ES2875327T3 - Producción de oligosacáridos - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de producción de un oligosacárido deseado usando un microorganismo huésped, en el que dicho oligosacárido deseado no se encuentra de forma natural en dicha célula huésped y es un oligosacárido de leche humana, el procedimiento comprende las etapas de: a) cultivar un microorganismo huésped apropiado para la producción de un oligosacárido deseado en condiciones y en un medio permisivo para la producción de dicho oligosacárido, por lo que se producen el oligosacárido y, cuando sea aplicable, los productos intermedios sacáridos biosintéticos y/o productos secundarios; b) usar una glucosidasa en el medio en el que se cultiva el microorganismo huésped, con el fin de degradar los productos intermedios sacáridos biosintéticos y/o los productos secundarios sacáridos y/o sustratos sacáridos no usados, en los que la glucosidasa se agrega al medio; y c) recuperar el oligosacárido deseado.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de oligosacáridos
La presente invención se refiere en general a los procedimientos para la producción de oligosacáridos o polisacáridos, tales como, por ejemplo, la producción de oligosacáridos o polisacáridos mediante fermentación microbiana, y en particular al uso de hidrolasas en tales procedimientos.
La producción comercial de oligosacáridos, junto con el desarrollo de nuevas biotecnologías de fabricación, se ha convertido en un interés creciente en los últimos años. Hoy en día, los oligosacáridos se usan, por ejemplo, como ingredientes alimentarios funcionales, aditivos nutricionales o como nutracéuticos. Tradicionalmente, los oligosacáridos se definen como polímeros de 2 o más (normalmente hasta 10) monosacáridos, sin embargo, también se asimilan con ellos polímeros de hasta 20 a 25. En particular, los oligosacáridos prebióticos son de gran interés, ya que representan compuestos no cariogénicos y no digeribles que estimulan el crecimiento y desarrollo de la microflora gastrointestinal humana.
Actualmente, los oligosacáridos se sintetizan ya sea mediante glucosilación química y de novo usando glucosiltransferasas, o pueden derivar de la degradación química, física o biológica de polisacáridos.
En la actualidad, los fructooligosacáridos y galactooligosacáridos sintetizados o aislados de polisacáridos vegetales representan los oligosacáridos producidos más abundantemente. Sin embargo, debido a los beneficios para la salud superiores, el interés en los oligosacáridos de la leche humana (HMO) como nutracéuticos ha aumentado considerablemente en los últimos años. Está bien establecido que los HMO contribuyen al mecanismo de defensa del cuerpo humano contra los patógenos humanos, el establecimiento de una flora intestinal particular (microbioma) y la estimulación posnatal del sistema inmunológico. Aunque los bebés consumen HMO, se acepta que los efectos beneficiosos de estos oligosacáridos observados durante el período posnatal también se pueden encontrar más adelante en la vida.
Se sabe desde hace mucho tiempo que la leche materna humana, además de lactosa, comprende una mezcla compleja de oligosacáridos denominada oligosacáridos de la leche humana (HMO) que representa una mezcla compleja de oligosacáridos que es única en cuanto a composición y cantidad. En la actualidad, se han caracterizado estructuralmente más de 80 compuestos HMO y, con pocas excepciones, se caracterizan por una unidad estructural de lactosa en el extremo reductor y, a menudo, contienen una fucosa y/o ácido siálico en el extremo no reductor. Generalmente, los monosacáridos de los que se derivan los HMO son D-glucosa, D-galactosa, N-acetilglucosamina, L-fucosa y ácido siálico.
Los oligosacáridos más destacados son 2'-fucosillactosa y 3'-fucosillactosa, que juntos pueden contribuir hasta 1/3 de la fracción total de HMO. Otros HMO prominentes presentes en la leche materna son lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa y las lacto-N-fucopentaosas. Además de estos oligosacáridos neutros, también se pueden encontrar HMO ácidos en la leche materna, como por ejemplo, 3'-sialillactosa, 6'-sialillactosa y 3-fucosil-3'-sialillactosa, disial¡l-Iacto-A/-tetraosa etc. Estas estructuras están estrechamente relacionadas con los epítopos de los glucoconjugados de la superficie de las células epiteliales, los antígenos del grupo histoblood de Lewis como Lewis x (LeX), y la homología estructural de HMO con los epítopos epiteliales explica las propiedades protectoras contra patógenos bacterianos.
Además de los efectos locales mencionados en el tracto intestinal, también se ha demostrado que los HMO provocan efectos sistémicos en los bebés al entrar en la circulación sistémica. Además, el impacto de los HMO en las interacciones proteína-carbohidrato, por ejemplo, la unión de selectina-leucocitos, puede modular las respuestas inmunes y reducir las respuestas inflamatorias.
Debido a las propiedades beneficiosas bien estudiadas de los oligosacáridos prebióticos, en particular de los HMO, relacionadas con su disponibilidad limitada, es muy deseable una producción comercial eficaz, es decir, a gran escala.
Sin embargo, en la actualidad, el principal inconveniente es en la mayoría de los casos la falta de producción eficaz de oligosacáridos. Como se mencionó anteriormente, los oligosacáridos se pueden generar a partir de la ingeniería de oligómeros con síntesis, ya sea usando ingeniería enzimática o química, o despolimerización de polisacáridos, usando métodos físicos, químicos o enzimáticos.
La síntesis química de oligosacáridos ha demostrado ser un desafío debido a la presencia de varios grupos hidroxilo de reactividad química similar. De este modo, en la síntesis química de oligosacáridos, los bloques de construcción de sacáridos deben primero protegerse selectivamente para controlar la reactividad de los grupos químicamente similares, luego acoplarse y finalmente desprotegerse para obtener el oligosacárido deseado. Incluso si es posible la síntesis a pequeña escala de un oligosacárido deseado, las rutas sintéticas desarrolladas son en general lentas, técnicamente desafiantes y, a menudo, prohibitivamente caras. La síntesis enzimática o la combinación de síntesis química y enzimática ofrecen ventajas significativas sobre las rutas sintéticas químicas puras. Varios oligosacáridos de la leche humana, tal como 2-fucosillactosa, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa o 3-sialillactosa, ya se obtuvieron mediante síntesis enzimática. Además de la síntesis enzimática, también los enfoques fermentativos de oligosacáridos resultaron exitosos, y varios oligosacáridos, incluidos los HMO, se han puesto a disposición con rendimientos considerables por medios fermentativos.
A este respecto, cada uno de los documentos JP H08 140691 A, JP S5995895 A y JP H05276969 describe una síntesis química de oligosacáridos técnicamente desafiante, en la que se usa una glucosidasa en una solución química altamente concentrada ya purificada que contiene una mezcla de sacarosa y oligosacáridos para descomponer la sacarosa y luego purificar cromatográficamente el oligosacárido deseado.
Los documentos EP 2479 263 A1 y WO 2010/142305 A1 describen cada uno un procedimiento fermentativo que usa un microorganismo huésped para la producción de un oligosacárido deseado. Ambas publicaciones usan una cepa bacteriana (JM109 (D5) y JM02 (D6)) para la fermentación que es deficiente en la actividad de la p-galactosidasa (es decir, deficiente en la actividad de la glucosidasa) debido a deleciones en las copias genómicas y episomales del gen lacZ.
El documento EP 0682 118 A2 describe un método de purificación de inulooligosacáridos cíclicos a partir de una solución de sacáridos. En el método, se usa una enzima de tipo exo que tiene la capacidad de cortar enlaces p-(2 ^ 1) fructósidos.
Además, con una síntesis química o bioquímica de estructuras oligosacáridas, que, como se mencionó anteriormente, es mucho más difícil que, por ejemplo, en la síntesis de otros biopolímeros tales como péptidos y ácidos nucleicos, a menudo se producen mezclas de oligosacáridos que contienen oligosacáridos no deseados que necesitan separarse o eliminarse del oligosacárido deseado. Lo mismo se aplica a los oligosacáridos generados por fermentación microbiana, ya que durante esos procedimientos se encuentra una gran cantidad de productos secundarios, productos intermedios o incluso sustratos de partida en la mezcla de reacción/medio celular que contiene los microorganismos que se van a fermentar.
En este contexto, existe una gran necesidad de métodos y procedimientos eficaces para la producción de un oligosacárido deseado, en particular de HMO, cuya producción eficiente tenga una gran relevancia médica y también un impacto comercial.
Este y otros objetos se resuelven mediante la presente invención mediante un procedimiento de producción de un oligosacárido deseado usando un microorganismo huésped, en el que dicho oligosacárido deseado no se encuentra de forma natural en dicha célula huésped y es un oligosacárido de leche humana, comprendiendo el procedimiento las etapas de a) cultivar un microorganismo huésped apropiado para la producción de un oligosacárido deseado en condiciones y en un medio permisivo para la producción de dicho oligosacárido, por lo que se producen el oligosacárido y, cuando sea aplicable, los productos intermedios biosintéticos y/o productos secundarios; b) usar una glucosidasa en el medio en el que se cultiva el microorganismo huésped, con el fin de degradar los productos intermedios sacáridos biosintéticos y/o los productos secundarios sacáridos y/o sustratos sacáridos no usados, en el que la glucosidasa se agrega al medio; y c) recuperar el oligosacárido deseado.
Según la invención, se aplica una glucosidasa en el procedimiento para la producción de un oligosacárido, en el que la glucosidasa se usa para degradar productos secundarios obstaculizadores y/o no deseados, sustratos de partida no usados y productos intermedios generados durante la producción del oligosacárido deseado; de este modo, según la invención, la glucosidasa se emplea para la purificación del oligosacárido deseado a partir de una mezcla que contiene el oligosacárido deseado y otras unidades estructurales de carbohidrato no deseados.
Según la invención, la glucosidasa se usa en procedimientos de fermentación produciendo un oligosacárido deseado.
Por medio de la glucosidasa se puede lograr que, por ejemplo otros (oligo-)sacáridos - además del oligosacárido deseado­ , qué otros (oligo-)sacáridos se producen en el microorganismo durante la síntesis del oligosacárido deseado, y qué otros oligosacáridos interfieren con la etapa de purificación del oligosacárido deseado, pueden ser metabolizados.
Hasta ahora no se ha descrito el uso de una glucosidasa en un procedimiento para la producción de un oligosacárido de leche humana deseado en un procedimiento de fermentación en un microorganismo huésped. Al contrario: en los procedimientos que se aplican actualmente, es decir, para la fermentación de HMO, habitualmente se agrega lactosa como sustrato para la síntesis. Para evitar la degradación de la lactosa beta-galactosidasa agregada, así como otras reacciones de glucosidasa se evitan enérgicamente en las cepas de fermentación. Por lo tanto, se aplicaron tinciones deficientes en beta-galactosidasa en la fermentación (véase, por ejemplo, Dumon et al., (2004) Biotechnol. Prog. 20, 412­ 419) o el gen de beta-galactosidasa de la cepa se ha inactivado específicamente (Dumon et al., (2006) ChemBioChem.
7, 359-365)). Generalmente, la presencia de cualquier actividad glucosidasa se considera contraproducente para la fermentación de oligosacáridos.
Según la invención, se entiende por "oligosacárido" los polímeros cortos de monosacáridos, que comprenden al menos 2 subunidades de azúcar, como ya se mencionó al principio. Los oligosacáridos pueden estar ramificados o formar una cadena lineal de subunidades. Además, las subunidades de azúcar de los oligosacáridos pueden presentar una serie de modificaciones químicas. De acuerdo con lo anterior, los oligosacáridos según la presente invención pueden comprender una o más unidades estructurales no azúcar.
Además, en la actualidad y en general en el campo relevante, una "glucosidasa", también denominada "glucósido hidrolasas" o "glucosilhidrolasas", cataliza la hidrólisis del enlace glucosídico para liberar azúcares más pequeños. Se pueden clasificar como enzimas que catalizan la hidrólisis de O- o S-glucósidos, y por lo general reciben el nombre del sustrato sobre el que actúan. De acuerdo con lo anterior, las glucosidasas catalizan la hidrólisis de glucósidos y las xilanasas catalizan la escisión del xilano. De este modo, una glucosidasa según la invención cataliza la hidrólisis de enlaces glucosídicos para liberar monosacáridos y oligosacáridos de menor peso molecular que los sustratos de carbohidratos nativos simples y complejos.
Según la invención, en los procedimientos descritos en este documento se emplea una glucosidasa para degradar los productos secundarios obstaculizadores y/o no deseados, los sustratos de partida no usados y los productos intermedios generados durante la producción del oligosacárido deseado cuyos productos secundarios no deseados, los sustratos de partida no usados y productos intermedios generalmente tienen un peso molecular más alto en comparación con los monosacáridos y oligo o disacáridos liberados por la acción de la glucosidasa durante la degradación de los productos secundarios no deseados, sustratos de partida no usados y productos intermedios.
De este modo, en la actualidad, un "monosacárido liberado" se debe entender como un monosacárido que se ha generado durante la hidrólisis mediada por glucosidasas de un enlace glucosídico de un sustrato de carbohidrato donde los monosacáridos y oligosacáridos de peso molecular más bajo que el sustrato de carbohidrato hidrolizado están formados.
Según la invención, en el procedimiento según la invención se puede aplicar al menos una glucosidasa, o una combinación de dos o más.
Según un aspecto de la invención, la glucosidasa se usa en un procedimiento de fermentación microbiana empleado para la producción del oligosacárido deseado y usando un microorganismo huésped, en el que dicho oligosacárido y/o dicha glucosidasa no se encuentran naturalmente en el microorganismo para dicha célula huésped.
En la actualidad y como se entiende generalmente en el campo relacionado, una "fermentación microbiana" se debe entender como un procedimiento metabólico industrial, generalmente a gran escala, en el que durante el cultivo de microorganismos tales como bacterias, hongos y mohos, la descomposición enzimática y el uso de nutrientes, particularmente carbohidratos, y tiene lugar la conversión de compuestos en otros compuestos. Como tal, la fermentación microbiana industrial o a gran escala es el procedimiento de controlar microorganismos, es decir, bacterias, levaduras y mohos, para modificar los alimentos y producir un producto deseado.
En la actualidad, y en general en el campo relevante, un "microorganismo" designa y abarca actualmente cualquier organismo microscópico que comprenda ya sea una sola célula, grupos de células u organismos multicelulares relativamente complejos, que sea apropiado para ser empleado en el procedimiento según la invención, y particularmente incluye bacterias y levaduras. Un microorganismo tal como se emplea según la invención se puede cultivar en un medio líquido y generalmente necesita una fuente de carbono en el medio para crecer y replicarse.
Actualmente, y a lo largo de la invención, "recombinante" significa ADN modificado genéticamente preparado mediante el trasplante o empalme de genes de una especie en las células de un microorganismo huésped de una especie diferente. Tal ADN se convierte en parte de la estructura genética del huésped y se replica.
En consecuencia, "un microorganismo huésped" se designa para significar cualquier microorganismo que contenga secuencias de ácido nucleico o proteínas expresadas extrañas /no naturales en el microorganismo huésped recombinante de este modo y en el que la secuencia de ácidos nucleicos extraña/no natural en dicho microorganismo está integrada en el genoma de la célula del microorganismo huésped. Así, "de origen no natural" significa que la secuencia/proteína de ácido nucleico(tal como, por ejemplo, una enzima), es extraña a dicha célula del microorganismo huésped, es decir, las secuencias/proteínas de ácido nucleico son heterólogas con respecto a la célula huésped del microorganismo. La secuencia heteróloga se puede introducir de forma estable, por ejemplo, por transfección, transformación o transducción, en el genoma de la célula del microorganismo huésped, en la que se pueden aplicar técnicas que dependerán de la célula huésped en la que se va a introducir la secuencia. El experto en la materia conoce diversas técnicas y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989). De este modo, el microorganismo huésped en el que se ha introducido la secuencia heteróloga producirá las proteínas heterólogas que codifican las secuencias de ácido nucleico según la invención.
Para la producción recombinante, las células huésped se pueden modificar mediante ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos y las secuencias de ácido nucleico de la invención. La introducción de una secuencia de ácido nucleico en la célula del microorganismo huésped se puede realizar mediante métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986), and Sambrook et al., 1989, supra.
De este modo, las secuencias de ácido nucleico según la invención pueden, por ejemplo, estar comprendidas en un vector que se va a transformar/transfectar de forma estable o introducir de otro modo en las células del microorganismo huésped.
Se puede usar una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Las construcciones del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan y generan la expresión. Generalmente, cualquier sistema o vector apropiado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y para sintetizar un polipéptido en un huésped se puede usar para la expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook et al., supra.
Actualmente, un "oligosacárido deseado" designa un oligosacárido que se producirá específica e intencionalmente con el procedimiento aplicado. De acuerdo con lo anterior, un "oligosacárido no deseado" representa un oligosacárido que no se pretende producir o generar durante la producción del oligosacárido deseado o un oligosacárido formado por el organismo usado no relacionado con el oligosacárido deseado. Un "producto metabólico" o "producto de sacárido metabólico" o "intermedio de sacárido" es un sacárido, es decir, un producto de carbohidrato generado durante la producción de un oligosacárido deseado, y un "sustrato de sacárido no usado" representa una molécula de partida o unidad estructural usada para/durante la producción del oligosacárido deseado.
Como se mencionó al principio, la invención se refiere a un procedimiento de producción de un oligosacárido deseado usando un microorganismo huésped, en el que dicho oligosacárido deseado no se encuentra de forma natural en dicha célula huésped y es un oligosacárido de leche humana, el procedimiento comprende las etapas de a) cultivar un microorganismo huésped apropiado para la producción de un oligosacárido deseado en condiciones y en un medio permisivo para la producción de dicho oligosacárido, por lo que se producen el oligosacárido y, cuando sea aplicable, los productos intermedios sacáridos biosintéticos y/o los productos secundarios de los sacáridos; b) usar una glucosidasa en el medio en el que se cultiva el microorganismo huésped, para degradar productos intermedios biosintéticos y/o productos secundarios y/o sustratos no usados, en los que la glucosidasa se agrega al medio, y c) recuperar el oligosacárido deseado.
Con el procedimiento según la invención, se ha proporcionado un método de fabricación eficaz, por medio del cual se puede producir un oligosacárido deseado en una forma donde los oligosacáridos no deseados o los productos intermedios que obstaculizan o sustratos no usados ya no están presentes esencialmente.
Como se usa en este documento, el término "cultivar" significa cultivar un microorganismo en un medio y en condiciones permisivas y apropiadas para la producción del oligosacárido deseado. Un par de microorganismos huésped apropiados, así como los medios y condiciones para su cultivo, estarán fácilmente disponibles para un experto en la técnica al leer la divulgación de esta invención en relación con los antecedentes técnicos y expertos de la persona capacitada.
Como se usa en este documento, el término "recuperar" significa aislar, recolectar, purificar, recolectar o separar de otro modo del cultivo de microorganismos huésped el oligosacárido producido por el microorganismo huésped según la invención.
Según un aspecto de la invención, la glucosidasa se agrega al medio en el que se cultiva el microorganismo. "Agregar" significa en la presente la adición directa de la enzima al medio, es decir, contrariamente a una provisión de la glucosidasa que sería producido endógenamente por el microorganismo usado para la producción. Como tal, la enzima está, en su forma activa, disponible comercial y fácilmente en el mercado y se puede agregar en las cantidades necesarias para degradar los oligosacáridos/sustratos no usados/productos intermedios no deseados. La cantidad que se va a aplicar dependerá de la cantidad del microorganismo cultivado y también de la cantidad del oligosacárido deseado producido, la cantidad de sustrato y los productos intermedios esperados probablemente.
La (s) glucosidasa (s), según esta realización, se agregan externamente al medio/sobrenadante al final del procedimiento de producción según la invención, lo cual es particularmente preferido cuando se han inactivado o eliminado genes endógenos del microorganismo huésped que codifica las glucosidasas. Al hacerlo, los oligo o monosacáridos no deseados no se pueden acumular y no interfieren con la recuperación del oligosacárido deseado.
Por ejemplo, a una solución que contiene un oligosacárido deseado y un oligosacárido no deseado, tal como lacto-W-tetraosa y lactosa derivadas de la fermentación, se agrega beta-galactosidasa; la cantidad de beta-galactosidasa que se va emplear dependerá de la cantidad (real o esperada) de oligosacáridos. Por ejemplo, con lacto-W-tetraosa y lactosa, ambas a una concentración de 10 mM, una cantidad de 50 unidades/ml (concentración final) de beta-galactosidasa (por ejemplo, de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Alemania, catálogo No. G6008)) puede lograr buenos resultados para escindir la lactosa en glucosa y galactosa para una mejor separación cromatográfica de los sacáridos (por ejemplo, mediante cromatografía de filtración en gel dependiente del tamaño). En los experimentos respectivos llevados a cabo por los inventores, se pudo demostrar que en segundos la lactosa se escindió en sus monosacáridos galactosa y glucosa, mientras que la lacto-N-tetraosa permaneció como tal (véase también la figura 1 y la descripción respectiva a continuación). Estos experimentos demostraron la acción altamente selectiva de la beta-galactosidasa de E. coli purificada, que selectivamente solo hidroliza el enlace glucosídico Gal(beta1-4)Glc y no el enlace glucosídico Gal(beta13)GlcNAc presente en el extremo no reductor de la lacto-W-tetraosa. Resultará evidente a partir de la presente divulgación qué cantidad de la glucosidasa respectiva es probable que se necesite usar.
Por ejemplo, los microorganismos apropiados para producir, por ejemplo, oligosacáridos fucosilados en procedimientos de fermentación se conocen por el documento EP 2 479 263 A1 o el documento EP 2 439 264 o el documento WO 2010/142305, cuyo contenido se menciona explícitamente aquí.
De acuerdo con lo anterior, y según determinados aspectos de la invención, el procedimiento según la invención es un procedimiento discontinuo o continuo.
De este modo, según un aspecto de la invención, es decir, en un procedimiento continuo, la glucosidasa se agrega constantemente al medio durante la etapa de cultivo del microorganismo huésped, por ejemplo mediante la provisión de una cepa que exprese una glucosidasa, mientras que las reacciones glicosídica y catabólica se pueden separar espacialmente.
Según otro aspecto, es decir, en un procedimiento discontinuo o de cultivo discontinuo, las reacciones de escisión hidrolítica están restringidas a períodos particulares.
Según otro aspecto de la invención, el oligosacárido se recupera del sobrenadante del microorganismo huésped cultivado, sobrenadante que se obtiene centrifugando el microorganismo huésped cultivado para obtener un sobrenadante y unas pellas de microorganismo huésped.
Con el nuevo procedimiento proporcionado, es posible recuperar el oligosacárido producido del medio en el que se cultiva el microorganismo huésped, ya que el oligosacárido que se produce en una célula de microorganismo se transporta preferiblemente al medio, haciendo de este modo posible sin esfuerzo recuperar el oligosacárido del sobrenadante, una vez que las células del microorganismo se hayan separado del medio de cultivo.
Además, según otro aspecto de la invención, antes de la adición de la glucosidasa, se puede producir un sobrenadante que separa los microorganismos huésped del medio preferiblemente líquido en el que se cultiva el microorganismo huésped, en el que el oligosacárido producido está contenido en el sobrenadante. A este sobrenadante se le puede agregar la glucosidasa.
Según otro aspecto, el oligosacárido deseado se selecciona entre 2'-fucosillactosa (2'-FL), 3-fucosillactosa (3-FL), difucosillactosa (DF-L), 3'-sialillactosa (3'-SL ), 6'-sialillactosa (6'-SL), 3-fucosil-3'-sialillactosa (F-SL), lacto-N-tetraosa ((LNT), lacto-W-neotetraosa (LNneoT), lacto-W-fucopentaosa(s) (LNFP-I, II, III, V), lacto-W-difucohexaosa(s) (LNDH-I y II), lacto-W-sialilpentaosa(s) (LSTa, b y c), fucosil- lacto-W-sialilhexaosa (F-LSTa, b y c), disialil-lacto-W-hexaosa (DS-LNT) y en particular seleccionados de los mostrados en la tabla 1, o derivados de los mismos. En este sentido, para la producción de los oligosacáridos, se hace referencia explícitamente a los documentos EP 2 479 263 A, EP 2 439 264 o WO 2010/142305, cuyo contenido se menciona explícitamente en la presente.
Tabla 1: lista de oligosacáridos que se pueden producir según la invención (Figura 11)
No. Nombre Abreviatura Oligosacárido
1 2'-Fucosil-lactosa 2'-FL Fuc(a1-2)Gal(p1-4)Gluc
2 3-Fucosil-lactosa 3-FL Gal(|5l-4)OlLc
I
Fuc{í i 1-3)
3 2',3-Difucosil-lactosa DF-L Fuc(a1-2)Gal([l1-4)GriJC
I
Fuete 1-3)
5 Lacto-W-triosa II LNT II GlcNAc(p1-3)Gal(p1-4)Gluc
6 Lacto-W-tetraosa LNT Gal(p1-3)GlcNAc(p1-3)Gal(p1-4)Gluc
7 Lacto-W-neotetraosa LNnT Gal(p1-4)GlcNAc(p1-3)Gal(p1-4)Gluc
Lacto-W-fucopentaosa I LNFP I Fuc((a1-2)Gal(pi-3)GlcNAc(pi-3)Gal(pi-4)Gluc
Lacto-W-neofucopentaosa I LNnFP I Fuc(a1 -2)Gal(pi-4)GlcNAc(pi -3)Gal(pi -4)Gluc
Lacto-W-fucopentaosa II LNFP II Gal ((51 '3jG!cMAo(p1 -3)Ga l(p 1 -4)Gluc i
Fucí«14)
Lacto-W-fucopentaosa III LNFP III Gal fjí 1 -4) GlcWAc(p1 -3>Ga I (p 1 -4)G1uq I
Fucfe1-3)
Lacto-W-fucopentaosa V LNFP V Gal ([j 1 -3}GlcN lAc^ p 1 -3)Gal(p 1-4)GluC
I
Fuc<«1-3)
Lacto-W-neofucopentaosa V LNnFP V Gal(fj1-4)GICNA0(P1 -3)Ga1(p 1 -4)C5liiC
I FU0(a1-3)
Lacto-W-difucohexaosa I LNDH I Gal(p1 -3)GlcNAc(p 1 -3)G al(p1 -4)Gluc I I
Fw tal-2) Fucf«l-4)
Lacto-W-difucohexaosa II LND Gal([H -3)GlcNAc(p1 -3)Gal(P1-4)Gluc
FuGfcrf
Figure imgf000007_0001
6'-Galactosillactosa 6'-GL Gal(p1-6)Gal(p1-4)Gluc
3'-Galactosillactosa 3'-GL Gal(p1-3)Gal(p1-4)Gluc
Lacto-W-hexaosa LNH Gal(01 -4)G!cMAc(p1-6}Gal(p14)G1uc I
Gal® 1-3)GlcNAc(p 1-3)
Lacto-W-neohexaosa LNnH Gal(pi -45GicNAc([i1-6)Gaí(|}1 -4)G(uc 1
GaK01-4)GlcNAc(p1 -3)
para-Lacto-W-hexaosa paraLNT Gal(p1-3 )GlcNAc(pi -3)Gal(pi-4)GlcNAc(pi -3)Gal(pi -4)Gluc
para-Lacto-W-neohexaosa paraLNnH Gal(p1-4 4)GlcNAc(pi-3)Gal(pi -4)GlcNAc(pi-3)Gal(pi-4)Gluc
Difucosil-lacto-W-neohexaosa DF-LNnH
Fjc(a1-3)
1
Gal <|) 1 -4)G lcNAo(|31 -6 Gal (|11 -4}GLc Ga I [fí 1 -4) Gl cN Acfll
Figure imgf000008_0001
I
Ftic{a1-3}
3'-SialiMactosa 3'-SL Neu5Ac(a2-3)Gal(pi -4)Gluc
6'-SialiMactosa 6'-SL Neu5Ac(a2-6)Gal(pi -4)Gluc
Lacto-W-sialilpentaosa a LST-a Neu5Ac(a2-3)Gal(P-3)GlcNAc(pi-3)Gal(pi-4)Gluc
Lacto-W-sialilpentaosa b Gal(P 1 -3) GlcWActp 1 -3)Gal (p 1 -4)Gluc LST-b I
Neu5Agfa2-6)
Lacto-W-sialilpentaosa c LST-c Neu5Ac(a2-6)Gal(pi -4)GlcNAc(pi-3)Gal(pi -4)Gluc
Fucosil-lacto-W-sialilpentaosa a F-LST-a N eu5Ac^-3)G al(p 1 -3}GlcNAí:(p 1 -3}Gal{p1 -4)Gluc I
Fuc(í i 1'4)
Fucosil-lacto-W-sialilpentaosa b F-LST-b Fu c(n 1 -2)GaL(|j 1 -3)G IcN Ac(p 1 -3>Gal ® 1 -4)Giuc I
toeu5Ac(u2-&)
Fucosil-lacto-W-sialilpentaosa c F-LST-c Neu5Ac(<i2-3)GaK|J1 -3}GlcNAc(pl -3)Gal(p1-4)Qluc Fuc
Figure imgf000008_0002
Disialil-lacto-W-tetraosa DS-LNT NeuS Ac(a2-3)G a l(fl 1 -4>G!cN Ac(p 1 -3) Gal(P 1 -4)Gluc t
Neu5Act«2-S}
Disialil-lacto-W-fucopentaosa DS-LNFP V ' Neu5Ac(a2-3)Gal(p1-4)GlcNAc(p‘l-3)Gal(fl1-4)GI(JC I 1 Meu5Ac(«3-6) Fvgfcl-3)
3-Fucosil-3'-sialillactosa 3F-3'-SL Neu5Ac((i2-3)Gal{[H-4)Gltic
Figure imgf000008_0003
3-Fucosil-6'-sialillactosa 3F-6'-SL Neu5Ac(<x2-e)Gal(p1 -4)Gluc Fucítrf-
Figure imgf000008_0004
35 Lacto-A/-neodifucohexaosa I LNnDFH I Gal(P1-4)Ga)NAc(p1-3)Gat®1-4)GIC
I I
Fuc(a1-3) Fuc(ft 1-3)
Según otro aspecto de la invención, en el procedimiento según la invención la glucosidasa se selecciona de uno o más del grupo que comprende galactosidasas, glucosidasas, galactosidasas, N-acetil-glucosamidasas, /V-acetilhexosaminidasas, manosidasas, fucosidasas y sialidasas, que a veces también se denominan neuraminidasas.
A este respecto, se prefiere si la glucosidasa se selecciona de uno o más del grupo que comprende betagalactosidasa, beta-glucosidasa, beta-N-acetilhexosaminidasa, alfa-fucosidasa, beta-fucosidasa, alfaglucosidasa, alfa-galactosidasa, beta-manosidasa, alfa-manosidasa, neuramidasa, y se prefiere particularmente si la glucosidasa es una beta­ galactosidasa, preferiblemente una beta-galactosidasa de E. coli.
"Beta-galactosidasa", como se usa en este documento y como se entiende generalmente dentro del campo de la invención, es una enzima hidrolasa que cataliza la hidrólisis de beta-galactosidos en monosacáridos.
Las beta-galactosidasas, se emplean regularmente en las técnicas de ingeniería genética, biología molecular y biotecnología, y son conocidas per se por un experto en la técnica.
Según una realización preferida, el microorganismo - usado en el procedimiento según la invención y reivindicado en el mismo - se selecciona entre una bacteria o una levadura, y más preferiblemente, el microorganismo huésped es una cepa de Escherichia coli, una cepa de Corynebacterium, en particular Corynebacterium glutamicum, una especie de Lactobacillus o cepa de Saccharomyces sp.
Las bacterias Escherichia coli, Lactobacillus sp., y Corynebacterium glutamicum y la levadura Saccharomyces sp. tienen la ventaja de que estos microorganismos se pueden cultivar de forma fácil y económica en entornos de laboratorio, y las bacterias y las levaduras se han investigado intensamente durante más de 60 años.
De acuerdo con lo anterior, en una realización preferida, el microorganismo huésped usado en el procedimiento según la invención y reivindicado de otro modo en el mismo se selecciona del grupo que consiste en bacterias y levaduras, y es preferiblemente una cepa de Escherichia coli.
Según otro aspecto de la invención, en el procedimiento según la invención, el microorganismo huésped empleado, y que preferiblemente expresa una glucosidasa, expresa además proteínas para rutas catabólicas de azúcar que de otro modo no están presentes en el microorganismo, cuyas proteínas se seleccionan entre al menos una de las siguientes: proteínas de la ruta catabólica de la galactosa, tales como las codificadas por el operón gal cuando se usa una galactosidasa, proteínas de la ruta catabólica de la fucosa cuando se usa una fucosidasa, proteínas de la ruta catabólica de la N-acetilglucosamina cuando se usa la beta-N-acetilhexosaminidasa. Al usar la beta-N-acetilhexosaminidasa para la degradación de oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina terminal, resultó beneficioso sobreexpresar enzimas implicadas en el catabolismo del monosacárido N-acetilglucosamina. Asimismo, si el monosacárido liberado es L-fucosa, es ventajoso expresar la ruta catabólica de la L-fucosa. Lo mismo es cierto para el ácido siálico, etc.
Esta realización tiene la ventaja de que con la desregulación de las rutas catabólicas de los azúcares, los monosacáridos liberados por la acción de las glucosidasas se pueden eliminar eficiente y eficazmente del medio de fermentación. Alternativamente, también los monosacáridos agregados como precursores se pueden eliminar igualmente del medio de fermentación por este medio. De este modo, el microorganismo huésped expresa, además de la glucosidasa, proteínas para las rutas catabólicas de los azúcares, tal como la ruta catabólica de la galactosa, con el fin de prevenir la acumulación del producto de degradación galactosa. Sin embargo, la glucosidasa y la ruta catabólica del azúcar no tienen que ser expresadas por un organismo individual, también pueden ser expresadas por dos cepas cocultivadas diferentes o la (s) glucosidasa(s) se agrega (n) a una cepa apropiada capaz del catabolismo de monosacáridos deseado.
Según otra realización, y alternativamente a la expresión de una ruta catabólica del azúcar para el monosacárido liberado, el monosacárido liberado durante la degradación de los productos secundarios no deseados, los sustratos de partida no usados y los productos intermedios se pueden conferir en su forma activada por nucleótidos expresando su ruta de rescate y reusados para la síntesis de oligosacáridos. De este modo, por ejemplo La fucosa se puede conferir a GDP-fucosa, o el ácido siálico en CMP-Neu5Ac.
Por ejemplo, si se genera fucosa como monosacárido liberado, se puede usar su ruta de rescate (es decir, sobreexpresada (altamente regulada) en el microorganismo huésped que se ha generado la fucosa) para conferir la fucosa en GDP-fucosa.
En la denominada "ruta de recuperación de fucosa", la fucosa se fosforila primero a fucosa-1-fosfato por la enzima fucosa quinasa. La fucosa-1-fosfato se convierte luego en GDP-fucosa por la acción de la enzima fucosa-1-P-guanililtransferasa.
De este modo, según un aspecto, se puede emplear un microorganismo que esté modificado genéticamente para expresar una fucosa quinasa y una guanililtransferasa. Según una realización, se usa la enzima bacteriana Fkp que representa la primera enzima bifuncional identificada tanto con fucosa quinasa como con L-fucosa-1-P-guanililtransferasa. En el documento WO 2010/070104 A1 se puede encontrar una descripción detallada de la generación de tales microorganismos modificados genéticamente.
Para la fermentación de oligosacáridos más complejos se emplea la combinación de glucosidasas, es decir, expresadas en el microorganismo huésped, tal como la beta-galactosidasa y una beta-W-acetilhexosaminidasa, la última de las cuales degrada específicamente la lacto-W-triosa II(LNT-2) en W-acetilglucosamina y lactosa. La N-acetilglucosamina y la galactosamina liberadas se pueden eliminar asimismo eficazmente del medio de fermentación desregulando o introduciendo importadores de monosacáridos específicos y la ruta catabólica específica de monosacáridos.
Según otra realización del procedimiento de la invención, el microorganismo huésped que se va a emplear son proteínas que expresan de tipo salvaje para las rutas catabólicas de los azúcares, proteínas que se seleccionan de al menos una de las siguientes: proteínas de la ruta catabólica de la galactosa cuando se usa un galactosidasa, proteínas de la ruta catabólica fucosa cuando se usa una fucosidasa, proteínas de la ruta catabólica N-acetilglucosamina cuando se usa beta-W-acetilhexosaminidasa, ácido siálico, en el que se induce una sobreexpresión de tales proteínas en dicho microorganismo huésped durante el procedimiento.
Esta realización tiene la ventaja de que se puede emplear un microorganismo huésped que ya comprende y expresa las proteínas deseadas para las rutas catabólicas de los azúcares, en el que se induce la sobreexpresión de dicha (s) proteína (s). La sobreexpresión se puede lograr, por ejemplo, poniendo la secuencia de ácido nucleico que codifica estas proteínas bajo el control de un promotor inducible, de modo que la expresión del gen/polinucleótido pueda dirigirse específicamente y sobreexpresarse de esa manera.
De este modo, las construcciones del sistema de expresión contienen regiones de control que regulan y generan la expresión. Generalmente, cualquier sistema o vector apropiado para mantener, propagar o expresar proteínas y/o expresar una proteína en un huésped se puede usar para la expresión a este respecto. La secuencia de a Dn apropiada se puede insertar en el sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook et al., véase más arriba.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento generalmente tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Generalmente, la nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular, química orgánica y química de ácidos nucleicos e hibridación descritos anteriormente y a continuación son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica.
Otras ventajas se desprenden de la descripción de las formas de realización y de los dibujos adjuntos.
Varias realizaciones de la invención se ilustran en las figuras y se explican con más detalle en la siguiente descripción. En las figuras:
La figura 1 muestra la resolución de lacto-W-tetraosa y lactosa usando una beta-galactosidasa. A. muestra los cromatogramas de HPLC superpuestos de lactosa 10 mM y lacto-W-tetraosa 10 mM (estándares auténticos). B. Cromatograma de HPLC de la reacción de beta-galactosidasa que contiene lactosa 10 mM y lacto-W-tetraosa 10 mM tomada inmediatamente después de la adición de la enzima. C. Cromatograma de HPLC de la reacción de betagalactosidasa que contiene lactosa 10 mM y lacto-W-tetraosa 10 mM tomada 3 horas después de la adición de la enzima;
La figura 2 muestra un diagrama que muestra una configuración de fermentación continua apropiada para la producción de un oligosacárido, tal como 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2'3-difucosillactosa, 3'-sialillactosa, 6'-sialillactosa, con un primer fermentador y un segundo fermentador (no según la invención; mostrados a modo de comparación);
La figura 3 muestra un análisis por HPLC de una muestra de medio libre de células antes de la adición de una cepa de E. coli que expresa beta-galactosidasa a la fermentación. La cepa también expresó la ruta catabólica de la galactosa para prevenir la acumulación de galactosa;
La figura 4 muestra un análisis por HPLC de una muestra de medio libre de células después de la adición de una segunda cepa de E. coli que expresa beta-galactosidasa a la fermentación;
La figura 5 muestra un diagrama que muestra una configuración de fermentación continua útil para la producción de 2'-fucosillactosa (no según la invención; se muestra a modo de comparación). El primer recipiente fermentador se usa para la síntesis continua de la síntesis de 2'-fucosillactosa, mientras que el segundo recipiente de fermentación, además de la síntesis de 2'-fucosillactosa, se emplea para eliminar el exceso de sustrato (lactosa) y otros productos secundarios sacáridos;
La figura 6 muestra un análisis por HPLC del flujo del producto tomado del fermentador 1. El análisis del caldo de fermentación libre de células muestra la presencia tanto de lactosa como de 2-fucosillactosa;
La figura 7 muestra un análisis por HPLC del flujo del producto obtenido del fermentador 2. El análisis por HPLC muestra la falta del sustrato lactosa que, como se metaboliza por la cepa a través de la expresión del gen lacZ de E. coli que codifica una beta-galactosidasa y la gal operón para el metabolismo de la galactosa liberada;
La figura 8 muestra un análisis por HPLC de una muestra de medio libre de células antes de la adición de una cepa de E. coli que expresa beta-galactosidasa y beta-A/-acetilhexosamin¡dasa a la fermentación. La cepa también expresó la ruta catabólica de la galactosa para prevenir la acumulación de galactosa;
La figura 9 muestra una muestra tomada después del tratamiento con glucosidasa y beta-N-acetilhexosaminidasa: La comparación de los cromatogramas de HPLC muestra claramente la desaparición de la lactosa y Lacto-W-triosa II presentes en la muestra antes del tratamiento con la beta-galactosidasa y beta-W- acetilhexosaminidasa;
La figura 10 muestra la secuencia del operón gal usado en la generación de las cepas de E. coli recombinantes; y
La figura 11 muestra una lista de oligosacáridos que se pueden producir según la invención.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Ejemplo según la invención.
A una solución que contenía lacto-N-tetraosa y lactosa derivadas de la fermentación, ambas a una concentración de 10 mM, se agregó betagalactosidasa; se agregaron 50 unidades/ml (concentración final) de beta-galactosidasa (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Alemania, No. de catálogo G6008)) para escindir la lactosa en glucosa y galactosa para una mejor separación cromatográfica de los sacáridos (por ejemplo, por cromatografía de filtración en gel dependiente del tamaño). Se pudo demostrar que en cuestión de segundos la lactosa se escindió en sus monosacáridos galactosa y glucosa, mientras que la lacto-W-tetraosa permaneció como tal (véase también la figura 1). Estos experimentos demostraron la acción altamente selectiva de la betagalactosidasa de E. coli purificada, que selectivamente solo hidroliza el enlace glucosídico Gal(beta1-4)Glc y no el enlace glucosídico Gal(beta1-3)GlcNAc presente en el extremo no reductor del lacto-N-tetraosa. De acuerdo con lo anterior, la figura 1A muestra los cromatogramas de HPLC superpuestos de lactosa 10 mM y lacto-N-tetraosa 10 mM (estándares auténticos), y la figura 1B muestra el cromatograma de HPLC de la reacción de beta-galactosidasa que contiene lactosa 10 mM y lacto-N-tetraosa 10 mM tomada inmediatamente después de la adición de la enzima. La figura 1C muestra el cromatograma de HPLC de la reacción de beta-galactosidasa que contiene lactosa 10 mM y lacto-W-tetraosa 10 mM tomada 3 horas después de la adición de la enzima.
La figura 2 muestra una configuración de fermentación continua útil para la producción de oligosacáridos tales como 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2',3-difucosillactosa, 3'-sialillactosa o 6'-sialillactosa y derivados de los mismos (no según la invención; mostrado solo para comparación).
El primer recipiente fermentador ("Fermentador 1") se usa para la síntesis continua del oligosacárido deseado mientras que el segundo recipiente de fermentación ("Fermentador 2") que contiene una cepa microbiana que expresa una glucosidasa apropiada, tal como beta-galactosidasa, se usa para la degradación del exceso de monosacáridos, tales como lactosa y otros sacáridos presentes en el medio que interfieren con la posterior purificación del producto oligosacárido deseado. El fermentador 1 y el fermentador 2 están conectados entre sí por conductos apropiados y una bomba efectúa la transferencia de la lechada de fermentación desde el fermentador 1 al fermentador 2. Otra bomba elimina la corriente que contiene el producto oligosacárido deseado del fermentador 2.
Ejemplo comparativo 1 (no según la invención).
Resolución de mezclas de sacáridos mediante tratamiento con glucosidasa en la producción de 2-fucosillactosa
Una fermentación por lotes de alimentación de 2-fucosillactosa que emplea una cepa de E. coli sintetizada por 2'-fucosillactosa recombinante (E. coli BL21 (DE3) AlacZ, que contiene una integración genómica 2'-fuosiltranferasa, codificada por el gen wbgL (EP 2479 263 A1), y que tiene una copia adicional de E. coli lacY, manB, manC, gmd y fcl, todo bajo el control de un fuerte promotor constitutivo de tetraciclina, que contiene un operón gal funcional que comprende los genes galM, galK, galT y galE; véase la figura 10; cebador directo P-TTACTCAGCAATAAACTGATATTCCGTCAGGCTGG (SEQ ID No. 2); cebador inverso P-TTGATAATCTCGCGCTCTTCAGCAGTCAGACTTTCCATATAGAGCGTAATTTCCG TTAACGTCGGTAGTGCTGACCTTGCCGGAGG (SEQ ID. No. 3)), crecido en medio de sal definida (7 g f 1 de NH4H3PO4, 7 g l-1 de K2HPO4, 2 g l-1 de KOH, 0.37g l-1 de ácido cítrico, 1 ml l-1 de antiespumante (Struktol J673, Schill Seilacher), CaCl2 1 mM, MgSO44 mM, oligoelementos compuestos de 0.101 g l-1 de ácido nitrilotriacético pH 6.5, 0.056 g l-1 de citrato férrico amónico, 0.01 g l-1 de MnCl2 x 4 H2O, 0.002 g l-1 CoCl2 x 6 H2O, 0.001 g l-1 CuCl2 x 2 H2O, 0.002 g l-1 de ácido bórico, 0.009 g f 1 de ZnSO4 x 7 H2O, 0.001 g f 1 de Na2MoO4 x 2 H2O, 0.002 g l-1 de Na2SeO3, 0.002 g f 1 NiSO4 x 6 H2O con glicerol al 2 % como fuente de carbono); la alimentación con glicerol consistió en glicerol 800 g l-1, 2.64 g l-1 de MgSO4 y solución de oligoelementos 4 ml l-1. Para la formación de 2'-fucosillactosa se empleó una alimentación de lactosa de 216 g l-1. El pH se controló usando una solución de amoniaco (25 % v/v), que también sirvió como fuente de nitrógeno. Se suministró lactosa como precursor para la producción de 2'-fucosillactosa. El lote de alimentación se cultivó a 30 °C con aireación y agitación constantes durante 90 horas. 90 horas después del inicio de la fermentación, la mayor parte de la lactosa agregada se convirtió en 2'-fucosillactosa.
Para eliminar la mayor parte o la totalidad de la lactosa todavía presente en el sobrenadante de fermentación, se agregó una segunda cepa bacteriana al recipiente de fermentación 90 horas después del inicio de la fermentación (véase la configuración en la figura 2). La segunda cepa bacteriana agregada fue genéticamente idéntica a la primera cepa bacteriana empleada, diferenciándose, sin embargo, sólo en la expresión de una beta-galactosidasa integrada en el genoma y expresando un operón gal funcional (véase la figura 10) (para la degradación de D-galactosa). La incubación de la cepa bacteriana secundaria agregada dio como resultado la desaparición de la lactosa residual en 5 horas. Se agregaron aproximadamente 25 ml de cultivo iniciador de la segunda cepa bacteriana que expresaba beta-galactosidasa por 1 l de caldo de fermentación.
Para el análisis por HPLC, se usó una muestra de medio filtrado estéril libre de células y se desaló pasando una muestra de 350 |il sobre una columna de desalinización (Strata ABW (55 |im, 70A) phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). Para el análisis por HPLC, se usó una columna ReproSil Carbohidrato 5 |im, 250 x 4.6 mm (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Alemania) con las siguientes condiciones: eluyente acetonitrilo/ddH2O (68:32), condición isocrática con una velocidad de flujo 1.4 ml/min (el horno de columna se ajustó a 35 °C); como patrón interno para la cuantificación se usó sacarosa; para la identificación de lactosa y 2'-fucosillactosa se emplearon estándares auténticos. Para la detección se usó un detector de índice de refracción (RID). La inclusión de la etapa de resolución de la glucosidasa al final del procedimiento de fermentación condujo a una reducción significativa en la complejidad del filtrado de fermentación resultante. La figura 3 muestra el análisis del medio de fermentación libre de células tomado antes del tratamiento con glucosidasa y la figura 4 muestra una muestra tomada después del tratamiento con glucosidasa: La comparación de los cromatogramas de HPLC muestra claramente la desaparición de la lactosa presente en la muestra antes del tratamiento con beta-galactosidasa. La cepa también expresó la ruta catabólica de la galactosa para prevenir la acumulación de D-galactosa.
Ejemplo comparativo 2 (no según la invención).
Resolución de mezclas de sacáridos por tratamiento con glucosidasa en la producción continua de 2'-fucosillactosa
La síntesis continua de 2'-fucosillactosa se logró mediante el uso de dos recipientes de fermentación, el fermentador 1 que contiene una cepa fermentadora de 2'-fucosillactosa deficiente en la degradación de lactosa (E. coli BL21 (DE3) ÁlacZ, que contiene una integración genómica 2'-fuosiltranferasa, codificada por el gen wbgL (EP 2479 263 A1), y que tiene una copia adicional de E. coli lacY, manB, manC, gmd y fcl, todo bajo el control de un fuerte promotor constitutivo de tetraciclina, que contiene un operón gal funcional (véase la figura 10) que comprende los genes galM, galK, galT y galE). El fermentador 2 contenía un cultivo iniciador genéticamente similar a la cepa fermentadora de 2'-fucosillactosa usada del fermentador 1, excepto que esta cepa expresó además el gen lacZ de E. coli que codifica una betagalactosidasa (véase la configuración mostrada en la figura 5). Para ambos fermentadores, un medio salino definido que contiene 7 g l-1 de NH4H3PO4, 7 g l-1 de K2HPO4, 2 g l-1 de KOH, 0.37g l-1 del ácido cítrico, 1 ml l-1 de antiespumante (Struktol J673, Schill Seilacher), CaCh 1 mM, MgSO44 mM, los oligoelementos consistieron en 0.101 g l-1 de ácido nitrilotriacético pH 6.5, 0.056 g l-1 de citrato férrico amónico, 0.01 g l-1 de MnCh x 4 H2O, 0.002 g l-1 CoCh x 6 H2O, 0.001 g l-1 de CuCl2 x 2 H2O, 0.002 g M de ácido bórico, 0.009 g M de ZnSO4 x 7 H2O, 0.001 g M de Na2MoO4 x 2 H2O, 0.002 g l-1 de Na2SeO3, 0.002 g l-1 de NiSO4 x 6 H2O con lactosa 10 mM como sustrato y se usó glicerol al 2 % como fuente de carbono.
Como se ilustra, al fermentador 1 una alimentación constante de medio (7 g l-1 de NH4H3PO4, 7 g l-1 de K2HPO4, 2 g l-1 de KOH, 0.37g l-1 de ácido cítrico, 1 ml l-1 de antiespumante, CaCh 1 mM, MgSO44 mM, los oligoelementos consisten en 0.101 g l-1 de ácido nitrilotriacético pH 6.5, 0.056 g l-1 de citrato férrico amónico, 0.01 g l-1 de MnCh x 4 H2O, 0.002 g l-1 de CoCl2 x 6 H2O, 0.001 g M de CuCh x 2 H2O, 0.002 g M de ácido bórico, 0.009 g M de ZnSO4 x 7 H2O, 0.001 g M de Na2MoO4 x 2 H2O, 0.002 g l-1 de Na2SeO3, 0.002 g l-1 de NiSO4 x 6 H2O) que contenía lactosa 40 mM y se suministró 5 % de glicerol. Usando un sistema de fermentación paralela New Brunswick (Bio-Flow/CelliGen 115) con un volumen de trabajo de 1 l, se aplicó un flujo continuo de 20 ml/h de solución de alimentación. La acción de tres bombas de trabajo sincronizadas condujo entonces a la producción similar de una corriente de producto de 20 ml/h que contiene casi exclusivamente 2'-fucosillactosa como único producto sacárido.
La figura 6 muestra un análisis por HPLC del flujo del producto tomada del fermentador 1. El análisis del caldo de fermentación libre de células muestra la presencia tanto de lactosa como de 2'-fucosillactosa. Por el contrario, la figura 7 muestra un análisis por HPLC del flujo del producto obtenida del fermentador 2. El análisis por HPLC muestra la falta del sustrato lactosa que es metabolizada por la cepa a través de la expresión del gen lacZ de E. coli que codifica una betagalactosidasa y el operón gal para el metabolismo de la galactosa liberada.
Ejemplo comparativo 3 (no según la invención).

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de producción de un oligosacárido deseado usando un microorganismo huésped, en el que dicho oligosacárido deseado no se encuentra de forma natural en dicha célula huésped y es un oligosacárido de leche humana, el procedimiento comprende las etapas de:
a) cultivar un microorganismo huésped apropiado para la producción de un oligosacárido deseado en condiciones y en un medio permisivo para la producción de dicho oligosacárido, por lo que se producen el oligosacárido y, cuando sea aplicable, los productos intermedios sacáridos biosintéticos y/o productos secundarios;
b) usar una glucosidasa en el medio en el que se cultiva el microorganismo huésped, con el fin de degradar los productos intermedios sacáridos biosintéticos y/o los productos secundarios sacáridos y/o sustratos sacáridos no usados, en los que la glucosidasa se agrega al medio; y
c) recuperar el oligosacárido deseado.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque el procedimiento es un procedimiento discontinuo o continuo.
3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el oligosacárido deseado se recupera del sobrenadante del microorganismo huésped cultivado, sobrenadante que se obtiene centrifugando el microorganismo huésped cultivado para obtener un sobrenadante y unas pellas de microorganismo huésped.
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el oligosacárido deseado se selecciona de 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2'3-difucosillactosa, 3-sialillactosa, 6-sialillactosa, 3-fucosil-3'-sialillactosa, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa, lacto-A/-fucopentaosa I, lacto-A/-fucopentaosa II, lacto-A/-fucopentaosa III, lacto-W-fucopentaosa V, lacto-W-difucosilhexaosa I , lacto-W-difucosilhexaosa II, lacto-W-sialilpentaosa LSTa, LSTb, LSTc o derivados de los mismos.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el oligosacárido deseado se selecciona de lacto-W-triosa II, lacto-W-neofucopentaosa I, lacto-W-neofucopentaosa V, 6'-galactosillactosa, 3'-galactosillactosa, lacto-W-hexaosa, lacto-W-neohexaosa, para-lacto-W-hexaosa, para-lacto-W-neohexaosa, difucosil-lacto-W-neohexaosa, fucosil-lacto-W-sialilpentaosa a, fucosil-lacto-W-sialilpentaosa b, fucosil-lacto-W-sialilpentaosa c, disialillacto-W-tetraosa, disialil-lacto-W-fucopentaosa, 3-fucosil-6'-siaillactosa, lacto-W-neodifucohexaosa I o derivados de las mismas.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la glucosidasa se selecciona del grupo que comprende, galactosidasas, manosidasas, fucosidasas, sialidasas (neuraminidasa), glucosidasa, W-acetilglucosaminidasas, W-acetilhexosaminidasas.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la glucosidasa se selecciona del grupo que comprende beta-galactosidasa, alfa-galactosidasa, beta-W-acetilglucosaminidasa, beta-W-acetilhexosaminidasa, beta-manosidasa, alfa-manosidasa, alfa-fucosidasa, beta-fucosidasa, beta-glucosidasa, alfaglucosidasa, neuraminidasa.
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo huésped se selecciona de una bacteria y una levadura, y preferiblemente es una cepa de Escherichia coli, una especie de Lactobacillus o una cepa de Corynebacterium glutamicum o una cepa Saccharomyces sp.
9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo huésped empleado está expresando proteínas para las rutas catabólicas de los azúcares que de otro modo no están presentes en el microorganismo, proteínas que se seleccionan de al menos una de las siguientes: proteínas de la ruta catabólica de la galactosa cuando se usa una galactosidasa, proteínas de la ruta catabólica fucosa cuando se usa una fucosidasa, proteínas de la ruta catabólica W-acetilglucosamina cuando se usa beta-W-acetilhexosaminidasa.
10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el microorganismo huésped empleado se sobreexpresa una ruta de rescate para un monosacárido liberado durante la degradación, con el fin de convertir el monosacárido
11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo huésped empleado son proteínas que expresan de tipo salvaje para las rutas catabólicas de los azúcares, proteínas que se seleccionan de al menos una de las siguientes: proteínas de la ruta catabólica de la galactosa cuando se usa una galactosidasa, proteínas de la ruta catabólica de la fucosa cuando se usa una fucosidasa, proteínas de la ruta catabólica de la W-acetilglucosamina cuando se usa beta-W-acetilhexosaminidasa, en las que se induce una sobreexpresión de tales proteínas en dicho microorganismo huésped durante el procedimiento o el uso.
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