフィムリウム FERM−P 9470 （Salmonella typhimurium） ビブリモ メチュニコビ ATCC−7708 （Vibrio metschnikovii） 等がある。

これらの微生物を用いてチミジンを生成せしめる方法
は、微生物の培養中に基質を添加する培養法を用いても
良いし、また培養した菌体あるいはこの処理物を基質に
作用させる酵素法を用いても良い。

培養法を用いる場合には、炭素源、窒素源、P,S、Fe,Mn
等の無機イオン更に必要ならばビタミン等の微量栄養素
または蛋白分解物、酵母エキスのような有機窒素源を含
有する通常の培地を基本に用いれば良い。

即ち、２′−デオキシリボース−１−リン酸からチミジ
ンを生産する場合には、上記基本培地２′−デオキシリ
ボース−１−リン酸とチミンを適宜添加すればよい。

更に、チミジン以外の２′−デオキシリボヌクレオシド
からチミジンを直接生産する場合には、上記基本培地
に、チミジン以外の２′−デオキシリボヌクレオシドと
リン酸もしくはその塩とチミン添加して培養すればよ
い。

上記基質の添加は培養初期でも培養途中でも構わない。
酵素法を用いる場合の酵素源としては、炭素源、窒素
源、Ｐ、Ｓ、Fe、Mn等の無機イオン、更に必要ならばビ
タミン等の微量栄養素または蛋白分解物、酵母エキスの
ような有機窒素源を含有する通常の培地で培養した培養
液、洗浄菌体が使用できる他に、菌体処理物も使用でき
る。菌体処理物としては、アセトン乾燥菌体、菌体の磨
砕物、菌体の超音波処理物、界面活性剤あるいはトルエ
ン等の処理菌体、リゾチーム等の酵素処理菌体、菌体よ
り抽出した後、塩析等により分離した菌体の蛋白区分、
本反応の酵素活性を有する蛋白区分の精製物、更に本菌
体および菌体処理物の固定化物等いずれもが使用でき
る。培養法を用いる場合でも、酵素法を用いる場合でも
基質として使用する２′−デオキシリボース−１−リン
酸、２′−デオキシアデノシン、２′−デオキシグアノ
シン、２′−デオキシシチジンあるいは２′−デオキシ
イノシンの濃度は１−1000mM程度が適当であり、リン酸
またはその塩の濃度は上記基質の0.01−10倍モル程度が
適当である。無機リン酸の塩は反応の進行を大きく阻害
しないものであればいずれを用いても良く、例えばナト
リウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム
塩、マグネシウム塩、等の無機塩、さらにはトリメチル
アンモニウム塩等の有機塩が用いられる。２′−デオキ
シアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオ
キシシチジンあるいは２′−デオキシイノシンからチミ
ジンを直接生産する場合でも、２′−デオキシリボース
−１−リン酸からチミジンを生産する場合でも、チミン
の添加量は上記基質と等モルあるいはそれ以上が適当
で、通常１−10倍モル程度が適当である。また、直成生
産させる場合において、基質の２′−デオキシアデノシ
ン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジ
ン又は２′−デオキシイノシンが反応液に残っても良い
場合には、チミンの添加量はこれらの基質の等モル以下
でもよい。

さて、これらを含む水溶液に前記菌体、またはその処理
物を加え、pHを４−10の範囲に調製した後、20−70℃、
望ましくは50−70℃で静置あるいは撹拌しながら10分−
10日間保持すると反応が進行し、反応液中に目的とする
チミジンが著量蓄積される。

反応液よりチミジンを採取する方法は、水等の溶媒に対
する溶解度差を利用したり、イオン交換樹脂や吸着樹脂
を用いる方法で行うことができる。またチミジンの定量
は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法で行なえば
よい。

以下、実施例に従って本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ 酵母エキス0.5g/dl、ペプトン1.0g/dl、肉エキス1.0g/d
lおよびNaCl0.5g/dlを含む培地（pH7.0）50mlを500ml容
肩付フラスコに分注し殺菌した。この培地に、ブイヨン
寒天培地にて30℃,16時間前培養した第１表に示す微生
物を１白金耳ずつ接種し、30℃にて16時間振とう培養し
た。得られた培養液より菌体を遠心分離により分離した
後、0.05Mリン酸バッファー（pH7.0）で洗浄し、更に遠
心分離することにより洗浄菌体を調製した。

上記洗浄菌体を20mMの２′−デオキシリボース−１−リ
ン酸と20mMのチミンを含む0.05Mトリスバッファー（pH
7.2）10mlに5g/dlになる様に添加し、60℃,24時間反応
させた。各反応液中に生成したチミジンの濃度を高速液
体クロマトグラフィーを用いて測定しその結果を第１表
に示した。

実施例２ 実施例１と同様に培養調製した第２表に示す微生物の洗
浄菌体を20mMの２′−デオキシアデノシンあるいは２′
−デオキシグアノシンあるいは２′−デオキシイノシン
と20mMのチミンを含む100mMのリン酸バッファー（pH7.
0）10mlに5g/dlになる様に添加し、60℃,24時間反応さ
せた。各反応液中に生成したチミジンを実施例１と同様
の方法で測定し、その結果を第２表に示した。

実施例３ 実施例１と同様に培養、調製した第３表に示す微生物の
洗浄菌体を、20mMの２′−デオキシシチジンと20mMのチ
ミンを含む100mMのリン酸バッファー（pH7.0）10mlに5g
/dlになる様に添加し、60℃,24時間反応させた。各反応
液中に生成したチミジンを実施例１と同様の方法で測定
し、その結果を第３表に示した。

実施例４ 実施例１と同様に培養、調製した第４表に示す微生物の
洗浄菌体を、20mMの２′−デオキシシチジンと20mMのチ
ミンを含む100mMのリン酸バッファー（pH7.0）10mlに5g
/dlになる様に添加し、60℃,24時間反応させた。各反応
液中に生成したチミジンを実施例１と同様の方法で測定
し、その結果を第４表に示した。

実施例５ 実施例１と同様の培地を用いて、実施例１と同様の方法
で、37℃,16時間培養したエシェリヒアコリ FERM−P 4
799の培養液に予め殺菌した200mMの２′−デオキシグア
ノシンと200mMのチミンを含む500mMのリン酸バッファー
（pH7.0）5mlを添加し、更に10時間培養を続けた。この
培養液中に生成したチミジンを実施例１の方法と同様に
定量した結果、41mg/dlのチミジンが生成していた。

実施例６ 300mMのリン酸バッファー（pH7.0）と50mMのチミンを含
むサケ精子由来のDNAの酵素水解物（チミジン282mg/d
l、２′−デオキシアデノシン97mg/dl、２′−デオキシ
イノシン124mg/dl、２′−デオキシシチジン121mg/dl、
２′−デオキシグアノシン157mg/dlを含む）10mlに実施
例１と同様に培養調製したスタフィロコッカス シトレ
ウス IFO 3332あるいはバチルス スフェリカス FERM
−P 9468を5g/dlになる様に添加し、60℃,8時間反応さ
せた。

この反応液中のチミジンの量を実施例１と同様の方法で
測定した結果、スタフィロコッカス シトレウス IFO
3332を用いた場合には440mg/dlパチルス スフェリカス
FERM−P 9468を用いた場合には560ml/dlに増加してい
た。

比較例１ 実施例１と同様に培養調製した第５表に示す微生物の洗
浄菌体を20mMの２′−デオキシリボース−１−リン酸と
20mMのチミンを含む0.05Mトリスバッファー（pH7.2）10
mlに5g/dlになる様に添加し、60℃、24時間反応させ
た。各反応液中に生成したチミジンを実施例１と同様の
方法で測定し、その結果を第５表に示した。

第１表と第５表の比較により、エルビニア カロトボラ
ATCC−7403によるチミジンの生成量はエルビニア ア
ミロバラ CCM−1017及びエルビニア ヘルビコラ ATC
C−14537と比べて顕著に高く、また、プロテウス レッ
テゲリ FERM−P 4796によるチミジンの生成量はプロテ
ウス ブルガリス FERM−P 4795と比べて顕著に高いこ
とは明らかである。

比較例２ 実施例１と同様に培養調製した第６表に示す微生物の洗
浄菌体を20mMの２′−デオキシアデノシンあるいは２′
−デオキシグアノシンあるいは２′−デオキシイノシン
と20mMのチミンを含む100mMのリン酸バッファー（pH7.
0）10mlに5g/dlとなる様に添加し、60℃、24時間反応さ
せた。各反応液中に生成したチミジンを実施例１と同様
の方法で測定し、その結果を第６表に示した。

第２表、第３表と第６表の比較により、エルビニア カ
ロトボラ ATCC−7403によるチミジンの生成量はエルビ
ニア アミロバラ CCM−1017及びエルビニア ヘルビ
コラ ATCC−14537と比べて顕著に高く、また、プロテ
ウス レッテゲリ FERM−P 4796によるチミジンの生成
量はプロテウス ブルガリスFERM−P 4795と比べて顕著
に高いことは明らかである。

〔効果〕 本発明の方法を用いると、２′−デオキシリボース−１
−リン酸又はチミジン以外の２′−デオキシリボヌクレ
オシドから効率よく、しかも大量にチミジンを生産する
ことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07 1:13 1:15 1:20 1:265 1:38 1:41 1:42 1:465 1:63 1:44 1:18 1:37 1:21 1:365） (72)発明者 川喜田 哲哉 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１―１ 味の 素株式会社中央研究所内 審査官 谷口 博

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アクロモバクター属、アグロバクテリウム
   属、アースロバクター属、バチルス属、ブレビバクテリ
   ウム属、セルロモナス属、コリネバクテリウム属、フラ
   ボバクテリウム属、ロドコッカス属、クルイヘラ属、ミ
   コバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、
   プラノコッカス属、プロタミノバクター属、シュードモ
   ナス属、リゾビウム属、サルモネラ属、ザルチナ属、ス
   トレプトマイセス属、ビブリオ属、スタフィロコッカス
   属、エルビニア カロトボラ又はプロテウス レッテゲ
   リに属し、２′−デオキシリボース−１−リン酸又はそ
   の塩とチミンからチミジンを生成する能力を有する微生
   物を水性媒体中で２′−デオキシリボース−１−リン酸
   又はその塩とチミンに作用させてチミジンを生成させ、
   これを取得することを特徴とするチミジンの製造方法。
2. 【請求項２】アクロモバクター属、アグロバクテリウム
   属、アースロバクター属、バチルス属、ブレビバクテリ
   ウム属、セルロモナス属、コリネバクテリウム属、フラ
   ボバクテリウム属、ロドコッカス属、クルイヘラ属、ミ
   コバクテリウム属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、
   プラノコッカス属、プロタミノバクター属、シュードモ
   ナス属、リゾビウム属、サルモネラ属、ザルチナ属、ス
   トレプトマイセス属、ビブリオ属、スタフィロコッカス
   属、ヘモフィラス属、ハフニア属、クルチア属、ミクロ
   バクテリウム属、ノカルディア属、プロピオニバクテリ
   ウム属、エルビニア カロトボラ又はプロテウス レッ
   テゲリに属し、チミジン以外の２′−デオキシリボヌク
   レオシド及び無機リン酸もしくはその塩とチミンからチ
   ミジンを生成する能力を有する微生物を水性媒体中でチ
   ミジン以外の２′−デオキシリボヌクレオシド及び無機
   リン酸もしくはその塩とチミンに作用させて、チミジン
   を生成させ、これを取得することを特徴とするチミジン
   の製造方法。
3. 【請求項３】２′−デオキシリボヌクレオシドが２′−
   デオキシアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′
   −デオキシイノシン又は２′−デオキシシチジンである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第（２）項記載の製造
   方法。