CN109628527B - 一种梯度pH法制备胸苷的方法 - Google Patents

一种梯度pH法制备胸苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种梯度pH法制备胸苷的方法，以DNA水解液为底物与胸腺嘧啶混合，以固定化大肠杆菌细胞为催化剂反应制备胸苷，在制备过程中通过利用梯度pH法加入磷酸盐缓冲液调节体系反应前期、反应后期的pH值，可有效提高反应速率，大大缩短反应时间；利用包埋‑交联法制备固定化大肠杆菌，较好的提高了菌体对底物的耐受性，其中添加的活性炭能降低固定化大肠杆菌的内扩散阻力，有利于物质在固定化大肠杆菌中的扩散，有效提高反应速率，且固定化大肠杆菌细胞操作稳定性好，重复利用性高；采用本发明方法制备胸苷的工艺简单，转化率较好，收率达61％以上，提纯后胸苷纯度可达96％以上。

Description

一种梯度pH法制备胸苷的方法
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种梯度pH法制备胸苷的方法。
背景技术
胸苷是抗艾滋病有效治疗药物齐多夫定和叠氮胸苷的重要原料，在抗病毒、抗肿瘤方面起到了不可替代的作用。目前胸苷的生产方法主要有四种：化学合成法，DNA酶解法，发酵法和酶法。
化学合成法有多种途径，但是其在制备胸苷的过程中糖苷键缺乏立体专一性，原料不易得，且胸苷收率非常低，而且生产过程中有大量废水产生，环境污染大。发酵法是利用微生物培养使其在培养基中积累胸苷，虽然能够规模且单一地生产胸苷，但该方法周期长、易染菌、收率低。酶法是以2′-脱氧核苷和胸腺嘧啶为原料，以菌体或酶为催化介质，催化得到胸苷，尽管酶法具有专一性强、操作简单、反应时间短等优点，但是原料2′-脱氧核苷价格昂贵。目前工业制造主要是以DNA酶解后所得2′-脱氧核苷混合液为原料，但是这种方法受反应平衡的限制，收率较低。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有酶法制备胸苷技术的不足，以DNA水解液(即2′-脱氧核苷混合物)为原料，采用梯度pH法，经酶法转化，提高反应阶段的转化率及缩短反应时间；并利用包埋-交联法对大肠杆菌菌体进行固定，解决目前菌体易于受底物抑制，转化率低的问题，同时提高菌体重复使用率。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：以DNA水解液为底物和胸腺嘧啶混合，以固定化大肠杆菌细胞为催化剂反应制备胸苷，在制备过程中加入磷酸盐缓冲液，采用梯度pH法调节体系反应前期pH为弱酸性，反应后期调节体系pH为弱碱性。
本发明通过如下方案实现：
将DNA水解液和胸腺嘧啶混合，在反应前期加入磷酸盐缓冲溶液并调节体系pH值为5.0～6.0，加入固定化大肠杆菌细胞，在此弱酸性体系下于50～70℃反应2.0～2.5h，反应后期调节体系pH值为7.5～8.5，在此弱碱性体系下反应1.5～2.0h，反应结束；将反应液置于4℃冰箱2～5d，过滤，弃去滤渣，加入活性炭脱色，过滤得到透明液体，减压蒸干，得到微黄色固体粉末；然后用硅胶柱进行等度洗脱分离，制得白色晶体胸苷。
进一步地，所述DNA水解液在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为30～100mmol/L，固定化大肠杆菌细胞的质量浓度为80～200g/L，胸腺嘧啶浓度为DNA水解液浓度的3倍。
进一步地，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0。
进一步地，所述固定化大肠杆菌细胞采用包埋-交联法以PVA和卡拉胶为包埋有机材料、活性炭为添加剂、饱和硼酸和KCI溶液为固定剂溶液制得，具体为：
①将PVA浸泡在水中，加入卡拉胶，加热使两者充分溶解并灭菌，得到混合溶液并待用；
②将大肠杆菌种子接种于液体培养基中，依次经过培养、离心、洗涤和再次离心，得到大肠杆菌细胞；
③将步骤②的大肠杆菌细胞和灭菌活性炭加入到步骤①中的混合溶液中，混匀后，滴加灭菌固定剂溶液进行成型，得到固定化大肠杆菌细胞。
进一步地，所述混合溶液中PVA、卡拉胶、水的质量比为3:0.3:50；所述大肠杆菌细胞和活性炭的质量比为5:1，大肠杆菌细胞在所述混合溶液中的质量浓度为1g/L。
进一步地，所述固定剂溶液为KCl-饱和硼酸溶液，其中KCl的质量分数为4％。
有益效果为：本发明采用梯度pH法通过调节反应前期、反应后期体系的pH值，有效提高反应速率，大大缩短反应时间；采用包埋-交联法制备固定化大肠杆菌，较好的提高了菌体对底物的耐受性，其中添加的活性炭能降低固定化大肠杆菌的内扩散阻力，有利于物质在固定化大肠杆菌中的扩散，有效地提高了反应速率，且固定化大肠杆菌细胞操作稳定性好，重复利用性高；采用本发明方法制备胸苷的工艺简单，转化率较好，收率达61％以上，提纯后胸苷纯度可达96％以上。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步描述本发明，但不限制本发明范围。
实施例1
固定化大肠杆菌细胞的制备：
①将3g PVA浸泡在50ml蒸馏水中24h，再加入0.3g卡拉胶，在110℃保温30min灭菌并使两者充分溶解，混合溶液降温到45℃并保温待用。
②将一环成熟的大肠杆菌种子接种于30mL液体培养基中，30℃、100r/min振荡培养28h，培养液装于无菌离心管中；3000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤，再次离心，得到大肠杆菌细胞。
③将50mg步骤②所得大肠杆菌细胞和10mg灭菌的超细活性碳加入到步骤①的混合溶液中，混匀后用针管滴入经灭菌的KCl-饱和硼酸(pH＝7.0，KCl的质量分数为4％)固定剂溶液进行成型36h，得到固定化大肠杆菌细胞，置于pH7.0的磷酸缓冲溶液中，于4℃下保存待用。
胸苷的制备：
将含3mmol 2′-脱氧核苷的DNA酶解液和9mmol(1.13g)胸腺嘧啶混合，在反应前期加入磷酸盐缓冲溶液至100mL并调节体系pH值为6.0，加入10g步骤③制备的固定化大肠杆菌细胞，60℃下反应2.5h，反应后期调节体系pH值为8.0，继续反应1.5h，反应结束，进行固定化细胞分离；将反应液置于4℃冰箱2～5d，过滤，弃去滤渣，加入活性炭脱色，过滤得到透明液体，60℃减压蒸干，得到微黄色固体粉末；然后用硅胶柱进行分离，选用洗脱剂为V(甲醇)：V(二氯甲烷)＝1:15，进行等度洗脱，得到白色晶体样品1.47g，收率61％，纯度97.2％。
实施例2～5
实施例2～5制备胸苷的方法与实例1的制备方法相同，不同之处见表1，其中底物是DNA水解液(即2′-脱氧核苷混合物)，胸腺嘧啶的浓度为2′-脱氧核苷的3倍。
表1
Figure GDA0003243955260000031
Figure GDA0003243955260000041
由表1可以看出，实施例7中DNA水解液含2′-脱氧核苷80mmol/L，反应温度60℃，反应前期pH 5.5，反应时间2.5h，反应后期pH8.5，反应时间1.5h，胸苷收率达到72.6％，纯度97.2％。
下面对照实验(对比例)采用实施例7的制备方法及工艺参数。
对比例1～4
对比例1～4与实施例7的工艺及参数相同，不同之处见表2。
表2
Figure GDA0003243955260000042
由表2可以看出，实施例7中固定化大肠杆菌细胞催化产物收率明显高于对比例1中游离大肠杆菌，可见采用包埋-交联法制得的固定化大肠杆菌细胞具有良好的底物耐受性，同时也具有良好的操作稳定性和重复利用性；实施例7中采用梯度pH法调节反应前期、反应后期pH值，与对比例2、对比例3、对比例4中维持体系pH值为中性、弱酸性及弱碱性的实验工艺相比，采用梯度pH法调节体系反应前期、反应后期的pH值能较大程度地提高反应速率并缩短反应时间，在一定程度上提高产物收率。
对比例5
对比例5与的实施例7的工艺及参数相同，不同之处见表3。
表3
Figure GDA0003243955260000051
由表3可知，在制备固定化大肠杆菌细胞的过程中采用活性炭为添加剂，能有效提高收率，这得益于包埋材料中活性碳的吸附性能，它能有效降低固定化大肠杆菌的内扩散阻力，有利于物质在固定化大肠杆菌中的扩散，因此在一定程度上能提高反应速率，增加产物收率。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围内。

Claims (4)

1.一种梯度pH法制备胸苷的方法，其特征在于，以DNA水解液为底物与胸腺嘧啶混合，以固定化大肠杆菌细胞为催化剂反应制备胸苷，包括以下步骤制备胸苷：将DNA水解液和胸腺嘧啶混合，在反应前期加入磷酸盐缓冲溶液并调节体系pH值为5.0~6.0，加入固定化大肠杆菌细胞，在此弱酸性体系下于50~70℃反应2.0~2.5 h，反应后期调节体系pH值为7.5~8.5，在此弱碱性体系下反应1.5~2.0h，反应结束；将反应液置于4℃冰箱2～5d，过滤，弃去滤渣，加入活性炭脱色，过滤得到透明液体，减压蒸干，得到微黄色固体粉末；然后用硅胶柱进行等度洗脱分离，制得白色晶体胸苷；
所述固定化大肠杆菌细胞采用包埋-交联法以PVA和卡拉胶为包埋有机材料、活性炭为添加剂、饱和硼酸和KCI溶液为固定剂溶液制得，具体为：
①将PVA浸泡在水中，加入卡拉胶，加热使两者充分溶解并灭菌，得到混合溶液并待用；
②将大肠杆菌种子接种于液体培养基中，依次经过培养、离心、洗涤和再次离心，得到大肠杆菌细胞；
③将步骤②的大肠杆菌细胞和灭菌活性炭加入到步骤①中的混合溶液中，混匀后，滴加灭菌固定剂溶液进行成型，得到固定化大肠杆菌细胞；
所述混合溶液中PVA、卡拉胶、水的质量比为3:0.3:50；所述大肠杆菌细胞和活性炭的质量比为5:1，大肠杆菌细胞在所述混合溶液中的质量浓度为1g/L。
2.根据权利要求1所述的一种梯度pH法制备胸苷的方法，其特征在于，所述DNA水解液在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为30~100 mmol/L，固定化大肠杆菌细胞的质量浓度为80~200g/L，胸腺嘧啶浓度为DNA水解液浓度的3倍。
3.根据权利要求2所述的一种梯度pH法制备胸苷的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0。
4.根据权利要求1所述的一种梯度pH法制备胸苷的方法，其特征在于，所述固定剂溶液为KCl-饱和硼酸溶液，其中KCl的质量分数为4%。
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