CN115011535A - 一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以葡萄糖为碳源合成2’‑岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。所述菌株将重组质粒pACYCDuet‑J23115‑LacY和ptrc99a‑ManCB‑Gmdfcl‑FucT共转化到大肠杆菌获得。采用本发明提供的菌株以葡萄糖为碳源来合成2’‑岩藻糖基乳糖，产量为3.2g/L。

Description

一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株及其构建 方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用。

背景技术

人乳寡糖(human milk oligosaccharides，简称HMO)是人类乳汁中独有的物质，迄今已发现了200多种，多由3～6个糖基组成。大部分人乳寡糖都含有L-岩藻糖，例如2'-岩藻糖基乳糖(简称2'-FL)、6'-唾液酸乳糖(6'-SL)、乳糖-N-新四糖(LNnT)等；其中三糖2'-FL的占比很高，达人乳寡糖总量的30％。2'-FL已被证明对婴幼儿免疫系统成熟起到关键的促进作用，显著降低婴幼儿得病率；还能改善肠道菌群关系、促进大脑认知发育，是大健康产业关注的热点问题。

近期研究表明，2'-FL食用后可被肠道益生菌利用，有效调节肠道菌群；还可抑制弯曲杆菌与人肠粘膜的结合来减少婴幼儿腹泻，数据表明：2'-FL可使空肠弯曲杆菌对人体的侵袭能力降低80％，从而抑制肠道粘膜促炎因子和信号的释放，并减少婴儿由空肠弯曲杆菌引发的腹泻；2'-FL还可以通过调节人肠道上皮细胞CD14的表达来减轻炎症。所以在奶粉中添加适量2'-FL可以增强新生婴儿的免疫力，有效增强婴儿体质。2'-FL可以通过提高非致病菌共生体的竞争优势来间接抑制致病菌的生长，并能直接充当抗黏附抗菌剂减少微生物感染，使摄入2'-FL的婴儿不容易患由肺炎链球菌、绿脓杆菌引起的中耳炎。此外，2'-FL在大脑发育、神经元传递和突触的形成中也起作用，能够刺激大脑发育，所以在饮食中添加2'-FL可以促进大脑发育并且能够改善学习和记忆能力。由于2'-FL针对婴幼儿的卓越生理功能，以及我国母乳喂养率的逐年下降，导致2'-FL成为食品添加剂市场上急需的新产品。然而牛奶、羊奶中都不含有这种物质，所以2'-FL只能通过人工合成来大量获得。在技术手段上，化学合成2'-FL的步骤多、产量低，不能满足规模化使用的需求。微生物发酵法已被证明具有很强的可行性，因而如何提高2′-FL的生产规模、满足工业化生产食品添加剂的成本要求，是亟待解决的问题。

已报道的生产方法一般使用甘油作为发酵碳源，通过高密度发酵及合成来获得较高的2′-FL产量。然而甘油在发酵过程中不便于实时测定其含量，残留的甘油也较难与产物完全分离。使用葡萄糖为碳源生产工艺更为便利，成本也低于甘油，但葡萄糖效应会导致菌株体内乳糖操纵子上的β-半乳糖苷透性酶LacY基因无法转录表达，这将阻断乳糖进入细胞，导致2′-FL无法合成。将LacY在菌株体内由独立运作的启动子来过表达可以解决这一问题，然而LacY属于膜结合蛋白，过量表达会对菌株产生毒害作用，造成其生长缓慢甚至死亡。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用，采用本发明提供的菌株以葡萄糖为碳源来合成2’-岩藻糖基乳糖，产量为3.2g/L。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株，将重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY和ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共转化到大肠杆菌获得；

所述重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY是将质粒pACYCDuet-1与LacY基因连接，并将质粒pACYCDuet-1中的T7启动子替换为J23115启动子；

所述重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT是将质粒ptrc99a与ManCB基因簇、Gmdfcl基因簇、FucT基因、质粒ptrc99a的trc启动子、质粒ptrc99a的终止子连接后得到。

优选的，所述LacY基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述ManCB基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述Gmdfcl基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述FucT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述质粒ptrc99a的trc启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述质粒ptrc99a的终止子的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

优选的，所述重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY和ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT的质量比为1:1。

优选的，所述大肠杆菌包括大肠杆菌JM109(DE3)。

本发明还提供了上述技术方案所述的菌株的构建方法，包括以下步骤：

1)将质粒pACYCDuet-1经限制性内切酶NdeI和EcoRV双酶切，得到线性质粒；

2)将所述步骤1)得到的线性质粒与LacY基因连接，得到重组质粒 pACYCDuet-LacY，以所述重组质粒pACYCDuet-LacY为模板，经PCR扩增，得到不含有T7启动子的基因序列；

3)将所述步骤2)不含有T7启动子的基因序列与J23115启动子经BsaI和T4DNA 连接酶催化，得到重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY；

4)将质粒ptrc99a与ManCB基因簇、Gmdfcl基因簇、FucT基因、质粒ptrc99a的trc启动子、质粒ptrc99a的终止子经BsaI和T4DNA连接酶催化，得到重组质粒 ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT；

5)将所述步骤3)得到的重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY与步骤4)得到的重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共转化到大肠杆菌中，得到菌株。

本发明还提供了上述技术方案所述的菌株在以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

优选的，所述应用包括：将所述菌株接种到发酵培养基中进行发酵，当发酵液的OD₆₀₀为1时，加入终浓度为0.05～0.2mM IPTG和5g/L乳糖，继续发酵，得到2’-岩藻糖基乳糖。

优选的，所述发酵培养基中葡萄糖的含量为15g/L。

优选的，所述发酵的条件包括：发酵的温度为37℃，发酵的转速为220rpm；

所述继续发酵的条件包括：继续发酵的温度为25℃，继续发酵的转速为220rpm，继续发酵的时间为60h。

本发明以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的机理为：

本发明过表达了2’-岩藻糖基乳糖合成的关键酶基因ManCB、Gmdfcl、以及FucT，葡萄糖被菌株摄入后经过菌株自身代谢系统相继转化为葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、和甘露糖-6-磷酸，甘露糖-6-磷酸通过ManCB酶系作用转化为GDP-甘露糖，GDP-甘露糖经过Gmdfcl酶系作用转化为GDP-L-岩藻糖。由于使用组成型启动子过表达了乳糖转运蛋白LacY，乳糖能够在葡萄糖存在的环境下被转运进菌株体内，在FucT酶的作用下和 GDP-L-岩藻糖发生反应，最终生成2’-岩藻糖基乳糖。

本发明的有益效果：

JM109(DE3)J23115菌株可以在葡萄糖为碳源的条件下发酵高产2′-FL，产量为3.2g/L，产量仅略低于以甘油为碳源的条件(产量3.5g/L)。而没有过表达LacY基因的对照菌株JM109(DE3)V0，则无法在葡萄糖为碳源的条件下发酵合成2′-FL。

附图说明

图1为重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY和ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株，将重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY和ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共转化到大肠杆菌获得；

所述重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY是将质粒pACYCDuet-1与LacY基因连接，并将质粒pACYCDuet-1中的T7启动子替换为J23115启动子；

所述重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT是将质粒ptrc99a与ManCB基因簇、Gmdfcl基因簇、FucT基因、质粒ptrc99a的trc启动子、质粒ptrc99a的终止子连接后得到。

在本发明中，所述质粒pACYCDuet-1为市售，Addgene订购号：71147。

在本发明中，所述LacY基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

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在本发明中，所述ManCB基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ManCB 基因簇的作用是编码ManCB酶系，催化甘露糖-6-磷酸为GDP-甘露糖。所述ManCB基因簇的的核苷酸序列具体如下：

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在本发明中，所述Gmdfcl基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述Gmdfcl基因簇的作用是编码Gmdfcl酶系，催化GDP-甘露糖为GDP-L-岩藻糖。在本发明中，所述Gmdfcl基因簇的核苷酸序列具体如下：

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在本发明中，所述FucT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述FucT基因的作用是编码FucT酶，以GDP-L-岩藻糖和乳糖为底物合成2’-岩藻糖基乳糖。在本发明中，所述FucT基因的核苷酸序列具体如下：

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在本发明中，所述质粒ptrc99a的trc启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：

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在本发明中，所述质粒ptrc99a的终止子的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下：

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在本发明中，所述质粒ptrc99a的核苷酸序列如SEQ ID No.48所示，具体如下：

ggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaatta agcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactctttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaga caataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcatttt gccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactgga tctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtatta tcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaag catcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacga tcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaag ccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctacagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctag cttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgc tgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctac acgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcaga ccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaat cccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgct gcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcag cagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgct ctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgc agcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgag ggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcagg ggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgtt atcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagt gagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacac ccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagagg ttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagcagatcaattcgcgcgcgaaggcgaagcggcatgcatttacgttgacaccatcgaa tggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgat gtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagt ggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgcc acctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtc gatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatc cgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaac agtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggc ccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaag gcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatca gatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaa gacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactct ctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccg cctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaa tgtgagttagcgcgaattgatctggtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagct gtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcata acggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacaca ggaaacagaccatggaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggctgttttggcggatga gagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtc ccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgcc aggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaat ccgccg。

在本发明中，所述J23115启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示，所述J23115启动子的作用是以合适的强度转录乳糖转运蛋白LacY。所述J23115启动子的核苷酸序列具体如下：

TTTATAGCTAGCTCAGCCCTTGGTACAATGCTAGC。

在本发明中，所述重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY和 ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT的质量比优选为1:1。在本发明中，所述大肠杆菌优选包括大肠杆菌JM109(DE3)，本发明对所述大肠杆菌JM109(DE3)的来源没有特殊限定，采用市售商品即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的菌株的构建方法，包括以下步骤：

1)将质粒pACYCDuet-1经限制性内切酶NdeI和EcoRV双酶切，得到线性质粒；

2)将所述步骤1)得到的线性质粒与LacY基因连接，得到重组质粒 pACYCDuet-LacY，以所述重组质粒pACYCDuet-LacY为模板，经PCR扩增，得到不含有T7启动子的基因序列；

3)将所述步骤2)不含有T7启动子的基因序列与J23115启动子经BsaI和T4DNA 连接酶催化，得到重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY；

4)将质粒ptrc99a与ManCB基因簇、Gmdfcl基因簇、FucT基因、质粒ptrc99a的trc启动子、质粒ptrc99a的终止子经BsaI和T4DNA连接酶催化，得到重组质粒 ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT；

5)将所述步骤3)得到的重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY与步骤4)得到的重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共转化到大肠杆菌中，得到菌株。

本发明将质粒pACYCDuet-1经限制性内切酶NdeI和EcoRV双酶切，得到线性质粒。在本发明中，所述双酶切的反应体系优选为100μl：NdeI 3μl、EcoRV 3μl、pACYCDuet-1 载体500ng、10×缓冲液buffer 10μl、其余用双蒸水补齐。在本发明中，反应条件优选为37℃水浴反应8h。

本发明将得到的线性质粒与LacY基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-LacY，以所述重组质粒pACYCDuet-LacY为模板，经PCR扩增，得到不含有T7启动子的基因序列。本发明对所述LacY基因的获取方式没有特殊限定，本领域技术人员根据常规操作获取即可。本发明对所述连接的条件没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。本发明对PCR扩增不含有T7启动子的基因序列没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。

本发明将不含有T7启动子的基因序列与J23115启动子经BsaI和T4DNA连接酶催化，得到重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY。在本发明中，所述催化反应的条件优选包括：37℃1min，16℃1min；共30个循环；再60℃5min。在本发明中，所述催化的体系20μL优选包括前述扩增出的pACYCDuet-LacY DNA 100ng，J23115启动子DNA片段50ng，10×Tango buffer 2μL，ATP 10mM，T4DNA连接酶0.5μL，双蒸水补齐至20 μL。

本发明将质粒ptrc99a与ManCB基因簇、Gmdfcl基因簇、FucT基因、质粒ptrc99a 的trc启动子、质粒ptrc99a的终止子经BsaI和T4DNA连接酶催化，得到重组质粒 ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT。本发明对上述基因的获取方式没有特殊限定，本领域技术人员根据常规获取即可。在本发明中，所述催化反应的条件优选包括：37℃1min，16℃ 1min；共30个循环；再60℃5min。在本发明中，所述催化的体系优选包括前述扩增出的ptrc99a DNA 100ng，ManCB基因簇片段100ng，Gmdfcl基因簇片段100ng，FucT基因片段100ng，质粒ptrc99a的trc启动子片段50ng，质粒ptrc99a的终止子片段50ng， 10×Tango buffer 2μL，ATP 10mM，T4DNA连接酶0.5μL，双蒸水补齐至20μL。

本发明将得到的重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY与步骤4)得到的重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共转化到大肠杆菌中，得到菌株。在本发明中，所述重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY与重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT的质量比优选为 1:1。本发明对将重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY与重组质粒 ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT转入大肠杆菌的其它条件没有特殊限定，本领域技术人员根据常规操作即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的菌株在以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

在本发明中，所述应用优选包括：将所述菌株接种到发酵培养基中进行发酵，当发酵液的OD₆₀₀为1时，加入终浓度为0.05～0.2mM IPTG和5g/L乳糖，继续发酵，得到 2’-岩藻糖基乳糖。

在本发明中，所述发酵培养基中葡萄糖的含量优选为15g/L。在本发明中，所述发酵培养基优选包括：15g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L氯化钠、链霉素25mg/L和氯霉素34mg/L。在本发明中，所述菌株的接种量优选为1％。在本发明中，所述发酵的条件优选包括：发酵的温度为37℃，发酵的转速为220rpm。

在本发明中，所述IPTG的作用是诱导剂，诱导相关基因过表达，所述乳糖的作用是合成2’-岩藻糖基乳糖的底物。在本发明中，所述所述继续发酵的条件优选包括：继续发酵的温度为25℃，继续发酵的转速为220rpm，继续发酵的时间为60h。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)构建携带组成型启动子的pACYCDuet-LacY重组质粒

通过限制性内切酶NdeI(Takara公司，货号：1161A)和EcoRV(Takara公司，货号：1042A)双酶切pACYCDuet-1载体，反应体系为100微升：NdeI 3微升、EcoRV 3 微升、pACYCDuet-1载体500纳克、10×缓冲液buffer 10微升、其余用水补齐；反应条件为37℃水浴反应8小时，酶切产物使用胶回收试剂盒纯化回收(Takara公司MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit，货号：9762)。

通过PCR获得LacY基因，模板为E.coli DH5ɑ菌株(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：C502-03)的基因组，引物为LacY-S和LacY-A，PCR体系为50微升：Ex Taq酶(Takara公司，货号：RR001A)0.5微升、10×缓冲液buffer 5微升、正向引物2 微升、反向引物2微升、大肠杆菌DH5ɑ菌株基因组DNA 1微升。PCR扩增程序为：95 ℃预变性1分钟，30个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分30秒，72 ℃终延伸1分钟。PCR产物使用胶回收试剂盒纯化回收(Takara公司，货号：9762)。

然后使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的

II One StepCloning Kit 试剂盒(货号：C112-01)将双酶切线性化的pACYCDuet载体与LacY基因DNA进行重组连接(连接体系和反应条件见产品说明书)，转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：C502-03)，LB平板(含34mg/L氯霉素)涂布后37℃过夜培养。所得克隆挑取后在LB液体培养基(含34mg/L氯霉素)中培养12小时，将菌液通过PCR验证(PCR程序同上，引物为LacY-S和LacY-A)是否为阳性克隆，阳性克隆可以得到大小约1200bp的扩增DNA条带。

使用质粒提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：DC201-01)提取阳性克隆的重组质粒pACYCDuet-LacY。以pACYCDuet-LacY重组质粒为模板，通过 PCR获得不含T7启动子的线性DNA片段并装上适合于Golden gate连接的Overhang接头(PCR程序同上，引物见表1)。PCR体系为50微升：Ex Taq酶(Takara公司，货号： RR001A)0.5微升、10×缓冲液buffer 5微升、引物pACYCDuet-LacY-S 2微升、引物 pACYCDuet-LacY-A 2微升、pACYCDuet-LacY重组质粒DNA 1微升。PCR扩增程序为： 95℃预变性1分钟，30个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸5分钟，72 ℃终延伸1分钟。

将多种组成型启动子通过退火聚合分别获得，包括J23100、J23101、J23106、J23105、J23115、J23109、J23113，以便于从中挑选出最适合的启动子。将启动子片段与pACYCDuet-LacY线性化DNA片段混合，加入BsaI酶(New England Biolabs公司，货号：R3733L)和T4 DNA连接酶(New England Biolabs公司，货号：M0202T)催化；所述催化的体系20μL包括前述扩增出的pACYCDuet-LacY DNA 100ng，启动子DNA 片段50ng，10×Tangobuffer 2μL，ATP 10mM，T4DNA连接酶0.5μL，双蒸水补齐至20μL。催化可使用PCR仪，反应条件为：(37℃1分钟、16℃1分钟)×30个循环， 60℃再反应5分钟。然后取10微升反应液转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：C502-03)，LB平板(含34mg/L氯霉素)涂布后37℃过夜培养。所得克隆是否正确通过PCR对应的启动子片段确定，PCR得到约40bp DNA片段的即为阳性克隆。

表1引物列表

2)构建重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT

通过PCR(引物为ptrc99a-S和ptrc99a-A)获得ptrc99a质粒的线性化片段并装上适合于Golden gate连接的Overhang接头，PCR(引物为ManCB-S和ManCB-A)获得 ManCB基因簇并装上适合于Golden gate连接的Overhang接头，PCR(引物为Gmdfcl-S 和Gmdfcl-A)获得Gmdfcl基因簇并装上适合于Golden gate连接的Overhang接头，PCR (引物为FucT-S和FucT-A)获得FucT基因(由通用生物系统(安徽)有限公司经密码子优化后合成，序列见序列表)并装上适合于Golden gate连接的Overhang接头，PCR ptrc99a质粒上的trc启动子和终止子序列(序列见序列表)，并装上适合于Golden gate连接的Overhang接头(引物分别为P-S1/P-A1、P-S2/P-A2，Ter-S1/Ter-A1、 Ter-S2/Ter-A2)。

使用BsaI酶(New England Biolabs公司，货号：R3733L)和T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs公司，货号：M0202T)共同催化，反应体系为：ptrc99a线性化片段 100ng，ManCB基因簇片段100ng，Gmdfcl基因簇片段100ng，FucT基因片段100ng，质粒ptrc99a的trc启动子片段50ng，质粒ptrc99a的终止子片段50ng，10×Tango buffer 2μL，ATP 10mM，T4DNA连接酶0.5μL，双蒸水补齐至20μL

反应条件为：(37℃1分钟、16℃1分钟)×30个循环，60℃再反应5分钟。反应产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号： C502-03)，涂布含50mg/L氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养。所得克隆提取质粒后通过酶切验证是否正确：使用EcoNI酶(New England Biolabs公司，货号：#R0521S)37 ℃酶切1小时后跑核酸电泳胶，酶切反应体系为10微升：EcoNI酶0.5微升，质粒5微升，10×缓冲液1微升，其余水补齐。酶切产物大小约为10000～11000bp之间即为正确，对应克隆即为阳性克隆。

表2引物列表

引物名称	序列号	引物序列
			ptrc99a-S	SEQ ID No.25	ggctacggtctcgtgttttggcggatgagagaagattttc
ptrc99a-A	SEQ ID No.26	ggctacggtctccaggatccccgggtaccga
			ManCB-S	SEQ ID No.27	ggctacggtctcctcctctagaatggcgcagtcgaaactc
ManCB-A	SEQ ID No.28	ggctacggtctctgagcctttcgttttatttactcgttcagcaacgtc
			Ter-S1	SEQ ID No.29	ggctacggtctctgctcagtcgaaagactgg
Ter-A1	SEQ ID No.30	ggctacggtctccttgtcaaaaaaggccatccgtcagg
			P-S1	SEQ ID No.31	ggctacggtctccacaattaatcatccggctc
P-A1	SEQ ID No.32	ggctacggtctcgcctgtgtgaaattgttatc
			Gmdfcl-S	SEQ ID No.33	ggctacggtctcgcaggaaacagaccatgtcaaaagtcgctctc
Gmdfcl-A	SEQ ID No.34	ggctacggtctcccgaaagcggtcttgattc
			Ter-S2	SEQ ID No.35	ggctacggtctccttcgggggtaaataaaacgaaaggctcagtcg
Ter-A2	SEQ ID No.36	ggctacggtctcaggatgattaattgtcaaaaaaggccatccgtcagg
			P-S2	SEQ ID No.37	ggctacggtctcaatccggctcgtataatgtg
P-A2	SEQ ID No.38	ggctacggtctctctttgaacgccatggtctgtttcctgtgtgaaattg
			FucT-S	SEQ ID No.39	ggctacggtctctaaagttgttcagatctgc
FucT-A	SEQ ID No.40	ggctacggtctcgaacagccaagcttttacgcgttgtatttctg

3)构建携带组成型启动子的pACYCDuet-LacY重组质粒和重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT的共转化

通过质粒转化方法将步骤1)和步骤2)制备得到的pACYCDuet-组成型启动子 -LacY重组质粒和重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共转化到JM109(DE3)菌株中，即获得发酵用的JM109(DE3)双质粒菌株。

具体步骤如下：

(1)制备含有50mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的LB琼脂平板(配方为10g/L 蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L琼脂)；

(2)取一个1.5ml离心管，加入100μL JM109(DE3)感受态细胞悬液并置于冰上；加入1μL重组质粒pACYCDuet-组成型启动子-LacY(100ng/μL浓度)、1μL重组质粒 ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT(100ng/μL浓度)，用移液器轻柔混匀，冰上静置20min；

(3)42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min，整个过程不要振荡菌液；

(4)加入1mL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(100rpm)1 小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；

(5)取100μL菌液至含有50mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的LB琼脂平板上，涂布均匀；

(6)待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12～16小时，出现单菌落后挑取 JM109(DE3)V1单菌落到含有50mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的LB液体培养基中37℃培养至浑浊，吸取500μL菌液至灭过菌的EP管，再加入500μL 40％(w/w)浓度甘油，混匀后-80℃保藏待用，记为实验组；

(7)以相同的转化方法，将重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT转化到 JM109(DE3)感受态细胞，即获得用做对照实验的JM109(DE3)V0单质粒菌株。该菌株没有过表达乳糖转运蛋白LacY，只通过单质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT过表达了2’- 岩藻糖基乳糖合成所需的关键酶基因ManCB、Gmdfcl、和FucT。

实施例2

菌株的摇瓶发酵合成2′-FL

使用三角摇瓶发酵，摇瓶规格500mL，装液量100mL，将实施例1制备的 JM109(DE3)V0(单质粒对照组)和JM109(DE3)V1(双质粒实验组)分别以1％(v/v) 接种量分别接种到摇瓶中，内有含葡萄糖或甘油的LB培养基(配方为15g/L葡萄糖(或甘油)，10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，链霉素25mg/L，氯霉素34 mg/L)，37℃，220rpm培养至OD₆₀₀＝1.0，冷却至25℃，加入终浓度0.2mM IPTG和5g/L 乳糖，继续25℃、220rpm培养发酵60小时。将摇瓶发酵液通过12000rpm离心5分钟后，取上清液95℃加热10分钟灭活可溶性蛋白质，再次12000rpm离心5分钟后，吸入注射器并流过0.22微米滤头，滤出液即可进行高效液相色谱法(HPLC)分析。HPLC测定发酵液中2’-FL浓度的具体方法如下：液相设备：Agilent1260Infinity II；示差检测器检测，型号：G7162A-1260RId；液相柱型号：Sepax HP-Amino，4.6*250mm、5微米粒径(或同等规格氨基柱)；流速：0.8ml/min，流动相：80％纯乙腈：20％水(v/v)，系统温度：35℃，进样量10～20微升。用于计算浓度的2’-FL标准品购自上海惠诚生物科技有限公司，纯度98％(货号：GY1141)。J23100启动子的序列号为SEQ ID No.41，J23101 启动子的序列号为SEQ ID No.42，J23106启动子的序列号为SEQ ID No.43，J23105启动子的序列号为SEQ ID No.44，J23115启动子的序列号为SEQ ID No.45，J23109启动子的序列号为SEQ ID No.46，J23113启动子的序列号为SEQ ID No.47。

2′-FL产量结果如表3所示：

表3不同组成型启动子的双质粒菌株发酵合成2′-FL产量情况

HPLC结果表明：J23115启动子对应双质粒菌株的2′-FL发酵产量最高，而反映菌株生长情况的OD₆₀₀值也较高，故其对应的JM109(DE3)J23115双质粒菌株即为本发明要求保护的高产2’-FL的工程菌。而当以甘油为碳源时，JM109(DE3)J23115菌株的2′ -FL产量为3.5g/L，OD₆₀₀值为13.4。比较JM109(DE3)J23115双质粒菌株和JM109(DE3) V0单质粒菌株，JM109(DE3)V0在使用甘油为碳源时OD₆₀₀值为15.8，但2′-FL的产量仅为0.8g/L，而在使用葡萄糖为碳源时OD₆₀₀值为14.2，但未测得产物(0g/L)。

以上结果表明：JM109(DE3)J23115菌株可以在葡萄糖为碳源的条件下发酵高产2′-FL，产量仅略低于以甘油为碳源的条件。而没有过表达LacY基因的对照菌株 JM109(DE3)V0，则无法在葡萄糖为碳源的条件下发酵合成2′-FL。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南通励成生物工程有限公司

<120> 一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株及其构建方法和应用

<141> 2022-05-09

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60

tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120

agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa 180

ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt 240

accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa 300

tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360

ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt 420

ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc 480

atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540

gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg 600

gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660

aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac 720

caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780

tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca 840

ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct 900

gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg 960

ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag 1020

tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080

gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc 1140

gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200

agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254

<210> 2

<211> 3000

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atggcgcagt cgaaactcta tccagttgtg atggcaggtg gctccggtag ccgcttatgg 60

ccgctttccc gcgtacttta ccccaagcag tttttatgcc tgaaaggcga tctcaccatg 120

ctgcaaacca ccatctgccg cctgaacggt gtggagtgcg aaagcccggt ggtgatttgc 180

aatgagcagc accgctttat tgtcgcggaa cagctgcgtc aactgaacaa actcaccaag 240

aacattattc tcgaaccggc agggcgtaac actgcacctg ccattgcgct ggcggcgctg 300

gcggcaaaac gtcatagccc ggagagcgac ccgttaatgc tggtcttggc ggcggatcat 360

gtgattgccg atgaagacgc gttccgtgcc gccgtgcgta atgccatgcc gtatgccaaa 420

gcgggcaagc tggtgacctt cggcattgtg ccggatctac ctgaaaccgg ttatggctat 480

attcgtcgcg gtgaagtgtc ggcgggtgag caggatacgg tggcctttga agtggcgcag 540

tttgtcgaaa aaccgaatct ggaaaccgct caggcctatg tggcaagcgg cgaatattac 600

tggaacagcg gtatgttcct gttccgcgcc ggacgctatc tcgaagaact gaaaaaatat 660

cgcccggata ttctcgatgc ctgtgaaaaa gcgatgagcg ccgtcgatcc ggatctcgat 720

tttattcgtg tggatgaaga agcgtttctc gcctgcccgg aagagtcggt ggattacgcg 780

gtcatggaac gtacggcaga tgccgttgtg gtgccgatgg atgcgggctg gagtgatgtc 840

ggttcttggt cttcattatg ggagatcagc gcccacaccg ccgagggcaa cgtttgccac 900

ggcgatgtga ttaatcacaa aactgaaaac agctatgtgt acgccgaatc tggcctggtc 960

accaccgtcg gggtgaaaga tttggtggta gtgcagacca aagatgcagt gctgattgcc 1020

gaccgtaacg cggtgcagga tgtgaaaaaa gtggtcgagc agatcaaagc cgatggtcgc 1080

catgagcatc gggtacatcg cgaagtgtat cgtccgtggg gcaaatatga ctctatcgac 1140

gcgggcgacc gctaccaggt gaaacgcatc accgtgaaac cgggcgaggg cttgtcggta 1200

cagatgcacc atcaccgcgc ggaacactgg gtagtggtcg cgggaacggc aaaagtcact 1260

attgacggtg atatcaaact gcttggtgaa aacgagtcca tttatattcc gctgggggcg 1320

acgcactgcc tggaaaaccc ggggaaaatt ccgctcgatt taattgaagt gcggtccggc 1380

tcttatctcg aagaggatga tgtggtgcgc ttcgcggatc gctacggacg ggtgtaaacg 1440

tcgcatcagg cgctgtttgt cggatgcggc gtgaacgcct tatccgacct acggttcggt 1500

tttgtaggcc tgataagacg cggcagcgtc gcatcaggca atgaatgcga aaccgcggtg 1560

taaataacga caaatataaa attggccgtt tcggtcaggg ccaactattg cctgaaaaag 1620

ggtaacgaca tgaaaaaatt aacctgcttt aaagcctatg atattcgtgg aaaattaggc 1680

gaagaactga atgaagatat tgcctggcgc attggtcgcg cttatggcga atttctcaaa 1740

ccgaaaacca ttgtgttagg cggtgatgtc cgcctcacca gcgaaacctt aaaactggcg 1800

ctggcgaaag gtttacagga tgcgggcgtc gatgtgctgg atattggcat gtccggcacc 1860

gaagagatct atttcgccac gttccatctc ggtgtggatg gcggcattga agttaccgcc 1920

agccataatc cgatggatta taacggcatg aagctggtgc gcgaaggggc tcgcccgatc 1980

agcggtgata ccggactgcg cgatgtccag cgtctggcag aagccaacga ctttcctccc 2040

gttgatgaaa ccaaacgcgg tcgctatcag caaatcaatc tgcgtgacgc ttacgttgat 2100

cacctgttcg gttatatcaa cgtcaaaaac ctcacgccgc tcaagctggt gatcaactcc 2160

gggaacggcg cagcgggtcc ggtggtggac gctatcgaag cccgctttaa cgccctcggc 2220

gctccggtgg aattaatcaa agtgcacaac acgccggacg gcaatttccc caacggtatt 2280

cctaacccgc tgctgccgga atgccgcgac gacacccgca atgcggtcat caaacacggc 2340

gcggatatgg gcattgcctt tgacggtgat tttgatcgct gtttcctgtt tgacgaaaaa 2400

gggcagttta tcgagggcta ctacattgtc ggcctgttgg cagaagcatt cctcgaaaaa 2460

aatcccggcg cgaagatcat ccacgatcca cgtctctcct ggaacaccgt tgatgtggtg 2520

actaccgcag gtggcacccc ggtaatgtcg aaaaccggac acgcctttat taaagaacgt 2580

atgcgcaagg aagacgccat ctacggtggc gaaatgagcg cccaccatta cttccgtgat 2640

ttcgcttact gcgacagcgg catgatcccg tggctgctgg tcgccgaact ggtgtgcctg 2700

aaagagaaaa cgctgggcga actggtacgc gaccggatgg cggcgtttcc ggcaagcggt 2760

gagatcaaca gcaaactggc gcaacccgtt gaggcgatta accgcgtcga acagcatttt 2820

agccgcgagg cgctggcggt ggatcgcact gatggcatca gcatgacctt tgccgactgg 2880

cgctttaacc tgcgcacctc caataccgaa ccggtggtgc gcctgaatgt ggaatcgcgc 2940

ggtgatgtgc cgctgatgga agcgcgaacg cgaactctgc tgacgttgct gaacgagtaa 3000

<210> 3

<211> 2090

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60

tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120

accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180

cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240

gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300

tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360

ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420

caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480

aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540

aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600

atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660

atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720

ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780

cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840

gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900

ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960

ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020

gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080

aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aagcatgagt aaacaacgag 1140

tttttattgc tggtcatcgc gggatggtcg gttccgccat caggcggcag ctcgaacagc 1200

gcggtgatgt ggaactggta ttacgcaccc gcgacgagct gaacctgctg gacagccgcg 1260

ccgtgcatga tttctttgcc agcgaacgta ttgaccaggt ctatctggcg gcggcgaaag 1320

tgggcggcat tgttgccaac aacacctatc cggcggattt catctaccag aacatgatga 1380

ttgagagcaa catcattcac gccgcgcatc agaacgacgt gaacaaactg ctgtttctcg 1440

gatcgtcctg catctacccg aaactggcaa aacagccgat ggcagaaagc gagttgttgc 1500

agggcacgct ggagccgact aacgagcctt atgctattgc caaaatcgcc gggatcaaac 1560

tgtgcgaatc atacaaccgc cagtacggac gcgattaccg ctcagtcatg ccgaccaacc 1620

tgtacgggcc acacgacaac ttccacccga gtaattcgca tgtgatccca gcattgctgc 1680

gtcgcttcca cgaggcgacg gcacagaatg cgccggacgt ggtggtatgg ggcagcggta 1740

caccgatgcg cgaatttctg cacgtcgatg atatggcggc ggcgagcatt catgtcatgg 1800

agctggcgca tgaagtctgg ctggagaaca cccagccgat gttgtcgcac attaacgtcg 1860

gcacgggcgt tgactgcact atccgcgagc tggcgcaaac catcgccaaa gtggtgggtt 1920

acaaaggccg ggtggttttt gatgccagca aaccggatgg cacgccgcgc aaactgctgg 1980

atgtgacgcg cctgcatcag cttggctggt atcacgaaat ctcactggaa gcggggcttg 2040

ccagcactta ccagtggttc cttgagaatc aagaccgctt tcgggggtaa 2090

<210> 4

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

atggcgttca aagttgttca gatctgcggt ggcttaggta accagatgtt ccagtacgcg 60

ttcgcgaaat ctctgcagaa acacagcaac accccggttc tgctggatat caccagcttc 120

gattggtctg atcgtaaaat gcagctggaa ctgttcccga tcgatctgcc gtacgcgtct 180

gcgaaagaaa ttgccatcgc gaaaatgcag cacctcccaa agctggtacg cgatgccctg 240

aagtgtatgg ggtttgatcg tgttagccag gaaatcgttt tcgaatacga accgaaactg 300

ctgaaaccgt cccgtctgac ctacttcttc ggctacttcc aggacccgcg ttacttcgat 360

gcgatcagcc cgctgatcaa acagaccttc accctgccgc cgccgccgga aaacaacaaa 420

aacaacaaca aaaaagaaga agaataccag tgcaaactga gcctgatcct ggcggcgaaa 480

aacagcgttt tcgttcacat ccgtcgtggc gattacgttg gtatcggttg ccagctgggt 540

atcgattacc agaaaaaagc gctggaatac atggcgaaac gtgttccgaa catggaactg 600

ttcgttttct gcgaagatct ggaatttacc cagaacctgg atctgggtta cccgttcatg 660

gatatgacca cccgtgataa agaagaagaa gcgtactggg atatgctgct gatgcagagc 720

tgccagcacg gcatcatcgc gaacagcacc tattcttggt gggcggcgta cctgatcgaa 780

aacccggaaa aaatcatcat cggtccgaaa cactggctgt tcggccacga aaacatcctg 840

tgcaaagaat gggttaaaat cgaaagccac ttcgaagtta aatctcagaa atacaacgcg 900

taa 903

<210> 5

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60

acaggaaaca gacc 74

<210> 6

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg 60

aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg 120

cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag 180

gccatcctga cggatggcct ttt 203

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

taagaaggag atatacatat gtactattta aaaaacacaa acttttggat g 51

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

atcgcgtggc cggccgatat cttaagcgac ttcattcacc tgacg 45

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

ggctacggtc tccgtttaag aaggagatat acatatgtac tatttaaaaa acac 54

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

ggctacggtc tccactacct aatgcaggag tcgcataagg g 41

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

tagtttgacg gctagctcag tcctaggtac agtgctagc 39

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

aaacgctagc actgtaccta ggactgagct agccgtcaa 39

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

tagttttaca gctagctcag tcctaggtat tatgctagc 39

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

aaacgctagc ataataccta ggactgagct agctgtaaa 39

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

tagttttacg gctagctcag tcctaggtat agtgctagc 39

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

aaacgctagc actataccta ggactgagct agccgtaaa 39

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

tagttttacg gctagctcag tcctaggtac tatgctagc 39

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

aaacgctagc atagtaccta ggactgagct agccgtaaa 39

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

tagttttata gctagctcag cccttggtac aatgctagc 39

<210> 20

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

aaacgctagc attgtaccaa gggctgagct agctataaa 39

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

tagttttaca gctagctcag tcctagggac tgtgctagc 39

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

aaacgctagc acagtcccta ggactgagct agctgtaaa 39

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

tagtctgatg gctagctcag tcctagggat tatgctagc 39

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

aaacgctagc ataatcccta ggactgagct agccatcag 39

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

ggctacggtc tcgtgttttg gcggatgaga gaagattttc 40

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

ggctacggtc tccaggatcc ccgggtaccg a 31

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

ggctacggtc tcctcctcta gaatggcgca gtcgaaactc 40

<210> 28

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

ggctacggtc tctgagcctt tcgttttatt tactcgttca gcaacgtc 48

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

ggctacggtc tctgctcagt cgaaagactg g 31

<210> 30

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

ggctacggtc tccttgtcaa aaaaggccat ccgtcagg 38

<210> 31

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

ggctacggtc tccacaatta atcatccggc tc 32

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

ggctacggtc tcgcctgtgt gaaattgtta tc 32

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 33

ggctacggtc tcgcaggaaa cagaccatgt caaaagtcgc tctc 44

<210> 34

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

ggctacggtc tcccgaaagc ggtcttgatt c 31

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

ggctacggtc tccttcgggg gtaaataaaa cgaaaggctc agtcg 45

<210> 36

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

ggctacggtc tcaggatgat taattgtcaa aaaaggccat ccgtcagg 48

<210> 37

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

ggctacggtc tcaatccggc tcgtataatg tg 32

<210> 38

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

ggctacggtc tctctttgaa cgccatggtc tgtttcctgt gtgaaattg 49

<210> 39

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

ggctacggtc tctaaagttg ttcagatctg c 31

<210> 40

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

ggctacggtc tcgaacagcc aagcttttac gcgttgtatt tctg 44

<210> 41

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35

<210> 42

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 42

tttacagcta gctcagtcct aggtattatg ctagc 35

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 43

tttacggcta gctcagtcct aggtatagtg ctagc 35

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 44

tttacggcta gctcagtcct aggtactatg ctagc 35

<210> 45

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 45

tttatagcta gctcagccct tggtacaatg ctagc 35

<210> 46

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 46

tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagc 35

<210> 47

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 47

ctgatggcta gctcagtcct agggattatg ctagc 35

<210> 48

<211> 4176

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 48

ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca 60

taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt 120

ctacaaactc tttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 180

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 240

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 300

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 360

aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 420

tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc 480

aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 540

tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 600

ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 660

taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 720

agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctaca gcaatggcaa 780

caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 840

tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 900

gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 960

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 1020

caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 1080

ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 1140

aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 1200

gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 1260

atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 1320

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 1380

gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 1440

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 1500

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 1560

agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 1620

ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 1680

aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 1740

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 1800

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 1860

cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 1920

cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 1980

gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt 2040

attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa 2100

tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atacactccg ctatcgctac gtgactgggt 2160

catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct 2220

cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt 2280

ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgaggca gcagatcaat tcgcgcgcga aggcgaagcg 2340

gcatgcattt acgttgacac catcgaatgg tgcaaaacct ttcgcggtat ggcatgatag 2400

cgcccggaag agagtcaatt cagggtggtg aatgtgaaac cagtaacgtt atacgatgtc 2460

gcagagtatg ccggtgtctc ttatcagacc gtttcccgcg tggtgaacca ggccagccac 2520

gtttctgcga aaacgcggga aaaagtggaa gcggcgatgg cggagctgaa ttacattccc 2580

aaccgcgtgg cacaacaact ggcgggcaaa cagtcgttgc tgattggcgt tgccacctcc 2640

agtctggccc tgcacgcgcc gtcgcaaatt gtcgcggcga ttaaatctcg cgccgatcaa 2700

ctgggtgcca gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg gcgtcgaagc ctgtaaagcg 2760

gcggtgcaca atcttctcgc gcaacgcgtc agtgggctga tcattaacta tccgctggat 2820

gaccaggatg ccattgctgt ggaagctgcc tgcactaatg ttccggcgtt atttcttgat 2880

gtctctgacc agacacccat caacagtatt attttctccc atgaagacgg tacgcgactg 2940

ggcgtggagc atctggtcgc attgggtcac cagcaaatcg cgctgttagc gggcccatta 3000

agttctgtct cggcgcgtct gcgtctggct ggctggcata aatatctcac tcgcaatcaa 3060

attcagccga tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca tgtccggttt tcaacaaacc 3120

atgcaaatgc tgaatgaggg catcgttccc actgcgatgc tggttgccaa cgatcagatg 3180

gcgctgggcg caatgcgcgc cattaccgag tccgggctgc gcgttggtgc ggatatctcg 3240

gtagtgggat acgacgatac cgaagacagc tcatgttata tcccgccgtc aaccaccatc 3300

aaacaggatt ttcgcctgct ggggcaaacc agcgtggacc gcttgctgca actctctcag 3360

ggccaggcgg tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac tggtgaaaag aaaaaccacc 3420

ctggcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 3480

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 3540

gcgcgaattg atctggtttg acagcttatc atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg 3600

cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt 3660

cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg 3720

ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc atccggctcg tataatgtgt 3780

ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagac catggaattc gagctcggta 3840

cccggggatc ctctagagtc gacctgcagg catgcaagct tggctgtttt ggcggatgag 3900

agaagatttt cagcctgata cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga 3960

atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga 4020

aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg 4080

catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg 4140

tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccg 4176

Claims (10)

1.一种以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株，其特征在于，将重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY和ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共转化到大肠杆菌获得；

所述重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY是将质粒pACYCDuet-1与LacY基因连接，并将质粒pACYCDuet-1中的T7启动子替换为J23115启动子；

所述重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT是将质粒ptrc99a与ManCB基因簇、Gmdfcl基因簇、FucT基因、质粒ptrc99a的trc启动子、质粒ptrc99a的终止子连接后得到。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述LacY基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述ManCB基因簇的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

所述Gmdfcl基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述FucT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述质粒ptrc99a的trc启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述质粒ptrc99a的终止子的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

所述J23115启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示。

4.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY和ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT的质量比为1:1。

5.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌JM109(DE3)。

6.权利要求1-5任一项所述的菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将质粒pACYCDuet-1经限制性内切酶NdeI和EcoRV双酶切，得到线性质粒；

2)将所述步骤1)得到的线性质粒与LacY基因连接，得到重组质粒pACYCDuet-LacY，以所述重组质粒pACYCDuet-LacY为模板，经PCR扩增，得到不含有T7启动子的基因序列；

3)将所述步骤2)不含有T7启动子的基因序列与J23115启动子经BsaI和T4DNA连接酶催化，得到重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY；

4)将质粒ptrc99a与ManCB基因簇、Gmdfcl基因簇、FucT基因、质粒ptrc99a的trc启动子、质粒ptrc99a的终止子经BsaI和T4DNA连接酶催化，得到重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT；

5)将所述步骤3)得到的重组质粒pACYCDuet-J23115-LacY与步骤4)得到的重组质粒ptrc99a-ManCB-Gmdfcl-FucT共转化到大肠杆菌中，得到菌株。

7.权利要求1-5任一项所述的菌株在以葡萄糖为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述菌株接种到发酵培养基中进行发酵，当发酵液的OD600为1时，加入终浓度为0.05-0.2mM IPTG和5g/L乳糖，继续发酵，得到2’-岩藻糖基乳糖。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基中葡萄糖的含量为15g/L。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵的条件包括：发酵的温度为37℃，发酵的转速为220rpm；

所述继续发酵的条件包括：继续发酵的温度为25℃，继续发酵的转速为220rpm，继续发酵的时间为60h。

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