JP2011517553A - 遊離細胞によるガラクトオリゴ糖の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は高純度のガラクトオリゴ糖/オリゴ糖の製造方法に関する。本発明はさらに特に、微細濾過膜装置を備えたバイオリアクターに使用される微生物全細胞を用いることによるガラクトオリゴ糖(GOS)の製造方法に関する。本方法の新規性は生物変換の反復サイクルにおける細胞バイオマスの再使用および単糖類および二糖類の分離を伴なわない高純度(>90%)ガラクトオリゴ糖の製造を包含する。
ガラクトオリゴ糖はプレバイオティック(prebiotic)化合物として工業界で広範な用途が見出されている。ガラクトオリゴ糖の製造には、多くの方法が開発されている。数種の方法は種々の微生物源、例えばアスペルギルス オリザエ(Aspergillus oryzae)、ブレラ シングラリス(Bullera singularis)、カンジダ(Candida)、クルベロマイセス種(Kluveromyces sp.)、バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)、ラクトバチルス ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、ストレプトコッカス テルモフィラス(Streptococcus thermophilus)およびビフィドバクテリウム種(Bifidobacterium sp.)から得られるβ−ガラクトシダーゼ酵素の使用を包含する(Akiyama等、2001、Ribu等、2001、Tzorite等、2005、Jorgensen等、2001、Shin等、1998、US5032509、EP0027295A2)。
a.マトリックスおよび交差結合剤は食品級状態での使用にかかわる認可に完全に適合しなければならない、
b.細胞を含む不動化されたビーズの機械的安定性は貧弱である、
c.基質および生成物の拡散には無理があり、そのため生体変換効率は遊離細胞に比較して低い、
d.低変換効率の故に、未反応基質および夾雑物からの生成物分離は困難を伴う作業である。
本発明の主目的は、微細濾過膜装置を備えたバイオリアクターにおいて酵母菌の全細胞を使用し、高純度および高収率でガラクトオリゴ糖(GOS)を製造する方法を提供することにある。
a.最適培地および条件下に糖をオリゴ糖に加水分解する酵素を産生する微生物を増殖させ、ビー.シングラリス(B.singularis)およびサッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)の細胞バイオマスを得る、
b.乳糖を加水分解し、生成されたグルコースを混合微生物培養物により利用する、
c.微細濾過膜装置/遠心分離を用い、微生物培養物からガラクトオリゴ糖を分離する、
d.コットンおよび活性炭/カーボンフィルターを備えた深床フィルターを用い、10〜30ml/分の流速で上記ガラクトオリゴ糖を濾過する、
e.減圧蒸発器において40〜60℃の温度範囲でガラクトオリゴ糖を濃縮し、70〜80%溶解固形物を有するシロップを得る、
f.このシロップを乾燥させ、高純度のガラクトオリゴ糖を無定形粉末として得る、
g.この無定形粉末を結晶化させ、結晶ガラクトオリゴ糖を得る。
本発明が開示する方法は下記図面から明白になるであろう:
遊離細胞による高純度のガラクトオリゴ糖の新規で、改良された製造方法は、最適増殖培地を用いる振とう器フラスコおよび/または醗酵器中における細胞バイオマスの生成、遠心分離/微細濾過膜装置を用いる醗酵培地からの細胞の分離、GOS製造用のバイオリアクター内における混合培養物の使用および生成されるグルコースの利用、糖カラムを用いるHPLSによるGOSの純度の推定、遠心分離/微細濾過膜装置を用いる微生物細胞からのGOSの分離、フィルター手段および活性炭を備えた深層カーボンフィルター/深床フィルターを用いるGOSの濾過、シロップ(70〜80%溶解固形物)形態を得るためのGOSの濃縮、無定形/結晶粉末形態を得るためのGOSの乾燥/結晶化を含んでいる。
乳糖加水分解性ビー.シングラリス(B.singularis)培養物の単離:
ビー.シングラリス(B.singularis)、TCL−IC/NUT−1は下記組成の酵母−麦芽−ペプトン(Yeast−Malt−Peptone)(YMP)培地上において連続希釈法により乳製品の廃液(dairy effluent)から単離した:酵母エキス0.3%、麦芽エキス0.3%、ペプトン0.5%、デキストロース1%および乳糖1%、ならびに寒天2.0%、pH6.5。
培養物をYMP斜面に線状に塗布し、次いで27℃で48時間かけて培養した。これらの斜面培養物を操作用原料培養物として使用した。
250mlフラスコ中のYMP培地50mlに上記斜面培養物を完全ループ形態で接種し、次いで振とう器において27℃で48時間かけ180rpmで培養した。
500mlフラスコ中のYMP培地150mlに、5%接種材料を接種し、次いで振とう器において27℃および180rpmで48時間かけて培養した。試料を振とうフラスコから無菌条件下に採取し、次いで例2に示されているとおりにGOSの生成について分析を行った。
YMP培地3lを5l醗酵器に装入し、次いで殺菌した。この醗酵器に振とうフラスコからの5%接種材料を接種した。醗酵は27℃、pH4.5、600rpm攪拌で、40〜60%溶解酸素を維持するために空気1vvmを用いて行った。醗酵器からの試料を、24時間、48時間および67時間の時点で採取し、例2に示されているとおりに最高GOS生成を測定した。
ガラクトオリゴ糖生成についての分析:
振とうフラスコまたは醗酵器からの細胞懸濁液25mlを遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを40%乳糖溶液15ml中に懸濁し、振とう器上に50℃および280rpm攪拌において保持した。試料0.5mlを採取し、遠心分離し、細胞バイオマスを分離した。この上清をミリQ(milli Q)水により50倍に希釈した。希釈された試料5μlをHPLC装置に注入した。
糖(グルコース、ガラクトース、乳糖およびガラクトオリゴ糖)の濃度をHPLCにより測定した。HPLC(ウオータース(Waters)717)装置は、屈折率検出器(ウオータースW2467)および炭水化物カラムフェノメネックス(Phenomenex)(PNM00h−0316、REZEX300mmLX7.5mm、孔サイズ8μ−)IDカラムから構成されていた。カラム温度は80℃に維持した。流動溶媒として、水を0.5ml/分の流速で使用した。ガラクトオリゴ糖およびその他の糖はピーク面積に基づき総糖の重量パーセントとして測定した。
ビー.シングラリス(B.singularis)の遊離細胞によるガラクトオリゴ糖の製造:
振とうフラスコまたは醗酵器からの細胞懸濁液25mlを遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを30%ラクトース溶液15mlに懸濁し、振とう器上に50℃および180rpm攪拌において保持した。
ビー.シングラリス(B.singularis)の完全細胞によるガラクトオリゴ糖の生成に対する乳糖濃度の効果:
硬化ビーズ100gを加水分解用の20%および40%水性乳糖溶液中に懸濁した。加水分解は180rpmおよび30℃において振とうフラスコで行った。相違する時間間隔で試料0.5mlを採取し、HPLCによりガラクトオリゴ糖について処理した。
GOS生成の反応速度:
サッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)の単離:
この菌株は、麦芽エキス0.3%、酵母エキス0.3%、グルコース1.0%、ペプトン0.5%および寒天2.0%、pH6.4から構成されているMYGP培地上において夾雑デキストロースシロップから単離した。菌株をグルコースおよび乳糖の利用性について特徴確認した。グルコースのみが存在し、乳糖が存在しない場合に増殖する菌株TCL−IC/NUT−2を選択した(lac−、glc+)。この菌種からの振とうフラスコおよび醗酵器内における細胞バイオマス製造は増殖培地を除いてビー.シングラリス(B.singularis)と同様であった。
サッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)による乳糖およびグルコースの加水分解:
振とうフラスコおよび醗酵器からの細胞懸濁液25mlを遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを乳糖20%およびグルコース2%溶液15ml中に懸濁し、振とう器上で50℃および180rpm攪拌下に維持した。試料を一定の時間間隔で採取し、例2に記載のとおりにHPLCにより残留乳糖およびグルコース濃度について分析した。
ビー.シングラリス(B.singularis)およびサッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)の混合遊離細胞の効果:
振とうフラスコまたは醗酵器からのビー.シングラリス(B.singularis)の細胞懸濁液25mlおよびサッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)の懸濁液25mlを混合し、次いで遠心分離し、細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを30%乳糖溶液15ml中に懸濁し、振とう器上で30℃および180rpm攪拌下に維持した。試料0.5mlを相違する時間間隔で採取し、HPLCによりガラクトオリゴ糖について分析した。
微細濾過装置を備えた反応器における混合細胞によるガラクトオリゴ糖の製造:
ビー.シングラリス(B.singularis)およびサッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)の全細胞を等濃度(乾燥重量に基づき1:1)で反応器内において30重量/重量%乳糖溶液と混合した。反応温度は30℃に維持した。24時間後、試料を採取し、GOS濃度について分析した(表6)。
GOS製造の反復サイクル:
ビー.シングラリス(B.singularis)およびサッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)の全細胞を、孔サイズ0.5ミクロン、腔径(ID)340mmおよび面積0.6メーターのポリエチレンスルホネートから形成された膜を有する交差流動式微細濾過装置に連結した反応器内で例9と同様に混合した。GOSの純度か90%以上に到達した時点で、この溶液の50%パーセントを交差流動式微細濾過装置に通すことによって透過により分離し、次いで新鮮な乳糖溶液30%を添加し、反応器内の容量を引続くサイクルの出発時容量にした。このサイクルをGOSの純度が10%低下するまで反復した。
GOSの濃度:
実験例10で得られた溶液を集め、活性炭パッドに通して濾過し、着色物質を除去した。この炭素研磨され、加水分解された溶液を40〜60℃において真空下に濃縮器に通し、70〜80%溶解固形物含有量を有するシロップを得た。
GOSの噴霧乾燥:
希ガラクトオリゴ糖(dilute galactooligosaccharides)を、GOS粉末の製造に使用される4kg/時間の能力を有する噴霧乾燥機(ボバン(Bovan)製)によって噴霧した。250Brixを有する希GOS 5リットルを、ノズルを通し40m/分の速度で散布した。流動速度以外に維持したその他の処理パラメーターは、加圧下に125〜130℃の範囲の温度である。得られた生成物は白色粉末を示した。
Claims (14)
- 遊離細胞による高純度ガラクトオリゴ糖の製造方法であって、以下を含む製造方法:
a)ビー.シングラリス(B.singularis)およびサッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)の細胞バイオマスを得るために、最適培地および条件下に糖をオリゴ糖に加水分解する酵素を産生する微生物を増殖させること
b)乳糖を加水分解し、生成されたグルコースを混合微生物培養物により利用すること
c)微細濾過膜装置または遠心分離を使用し、微生物培養物からガラクトオリゴ糖を分離すること
d)前記ガラクトオリゴ糖をコットンおよび活性炭またはカーボンフィルターを備えた深床フィルターを使用し、10〜30ml/分の流速で濾過すること
e)真空蒸発器において40〜60℃の温度範囲でガラクトオリゴ糖を濃縮し、70〜80%溶解固形物を含有するシロップを得ること
f)前記シロップを乾燥させ、高純度のガラクトオリゴ糖を無定形粉末として得ること
g)前記無定形粉末を結晶化させ、結晶ガラクトオリゴ糖を得ること。 - ビー.シングラリス(B.singularis)およびサッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)を、ホエー廃液および夾雑糖溶液からそれぞれ単離する、請求項1に記載の方法。
- サッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)がlac−glu+またはgal+である、請求項1に記載の方法。
- 上記細胞バイオマスが任意に、アスペルギルス オリザエ(Aspergillus Oryzae)、カンジダ(Candida)、クルベロマイセス種(Kluveromyces sp.)、バチルス サークランス(Bacillus Circulans)、ラクトバチルス ブルガリクス(Lactobacillus Bulgaricus)、ストレプトコッカス テルモフィラス(Streptococcus Thermophilus)およびビフィドバクテリウム種(Bifidobacterium sp.)から選択されるβ−ガラクトシダーゼ酵素産生性微生物培養物から製造される、請求項1に記載の方法。
- 上記細胞バイオマスの増殖を振とう器フラスコおよび醗酵器により行う、請求項1に記載の方法。
- 乳糖をオリゴ糖に加水分解する上記酵素がβ−ガラクトシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、カタラーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼおよびその組合せである、請求項1に記載の方法。
- 微生物細胞の比が乾燥重量に基づき1:1〜1:2である、請求項1に記載の方法。
- 加水分解反応をバイオリアクターにおいて、約3〜約10のpHを有する約15〜約45%乳糖溶液を使用し、約10〜60℃において約50〜200rpmの範囲の攪拌速度で約12〜48時間かけて行う、請求項1に記載の方法。
- 加水分解サイクルを上記追加のバイオマスの添加により反復し、所望の変換効率を補償する、請求項1に記載の方法。
- 上記ガラクトオリゴ糖の濾過をコットンおよび活性炭/カーボンフィルターを備えた深床フィルターを20ml/分の流速で使用して行う、請求項1に記載の方法。
- 透過液を炭素研磨器に通し、次いで0.2ミクロン微細濾過膜装置に通し、着色物質および懸濁炭素粒子を除去する、請求項1に記載の方法。
- 炭素研磨され、加水分解された溶液を減圧下に40〜60℃において濃縮器に通し、70〜80%溶解固形物を含有するシロップを得る、請求項1に記載の方法。
- 上記膜装置が、PES、PTFE、再生セルロースまたはセラミック中空繊維、TFFカセット膜から選択される、請求項1に記載の方法。
- 希ガラクトオリゴ糖の噴霧を、加圧下において、ノズルを通して100〜135℃の温度範囲において行う、請求項1に記載の方法。
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