CN109136160B - 一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种2‑甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明的2‑甲基柠檬酸高产基因工程菌是由苏云金芽胞杆菌BMB171基因组中敲除2‑甲基柠檬酸脱水酶基因prpD而得到的。本发明还提供了上述2‑甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，以苏云金芽胞杆菌BMB171为出发菌株，利用基于归巢内切酶I‑SceI诱发染色体同源重组机制的基因敲除体系成功获得2‑甲基柠檬酸脱水酶(PrpD)基因无痕缺失突变株ΔprpD。通过液相色谱和质谱的检测发现，与出发菌株BMB171相比，ΔprpD菌株胞内2‑甲基柠檬酸浓度提高了217倍，且与化学法合成的2‑甲基柠檬酸相比，本发明法所产生的2‑甲基柠檬酸空间构型专一。

Description

一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法。
背景技术
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一类杆状、产芽胞的革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤、植物叶表、植物根际等环境中，也是重要的昆虫病原菌。Bt最显著的特点是在形成芽胞的过程中产生由杀虫晶体蛋白组成的伴胞晶体，因而被广泛地用作微生物杀虫剂，具有杀虫活性高、杀虫谱广、对人畜安全、环境友好等优点。同时，Bt因培养周期短、中心代谢旺盛，是构建各种工程菌株的理想宿主。而苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171拥有遗传背景清晰、转化效率高、质粒兼容性及稳定性强等诸多优势，在蛋白质异源表达、高产小分子代谢物等方面极具潜力。
2-甲基柠檬酸是2-甲基柠檬酸循环的中间代谢物。2-甲基柠檬酸的合成是在2-甲基柠檬酸合成酶PrpC的催化下，以丙酰-CoA和草酰乙酸为底物缩合而成；其降解则是在2-甲基柠檬酸脱水酶PrpD的作用下脱水形成2-甲基顺乌头酸。
大量实验表明，细菌胞内2-甲基柠檬酸的积累能够产生细胞毒性，抑制细菌生长。例如，在肠道沙门氏菌中，prpD基因的缺失，导致该菌在含有丙酸的培养基中的生长受到明显的抑制，暗示着2-甲基柠檬酸能够抑制抑制细菌的生长；2-甲基柠檬酸可以显著抑制糖异生的关键酶果糖-1,6-二磷酸酶的活性，直接导致细菌的生长受阻。这些实验结果不仅丰富了2-甲基柠檬酸的生理功能，而且为新型抑菌物质的开发提供理论指导。
目前，市售的2-甲基柠檬酸药品均通过化学合成制得。而化学合成法往往选择性差，导致合成的2-甲基柠檬酸实为其四种对映异构体组成的混合物。同时，化学合成法工艺复杂、后续纯化难度极大，直接导致2-甲基柠檬酸药品价格高于黄金(仅仅10mg就需要1500元左右)。由此可见，利用合成特异性极强的生物法生产高纯的2-甲基柠檬酸具有重要经济价值。
因此，需要开发一种简单、高效并且成本低的生产2-甲基柠檬酸的生产方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌，是由苏云金芽胞杆菌BMB171基因组中敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD而得到的。
所述2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的有益效果是：本发明的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的2-甲基柠檬酸的产量比出发菌株苏云金芽胞杆菌BMB171提高了210倍，产量大大提升，降低了2-甲基柠檬酸的生产成本，且本发明生产的2-甲基柠檬酸空间构型专一。
本发明还提供了一种上述2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择含有壮观霉素抗性基因、归巢内切酶I-SceI特异识别作用位点、多克隆位点MCS、能在苏云金芽胞杆菌BMB171中复制的温敏型初始质粒，获取将要敲除的prpD基因上下游同源片段依次克隆到初始质粒中获得敲除载体；
(2)将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌BMB171中，筛选获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换菌株；
(3)将含有卡那霉素抗性基因、能够编码I-SceI酶的诱导质粒导入所述单交换菌株，在选择平板上选择获得第二次同源重组并实现靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株；
(4)挑取经PCR验证的靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株在无选择压力的条件下转接3～5次连续传代培养，获得质粒丢失的靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株，即为2-甲基柠檬酸高产基因工程菌。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述步骤(1)的具体步骤为：通过PCR技术，以出发菌株苏云金芽胞杆菌BMB171的总DNA为模板，分别扩增prpD靶基因上游和下游长度为0.7～1kb的同源序列片段，将他们依次连接到初始质粒上获得敲除载体。
进一步，所述初始质粒为pRP1028，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述步骤(2)中将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌BMB171中的方法为三亲本杂交法，将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌BMB171中的具体步骤为：将所述敲除载体转化大肠杆菌DH5α,获得含有敲除载体的供体菌，然后将供体菌与苏云金芽胞杆菌BMB171在辅助菌株的作用下将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌中。
进一步，所述诱导质粒为pSS4332，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
本发明的构建方法的有益效果是：本发明率先将无痕基因敲除技术应用于苏云金芽胞杆菌BMB171，可以将prpD基因完全敲除并且不残留任何抗生素抗性基因，本发明能够快速、稳定、高效的敲除prpD，还可以安全用于大规模工业生产。
本发明还提供了一种利用如权利要求1-2所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌生产2-甲基柠檬酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将2-甲基柠檬酸高产基因工程菌于28℃,200rpm下培养12～18h，收集菌液；
(2)将收集的菌液离心获得菌体并利用超声破碎以及有机溶剂前处理获得2-甲基柠檬酸粗品。
进一步，所述步骤(2)的具体步骤为：将收集的菌液离心弃去上清，加入去离子水重悬，加入的去离子水与原菌液的体积比为2～4:7，置于冰浴水中用超声破碎仪破碎，离心收集上清，加入8～10倍体积的丙酮剧烈震荡30～90s,12000rpm离心5min，除去上清，将得到的棕黄色沉淀在烘箱中烘干，然后用去离子水重悬棕黄色沉淀，去离子水与原菌液的体积比为3～10:700，加入乙腈，乙腈与去离子水的体积比为2:3，剧烈震荡，12000rpm离心5min，取上清，加入5～10倍的乙腈，剧烈震荡，12000rpm离心5min，弃去上清，将沉淀置于烘箱中烘干，即得到2-甲基柠檬酸粗品。
采用上述方法的有益效果是2-甲基柠檬酸的纯化效率高。
附图说明
图1为本发明经第二次单交换筛选所得6株菌的PCR验证结果图。各泳道所用PCR扩增模板说明：M为BM2000 Marker，从上至下分别指示的DNA片段大小为2kb、1kb、750bp、500bp、250bp；CK-模板为ddH2O，CK+模板为出发菌株BMB171总DNA，1-6泳道模板分别为第二次单交换筛选所得6株菌(编号依次为1#、2#、3#、4#、5#、6#)的总DNA；
图2为本发明prpC基因启动子活性的测定，BMB171/pHT1K-lacZ为空白对照菌株；
图3为本发明利用HPLC-UV检测2-甲基柠檬酸的色谱图，其中，图3A为2-甲基柠檬酸标准品的色谱图；图3B为ΔprpD样品的色谱图；图3C为BMB171样品的色谱图；
图4为本发明利用LC-Q-TOF检测ΔprpD和BMB171样品中2-甲基柠檬酸含量的结果图。菌株BMB171和ΔprpD在GYS培养基中分别培养6h和12h，用于胞内2-甲基柠檬酸的检测。小括号中数字表示2-甲基柠檬酸的浓度；***代表P<0.001。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明采用I-SceI酶介导的基因无痕敲除技术对苏云金芽胞杆菌BMB171染色体中的prpD基因进行无痕敲除，然后以lacZ为报告基因构建转录融合载体考察prpC基因在BMB171中的转录特性，并利用构建的高产2-甲基柠檬酸的工程菌生产2-甲基柠檬酸。
实施例1高产2-甲基柠檬酸的工程菌构建
1、敲除载体pRP1028-prpD-U-D的构建
以苏云金芽胞杆菌BMB171为出发菌株，根据prpD的基因序列及其上下游DNA序列，分别设计上下游同源片段引物，其中prpD的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，
ATGATTAAAACAAATGAAATTAAGCAAAAAGATGCATTATTAGAAGAGATTACCGATTATGTATTAAATAAAGAGGTTACTAGTGCAGAAGCATTCAGTACAGCTCGTTACGTATTACTTGATACACTTGGATGTGGAATTTTAGCACTGCAATATCCAGAATGTACGAAATTACTAGGACCAGTTGTGCCAGGAACAATCGTGCCAAATGGTACACGTGTACCAGGTACGTCTTATGTACTAGATCCAGTAAAAGGTGCATTTAATATCGGATGTATGATCCGTTGGTTAGACTATAACGATACTTGGCTTGCAGCAGAGTGGGGACATCCATCTGATAACCTAGGCGGAATTTTAGCAGTTGCAGATTATATTAGCCGTGTTCGTATTTCAGAAGGAAAAGAAGCTTTAAAAGTACGTGAAGTATTAGAAATGATGATTAAAGCACATGAAATTCAAGGCGTGCTTGCTTTAGAAAACAGCTTAAACAGAGTTGGTCTTGACCATGTATTATATGTAAAAGTAGCAACAACTGCAGTAGTTGCGAAAATGCTTGGCGGAACACGTGAAGAAATCTTTAATGCATTATCACATGCGTGGATTGATAATTCTAGTCTTCGTACATATCGTCATGCTCCAAATACGGGCTCACGTAAATCATGGGCTGCAGGTGACGCAACGAGCCGCGGTGTTCATCTTGCAATGACTGCTCTAAAAGGTGAAATGGGTTATCCAACAGCATTATCTGCGCCAGGATGGGGATTCCAAGATGTATTATTCAATAAACAAGAATTAAAATTAGCAAGACCACTAGAGTCATATGTAATGGAAAATGTATTATTTAAAGTGTCATATCCAGCAGAATTCCATGCACAAACGGCTGCAGAATGTGCAGTGAAGTTGCATCCGGAAATTAAAGAGAGATTAGATGAAATTGACCGTATTACAATTACAACTCATGAATCAGCAATTCGTATTATTGATAAAGAAGGTCCATTAAATAACCCAGCTGATCGTGATCATTGCTTACAATACATTACGGCAATTGGTTTATTAAAAGGAGATATCGTTGCAGACGATTATGAAGATGCAGTAGCAAACGATCCACGTGTAGATGAATTACGTAATAAGATGGTTGTTGTTGAAAACAAACAGTACAGTTTAGATTACCTTGACCCGAACAAGCGCTCAATCGCCAACGCTGTTCAAGTTCACTTTAAAGATGGCACAGTAACAGAAAATGTGGAATGTGAATATCCGCTTGGTCACCGCTTCCGTAGAGACGAAGCAATTCCAAAAGTTGTTCAAAAATTCACTGCAAATATGGCAGGTCATTATTCTAGTAAGCAACAAGAACAAATTCATGAAGTTTGTTTAAATGAAGAAAAACTAGAAAATATGAATGTAAACGAATTTGTAGATCTATTCTTAATTTAA
prpD基因上游臂的两条引物分别为prpD-U-F和prpD-U-R，prpD-U-F和prpD-U-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示：
AGCCACGCGTCTTATAGTGCGAATTTCTTC(SEQ ID NO:4)
TTCTAAATTCCCCCCTATTAGCTATTCTTCCCTTTCTGTCG(SEQ ID NO:5)
prpD基因下游臂的两条引物分别为prpD-D-F和prpD-D-R，prpD-D-F和prpD-D-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示：
CGACAGAAAGGGAAGAATAGCTAATAGGGGGGAATTTAGAA(SEQ ID NO:6)
ACGGTACCAACCATTTGGAAACCCATATTC(SEQ ID NO:7)
提取苏云金芽胞杆菌BMB171的总DNA，以总DNA为PCR扩增反应的模板，利用引物prpD-U-F和引物prpD-U-R扩增获得prpD基因上游臂，利用引物prpD-D-F和引物prpD-D-R扩增获得prpD基因下游臂，PCR配置体系为：DNA模板1μL，上游引物、下游引物各2μL，高保真PCR聚合酶1μL，5×buffer20μL，dNTP 2μL，补足ddH2O至100μL。PCR程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min，循环次数30次。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，prpD基因上游臂和下游臂的长度均为750bp，将目的条带进行割胶回收分别得到prpD基因上游臂同源片段prpD-U和prpD基因下游臂同源片段prpD-D。
利用cross-over PCR将prpD基因上游臂同源片段prpD-U和prpD基因下游臂同源片段prpD-D连接在一起，获得prpD-U-D片段。第一轮PCR的配置体系为：上游臂同源片段prpD-U 0.5μL,下游臂同源片段prpD-D 0.5μL，高保真PCR聚合酶0.2μL，5×buffer 4μL，dNTP 1μL，补足ddH2O至20μL。第一轮PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1.5min，循环次数10次。该轮PCR得到的产物可直接作为第二轮PCR的模板。第二轮PCR的配置体系为：第一轮PCR产物5μL，引物prpD-U-F 2μL，引物prpD-D-R 2μL，高保真PCR聚合酶1μL，5×buffer 20μL，dNTP 2μL，补足ddH2O至100μL。PCR程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1.5min，循环次数30次。第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并割胶回收纯化得到prpD-U-D片段。
初始质粒的抗生素抗性需要选用苏云金芽胞杆菌不具有的抗生素抗性，并且具有归巢内切酶I-SceI特异识别作用位点，选用本实验室保存的质粒pRP1028，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，pRP1028质粒具有壮观霉素抗性，且在苏云金芽胞杆菌中为温敏型，该质粒转入苏云金芽胞杆菌内28℃时可以自主复制，在37℃时无法复制。
GCGGCCGGAGACCTGTACACCCGGGACGCGTGGATCCGTCGACATGCATGGTACCAATTACCCTGTTATCCCTATAGTACCGGATCGCGCTTTTCCGCTGCATAACCCTGCTTCGGGGTCATTATAGCGATTTTTTCGGTATATCCATCCTTTTTCGCACGATATACAGGATTTTGCCAAAGGGTTCGTGTAGACTTTCCTTGGTGTATCCAACGGCGTCAGCCGGGCAGGATAGGTGAAGTAGGCCCACCCGCGAGCGGGTGTTCCTTCTTCACTGTCCCTTATTCGCACCTGGCGGTGCTCAACGGGAATCCTGCTCTGCGAGGCTGGCCGCGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGGGGATAGACTGTAACATTCTCACGCATAAAATCCCCTTTCATTTTCTAATGTAAATCTATTACCTTATTATTAATTCAATTCGCTCATAATTAATCCTTTTTCTTATTACGCAAAATGGCCCGATTTAAGCACACCCTTTATTCCGTTAATGCGCCATGACAGCCATGATAATTACTAATACTAGGAGAAGTTAATAAATACGTAACCAACATGATTAACAATTATTAGAGGTCATCGTTCAAAATGGTATGCGTTTTGACACATCCACTATATATCCGTGTCGTTCTGTCCACTCCTGAATCCCATTCCAGAAATTCTCTAGCGATTCCAGAAGTTTCTCAGAGTCGGAAAGTTGACCAGACATTACGAACTGGCACAGATGGTCATAACCTGAAGGAAGATCATTTTGTTTATTGCAATTGTATTGCTATTAATCGCAACATCAAACCAAAATAAAAACCCCCTTCGACTTTCGTCAGGGGGCTTTTATTTATTCAATAATCCCTCCTCTCAATAAATCTATTGTTGTACTTAATTCAACTTCCATTTCTCTGTATCTTTCAATACGCTCTTTTAAGTCCTTAATTTCTTTTTTTAATTCCTCATTTTCAGCAAATAACTCTTTTTCTTTGTTTGTCATTTTATTTCCCCCGTTTCAGCATCAAGAACCTTTGCATAACTTGCTCTATATCCACACTGATAATTGCCCTCAAACCATAATCTAAAGGCGCTAGAGTTTGTTGAAACAATATCTTTTACATCATTCGTATTTAAAATTCCAAACTCCGCTCCCCTAAGGCGAATAAAAGCCATTAAATCTTTTGTATTTACCAAATTATAGTCATCCACTATATCTAAAAGTAAATTCTTCAATTCTCTTTTTTGGCTTTCATCAAGTGTTATATAGCGGTCAATATCAAAATCATTAATGTTCAAAATATCTTTTTTGTCGTATATATGTTTATTCTTAGCAATAGCGTCCTTTGATTCATGAGTCAAATATTCATATGAACCTTTGATATAATCAAGTATCTCAACATGAGCAACTGAACTATTCCCCAATTTTCGCTTAATCTTGTTCCTAACGCTTTCTATTGTTACAGGATTTCGTGCAATATATATAACGTGATAGTGTGGTTTTTTATAGTGCTTTCCATTTTGTATAATATTACTATTATTCCATGTATCTTTATCTTTTTTTTCGTCCATATCGTGTAAAGGACTGACAGCCATAGATACGCCCAAACTCTCTAATTTTTCTTTCCAATCATTAGGAATTGAGTCAGGATATAATAAAAATCCAAAATTTCTAGCTTTAGTATTTTTAATAGCCATGATATAATTACCTTATCAAAAACAAGTAGCGAAAACTCGTATCCTTCTAAAAACGCGAGCTTTCGCTTATTTTTTTTGTTCTGATTCCTTTCTTGCATATTCTTCTATAGCTAACGCCGCAACCGCAGATTTTGAAAAACCTTTTTGTTTCGCCATATCTGTTAATTTTTTATCTTGCTCTTTTGTCAGAGAAATCATAACTCTTTTTTTCGATTCTGAAATCACCATTTAAAAAACTCCAATCAAATAATTTTATAAAGTTAGTGTATCACTTTGTAATCATAAAAACAACAATAAAGCTACTTAAATATAGATTTATAAAAAACGTTGGCGAAAACGTTGGCGATTCGTTGGCGATTGAAAAACCCCTTAAACCCTTGAGCCAGTTGGGATAGAGCGTTTTTGGCACAAAAATTGGCACTCGGCACTTAATGGGGGGTCGTAGTACGGAAGCAAAATTCGCTTCCTTTCCCCCCATTTTTTTCCAAATTCCAAATTTTTTTCAAAAATTTTCCAGCGCTACCGCTCGGCAAAATTGCAAGCAATTTTTAAAATCAAACCCATGAGGGAATTTCATTCCCTCATACTCCCTTGAGCCTCCTCCAACCGAAATAGAAGGGCGCTGCGCTTATTATTTCATTCAGTCATCGGCTTTCATAATCTAACAGACAACATCTTCGCTGCAAAGCCACGCTACGCTCAAGGGCTTTTACGCTACGATAACGCCTGTTTTAACGATTATGCCGATAACTAAACGAAATAAACGCTAAAACGTCTCAGAAACGCGGCCGCAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAACGTGTGGAATTGTGAAGAAAGGAGGTGAAATCATGAGCAATTTGATTAACGGAAAAATACCAAATCAAGCGATTCAAACATTAAAAATCGTAAAAGATTTATTTGGAAGTTCAATAGTTGGAGTATATCTATTTGGTTCAGCAGTAAATGGTGGTTTACGCATTAACAGCGATGTAGATGTTCTAGTCGTCGTGAATCATAGTTTACCTCAATTAACTCGAAAAAAACTAACAGAAAGACTAATGACTATATCAGGAAAGATTGGAAATACGGATTCTGTTAGACCACTTGAAGTTACGGTTATAAATAGGAGTGAAGTTGTCCCTTGGCAATATCCTCCAAAAAGAGAATTTATATACGGTGAGTGGCTCAGGGGTGAATTTGAGAATGGACAAATTCAGGAACCAAGCTATGATCCTGATTTGGCTATTGTTTTAGCACAAGCAAGAAAGAATAGTATTTCTCTATTTGGTCCTGATTCTTCAAGTATACTTGTCTCCGTACCTTTGACAGATATTCGAAGAGCAATTAAGGATTCTTTGCCAGAACTAATTGAGGGGATAAAAGGTGATGAGCGTAATGTAATTTTAACCCTAGCTCGAATGTGGCAAACAGTGACTACTGGTGAAATTACCTCGAAAGATGTCGCTGCAGAATGGGCTATACCTCTTTTACCTAAAGAGCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCTATCGGGGAGAGTGTGATGATAAGTGGGAAGGACTATATTCAAAGGTGAAAGCACTCGTTAAGTATATGAAAAATTCTATAGAAACTTCTCTCAATTGATGGCAAAACAACTTGAAAAAAGTTGTTGACAAAAAAGAAGCTGAATGTTATATTAGTAAAGTCTCGATGTTTGTTGACAGTATAAAGTTAGAAACTTATAATGATAAGAATTTTAGAAAGGAGGTAATTTAGATGCGTGGATCAGGATCTATGAGTGAATTGATTAAAGAAAATATGCATATGAAATTATATATGGAAGGAACTGTTAATAATCATCATTTCAAATGTACATCAGAGGGAGAAGGAAAACCATATGAGGGAACGCAAACTATGAAAATAAAGGTGGTAGAAGGAGGGCCTTTACCATTTGCATTCGATATTTTAGCTACGAGTTTTATGTATGGAAGTAAAGCATTTATTAATCATACTCAGGGGATACCGGATTTCTTTAAACAATCATTTCCTGAAGGATTTACATGGGAACGTATTACAACATATGAAGATGGGGGAGTATTAACGGCAACTCAAGATACGTCATTTCAAAATGGATGCATCATATACAATGTTAAAATCAATGGGGTTAACTTTCCATCTAATGGACCTGTGATGCAGAAGAAAACACGTGGGTGGGAAGCGAATACTGAGATGTTATATCCAGCTGATGGAGGGTTAAGAGGACATAGTCAAATGGCATTGAAATTAGTAGGAGGGGGATACTTACATTGTTCTTTTAAAACTACATATCGTTCTAAGAAACCAGCTAAAAACTTAAAGATGCCGGGGTTTCATTTTGTAGACCATAGATTAGAACGTATTAAAGAAGCGGATAAAGAAACATATGTTGAGCAACATGAAATGGCTGTAGCAAAATATTGTGATTTACCTAGTAAATTAGGGCATAGATAAGAATTCCCACGGGTTTTGCTGCCCGCAAACGGGCTGTTCTGGTGTTGCTAGTTTGTTATCAGAATCGCAGATCCGGCTTCGCCAGGTTTGCCGGCTGAAAGCGCTATTTCTTCCAGAATTGCCATGATTTTTTCCCCACGGGAGGCGTCACTGGCTCCCGTGTTGTCGGCAGCTTTGATTCGATAAGCAGCATCGCCTGTTTCAGGCTGTCTATGTGTGACTGTTGAGCTGTAACAAGTTGTCTCAGGTGTTCAATTTCATGTTCTAGTTGCTTTGTTTTACTGGTTTCACCTGTTCTATTAGGTGTTACATGCTGTTCATCTGTTACATTGTCGATCTGTTCATGGTGAACAGCTTTAAATGCACCAAAAACTCGTAAAAGCTCTGATGTATCTATCTTTTTTACACCGTTTTCATCTGTGCATATGGACAGTTTTCCCTTTGATATCTAACGGTGAACAGTTGTTCTACTTTTGTTTGTTAGTCTTGATGCTTCACTGATAGATACAAGAGCCATAAGAACCTCAGATCCTTCCGTATTTAGCCAGTATGTTCTCTAGTGTGGTTCGTTGTTTTTGCGTGAGCCATGAGAACGAACCATTGAGATCATGCTTACTTTGCATGTCACTCAAAAATTTTGCCTCAAAACTGGTGAGCTGAATTTTTGCAGTTAAAGCATCGTGTAGTGTTTTTCTTAGTCCGTTACGTAGGTAGGAATCTGATGTAATGGTTGTTGGTATTTTGTCACCATTCATTTTTATCTGGTTGTTCTCAAGTTCGGTTACGAGATCCATTTGTCTATCTAGTTCAACTTGGAAAATCAACGTATCAGTCGGGCGGCCTCGCTTATCAACCACCAATTTCATATTGCTGTAAGTGTTTAAATCTTTACTTATTGGTTTCAAAACCCATTGGTTAAGCCTTTTAAACTCATGGTAGTTATTTTCAAGCATTAACATGAACTTAAATTCATCAAGGCTAATCTCTATATTTGCCTTGTGAGTTTTCTTTTGTGTTAGTTCTTTTAATAACCACTCATAAATCCTCATAGAGTATTTGTTTTCAAAAGACTTAACATGTTCCAGATTATATTTTATGAATTTTTTTAACTGGAAAAGATAAGGCAATATCTCTTCACTAAAAACTAATTCTAATTTTTCGCTTGAGAACTTGGCATAGTTTGTCCACTGGAAAATCTCAAAGCCTTTAACCAAAGGATTCCTGATTTCCACAGTTCTCGTCATCAGCTCTCTGGTTGCTTTAGCTAATACACCATAAGCATTTTCCCTACTGATGTTCATCATCTGAGCGTATTGGTTATAAGTGAACGATACCGTCCGTTCTTTCCTTGTAGGGTTTTCAATCGTGGGGTTGAGTAGTGCCACACAGCATAAAATTAGCTTGGTTTCATGCTCCGTTAAGTCATAGCGACTAATCGCTAGTTCATTTGCTTTGAAAACAACTAATTCAGACATACATCTCAATTGGTCTAGGTGATTTTAATCACTATACCAATTGAGATGGGCTAGTCAATGATAATTACTAGTCCTTTTCCTTTGAGTTGTGGGTATCTGTAAATTCTGCTAGACCTTTGCTGGAAAACTTGTAAATTCTGCTAGACCCTCTGTAAATTCCGCTAGACCTTTGTGTGTTTTTTTTGTTTATATTCAAGTGGTTATAATTTATAGAATAAAGAAAGAATAAAAAAAGATAAAAAGAATAGATCCCAGCCCTGTGTATAACTCACTACTTTAGTCAGTTCCGCAGTATTACAAAAGGATGTCGCAAACGCTGTTTGCTCCTCTACAAAACAGACCTTAAAACCCTAAAGGCTTAAGTAGCACCCTCGCAAGCTCGGGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTCTCCGACCATCAGGCACCTGAGTCGCTGTCTTTTTCGTGACATTCAGTTCGCTGCGCTCACGGCTCTGGCAGTGAATGGGGGTAAATGGCACTACAGGCGCCTTTTATGGATTCATGCAAGGAAACTACCCATAATACAAGAAAAGCCCGTCACGGGCTTCTCAGGGCGTTTTATGGCGGGTCTGCTATGTGGTGCTATCTGACTTTTTGCTGTTCAGCAGTTCCTGCCCTCTGATTTTCCAGTCTGACCACTTCGGATTATCCCGTGACAGGTCATTCAGACTGGCTAATGCACCCAGTAAGGCAGCGGTATCATCAACAGGCTTACCCGTCTTACTGTCGGGAATTGATGCAGAAGCTTGAGCTCCTA(SEQ ID NO:2)
使用MulI和KpnI限制性内切酶双酶切初始质粒pRP1028，酶切体系为：86μLpRP1028，2μL MulI，2μL KpnI，10μL buffer K，充分混匀。将盛有酶切体系的1.5ml离心管放入37℃水浴锅中，6h后取出离心管加入10×loading buffer终止酶切反应，琼脂糖凝胶电泳并回收目的条带。使用相同的酶切体系酶切prpD-U-D片段，20h后加入10Xloadingbuffer终止酶切反应，琼脂糖凝胶电泳并回收目的条带。各取2μL回收的pRP1028 DNA和prpD-U-D DNA利用琼脂糖凝胶电泳分析各自浓度，确定连接体系的添加量。连接体系中prpD-U-D和载体pRP1028的分子摩尔比为4～10较适宜，T4DNA连接酶1μL，T4连接酶buffer1μL，40％PEG30001μL总体积10μL置于16℃连接过夜，将连接产物与E.coli DH5α感受态细胞混合均匀，冰上放置30min，42℃热激1min，立即冰上放置2min，再加入900μL LB培养基于37℃摇床中恢复培养1h，之后取100μL菌液涂布在含有壮观霉素(Spc，100μg/mL)的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。待菌落长出后，用无菌牙签挑取适量菌体打散在盛有40μLddH2O的1.5mL离心管中，沸水中煮10min，12,000rpm离心1min后取上清作为PCR反应的DNA模板。PCR配置体系为：DNA模板1μL，引物prpD-U-F、prpD-D-R各1μL，Easy Taq DNA聚合酶0.2μL，10×buffer 2μL，dNTP 0.8μL，补足ddH2O至20μL。PCR程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1.5min，循环次数30次。PCR完成后，取5μL产物用琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性克隆送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序正确的转化子即为含有敲除载体pRP1028-prpD-U-D的转化子，将测序结果正确的转化子保存甘油管。
2、第一次单交换流程及筛选
用三亲本杂交法将敲除载体pRP1028-prpD-U-D转入苏云金芽胞杆菌BMB171中，筛选获得发生第一次同源重组并使质粒整合到受体菌染色体上的单交换菌株。三亲本杂交法使用的辅助菌株为含有辅助质粒pSS1827的E.coli DH5α，质粒pSS1827具有Amp抗性，其核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示。
活化受体菌株(苏云金芽胞杆菌BMB171)、辅助菌株(含有辅助质粒pSS1827的E.coli DH5α，Amp抗性)和整合菌株(上述制备的含有敲除载体pRP1028-prpD-U-D的E.coliDH5α，Spc抗性)，活化的方法为：分别划线与固体LB平板上，过夜培养使其形成典型的单菌落，挑取单菌落接种于5mL液体LB培养基中，200r/min振荡过夜培养，其中BMB171的培养温度为28℃，大肠杆菌培养温度为37℃。各取1mL的上述三株菌，用无抗性的LB液体培养基洗涤三次，最后用300μL的LB培养基重悬(尽量使重悬后的三株菌的OD值保持一致)，然后将三株菌混合在一起，并充分混匀，取200μL的混合菌液滴于LB固体平板上，28℃静置培养1天，用枪头将长好的菌落刮尽并重悬于500μL的LB培养基中，分别涂布于4个有抗性的LB平板(Spc 300μg/mL和Pmx 60units)上，其中Pmx为多粘菌素，能够抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌的生长，可以将辅助菌株筛除，于28℃静置培养直至有红色菌落(质粒pRD1028可以编码红色荧光蛋白)出现为止，一般为一星期左右。
挑取红色的单菌落于液体有抗性的LB培养基中(Spc 300μg/mL和Pmx 60units)，28℃过夜活化。然后转接两次，37℃培养，每次培养7h，以消除未整合到BMB171基因组上的质粒pRP1028-prpD-U-D，转接完毕后，划线于固体LB平板(Spc 300μg/mL和Pmx 60units)中，37℃培养1天。最后挑取红色的单菌落，则得到第一次单交换菌株。
3、第二次单交换流程及筛选
诱导质粒选择本实验室保存的质粒pSS4332，质粒pSS4332具有卡那霉素(Kan)抗性，能够编码I-SceI酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：CGACTCACTATTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGAGATAGTGTTCGGCAGTTTGTACATCATCTGCGGGATCAGGTACGGTTTGATCAGGTTGTAGAAGATCAGGTAAGACATAGAATCGATGTAGATGATCGGTTTGTTTTTGTTGATTTTTACGTAACAGTTCAGTTGGAATTTGTTACGCAGACCCTTAACCAGGTATTCTACTTCTTCGAAAGTGAAAGACTGGGTGTTCAGTACGATCGATTTGTTGGTAGAGTTTTTGTTGTAATCCCATTTACCACCATCATCCATGAACCAGTATGCCAGAGACATCGGGGTCAGGTAGTTTTCAACCAGGTTGTTCGGGATGGTTTTTTTGTTGTTAACGATGAACAGGTTAGCCAGTTTGTTGAAAGCTTGGTGTTTGAAAGTCTGGGCGCCCCAGGTGATTACCAGGTTACCCAGGTGGTTAACACGTTCTTTTTTGTGCGGCGGGGACAGTACCCACTGATCGTACAGCAGACATACGTGGTCCATGTATGCTTTGTTTTTCCACTCGAACTGCATACAGTAGGTTTTACCTTCATCACGAGAACGGATGTAAGCATCACCCAGGATCAGACCGATACCTGCTTCGAACTGTTCGATGTTCAGTTCGATCAGCTGGGATTTGTATTCTTTCAGCAGTTTAGAGTTCGGACCCAGGTTCATTACCTGGTTTTTTTGATGCATTAGCGTTCTCCTTTCATTGGATCCCCCGGGAGATCTCGATATCGAATTCTCAGAAAGGGACAACAGAGGTTATATGTGCAACAGCGTGCTCCGTCAGCTGAACACTGTTGCCACCTTTGTCAAGGTCGGTCCTCGCAATGCGATGTTCCACCGCATGGTTTGGTGGCATCGTCACCGGTTTTTTTGTCTTGTAAGAAGTGTGGAATTGGCATCTGTAATTGCCACCTCCTTGCAGCATGAGGAACGCGGTGACATCACCCTTCAATATTCCATCGCAGACAGTCATTTTCTCAAAAGATGGGTCCCAACCAGTTGTCATCTTCGCCATCACAGGTCCATCAGCAGGAAAGTTCACTCCATGAAACGTGGATTTGTGCTCAAAGCAGTTGCCTTTAAGGCTTATTTCCCAACTGGCTGTAGCAACTCCTCCATCTTCATAGGTAAAAGTCCTTTCATATGACATTCCGTCAGGAAATGCTTGTTTGAAATAGTCGGGCATACTGGTAGGATACGCAGTAAAGCATCGATTTCCATACATGAACACTGTAGATAGTATGTCAAAGGAGAATGCAAGGGGCCCACCGTTGGCCATGGTGACTTTAAAAGTCGAGGTCTGCGTCCCTTCGTATGGCTTCCCGCTGCCTTCACCTTTGACGGTAAAGTAATGCCCATTGACACAGCCATCCATATGGTAGGTCATTTTCATGTCATCTCCGATAAACTTGTTTGAAAGAGCCATCAAAACAATTCATCCAGTAAAATATAATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATATCCTCCCTGATCGACCGGACGCAGAAGGCAATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCTCCCAAGATCAATAAAGCCACTTACTTTGCCATCTTTCACAAAGATGTTGCTGTCTCCCAGGTCGCCGTGGGAAAAGACAAGTTCCTCTTCGGGCTTTTCCGTCTTTAAAAAATCATACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGAGTGTCTTCTTCCCAGTTTTCGCAATCCACATCGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAATCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAGGGACAATCCGATATGTCGATGGAGTGAAAGAGCCTGATGCACTCCGCATACAGCTCGATAATCTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTTCATACTCTTCCGAGCAAAGGACGCCATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGCTCCAGCCATCATGCCGTTCAAAGTGCAGGACCTTTGGAACAGGCAGCTTTCCTTCCAGCCATAGCATCATGTCCTTTTCCCGTTCCACATCATAGGTGGTCCCTTTATACCGGCTGTCCGTCATTTTTAAATATAGGTTTTCATTTTCTCCCACCAGCTTATATACCTTAGCAGGAGACATTCCTTCCGTATCTTTTACGCAGCGGTATTTTTCGATCAGTTTTTTCAATTCCGGTGATATTCTCATTTTAGCCATTTATTATTTCCTTCCTCTTTTCTACAGTATTTAAAGATACCCCAAGAAGCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCACTGTTCCTTGCATTCTAAAACCTTAAATACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACATAGTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCACAATTATGATAGAATTTACAAGCTATAGGGAATCATTTGAAGGTTGGTACTATATAAAAATAATATGCATTTAATACTAGCGACGCCATCTATGTGGCGCGGCCGCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGGGTACCGGATCGCGCTTTTCCGCTGCATAACCCTGCTTCGGGGTCATTATAGCGATTTTTTCGGTATATCCATCCTTTTTCGCACGATATACAGGATTTTGCCAAAGGGTTCGTGTAGACTTTCCTTGGTGTATCCAACGGCGTCAGCCGGGCAGGATAGGTGAAGTAGGCCCACCCGCGAGCGGGTGTTCCTTCTTCACTGTCCCTTATTCGCACCTGGCGGTGCTCAACGGGAATCCTGCTCTGCGAGGCTGGCCGGGTACCTAGGAATAATGAGGGCAGACGTAGTTTATAGGGTTAATGATACGCTTCCCTCTTTTAATTGAACCCTGTTACATTCATTACACTTCATAATTAATTCCTCCTAAACTTGATTAAAACATTTTACCACATATAAACTAAGTTTTAAATTCAGTATTTCATCACTTATACAACAATATGGCCCGTTTGTTGAACTACTCTTTAATAAAATAATTTTTCCGTTCCCAATTCCACATTGCAATAATAGAAAATCCATCTTCATCGGCTTTTTCGTCATCATCTGTATGAATCAAATCGCCTTCTTCTGTGTCATCAAGGTTTAATTTTTTATGTATTTCTTTTAACAAACCACCATAGGAGATTAACCTTTTACGGTGTAAACCTTCCTCCAAATCAGACAAACGTTTCAAATTCTTTTCTTCATCATCGGTCATAAAATCCGTATCCTTTACAGGATATTTTGCAGTTTCGTCAATTGCCGATTGTATATCCGATTTATATTTATTTTTCGGTCGAATCATTTGAACTTTTACATTTGGATCATAGTCTAATTTCATTGCCTTTTTCCAAAATTGAATCCATTGTTTTTGATTCACGTAGTTTTCTGTATTCTTAAAATAAGTTGGTTCCACACATACCAATACATGCATGTGCTGATTATAAGAATTATCTTTATTATTTATTGTCACTTCCGTTGCACGCATAAAACCAACAAGATTTTTATTAATTTTTTTATATTGCATCATTCGGCGAAATCCTTGAGCCATATCTGACAAACTCTTATTTAATTCTTCGCCATCATAAACATTTTTAACTGTTAATGTGAGAAACAACCAACGAACTGTTGGCTTTTGTTTAATAACTTCAGCAACAACCTTTTGTGACTGAATGCCATGTTTCATTGCTCTCCTCCAGTTGCACATTGGACAAAGCCTGGATTTACAAAACCACACTCGATACAACTTTCT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活化上述得到的第一次单交换菌株、辅助菌株(含有辅助质粒pSS1827的E.coliDH5α，Amp抗性)和表达菌株(含诱导质粒pSS4332的E.coli DH5α，Kan抗性)，各取1mL的上述三株菌，用无抗性的LB液体培养基洗涤三次，最后用300μL的LB培养基重悬(尽量使重悬后的三株菌的OD值保持一致)，然后将三株菌混合在一起，并充分混匀，取200μL的混合菌液滴于LB固体平板上，28℃静置培养1天，用枪头将长好的菌落刮尽并重悬于500μL的LB培养基中，分别涂布于2个有抗性的LB平板(Kan 50μg/mL和Pmx 60units)上，培养1～2天，用接种环分别划取每个平板上的菌落，然后划线于另2个相同抗性的LB平板上，培养1～2天，得到单菌落。挑取得到的单菌落，分别点板于两个不同抗性的LB固体平板(抗性分别为Spc 300μg/mL和Kan 50μg/mL)上培养，挑取Kan抗性下生长，但Spc抗性下不生长的单菌落于液体LB培养基中活化，抽提总DNA进行PCR和测序验证,PCR的上下游引物分别为prpD-I-F和prpD-I-R，其中prpD-I-F和prpD-I-R的引物序列分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13,SEQ IDNO:12的序列为ATGCATTATCACATGCGTGGA，SEQ ID NO:13的序列为TCTAATCTCTCTTTAATTTC。取6株菌进行PCR验证，结果如图1所示，阳性对照孔道CK+出现大小为600bp的prpD基因的特异性目的DNA条带，而4号与6号孔道中未出现相应的条带，说明4#和6#菌株中prpD基因被成功敲除。
将验证正确的菌株于28℃不断传代培养以获得最终消除多余的表达质粒pSS4332，prpD完全敲除的目的菌株。
实施例2苏云金芽胞杆菌中2-甲基柠檬酸合成时间点的确定
1、转录融合载体pHT1K-PprpC-lacZ的构建及提取
转录融合载体选择含有lacZ的质粒pHT1K,来自本实验室保存的质粒，质粒pHT1K-lacZ含有氨苄青霉素(Amp)抗性和红霉素(Ery)抗性，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
以BMB171总DNA为PCR扩增反应的模板，利用引物PprpC-lacZ-F和引物PprpC-lacZ-R扩增获得prpC启动子片段。其中引物PprpC-lacZ-F和引物PprpC-lacZ-R的序列分别为SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9所示：
CCCCCATGGTAACTTTATTAAAAATGA(SEQ ID NO:8)
GGATCCTATTTCCTCCAATCCTAATAG(SEQ ID NO:9)
PCR配置体系为：DNA模板1μL，引物PprpC-lacZ-F 2μL，引物PprpC-lacZ-R 2μL，高保真PCR聚合酶1μL，5×buffer 20μL，dNTP 2μL，补足ddH2O至100μL。PCR程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸30s，循环次数30次。琼脂糖凝胶检测并纯化回收目的条带，使用NcoI和BamHI限制性内切酶双酶切pHT1K-lacZ载体(Amp抗性)，酶切体系为：86μL pHT1K-lacZ，2μL NcoI，2μL BamHI，10μL buffer K，充分混匀，6h后加入10×loading buffer终止酶切反应并进行琼脂糖凝胶检测纯化回收。使用相同的酶切体系酶切prpC启动子片段。20h后加入10×loading buffer终止酶切反应并进行琼脂糖凝胶电泳检测纯化回收目的条带。将两个连接诶片段进行连接，转化E.coli DH5α菌株并筛选得到含有转录融合载体pHT1K-PprpC-lacZ的转化子，将含转录融合载体pHT1K-PprpC-lacZ的E.coliDH5α菌株(Amp抗性，浓度100μg/mL)接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。用质粒小提中量试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取质粒DNA。提取步骤为：取5mL菌液于离心管，12,000rpm离心1min，弃上清液；用250μL溶液P1充分溶解菌体；加入350μL溶液P2，温和上下翻转使菌体充分裂解；加入350μL溶液P3，轻轻翻转混匀，12,000rpm离心10min；将上清液全部转至树脂回收柱中，12,000rpm离心10min，弃掉收集管中废液；向树脂柱中加入700μL Washing Buffer，12,000rpm离心1min，弃掉收集管中废液；向树脂柱中加入500μL Washing Buffer，12,000rpm离心1min，弃掉收集管中废液；12,000rpm离心2min弃尽残留液体，向树脂膜上滴加60-100μL Elution Buffer，2min后12,000rpm离心1min收集得到的液体即为提取的转录融合载体pHT1K-PprpC-lacZ。
2、BMB171感受态细胞的制备及电转化
挑取BMB171单菌落接种于5mL液体LB培养基中，于28℃，200rpm振荡过夜培养；按1:100的接种量将活化好的菌液转接至100mL LB培养基中，然后于28℃，200rpm振荡培养至OD值为0.2；将培养好的菌液冰浴30min后，用100mL离心管以4,000rpm，5min冷冻离心收集菌体；加入10mL SG buffer重悬菌体，4,000r/min，5min冷冻离心收集菌体，重复洗涤3次；最后加入2mL SG buffer重悬菌体，每管分装100μL，放置于-80℃保存，即成感受态细胞；取100μL的感受态细胞，加入5μL的载体pHT1K-PprpC-lacZ，轻轻混匀，随后加入电转杯中，于冰上冰浴10min；用吸水纸吸干电转杯外壁水分后，至电转仪上进行电脉冲处理。电脉冲电压为1.25kV；电转完毕后，迅速加1mL LB培养基于电转化杯中，并轻轻混匀，然后转移至一无菌的EP管中，置于28℃，200rpm振荡恢复培养2h；随后取100μL培养基涂布于红霉素(Ery，浓度为25μg/mL)的LB固定平板中，28℃倒置培养过夜。红霉素抗性平板中长出的菌落表示pHT1K-PprpC-lacZ已成功电转至BMB171中，可用于后续β-半乳糖苷酶活性的测定。
2、β-半乳糖苷酶活性的测定
GYS培养基配方：葡萄糖1g；酵母提取物2g；硫酸铵2g；K2HPO4·3H2O，0.655g；MgSO4·7H2O，0.041g；MnSO4·H2O，0.0378g；CaCl2，0.08g；调节pH至7.8-7.9，定容至1L，115℃高温高压灭菌30min；
Z Buffer配方：0.06mol/L Na2HPO4，0.04mol/L NaH2PO4，0.01mol/L KCl，0.001mol/L MgSO4，0.05mol/Lβ-巯基乙醇，pH 7.0。β-巯基乙醇要在用前加入。
将携带有pHT1K-PprpC-lacZ质粒的BMB171菌株(命名为BMB171/pHT1K-PprpC-lacZ)接种至GYS培养基中，从培养的第6h开始至24h结束，每间隔2h，取2mL样品，12,000r/min离心2min，弃上清；加入1mL Z Buffer悬浮菌体；置于冰浴水中，用超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎5min(超声破功率：150W，超声波工作1.0s，超声波停止1.5s，如此反复，共计5min)；随后，12,000rpm离心5min，去除细胞碎片和不溶物；取50μL样品用Bradford法测定蛋白质浓度；另取一定体积的上清液，转移到新的离心管中，用ZBuffer补足到1mL；混匀后，置于37℃水浴锅中平衡5min。向样品中加入200μL已预热到37℃的ONPG溶液(4mg/mL)，混匀后置于37℃水浴锅中开始反应，并记录反应起始时间t0；待样品出现淡黄色(A420＝0.6-0.9)，加入0.5mL Na2CO3溶液终止反应，记录反应终止时间t；用可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)测定样品的A420和A550；样品β-半乳糖苷酶活性可由如下进行计算：
Figure BDA0001783632490000211
其中C为蛋白质浓度(mg/mL)。
结果如图2所示，表明prpC的转录活性在对数期(9h之前)处于比较低的水平，进入稳定期后(从9h开始)，活性逐步增强，并在较长时间内(12～18h)一直维持在高活性水平。BMB171/pHT1K-lacZ为空白对照菌株。
实施例3苏云金芽胞杆菌胞内2-甲基柠檬酸的提取及含量测定
1、提取方法
采用超声波破碎结合有机溶剂除杂前处理的技术获得2-甲基柠檬酸粗品。具体步骤为：将BMB171或ΔprpD菌株在GYS培养基中培养至6h或12h，收集35mL菌液，12,000r/min离心2min，弃上清，加入10mL ddH2O悬浮菌体；置于冰浴水中，用超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎30min(超声破功率：250W，超声波工作1.0s，超声波停止1.5s，如此反复，共计30min)；随后，12,000rpm离心5min，收集上清；取3.5mL上清液，加入31.5mL丙酮，置于振荡器上剧烈振荡1min，12,000rpm离心5min，弃掉上清；将有棕黄色沉淀的离心管放入50℃烘箱中充分烘干，加入150μL ddH2O充分溶解棕黄色沉淀；随后，加入100μL乙腈，置于振荡器上剧烈振荡，12,000rpm离心5min，取200μL上清至一新的离心管中；加入1mL乙腈，置于振荡器上剧烈振荡，12,000rpm离心5min，弃尽上清，将沉淀置于50℃烘箱中，所得沉淀即为2-甲基柠檬酸粗品。
2、2-甲基柠檬酸含量的测定
使用HPLC-UV和LC-Q-TOF分别测定12h时BMB171和ΔprpD胞内2-甲基柠檬酸含量。用100μL ddH2O充分溶解2-甲基柠檬酸粗品，并用孔径为0.22μm的尼龙膜滤器除去残留细微杂质，滤得的清澈液体即为可直接上机进行高效液相色谱和质谱检测。如图3所示，A图为2-甲基柠檬酸标准品的色谱图；图B为ΔprpD样品的色谱图；图C为BMB171样品的色谱图。2-甲基柠檬酸标准品谱图含有两个特征峰(保留时间分别为6.75min和8.25min)，这是由于2-甲基柠檬酸标准品为其对映异构体混合物所致(见图3A)。而ΔprpD样品只在6.75min处出现特征峰，说明生物体只合成特定构型的2-甲基柠檬酸(见图3B)。但是BMB171样品在相应保留时间处无特征峰出现(见图3C)，可能是由于该样品中2-甲基柠檬酸浓度较低，液相色谱检测法无法检出。该实验结果说明，ΔprpD样品中2-甲基柠檬酸浓度高于BMB171样品。
HPLC-UV检测2-甲基柠檬酸
液相色谱型号为UltiMate3000；选用C18分析柱(4.6mm×250mm,3.5μm；Agilent)。流动相为90％ddH2O+10％甲醇+0.1％甲酸；HPLC-UV参数设置为：柱温箱25℃，进样体积10μL，流速1mL/min，检测波长210nm。
LC-Q-TOF检测
液相色谱仪型号为Agilent 1260，Q-TOF质谱仪型号为G6530；选用ZORBAX SB-Aq分析柱(2.1mm×150mm,5μm；Agilent)。流动相为90％ddH2O+10％甲醇+0.1％甲酸；LC参数设置为：柱温箱30℃，进样体积5μL，流速300μL/min，紫外检测器波长210nm；Q-TOF参数设置为：负离子模式，毛细管电压4000V，辅助气压力50psi，干燥气流速9L/min，鞘气温度350℃，扫描范围m/z 50～800。利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis Softwareversion B.06.00软件和峰面积法计算样品中2-甲基柠檬酸的相对含量。首先，利用m/z205.03从总离子流图谱(TIC)中提取2-甲基柠檬酸离子组分(允许m/z单边20ppm质量摆动)，获得提取离子流图谱(EIC)；再将EIC中2-甲基柠檬酸特征离子峰进行积分获得峰面积，由于峰面积大小与2-甲基柠檬酸浓度成正比，即可通过峰面积大小得到BMB171和ΔprpD样品中2-甲基柠檬酸的相对含量，同时根据2-甲基柠檬酸的标准曲线计算BMB171和ΔprpD样品中2-甲基柠檬酸的含量。结果显示，在GYS培养基中培养至6h，BMB171和ΔprpD样品中均无2-甲基柠檬酸(前面结果显示2-甲基柠檬酸合成酶PrpC只在稳定期开始表达，因此6h所对应的对数生长期的菌株胞内并未开始合成2-甲基柠檬酸)；当培养至第12h时BMB171样品和ΔprpD样品中2-甲基柠檬酸的浓度分别为0.032mg/L和7mg/L，如图4所示，说明与出发菌株BMB171相比，ΔprpD菌株胞内2-甲基柠檬酸浓度提高了217倍。本发明的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌能够极大的提高2-甲基柠檬酸的产量，降低其生产成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北工程学院
<120> 一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌及其构建方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 1
atgattaaaa caaatgaaat taagcaaaaa gatgcattat tagaagagat taccgattat 60
gtattaaata aagaggttac tagtgcagaa gcattcagta cagctcgtta cgtattactt 120
gatacacttg gatgtggaat tttagcactg caatatccag aatgtacgaa attactagga 180
ccagttgtgc caggaacaat cgtgccaaat ggtacacgtg taccaggtac gtcttatgta 240
ctagatccag taaaaggtgc atttaatatc ggatgtatga tccgttggtt agactataac 300
gatacttggc ttgcagcaga gtggggacat ccatctgata acctaggcgg aattttagca 360
gttgcagatt atattagccg tgttcgtatt tcagaaggaa aagaagcttt aaaagtacgt 420
gaagtattag aaatgatgat taaagcacat gaaattcaag gcgtgcttgc tttagaaaac 480
agcttaaaca gagttggtct tgaccatgta ttatatgtaa aagtagcaac aactgcagta 540
gttgcgaaaa tgcttggcgg aacacgtgaa gaaatcttta atgcattatc acatgcgtgg 600
attgataatt ctagtcttcg tacatatcgt catgctccaa atacgggctc acgtaaatca 660
tgggctgcag gtgacgcaac gagccgcggt gttcatcttg caatgactgc tctaaaaggt 720
gaaatgggtt atccaacagc attatctgcg ccaggatggg gattccaaga tgtattattc 780
aataaacaag aattaaaatt agcaagacca ctagagtcat atgtaatgga aaatgtatta 840
tttaaagtgt catatccagc agaattccat gcacaaacgg ctgcagaatg tgcagtgaag 900
ttgcatccgg aaattaaaga gagattagat gaaattgacc gtattacaat tacaactcat 960
gaatcagcaa ttcgtattat tgataaagaa ggtccattaa ataacccagc tgatcgtgat 1020
cattgcttac aatacattac ggcaattggt ttattaaaag gagatatcgt tgcagacgat 1080
tatgaagatg cagtagcaaa cgatccacgt gtagatgaat tacgtaataa gatggttgtt 1140
gttgaaaaca aacagtacag tttagattac cttgacccga acaagcgctc aatcgccaac 1200
gctgttcaag ttcactttaa agatggcaca gtaacagaaa atgtggaatg tgaatatccg 1260
cttggtcacc gcttccgtag agacgaagca attccaaaag ttgttcaaaa attcactgca 1320
aatatggcag gtcattattc tagtaagcaa caagaacaaa ttcatgaagt ttgtttaaat 1380
gaagaaaaac tagaaaatat gaatgtaaac gaatttgtag atctattctt aatttaa 1437
<210> 2
<211> 6537
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggccggag acctgtacac ccgggacgcg tggatccgtc gacatgcatg gtaccaatta 60
ccctgttatc cctatagtac cggatcgcgc ttttccgctg cataaccctg cttcggggtc 120
attatagcga ttttttcggt atatccatcc tttttcgcac gatatacagg attttgccaa 180
agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa 240
gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg 300
ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg ccgcgtaccc aattcgccct atagtgagtc 360
gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt 420
tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc aggggataga ctgtaacatt 480
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ttattccgtt aatgcgccat gacagccatg ataattacta atactaggag aagttaataa 660
atacgtaacc aacatgatta acaattatta gaggtcatcg ttcaaaatgg tatgcgtttt 720
gacacatcca ctatatatcc gtgtcgttct gtccactcct gaatcccatt ccagaaattc 780
tctagcgatt ccagaagttt ctcagagtcg gaaagttgac cagacattac gaactggcac 840
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ctttcaatac gctcttttaa gtccttaatt tcttttttta attcctcatt ttcagcaaat 1080
aactcttttt ctttgtttgt cattttattt cccccgtttc agcatcaaga acctttgcat 1140
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aaagtaaatt cttcaattct cttttttggc tttcatcaag tgttatatag cggtcaatat 1380
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ttacaggatt tcgtgcaata tatataacgt gatagtgtgg ttttttatag tgctttccat 1620
tttgtataat attactatta ttccatgtat ctttatcttt tttttcgtcc atatcgtgta 1680
aaggactgac agccatagat acgcccaaac tctctaattt ttctttccaa tcattaggaa 1740
ttgagtcagg atataataaa aatccaaaat ttctagcttt agtattttta atagccatga 1800
tataattacc ttatcaaaaa caagtagcga aaactcgtat ccttctaaaa acgcgagctt 1860
tcgcttattt tttttgttct gattcctttc ttgcatattc ttctatagct aacgccgcaa 1920
ccgcagattt tgaaaaacct ttttgtttcg ccatatctgt taatttttta tcttgctctt 1980
ttgtcagaga aatcataact ctttttttcg attctgaaat caccatttaa aaaactccaa 2040
tcaaataatt ttataaagtt agtgtatcac tttgtaatca taaaaacaac aataaagcta 2100
cttaaatata gatttataaa aaacgttggc gaaaacgttg gcgattcgtt ggcgattgaa 2160
aaacccctta aacccttgag ccagttggga tagagcgttt ttggcacaaa aattggcact 2220
cggcacttaa tggggggtcg tagtacggaa gcaaaattcg cttcctttcc ccccattttt 2280
ttccaaattc caaatttttt tcaaaaattt tccagcgcta ccgctcggca aaattgcaag 2340
caatttttaa aatcaaaccc atgagggaat ttcattccct catactccct tgagcctcct 2400
ccaaccgaaa tagaagggcg ctgcgcttat tatttcattc agtcatcggc tttcataatc 2460
taacagacaa catcttcgct gcaaagccac gctacgctca agggctttta cgctacgata 2520
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aaaggaggtg aaatcatgag caatttgatt aacggaaaaa taccaaatca agcgattcaa 2700
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catagtttac ctcaattaac tcgaaaaaaa ctaacagaaa gactaatgac tatatcagga 2880
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gttgtccctt ggcaatatcc tccaaaaaga gaatttatat acggtgagtg gctcaggggt 3000
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gcacaagcaa gaaagaatag tatttctcta tttggtcctg attcttcaag tatacttgtc 3120
tccgtacctt tgacagatat tcgaagagca attaaggatt ctttgccaga actaattgag 3180
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gcccgttgca gttcctgagc accaagggcg accgtgcttg ggcgatggag tggatcgaca 7980
ccatcctggc gttgaacggc gtcgaaacga ccccggccca gcgcaacgaa atcggcaacg 8040
cgatcatgag catgcacgcc agcggcgcgc gcacgctctc cgagttcagc gtgacgattc 8100
aggatgaggc gatccgcgag gcgatccgcc agtacaccgt cgatggcgca atgggccatc 8160
tgctcgacgc cgaagaggac ggcttggcgc tgtccgactt tacagtgttc gagatcgaag 8220
agctgatgaa cctcggcgag aaattcgccc tgcctgtgtt gctctacctg ttccgccgta 8280
tcgagcgcgc cctgacgggc cagccggccg tcatcatcct ggacgaagcc tggttgatgc 8340
tcggccaccc ggcattccgc gcgaagatca gggaatggct caaggtgctg cgtaaggcca 8400
actgccttgt gctgatggca acgcagagcc tgtccgacgc cgccaacagc ggcatcctgg 8460
acgtgatcgt ggaatcgacc gcgaccaaga ttttcctgcc gaatatttac gccagggatg 8520
aggacacggc ggccctgtac cgccgcatgg gcctgaacgc tcgccagatc gagattctgg 8580
cccaggccgt tcccaagcgt cagtactact acgtgtcgga aaacggccgc cgtctctacg 8640
acctggcact tggcccgctc gcgctcgcgt tcgtcggcgc atccgacaag gaatccgtcg 8700
ccatcatcaa gaacctggaa gccaagttcg gcgaccagtg ggtggatgaa tggctgcgtg 8760
gccggggcct cgcccttgat gaatacctgg aggcagcatg agttttgcag acacgatcaa 8820
gggcttgatc ttcaagaaga agcccgcaac ggccgcagca gcggcgacgc cggccgcgac 8880
cggcccgcaa accgacaacc cgtacctgac ggcgcggcgc acctggaacg accacgttgg 8940
ttccgttgtg tcgcaaaagc agacctggca ggttgtcggc atcctttcgc tgatgatcgt 9000
cctcgcggcg gtcggcggca tcatccacat cggcagccag tcgaagttcg tgccctatgt 9060
ctacgaggta gacaagctcg ggcagacggc cgccgtgggg ccgatgacca gggcgtcgaa 9120
agccgatccg cgtgtcattc acgcctcggt ggctgagttc gtcggcgatg ctcgcctggt 9180
gacgccggac gtagctttgc agcgcaaggc cgtctaccgc ctctatgcca agctcgggcc 9240
gaatgacccg gccaccgcca agatgaacga atggctcaac ggcaccgccg acgccagccc 9300
gttcgctcgc gcggccgtcg aaacggtcag caccgaaatc acttccgtaa tcccgcagac 9360
gcccgacacc tggcaggtcg attgggtcga gacgacgcgc gacaggcaag gcgtggtgaa 9420
aggccagccc gtgcgcatgc gggccttggt gacggtctac gtcgtcgagc cgacggcgga 9480
caccaaggaa gaacaactgc gaaacaaccc ggccgggatc tacgtccggg acttctcctg 9540
gtcgagactt ctgtgaggca ctgaattatg aaaaaggaac tgtttgcttt ggtcctggcc 9600
gcgtccgtta gcgtgcctgc atttgccgcc gatcccggcg cggacctgac tgacctctat 9660
ttttccggca agaacccgga gctgaccgcg caagagcggg cggccatcgc catcgccaag 9720
aagtgggagg cgggtaccgc cggcatgcgg ccggtggccg gccccggtgg ttcggtgcgc 9780
ttcctgttcg gcgcgcagca gccgagcatc gtatgcgccg tgctgcaagt gtgcgacgtg 9840
gccctgcaac ccggcgagca agtcaactcg atcaacctgg gcgacaccgc ccgttggacg 9900
gtcgagccgg ccattaccgg cagcggcgcg aacgaaaccc agcacctcat catcaagccg 9960
atggatgtgg gcctggaaac cagcctggtc gtgaccacgg accgccgcag ctaccacatg 10020
cgcctgcgct cgcatcgcac gcagtacatg ccgcaggtgt cgttcaccta cccggaagat 10080
gcccttgcga agtgggacgc catcaagaac cgcgaacagc gggatcgcgt cgagaaaacc 10140
attccgcaga ccggcgagta cctgggcaac ctgagcttca actactccgt cagcgggtcc 10200
acgtcgtgga agccggtgcg cgtctacaac gacggcaaga aaaccatcat ccagatgccg 10260
cactcgatgg aacagaccga agcgccgacg ctcctggtcg ttcgcaggga gggcggcctg 10320
ttctccgacg atgaaacggt gatggtcaac taccgggtcc agggcgaccg ctacatcgtc 10380
gatacgattt tcgacaaggc catcctcatc gcgggcgtgg gcagcagcca ggaccgcgtg 10440
accatttcaa gggggaacta aaccatgcgt aagattctga ccgtcatcgc actcgcggcc 10500
acgttggccg gctgcgcgac ctccaagtac ggcagcttcg tccaggacgc gccggccgcc 10560
tacaaccaga ccattgcgac cgacgcggtg aagcagctcg tcaagctcta cccgccggcg 10620
caaaccaagc tggaattgca gcaggctacg cccgatccgt tcggcattgc cctggtcact 10680
gaccttcgcg cccagggcta tgctgtcatg gagtacaagc ccgacggcaa cgcggccgca 10740
gctccggctg ctgcgtcctc ggccgctgcg aagccggcaa cgccgcaagc ccagggcggc 10800
tatccgctgc gctacgtgct ggaccaattc agcgacagca acctgtatcg cctgaccgtc 10860
atggtcggct ctcaatcgct cacgcgcgcc tacctcgccc aaaacaacac gatggtcccg 10920
gccggcgcat gggttcggaa ggagtaagcc aatgagcgaa gatcaaatgg caccggacgc 10980
atcgccagat gcggtcaagc cgaaaagcgg ggttcgccgc gtcaacaaca tgccgatgta 11040
cctcatcggc ggtgtgctcg gcatcttcct gctggtgatg gccctggttg ctgcggatcg 11100
cgctgcgcag cagaaccagc cgggagctgc gaaggctgag aaggccggca gcaccagcat 11160
gtttgccgac gaaattgccg gcaaacagca ggacggcatc atcaaggcca agccgctgga 11220
gattccgccg gaacaaaccg cccagcaacc gacgacggag ctgacgccag ccccggcgca 11280
gggaacgact atcacggtcg cacggcccga gaacctggac cagcccccga cgccgccgca 11340
gggtgcgcgc aacgaggacc tggaccgcat ccgcatggcg aagttgcaga tgctggaaga 11400
ggcgatcaag gccaagacga cggtgcgcat cgacgcgccg cgcagccagg gcagcgccgg 11460
cggcggtgct ccgcagggcc gcgaggaaac ccttgcgcgc atccaggagc tgcgtcggca 11520
ggctgagaac gcccgcgcca ccgatccgac cgccgcctat caggccgcgc ttgcgcaggc 11580
tcgcacgatg ggcggcgcgg cagggggtgg cggtatgggc ggctcgggtg cgccgaccct 11640
cgtgcagacc tcgaaccgca gtggtggcgg cgctggctat gggtcgttcg acaaccgcag 11700
cgagggcgac cgttggcggc tcgactccca gccggaagca cctgcaacgc cctatgtgct 11760
gcgcgctggc ttcgtcgttc cggctacgct tatctcgggc atcaactccg atctgccagg 11820
ccaaatcatg gcccaggtat cgcagtcggt gtacgacacg gcgaccggca agcacatgct 11880
catcccccaa ggctcgcgcc tggtgggcag ctactcgaac gatgtggcct acgggcagaa 11940
gcgcgttctg gtggcatggc agcgcatcat cttccccgac ggcaaggcaa tggacattgg 12000
ggccatgccg ggcggcgata gcgctgggta tgcaggcttc aacgacaagg tcaacaacca 12060
ctacttccgc accttcgcat cggcattcct catgtcgggc gtcgttgcgg gcatcagctt 12120
gagtcaggac cgtggcaaca gcaacagcgg ttacggacga caagacgcgg gttccgcgat 12180
gagtgaagcg ttgggtcaac agctcggcca agtaacggcg cagatgatcg ccaaaaactt 12240
gaatatcgcg ccgacgctgg aaatccgtcc gggctatcgc ttcaacgtca ttgtcacgaa 12300
agacatgacg ttttctaagc cctaccaggc gtttgactat taactccaag gagtaactta 12360
tgaagaagct cgctaagaat gttttagccg ctaaagtagc tctggtgctg gccctctcgg 12420
tcggcacctt ggcggtcacg cctgcgcaag cgggcattcc ggtcatcgac ggcaccaacc 12480
tgtcacaaac cactgtcacc gcgattcagc aggttgcgca ggtccagaag caaatcgagg 12540
aataccggac gcagttgcag cagtacgaaa acatgctgca aaacacggtg gccccggccg 12600
cctacgtgtg ggaccaggcg cagtccacca tcaacggcct gatgagcgcc gttgataccc 12660
tgaactacta caagaaccag gcgggcagca tcgacgctta cctgggcaag ttcaaggacg 12720
tgtcctacta caaggggtcg ccgtgcttct ccctgtcggg ctgctcggaa agcgagcgca 12780
aggcgatgga agagaaccgc cgcctggcgt ccgaatcgca gaaaaaggcc aacgatgcgc 12840
tgttccgtgg cctcgatcag cagcagagca acctcaagtc cgacgccgcc acgctggagc 12900
aattgaaggg caaggcgacg acggcgcagg gccagttgga agccctcggc tacgccaacc 12960
agttcgccag ccagcaggcc aaccagctca tgcaaatccg tggccttctg cttgcgcagc 13020
agaacgccat cgccacgcag atgcaggccc agcaggaccg gcaggcccag caggacgctg 13080
cgggcgcgaa gctgcgcgag ggttcgtacc gcgcaagccc gtctaagacc tggtgagggg 13140
aggcgcgatg aagaaatcca acttcatcgc agttgccgcg ctggccgccg tcatggcggc 13200
cagcctggca ggctgcgaca acaagcccga caccgacaag ctgacctgcg ccgatctgcc 13260
gaaggtcacg gatgccgctc aacgcgcgga gctgttgaag aagtgcccgc gcggagaacc 13320
gggaggcttc aagcccagcg aaaagaaaga gtggtgatga cgtatgaaaa tccagactag 13380
agctgccgcg ctcgcggtcc tgatgctggc cttgatgccg gtagcggcat acgcccaaat 13440
cgacaattcg ggcatcctcg acaacgtatt gcagcgctac cagaacgccg cgagcggctg 13500
ggccactgtc gtccagaacg ccgcaacctg gctgttctgg accttgaccg tgattagcat 13560
ggtctggacc ttcggcatga tggcactgcg caaggccgac attggcgagt tcttcgccga 13620
gttcgtgcgg ttcaccatct tcaccggctt cttctggtgg ctgctgacca acggcccgaa 13680
tttcgcgtcg tccatctatg cgtccctgcg gcagattgca ggccaggcaa cggggttggg 13740
gcaggggctt tcgccgtccg gcatcgtcga tgttggcttc gagattttct tcaaggtgat 13800
ggacgaaacc tcgtactggt cgccggtcga tagcttcgtc ggtgcctcgt tggcggccgc 13860
catcctctgc atcctggccc tggtcggcgt gaatatgctt ctgctcctgg cgtccggatg 13920
gattcttgcc tacggcggtg tgttcttcct gggcttcggc ggctcgcgct ggacctcgga 13980
catggcgatc aactactaca agaccgtcct cggggtcgcc gcgcagctct tcgcaatggt 14040
gctgctcgta ggcatcggca agaccttcct cgatgactac tacagccgca tgagcgaagg 14100
catcaacttc aaggaacttg gagtgatgct gatcgtcggc ctgatcctgc tcgttctggt 14160
caacaaggtg ccgcagctca tcgccggcat catcaccggc gcgagcgtcg gcggtgctgg 14220
tatcggccag ttcggcgctg gcacgctcgt cggtgcggcc gcgacggccg gcgcggcaat 14280
cgcaactggc ggcgcatcta tcgcggccgg cgctgcggcg gcggccggtg gcgcgcaggc 14340
catcatggcg gccgcgtcga aggccagcga taacgtctct gccggcactg acattctgtc 14400
gagcatgatg ggcggcggcg gtggcggcgg cggtggtagc gccggcacca gcggcggcga 14460
cggcggcggc tcgggtggcg gcggtggctc gggcggcggt gaaaccccga tggcctcggc 14520
cgccggcgac aacagcagcg gcgcacgcgg cggcagttcg ggcggcggct cgggtggtgg 14580
ccgttcgtct ggcggtatcg gtgccacggc ggccaagggc ggccggatcg cggccgatac 14640
cgtcgccaac ctggcgaaag gtgccggctc gattgccaag gccaaggccg gcgaaatgcg 14700
cgcatcggcc caggaacgca tcggcgatac cgtaggcggc aagatcgcgc aggcaattcg 14760
cggcgcgggt gcggcggcgc agaccgctgc aaccgtcgcc gatagcaaca gccaggcgca 14820
ggaacaacct gcaccggcac ccgcaccgtc gttcgacgac aacagccttt ccgcaagcaa 14880
caacagggaa gcggccgccg acgcggattc cgaagtggcg agcttcgtca acaagcccgc 14940
ccaatcctga aacgactctt aggagctacg accatgcaac tgaaaaaagc gttctcgtcg 15000
gccgccctgg tggtggcctt gggcctcggc gcaactggct cggccagcgc gcaagacgtg 15060
ctgacgggcg atacccgcct ggcctgcgag gccattctgt gcctgtccac gggcagccgg 15120
cccagcgagt gcagcccgtc gctctcgcgg tacttcggca tccacaagcg caagctgtcg 15180
gacacgctca aggcgcggct gaacttcctc aacctctgcc cggtatcgaa ccagacgccg 15240
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ctgaactccg tgctgcgtga gtggcggagc tgggacgacc agttctacat cggcaaccgc 15360
ctgccggact actgcgcggc ctacaccggc catgcctata ccgacttcaa cacgaccgcg 15420
ccgcgctacg tcggcacgcc ggaagagggc ggctattgga tcgaggcggc cgactacgac 15480
cgcgcgctca aggagtacga ggcgaagctg aaagagcggc agcagcagta cggtcgctat 15540
ggcagcgacg cctaccgtcg gttcgagcgg taaggggagg ggatagcgat gccgtttgcc 15600
aagctgctgg cacggaacgc tctgccggtg gtcgccctgg tggcggccac tggcttcggt 15660
gcggcggatg cgaccgccgc acggctcttc cccgatctgt cggaacagat ggaagagcgc 15720
gttgtgtgct cggtgtctgc ggccgcgaag tacgagattc cggccaacat tcttctcgcc 15780
attcgggaaa aggagggcgg caagccgggc cagtgggtca agaacaccaa tggcacctat 15840
gacgtgggcg agctgcaatt caacaccgcc tacctgggcg acctggcgaa gtatgggatc 15900
acggcccagg acgttgctgc ggcaggctgc tatccctatg acctggcggc ctggcggttg 15960
cgcgggcaca ttcgcaacga caggggcgat ctgtggacac gcgccgctaa ctatcactcg 16020
cgcacgccgt cgaagaacgc gatctatcgc gccgatctga tggtgaaggc cgacaagtgg 16080
gcgaagtggc tggatgcgcg tttcgtcacc gtcaactatg gccccagctc gccggcgcag 16140
ccggcaggga aggggaccac acttgcggcc gctgatacgt cggcagcagc gccggccgaa 16200
gcgcagccga tgaagcaagg ccggatcacc cgcaccagcc tccgcagctc gggttacgta 16260
ccccggcagc tcatcatcaa caacacgcca taaggaggaa cggccgttta gcggctaaag 16320
cctatgggca ttcgcaacct gacgcagcga tacatgaacg gggccagggc ctacgcggcc 16380
tgggcggcat cgcaggcgaa agcgccgttt gatcttctgg tactgggcat cgggcctgtc 16440
atcgtctttg gcctggtcgc gcatacgctg ctcgcgttcc tgcccacatg ggccatgtac 16500
gccgccggcg ctctgctggt cctcgcggcc ctgcctttgg cgctgcacgt cctccgggaa 16560
tacgcgctgc gctatgggcg caaatagcgc cctgcagggc gttcttactc caagggggag 16620
ggcatgaata cacgcgccat gaacgacgcc agcggccggg cctcgctgcc tgccatggtg 16680
atcgccgacg gcaccattga agccttgaag tggctcgcct tgcttcccat gaccggggat 16740
cacgtcaaca agtacctgtt caacggtacg ctgccatatc tgttcgaggc ggggcgcttg 16800
gccctgcctc ttttcgtttt cgtcctggcg tacaacctcg cccgcccggg cgcgctcgag 16860
cgcggtttgt acgggcgagc gatgaaacgc ctgttggcct tcggcctggt cgcctcggtc 16920
ccgttcattg cgttgggtgg agtggtgggc ggatggtggc cgctgaacgt catgttcacg 16980
ctgttggccg caaccgcgat gctctacctg gtcgagcgcg gccgctcggt cgctcctata 17040
gcgctgttcg tcgtggccgg cggcctggtc gagttctgtt ggccggcgct gctgctggcc 17100
gcgtctgtct ggttgtacct caagcgcccg acgtgggcgg ccgcgttgat ggcgctgctg 17160
tcttgcgcgt ccctgtggta catcaatggc aacctttggg cgcttgctgt tgtgcccctg 17220
gtgatcgtcg ccgccggcgt cgatcttcgt gtcccgcgcc tgcgctgggc cttttacacg 17280
tactacccgc tgcatcttgc cgctctttgg ctgatccgct gtattgattc acttgaagta 17340
cgaaaaaaac cgggaggaca ttggattatt cgggatctga tgggattaga tttggtgggg 17400
cttgcaagcc tgtagtgcaa attttagtcg ttaatcaatg aaacgcgaaa gatagtaaaa 17460
aattgctttt gtttcattga aaatacgaaa aacaaaaaca ctgcaaatca tttcaataac 17520
agcttcaaaa aacgttcaaa accgataaca accaagctgt caccaaatga ctcatatcac 17580
aaatcagctt atgccgttta ggtatgttac atgtgtgatt atgtgaggtg aagtatgttt 17640
tagctggttc atggttgtta tacggctttt tttacctcct gtggttcctg tgaaggtact 17700
acaacacttt cctgttcatg aatcccatac tttgacaaaa tctctttgcg tttttcttca 17760
ggtaatgcat ctagcatcat caacgtctga atactttgct gtgaaaatcc tataaagctg 17820
taaagtttct gttcattaaa tacaagaggc attaacgcca acaacccccc tttacttaaa 17880
agtttcagtg ccttgcgtgc ttcatctggt tccagctctt caatcatatt gattaaggtt 17940
gtggttaatt tgtttatcag ttccgaagaa tcctgtttct cattggcttg agcaccagta 18000
tccggtgtgg ataaccccaa gtgcgcaata acttgctctc gttctttggt gggcatcgac 18060
atcacatcgt attcaacagc tttccccccc ttgacacctt cctttttttg cttcgtccag 18120
ccttgaacat ttgctcgata gtgaacacca gcaacagatc caggcatacc atcagcagcc 18180
ataatttctt gcggcgaaca ccaaattgac ttttcagtat tattcttttc tataaagtta 18240
cttttcaaaa tttaaactcc ttatttatca acgcgttaat cagtaatcaa aggaatttac 18300
caaaaagcag ctttacaaaa agcttcgttc gcacgcccaa tcaggcatgg ctcctgacaa 18360
cagcaataca tggaaaaacg gcatatcaag tgctgaaatc ggatttcgga gcccgtctcg 18420
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tttcactcga taatctactt atcgtcgaag gtaaggtagt cggctgcatc gacgttgggc 18720
gggctggtat tgctgatcga taccaagacc ttgccgtgtt atggaactgt cttgaggagt 18780
tcgaaccttc gcttcaggag aggcttgttg cgcaatatgg cattgccgat ccggataggc 18840
gcaagctgca atttcatctc ctgctggacg aacttttcta aggcgatgcc ccctcgacct 18900
cgatcaggga ggcgttcagg acgactcaca aagaaagccg ggcaatgccc ggctttttct 18960
gctgctacct ccgtagtcgt aaggtcgttg caggtgctcg ggtgcggtac aactcgccgg 19020
tcgccagctc aagcgcgatc acgtcgttgc cgtcgtagtt gacgatgatg ctgttgggcc 19080
gactgtcctc acgcttcgca gggagaggcc agccttcaat cgaagccggc gcaagctcgt 19140
agtgcttccc ggtttcgacg ctgcgcagcg tccaggtcct gcaaccggcc acgccggtcg 19200
cagaaaccac ggcgagcgag ccgcgaaaat cgtgcgggta cgcctcgatg ttcatacgcc 19260
tcctagatcg agcgcgagcg tttctgctcg gccttggccg cctgttcctg ggacacctcg 19320
ccgatgacct tgccctggcc ccggctgtag gcgatttcgt agttcttgcc gacaaccggc 19380
ggcttctcaa agatgccccg gctgtgtttc acgatcccgc cttcgctgaa ctggtagacg 19440
ttgcgcccat cgtcgtgcag cacctggccg acgtgcttgt gcgggtggac gtttttgctt 19500
gcgtccttcg catcgctcaa ctggtgaatg cctttcggta gccccgcctc gggcaacacc 19560
ttcatggtca gccattcgcc gttcactacc tggtccacct ggcggctgcc gttcatgacg 19620
gcgatcttga cgctgccctc gggtttcatg atgacgccag ggcttgccga tgtgcgtggt 19680
gccccgatct gtactttgtt catacgctct agttctcctt agtaggttct cgcgcggcgt 19740
tgccgctgtt cttgctgctc gatgtcttgc tgcttgagct gctgcacctt ctgccgctgg 19800
ccctcgtcga gaagcacctt gccgacagca cttctcacct ggcgttcaac cccgtccttg 19860
cccaggctgc tgcgctcgga caggtcgttg aaatcggtgt gcttcttcat gttcgacagg 19920
gcggcgagct ggccatcgtt caacagcgat tccttgagct tggccgtgtc ggcctcgctc 19980
aactggacct tgccggccgc cgcgtccgcg aggcgctttt cagcgtgcaa atggttgcgg 20040
tagttctccg gggtgatcgg cggcagctcc ttcgggtagg cgttctcgcc cggcgcgaag 20100
attgggaaga tggccttgcc gccgaccgcc ttggcggcct cctgtgcctt cgtcctgccg 20160
ggattcacgc cctgggtgat ctgcacctgg cggtcgtcgt cgccggcgat cacaacgggc 20220
ttgtccggga atttcgcgtg cagggcctcg gcaacagcct gtaggttgcc ggaatcgaac 20280
gcggcgacag tcgcgtgccc cagcgcttcg gccactgtgg cggcggtggc atagccttcg 20340
ccgatcacca gcgccggcgc ggccgcgagc gcatccatgc caccgacgac atggaagcat 20400
ccttccttgc ggctgtcctt ggcgaagcgc ttggtgccgt cctcctggat gtactgcatg 20460
gtccattgct tgccgtcggc gtcgtaggcc gggatgtagg ttttctggcc ctcctggtcg 20520
gtaaggacgc cggcgtgcac ctgtagaccc ttgtcgcgca ggtacggcgt cggttccgtg 20580
atgggaacca ggctttgcgc ctggcggccg atgcgctgcg ccgtggcttc gtgctggcgt 20640
tcttgttcct cggcacgcgc ggccagcttg gccgccgcct cggcctgcat cttggccttc 20700
tcggcggggt ccagggcgta gcccttggcc ttccacttca tttcgacgcc ggtgcggttg 20760
tttttgatgt aaccggccgg gtggccgtcg aggtggccga cgtagaagcc cgacttctcg 20820
cccttcttgt cgccctcggt ctcgatgcgg tgcttcttgc cgtccatgat ggggtgctcg 20880
ccgcctgggg tgacgacgca gcccatgctt ttcagggcct ccgcgaactc atcttcgggg 20940
gtgacggccg gggattgctg ggtgggcacg ttgtccggca gccagcgttg cagcttgccc 21000
atgtcggcgt tcggtccggc gtaccaggac ttggccacct tgtcccactg cgcgccggcc 21060
gccttggcaa cctggcgctc gccgtagggc acggccaggt agacgcgctc ctgggccgcg 21120
ttggggcgct cggccgtggg ttgggtaggc tgggcctcgg cgcgggcctc tacggccgct 21180
gtagcgccct cgcgcgccca tttggcgaac ggggcagggt caacccctgc cggaacgtac 21240
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<210> 11
<211> 7952
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 60
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 120
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atcatcctct gcatggtcag gtcatggatg agcagacgat ggtgcaggat atcctgctga 4800
tgaagcagaa caactttaac gccgtgcgct gttcgcatta tccgaaccat ccgctgtggt 4860
acacgctgtg cgaccgctac ggcctgtatg tggtggatga agccaatatt gaaacccacg 4920
gcatggtgcc aatgaatcgt ctgaccgatg atccgcgctg gctaccggcg atgagcgaac 4980
gcgtaacgcg aatggtgcag cgcgatcgta atcacccgag tgtgatcatc tggtcgctgg 5040
ggaatgaatc aggccacggc gctaatcacg acgcgctgta tcgctggatc aaatctgtcg 5100
atccttcccg cccggtgcag tatgaaggcg gcggagccga caccacggcc accgatatta 5160
tttgcccgat gtacgcgcgc gtggatgaag accagccctt cccggctgtg ccgaaatggt 5220
ccatcaaaaa atggctttcg ctacctggag agacgcgccc gctgatcctt tgcgaatacg 5280
cccacgcgat gggtaacagt cttggcggtt tcgctaaata ctggcaggcg tttcgtcagt 5340
atccccgttt acagggcggc ttcgtctggg actgggtgga tcagtcgctg attaaatatg 5400
atgaaaacgg caacccgtgg tcggcttacg gcggtgattt tggcgatacg ccgaacgatc 5460
gccagttctg tatgaacggt ctggtctttg ccgaccgcac gccgcatcca gcgctgacgg 5520
aagcaaaaca ccagcagcag tttttccagt tccgtttatc cgggcaaacc atcgaagtga 5580
ccagcgaata cctgttccgt catagcgata acgagctcct gcactggatg gtggcgctgg 5640
atggtaagcc gctggcaagc ggtgaagtgc ctctggatgt cgctccacaa ggtaaacagt 5700
tgattgaact gcctgaacta ccgcagccgg agagcgccgg gcaactctgg ctcacagtac 5760
gcgtagtgca accgaacgcg accgcatggt cagaagccgg gcacatcagc gcctggcagc 5820
agtggcgtct ggcggaaaac ctcagtgtga cgctccccgc cgcgtcccac gccatcccgc 5880
atctgaccac cagcgaaatg gatttttgca tcgagctggg taataagcgt tggcaattta 5940
accgccagtc aggctttctt tcacagatgt ggattggcga taaaaaacaa ctgctgacgc 6000
cgctgcgcga tcagttcacc cgtgcaccgc tggataacga cattggcgta agtgaagcga 6060
cccgcattga ccctaacgcc tgggtcgaac gctggaaggc ggcgggccat taccaggccg 6120
aagcagcgtt gttgcagtgc acggcagata cacttgctga tgcggtgctg attacgaccg 6180
ctcacgcgtg gcagcatcag gggaaaacct tatttatcag ccggaaaacc taccggattg 6240
atggtagtgg tcaaatggcg attaccgttg atgttgaagt ggcgagcgat acaccgcatc 6300
cggcgcggat tggcctgaac tgccagctgg cgcaggtagc agagcgggta aactggctcg 6360
gattagggcc gcaagaaaac tatcccgacc gccttactgc cgcctgtttt gaccgctggg 6420
atctgccatt gtcagacatg tataccccgt acgtcttccc gagcgaaaac ggtctgcgct 6480
gcgggacgcg cgaattgaat tatggcccac accagtggcg cggcgacttc cagttcaaca 6540
tcagccgcta cagtcaacag caactgatgg aaaccagcca tcgccatctg ctgcacgcgg 6600
aagaaggcac atggctgaat atcgacggtt tccatatggg gattggtggc gacgactcct 6660
ggagcccgtc agtatcggcg gaattacagc tgagcgccgg tcgctaccat taccagttgg 6720
tctggtgtca aaaataataa taaccgggca ggccatgtct gcccgtattt cgcgtaagga 6780
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catcatcatt aagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc 6900
acgcgtaccc caccgctgag caataactag catacgtgtt gttgacagca atgagctgtc 6960
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aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 7080
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 7140
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ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt 7260
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 7320
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 7380
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 7440
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 7500
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 7560
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 7620
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 7680
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 7740
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 7800
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 7860
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 7920
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cg 7952
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgcattatc acatgcgtgg a 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctaatctct ctttaatttc 20

Claims (8)

1.一种2-甲基柠檬酸高产基因工程菌，其特征在于，是由苏云金芽胞杆菌BMB171基因组中敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD而得到的，所述2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种如权利要求1所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选择含有壮观霉素抗性基因、归巢内切酶I-SceI特异识别作用位点、多克隆位点MCS、能在苏云金芽胞杆菌BMB171中复制的温敏型初始质粒，获取将要敲除的prpD基因上下游同源片段依次克隆到初始质粒中获得敲除载体；
（2）将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌BMB171中，筛选获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换菌株；
（3）将含有卡那霉素抗性基因、能够编码I-SceI酶的诱导质粒导入所述单交换菌株，在选择平板上选择获得第二次同源重组并实现靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株；
（4）挑取经PCR验证的靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株在无选择压力的条件下转接3~5次连续传代培养，获得质粒丢失的靶基因prpD敲除的苏云金芽胞杆菌BMB171突变菌株，即为2-甲基柠檬酸高产基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤（1）的具体步骤为：通过PCR技术，以出发菌株苏云金芽胞杆菌BMB171的总DNA为模板，分别扩增prpD靶基因上游和下游长度为0.7~1kb的同源序列片段，将上述同源序列片段依次连接到初始质粒上获得敲除载体。
4.根据权利要求3所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述初始质粒为pRP1028，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求2所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌BMB171中的方法为三亲本杂交法，将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌BMB171中的具体步骤为：将所述敲除载体转化大肠杆菌DH5α,获得含有敲除载体的供体菌，然后将供体菌与苏云金芽胞杆菌BMB171在辅助菌株的作用下将敲除载体转入苏云金芽胞杆菌中。
6.根据权利要求2所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述诱导质粒为pSS4332，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
7.一种利用如权利要求1所述的2-甲基柠檬酸高产基因工程菌生产2-甲基柠檬酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将2-甲基柠檬酸高产基因工程菌于28℃,200rpm下培养12~18h，收集菌液；
（2）将收集的菌液离心获得菌体并利用超声破碎以及有机溶剂前处理获得2-甲基柠檬酸粗品。
8.根据权利要求7所述的生产2-甲基柠檬酸的方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体步骤为：将收集的菌液离心弃去上清，加入去离子水重悬，加入的去离子水与原菌液的体积比为2~4:7，置于冰浴水中用超声破碎仪破碎，离心收集上清，加入8~10倍体积的丙酮剧烈震荡30~90s，12000rpm离心5min，除去上清，将得到的棕黄色沉淀在烘箱中烘干，然后用去离子水重悬棕黄色沉淀，去离子水与原菌液的体积比为3~10:700，加入乙腈，乙腈与去离子水的体积比为2:3，剧烈震荡，12000rpm离心5min，取上清，加入5~10倍的乙腈，剧烈震荡，12000rpm离心5min，弃去上清，将沉淀置于烘箱中烘干，即得到2-甲基柠檬酸粗品。
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