KR20130087013A - 추출 발효에서의 알코올 제거를 위한 오일로부터 유래되는 추출 용매 - Google Patents

추출 발효에서의 알코올 제거를 위한 오일로부터 유래되는 추출 용매 Download PDF

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케이트 에이치. 버류
로버트 디코시모
마이클 찰스 그라디
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부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨
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Abstract

알코올 발효 공정에서, 바이오매스로부터 유래된 오일은 발효 브로쓰로부터의 생성물 알코올, 예컨대 부탄올의 동소 제거에 이용가능한 추출제로 가수분해된다. 오일 중의 글리세리드는 촉매적으로(예컨대, 효소적으로) 유리 지방산으로 가수분해될 수 있으며, 이는 바이오매스의 오일의 생성물 알코올에 대한 분배 계수보다 더 큰 생성물 알코올에 대한 분배 계수를 갖는 발효 생성물 추출제를 형성한다. 알코올 발효 공정의 공급원료로부터 유래된 오일은 오일을 포함하는 공급원료를 하나 이상의 효소와 접촉시킴으로써 가수분해되어, 이에 의해 적어도 일부의 오일이 유리 지방산으로 가수분해되어, 발효 생성물 추출제를 형성할 수 있거나, 또는 공급원료를 발효 용기에 공급하기 전에 오일을 공급원료로부터 분리할 수 있으며, 분리된 오일을 효소와 접촉시켜, 발효 생성물 추출제를 형성할 수 있다. 발효 생성물 추출제를 생성물 알코올의 동소 제거를 위하여 발효 브로쓰와 접촉시킬 수 있다.

Description

추출 발효에서의 알코올 제거를 위한 오일로부터 유래되는 추출 용매{EXTRACTION SOLVENTS DERIVED FROM OIL FOR ALCOHOL REMOVAL IN EXTRACTIVE FERMENTATION}
본 출원은 미국 가출원 제61/356,290호(출원일: 2010년 6월 18일); 미국 가출원 제61/368,451호(출원일: 2010년 7월 28일); 미국 가출원 제61/368,436호(출원일: 2010년 7월 28일); 미국 가출원 제61/368,444호(출원일: 2010년 7월 28일); 미국 가출원 제61/368,429호(출원일: 2010년 7월 28일); 미국 가출원 제61/379,546호(출원일: 2010년 9월 2일); 및 미국 가출원 제61/440,034호(출원일: 2011년 2월 7일); 미국 특허 출원 제13/160,766호(출원일: 2011년 6월 15일)의 이익을 주장하며, 이들 전체 내용은 모두 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 출원과 관련된 서열 목록은 EFS-Web을 통해 전자 양식으로 제출되며, 그 전체가 본 명세서에서 상세한 설명에 참고로 포함된다.
본 발명은 발효성 알코올, 예컨대 부탄올, 특히 추출 발효를 위한 추출 용매의 생성, 및 바이오매스로부터 유래되는 오일의 추출 용매로의 전환 방법에 관한 것이다.
알코올은 음료(즉, 에탄올), 연료, 시약, 용매 및 소독제와 같이 산업 및 과학에서 다양하게 응용된다. 예를 들어, 부탄올은 연료 첨가제로서, 플라스틱 산업에서 공급원료 화학물질로서, 그리고 식품 및 향미료(flavor) 산업에서 식품등급 추출제로서의 이용을 비롯한 다양한 응용을 가지는 중요한 산업용 화학물질이다. 따라서, 알코올, 예컨대 부탄올에 대한 요구뿐 아니라 효율적이며 환경 친화적인 생성 방법에 대한 요구가 크다.
미생물에 의한 발효를 사용한 알코올의 생성은 이러한 하나의 환경 친화적인 생성 방법이다. 특히, 부탄올의 생성에서, 부탄올을 높은 수율로 생성하는 일부 미생물은 또한 낮은 부탄올 독성 역치를 갖는다. 부탄올이 생성됨에 따른 발효 용기로부터의 부탄올의 제거는 이들 낮은 부탄올 독성 역치를 관리하는 수단이다.
동소 생성물 제거(ISPR)(발효 추출로도 지칭됨)를 사용하여 부탄올이 생성됨에 따라 발효 용기로부터 부탄올(또는 다른 발효성 알코올)을 제거하여, 이에 의해, 미생물이 높은 수율로 부탄올을 생성하게 할 수 있다. 해당 분야에 기재되어 있는 발효성 알코올을 제거하기 위한 하나의 ISPR 방법은 액체-액체 추출이다(미국 특허 출원 공개 제2009/0305370호). 기술적으로 그리고 경제적으로 실행가능하게 되기 위하여, 액체-액체 추출법은 생성물 알코올의 추출제로의 효율적인 물질 이동을 위한 추출제와 발효 브로쓰(fermentation broth) 간의 우수한 접촉; 발효 브로쓰로부터의 추출제의 우수한 상 분리(발효 동안 및/또는 발효 후); 추출제의 효율적인 회수 및 재순환; 생성물 알코올을 추출하는 추출제의 능력의 최소의 저하(예를 들어, 생성물 알코올에 대한 추출제로의 분배 계수의 감소를 방지함으로써); 및 장기간 운영에 걸쳐 분배 계수를 감소시키는 지질에 의한 추출제의 최소의 오염을 필요로 한다.
추출제의 분배 계수는 예를 들어, 가수분해가능한 전분의 공급원료로서 발효 용기에 공급되는 바이오매스에 존재하는 지질의 축적에 의해, 각 재순환과 함께 시간이 지남에 따라 저하될 수 있다. 일 예로서, 30 wt% 건조 옥수수 고형물로 발효 용기에 로딩되는 액화된 옥수수 매쉬는 발효 브로쓰가 동시 당화 및 발효(SSF)(글루코아밀라제의 첨가에 의하여 발효 동안 액화된 매쉬의 당화가 발생하여 글루코스가 형성됨)에 의한 글루코스의 부탄올로의 전환 동안 약 1.2 wt%의 옥수수유를 함유하게 할 수 있다. ISPR 동안에 추출제로 소용되는 올레일 알코올(OA) 중의 옥수수유 지질의 용해는 각각의 OA 재순환과 함께 지질 농도의 축적을 야기하여, OA 중의 지질 농도가 각각의 OA의 재순환과 함께 증가하기 때문에, OA 중의 생성물 알코올에 대한 분배 계수를 감소시킨다.
또한, 추출 발효 동안의 용해되지 않은 고형물의 존재는 알코올 생성의 효능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 용해되지 않은 고형물의 존재는 발효 용기 내부의 물질 이동 계수를 낮출 수 있고/거나, 발효 용기 내의 상 분리를 지연시킬 수 있고/거나, 시간이 지남에 따라 추출 효능을 감소시키는 추출제 중의 용해되지 않은 고형물로부터의 옥수수유의 축적을 야기할 수 있고/거나, 용매가 고체에 포획되고 결국 주정박(Dried Distillers' Grains with Solubles, DDGS)으로 제거됨으로 인해 용매의 소실을 증가시키고/거나, 발효 브로쓰로부터의 추출제 액적의 이탈을 늦출 수 있고/거나 발효기 부피 효율을 더 낮게 할 수 있다
지질을 사용하는 추출 발효에 사용되는 추출제의 분해를 감소시키는 몇몇 방법에는 바이오매스 습식 밀링(wet milling), 분별 및 고형물의 제거가 포함된다. 습식 밀링은 바이오매스(예컨대, 옥수수)를 그의 주요 성분(배아, 껍질 섬유, 전분 및 글루텐)으로 분리하여, 각 공동-생성물로부터의 값을 따로 얻는 고가의 다단계 공정이다. 이러한 공정은 정제된 전분 스트림을 제공하지만; 이는 많은 비용이 들며, 바이오매스의 그의 비-전분 성분으로의 분리를 포함하는데, 비-전분 성분은 발효성 알코올 생성에 불필요한 것이다. 분별에 의해 분쇄된 전체 곡물, 예컨대 옥수수에 존재하는 대다수의 지질을 함유하는 배아 및 섬유가 제거되어, 옥수수가 더 높은 전분(내배유) 함량을 갖게 한다. 건식 분별은 배아 및 섬유를 분리하지 않으며, 이에 따라, 습식 밀링보다 비용이 더 적게 든다. 그러나, 분별에 의해 섬유 또는 배아의 전체가 제거되지 않으며, 전체 고형물의 제거를 야기하지 않는다. 더욱이, 분별에서 일부 전분의 소실이 있다. 옥수수의 습식 밀링이 건식 분별보다 더 고가이지만, 건식 분별은 분별되지 않은 옥수수의 건식 분쇄보다 더욱 고가이다. 발효에서 사용하기 전에, 액화된 매쉬로부터의, 지질을 함유하는 배아를 포함하는 고형물의 제거는 예를 들어, 공동-계류 중인 공동 소유의 미국 가출원 제61/356,290호(출원일: 2010년 6월 18일)에 기재된 바와 같이 용해되지 않은 고형물을 실질적으로 제거할 수 있다. 그러나, 추출제의 분배 계수의 저하가 심지어 용해되지 않은 고형물의 분별 또는 제거 없이도 감소될 수 있다면, 유익할 것이다. 따라서, 추출제의 분배 계수의 저하가 감소되는 추출 발효를 통해 생성물 알코올, 예컨대 부탄올을 생성하기 위한 더욱 효율적인 방법 및 시스템을 지속적으로 개발할 필요가 있다.
더욱이, 추출제(예컨대, 올레일 알코올)는 전형적으로 공정 내의 하나의 단계에서 생성되기 보다는 발효 공정에 첨가되며, 이에 따라, 추출제는 원료 비용이 된다. 추출제는 비-발효가능한 고형물에서의 흡수에 의해 소실되고/거나 발효 공정 내로 도입되는 지질에 의해 희석될 수 있기 때문에, 알코올 생성 공정의 경제적인 면은 추출제 회수 및 재순환의 효율에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 자본비 및/또는 운영비를 감소시킴으로써 더욱 경제적인 공정을 야기할 수 있는 대안적인 ISPR용 추출제가 지속적으로 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 생성물 알코올, 예컨대 부탄올을 생성하는 방법을 제공함으로써 상기 요구를 충족시키며, 여기서, 바이오매스 중의 지질은 ISPR에 사용될 수 있는 추출제로 전환되고, 공급원료와 함께 및/또는 추출제 재순환시에 발효 용기로 공급되는 지질의 양이 감소된다. 본 발명은 생성물 알코올에 대한 추출제로의 분배 계수의 저하를 방지함으로써 추출제가 생성물 알코올(예컨대, 부탄올)을 추출하는 능력의 저하에 대한 해결책을 제공한다. 본 출원은 생성물 알코올에 대한 추출제의 분배 계수를 낮추는 트라이글리세리드에 의한 추출제의 오염에 대한 해결책을 제공한다. 본 발명은 후술되는 실시형태의 설명에 의해 명백해질 것과 같이 추가의 관련 이점을 제공한다.
바이오매스로부터 유래된 지질의 지방산으로의 촉매적(예컨대, 효소적) 가수분해는 ISPR 추출제 중의 지질의 바람직하지 않은 축적 속도를 감소시킬 수 있다. 지방산은 발효를 위한 발효가능한 탄소를 공급하는 바이오매스에서 관찰되는 지질의 가수분해로부터 수득될 수 있다. 지방산은 생성물 알코올, 예컨대 부탄올의 추출제 상으로의 분배 계수를 지질만큼 많이 감소시키는 것으로 예상되지 않을 것이며, 이는 부탄올에 대한 물로부터 지방산으로의 분배 계수가 부탄올에 대한 물로부터 지방산 에스테르 또는 트라이글리세리드로의 분배 계수보다 유의미하게 더 큰 것으로 결정되었기 때문이다. 더욱이, 지방산은 알코올 생성 공정에서 생성될 수 있는 ISPR 추출제로 사용될 수 있으며, 공정에서 생성되지 않는, 공급되는 외인성 ISPR 추출제(예컨대, 비제한적으로 올레일 알코올 또는 올레산)를 대신하여, 또는 이에 더하여 사용되어, ISPR 추출제에 대한 원료 비용을 줄일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 물, 발효가능한 탄소원 및 오일을 포함하는 바이오매스를 하나 이상의 촉매와 접촉시켜, 이에 의해 적어도 일부의 오일이 하나 이상의 촉매에 의해 가수분해되어 추출제를 형성하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 발효가능한 탄소원 및 오일은 둘 모두 바이오매스로부터 유래된다. 바이오매스는 옥수수 곡물, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 호밀, 밀짚, 보리, 보릿짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스(switchgrass), 폐지, 사탕수수 버개스(bagasse), 수수, 사탕수수, 콩, 곡물, 셀룰로스계 물질, 리그노셀룰로스계 물질, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 나뭇조각, 톱밥, 관목 및 떨기나무, 야채, 과실, 꽃, 동물 퇴비 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 오일은 글리세리드를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 촉매는 글리세리드를 가수분해시켜, 지방산을 형성할 수 있다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 촉매는 에스테라제, 리파제, 포스포리파제 및 라이소포스포리파제로부터 선택될 수 있다.
다른 실시형태에서, 추출제는 지방산, 지방산 아미드, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 트라이글리세리드 또는 그들의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 추출제는 지방산의 혼합물 또는 지방산 및 지방산 아미드의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 추출제의 생성물 알코올에 대한 분배 계수는 바이오매스의 오일의 생성물 알코올에 대한 분배 계수보다 더 클 수 있다.
본 발명의 방법은 적어도 일부의 오일이 가수분해된 후에, 촉매를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 촉매에 의한 가수분해 전에, 바이오매스로부터 오일을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 청구된 방법은 바이오매스를 발효 용기 내의 발효 브로쓰와 접촉시키는 단계; 바이오매스의 탄소원을 발효시켜, 생성물 알코올을 생성하는 단계; 및 발효 브로쓰를 추출제와 접촉시킴으로써 발효 브로쓰로부터 생성물 알코올을 동소 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 생성물 알코올은 부탄올일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 (a) 물, 발효가능한 탄소원 및 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하는 단계; (b) 바이오매스를 액화시켜, 액화된 바이오매스를 생성하는 단계; (c) 액화된 바이오매스를 하나 이상의 촉매와 접촉시켜, 이에 의해 적어도 일부의 오일을 가수분해시켜 추출제를 형성하는 단계; (d) 액화된 바이오매스를 올리고당류를 발효가능한 당으로 전환시킬 수 있는 당화 효소와 접촉시키는 단계; (e) 액화된 바이오매스를 발효 용기 내의 발효 브로쓰와 접촉시키는 단계; (f) 액화된 바이오매스의 탄소원을 발효시켜, 생성물 알코올을 생성하는 단계; (g) 발효 브로쓰를 추출제와 접촉시킴으로써 발효 브로쓰로부터 생성물 알코올을 동소 제거하는 단계를 포함하며; 임의로, 단계 (c) 및 (d)가 동시에 발생하는 것인 알코올 생성 방법에 관한 것이다. 바이오매스는 옥수수 곡물, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 호밀, 밀짚, 보리, 보릿짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스, 폐지, 사탕수수 버개스, 수수, 사탕수수, 콩, 곡물, 셀룰로스계 물질, 리그노셀룰로스계 물질, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 나뭇조각, 톱밥, 관목 및 떨기나무, 야채, 과실, 꽃, 동물 퇴비 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 오일은 글리세리드를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 촉매는 글리세리드를 가수분해시켜, 지방산을 형성할 수 있다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 촉매는 에스테라제, 리파제, 포스포리파제 및 라이소포스포리파제로부터 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, 추출제는 지방산, 지방산 아미드, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 트라이글리세리드 또는 그들의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 추출제는 지방산의 혼합물 또는 지방산 또는 지방산 아미드의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 추출제의 생성물 알코올에 대한 분배 계수는 바이오매스의 오일의 생성물 알코올에 대한 분배 계수보다 더 클 수 있다. 본 발명의 방법은 적어도 일부의 오일이 가수분해된 후에, 촉매를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 생성물 알코올은 부탄올일 수 있다.
또한, 본 발명은 알코올을 생성할 수 있는 재조합 미생물; 발효가능한 탄소원; 글리세리드를 지방산으로 가수분해시킬 수 있는 하나 이상의 촉매; 글리세리드를 포함하는 오일; 및 지방산을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 하나 이상의 촉매는 에스테라제, 리파제, 포스포리파제 및 라이소포스포리파제로부터 선택될 수 있고, 오일은, 옥수수유, 우지, 카놀라유, 카프르산/카프릴산 트라이글리세리드, 피마자유, 코코넛유, 면실유, 어유, 호호바유, 라드, 아마인유, 니이츠풋(neetsfoot) 오일, 오이티시카 오일, 팜(palm)유, 땅콩유, 평지씨유, 쌀겨기름, 홍화유, 콩기름, 해바라기씨유, 동(tung)유, 자트로파(jatropha)유 및 식물성 오일 배합물일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 발효가능한 탄소원 및 오일은 바이오매스로부터 유래된다. 바이오매스는 옥수수 곡물, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 호밀, 밀짚, 보리, 보릿짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스, 폐지, 사탕수수 버개스, 수수, 사탕수수, 콩, 곡물, 셀룰로스계 물질, 리그노셀룰로스계 물질, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 나뭇조각, 톱밥, 관목 및 떨기나무, 야채, 과실, 꽃, 동물 퇴비 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있다. 조성물은 당화 효소 및/또는 용해되지 않은 고형물을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 적어도 모노글리세리드, 다이글리세리드, 트라이글리세리드, 글리세롤, 단당류, 올리고당류 또는 알코올 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 알코올은 부탄올일 수 있다.
일부 실시형태에서, 발효 공정으로부터의 바이오매스로부터 유래된 오일의 제거 방법은 수성 바이오매스 공급스트림(feedstream)을 촉매와 접촉시키는 단계를 포함한다. 공급스트림은 물, 발효가능한 탄소 및 소정량의 오일을 포함하며, 발효가능한 탄소 및 오일은 둘 모두 바이오매스로부터 유래된다. 적어도 일부의 오일은 본 발명에 기재된 방법에 따라 지방산으로 가수분해되어, 지방산을 포함하는 촉매-처리된 바이오매스 공급스트림을 형성한다.
일부 실시형태에서, 생성물 알코올의 동소 제거를 위한 추출제의 생성 방법은 당, 및 소정량의 트라이글리세리드를 갖는 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하는 단계, 및 트라이글리세리드를 지방산으로 가수분해시킬 수 있는 하나 이상의 효소를 포함하는 조성물과 오일을 접촉시키는 단계를 포함한다. 오일 중의 트라이글리세리드는 가수분해되어, 생성물 알코올에 대한 분배 계수가 바이오매스의 오일의 생성물 알코올에 대한 분배 계수보다 더 큰 발효 생성물 추출제를 형성한다.
일부 실시형태에서, 부탄올의 생성 방법은 (a) 전분 및 오일을 갖는 바이오매스를 제공하는 단계로서, 오일이 소정량의 글리세리드를 포함하는 것인 단계; (b) 바이오매스를 액화시켜, 액화된 바이오매스를 생성하는 단계로서, 액화된 바이오매스가 전분으로부터 가수분해된 올리고당류를 포함하는 것인 단계; (c) 단계 (a)의 바이오매스 또는 단계 (b)의 액화된 바이오매스를 글리세리드를 유리 지방산으로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 효소를 갖는 조성물과 접촉시켜, 이에 의해 유리 지방산이 발효 생성물 추출제를 형성하는 단계; (d) 액화된 바이오매스를 올리고당류를 모노머 글루코스를 포함하는 발효가능한 당으로 전환시킬 수 있는 당화 효소와 접촉시키는 단계; (e) 액화된 바이오매스를 발효가능한 당을 부탄올로 전환시킬 수 있는 생체촉매와 접촉시켜, 이에 의해 부탄올을 포함하는 발효 생성물이 생성되는 단계; 및 (f) 발효 생성물을 발효 생성물 추출제와 접촉시켜, 이에 의해, 부탄올을 발효 생성물로부터 분리하는 단계로서, 발효 생성물 추출제는 부탄올에 대한 분배 계수가 바이오매스의 오일의 부탄올에 대한 분배 계수보다 더 큰 것인 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 공급원료로부터 생성물 알코올을 생성하는 공정 동안의 한 단계에서, 생성물 알코올을 천연 오일의 효소적 가수분해로부터 수득되는 유리 지방산을 포함하는 추출제와 접촉시키는 단계로서, 오일이 글리세리드를 포함하는 것인 단계를 포함한다. 추출제는 생성물 알코올에 대한 분배 계수가 천연의 오일의 생성물 알코올에 대한 분배 계수보다 더 크다.
일부 실시형태에서, 공급원료로부터 생성물 알코올을 생성하는 방법은 (a) 공급원료를 액화시켜, 공급원료 슬러리를 생성하는 단계; (b) (a)의 공급원료 슬러리를 원심분리하여, (i) 당을 포함하는 수층, (ii) 식물-유래의 오일층 및 (iii) 고형물 층을 포함하는 원심분리 생성물을 생성하는 단계; (c) 단계 (b)의 수층을 발효 용기에 공급하는 단계; 및 (d) 수층의 당을 발효시켜, 생성물 알코올을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 공급원료로부터 생성물 알코올을 생성하는 방법은 추출제를 발효 용기에 첨가하여, 수상 및 생성물 알코올-함유 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 천연의 오일은 식물-유래의 오일이며, 일부 실시형태에서, 공급원료로부터 생성물 알코올을 생성하는 방법은 식물-유래의 오일층으로부터 식물-유래의 오일을 수득하는 단계; 및 식물-유래의 오일을 글리세리드를 유리 지방산으로 가수분해시키는 하나 이상의 효소와 접촉시킴으로써 식물-유래의 오일을 추출제로 전환시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 공급원료로부터 생성물 알코올을 생성하는 방법은 적어도 일부의 글리세리드를 유리 지방산으로 가수분해시킨 후에, 하나 이상의 효소를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 공급원료로부터 생성물 알코올을 생성하는 방법은 식물-유래의 오일을 추출제로 전환시키는 단계 전에, 식물-유래의 오일을 발효 용기에 공급하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 공급원료로부터 생성물 알코올을 생성하는 방법은 제2 추출제를 발효 용기에 첨가하여, 수상 및 생성물 알코올-함유 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 식물-유래의 오일은 제2 추출제의 첨가 단계 후에 추출제로 전환된다.
일부 실시형태에서, 발효 공정으로부터의 바이오매스로부터 유래된 오일을 제거하는 방법은 (a) 생성물 알코올, 및 바이오매스로부터 유래된 오일을 포함하는 발효 브로쓰를 제공하는 단계로서, 오일이 글리세리드를 포함하는 것인 단계; (b) 발효 브로쓰를 제1 추출제와 접촉시켜, 수상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성하는 단계로서, 생성물 알코올 및 오일을 유기상으로 분배하여, 생성물 알코올-함유 유기상을 형성하는 단계; (c) 생성물 알코올-함유 유기상을 수상으로부터 분리하는 단계; (d) 생성물 알코올을 유기상으로부터 분리하여, 희박 유기상(lean organic phase)을 생성하는 단계; 및 (e) 희박 유기상을 글리세리드를 유리 지방산으로 가수분해시킬 수 있는 하나 이상의 촉매를 포함하는 조성물과 접촉시켜, 적어도 일부의 제1 추출제 및 유리 지방산을 포함하는 제2 추출제를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 발효 브로쓰를 단계 (e)의 제2 추출제와 접촉시킴으로써 단계 (b)를 반복하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 동소 발효 추출제-형성 조성물은 (a) 물, 전분 및 오일을 포함하는, 바이오매스로부터 형성되는 매쉬, (b) 적어도 일부의 트라이글리세리드를 유리 지방산으로 가수분해시킬 수 있는 촉매 및 (c) 유리 지방산을 포함한다. 전분 및 오일은 둘 모두 바이오매스로부터 유래되며, 오일은 소정량의 트라이글리세리드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 발효 브로쓰는 (a) 부탄올을 생성할 수 있는 재조합 미생물, (b) 올리고당류, (c) 글리세리드를 유리 지방산으로 가수분해시키기 위한 촉매, (d) 글리세리드 및 (e) 유리 지방산을 포함한다.
도면의 간단한 설명
본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부 도면은 본 발명을 예시하며, 상세한 설명과 함께, 추가로 본 발명의 원리를 설명하며, 당업자가 본 발명을 구성하고 사용할 수 있는 역할을 한다.
<도 1>
도 1은 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한 것이며, 여기서, 액화된 바이오매스는 발효 전에 지질 가수분해를 위한 촉매와 접촉된다.
<도 2>
도 2는 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한 것이며, 여기서, 액화되고 당화된 바이오매스는 발효 전에 지질 가수분해를 위한 촉매와 접촉된다.
<도 3>
도 3은 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한 것이며, 여기서, 바이오매스 공급스트림 중의 지질은 액화 전에 또는 액화 동안 지질 가수분해를 위한 촉매와 접촉된다.
<도 4>
도 4는 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한 것이며, 여기서, 용해되지 않은 고형물 및 지질은 발효 전에 액화된 바이오매스로부터 제거되며, 제거된 지질은 촉매를 사용하여 유리 지방산으로 가수분해되고, 유리 지방산은 발효 용기에 공급된다.
<도 5>
도 5는 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한 것이며, 여기서 천연의 오일로부터 유래된 지질은 촉매를 사용하여 유리 지방산으로 가수분해되고, 유리 지방산은 발효 용기에 공급된다.
<도 6>
도 6은 본 발명의 예시적인 방법 및 시스템을 개략적으로 예시한 것이며, 여기서 발효 용기를 빠져 나오는 제1 추출제 중에 존재하는 바이오매스 지질은 유리 지방산으로 전환되고, 이는 제2 추출제로서 발효 용기에 공급된다.
<도 7>
도 7은 발효 용기 내의 지방산의 존재가 부타놀로겐(butanologen) 스트레인 NGCI-047에 대한 글루코스 소모에서 갖는 영향을 예시하는 차트이다.
<도 8>
도 8은 발효 용기 내의 지방산의 존재가 부타놀로겐 스트레인 NGCI-049에 대한 글루코스 소모에서 갖는 영향을 예시하는 차트이다.
<도 9>
도 9는 발효 용기 내의 지방산의 존재가 부타놀로겐 스트레인 NYLA84에 대한 글루코스 소모에서 갖는 영향을 예시하는 차트이다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충될 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 좌우할 것이다. 또한, 문맥에 의해 다르게 필요로 하지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이며, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
본 발명을 추가로 정의하기 위하여, 하기의 용어 및 정의가 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "포함하다", "포함하는", "구성하다", "구성하는", "갖다", "갖는", "함유하다" 또는 "함유하는", 또는 그들의 임의의 다른 변이형은 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹의 배제가 아닌, 언급된 정수 또는 정수의 그룹의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치는 반드시 그러한 요소만으로 제한되지는 않고, 명확하게 열거되지 않거나 그러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 용품, 또는 장치에 내재적인 다른 요소를 포함할 수 있다. 더욱이, 명백히 반대로 기술되지 않는다면, "또는"은 포괄적인 '또는'을 말하며 배타적인 '또는'을 말하는 것은 아니다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기 중 어느 하나에 의해 만족된다: A는 참 (또는 존재함)이고 B는 거짓 (또는 존재하지 않음), A는 거짓 (또는 존재하지 않음)이고 B는 참 (또는 존재함), A 및 B가 모두가 참 (또는 존재함).
또한, 본 발명의 요소 또는 성분 앞의 부정 관사 "a" 및 "an"는 요소 또는 성분의 경우, 즉, 출현의 수에 관해서는 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서, 부정 관사는 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 판독되어야 하며, 요소 또는 성분의 단수형 단어는 그 수가 단수형을 명백하게 의미하는 것이 아니라면 복수형을 또한 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비제한적인 용어이며, 특정 발명의 임의의 단일의 실시형태를 언급하는 것으로 의도되지 않고, 출원서에 기재된 바와 같은 모든 가능한 실시형태들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 채용된 발명의 성분 또는 반응물의 분량을 수정하는 용어 "약"은, 예를 들어, 실제에서 농축물 또는 용액을 생성하는데 사용되는 통상적 측정 및 액체 취급 과정; 이들 과정에서의 우발적인 오차; 조성물을 생성하거나 방법을 실행하기 위해 채용된 성분의 생성, 공급원 또는 순도의 차이; 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 혼합물로부터 유발되는 조성물에 대한 상이한 평형 조건으로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의한 수정 여부를 불문하고, 특허청구범위는 분량의 등가물을 포함한다. 일 실시형태에서, 용어 "약"은 보고된 수치의 10% 이내, 대안적으로는 보고된 수치의 5% 이내를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "바이오매스"는 옥수수, 사탕 수수, 밀, 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질 및 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌, 전분, 올리고당류, 이당류 및/또는 단당류를 포함하는 물질 및 그들의 혼합물과 같은 천연의 자원으로부터 유래된 임의의 당 및 전분을 포함하는 발효가능한 당을 제공하는 가수분해가능한 다당류를 함유하는 천연 생성물을 말한다. 바이오매스는 또한 단백질 및/또는 지질과 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다. 바이오매스는 단일의 공급원으로부터 유래할 수 있거나 바이오매스는 1가지 초과의 공급원으로부터 유래된 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는 옥수수 속대 및 옥수수 대의 혼합물, 또는 풀과 잎의 혼합물을 포함할 수 있다. 바이오매스는 바이오에너지 작물, 농업 잔류물, 도시 고형 폐기물(municipal solid waste), 산업 고형 폐기물, 제지 제조로부터의 슬러지, 마당 폐기물(yard waste), 나무 및 삼림지 폐기물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바이오매스의 예는, 옥수수 곡물, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 이를 테면 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 호밀, 밀짚, 보리, 보릿짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스(switchgrass), 폐지, 사탕수수 버개스(bagasse), 수수, 사탕 수수, 콩, 곡물의 제분으로부터 수득된 성분, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 나뭇조각, 톱밥, 관목 및 떨기나무, 야채, 과실, 꽃, 동물 퇴비 및 그들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 매쉬, 즙(juice), 당밀 또는 가수분해물은 발효의 목적을 위해 바이오매스를 처리하기 위한 해당 분야에 공지되어 있는 임의의 처리에 의해, 예컨대 밀링, 처리 및/또는 액화에 의해 바이오매스로부터 형성될 수 있으며, 발효가능한 당을 포함하며, 물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 셀룰로스계 및/또는 리그노셀룰로스계 바이오매스를 처리하여, 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 발효가능한 당을 함유하는 가수분해물을 수득할 수 있다. 저 암모니아 사전처리는 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2007/0031918A1호에 개시되어 있다. 셀룰로스계 및/또는 리그노셀룰로스계 바이오매스의 효소적 당화는 전형적으로 셀룰로스 및 헤미셀룰로스를 분해하기 위한 효소 조합을 사용하여, 글루코스, 자일로스 및 아라비노스를 비롯한 당을 함유하는 가수분해물을 생성한다. (셀룰로스계 및/또는 리그노셀룰로스계 바이오매스에 적합한 당화 효소는 문헌[Lynd, et al. (Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:506-577, 2002]에서 검토되었다).
매쉬, 즙(juice), 당밀 또는 가수분해물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 공급원료(12) 및 공급원료 슬러리(16)를 포함할 수 있다. 수성 공급스트림은 발효의 목적을 위해 바이오매스를 처리하기 위한 해당 분야에 공지되어 있는 임의의 처리에 의해, 예컨대 밀링 처리 및/또는 액화에 의해 바이오매스로부터 유래되거나 형성될 수 있으며, 발효가능한 탄소 기질(예컨대, 당)을 포함하며, 물을 포함할 수 있다. 수성 공급스트림은 본 명세서에 기재된 바와 같은 공급원료(12) 및 공급원료 슬러리(16)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "공급원료"는 발효 공정에서의 공급물을 의미하며, 공급물은 용해되지 않은 고형물이 있거나 또는 이것이 없는 발효가능한 탄소원을 함유하며, 적용가능한 경우, 공급물은 발효가능한 탄소원이 전분으로부터 유리되거나 추가의 처리에 의해, 예컨대 액화, 당화 또는 다른 공정에 의해 복합당의 분해로부터 수득되기 전 또는 그 후의 발효가능한 탄소원을 함유한다. 공급원료는 바이오매스를 포함하거나 그로부터 유래된다. 적절한 공급원료에는 호밀, 밀, 옥수수, 사탕수수(cane), 보리, 셀룰로스계 물질, 리그노셀룰로스계 물질 또는 그들의 혼합물이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "발효 브로쓰"는 물, 당, 용해된 고형물, 임의로, 알코올을 생성하는 미생물, 생성물 알코올 및 발효 용기 내에 보유되는 물질의 모든 다른 구성성분의 혼합물을 의미하며, 여기서, 생성물 알코올은 존재하는 미생물에 의해 당을 알코올, 물 및 이산화탄소(CO2)로 반응시킴으로써 제조된다. 때때로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "발효 배지" 및 "발효된 혼합물"은 "발효 브로쓰"와 동의어로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "발효가능한 탄소원" 또는 "발효가능한 탄소 기질"은 발효성 알코올의 생성을 위해 본 명세서에 개시된 미생물에 의해 대사될 수 있는 탄소원을 의미한다. 적합한 발효가능한 탄소원에는 단당류, 예컨대 글루코스 또는 프룩토스; 이당류, 예컨대 락토스 또는 수크로스; 올리고당류; 다당류, 예컨대 전분 또는 셀룰로스; C5 당, 예컨대 자일로스 및 아라비노스; 메탄을 비롯한 1-원자 탄소 기질; 및 그들의 혼합물이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "발효가능한 당"은 발효성 알코올의 생성을 위해 본 명세서에 개시된 미생물에 의해 대사될 수 있는 하나 이상의 당을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "발효 용기"는 생성물 알코올, 예컨대 부탄올이 당으로부터 만들어지는 발효 반응이 수행되는 용기를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "액화 용기"는 액화가 수행되는 용기를 의미한다. 액화는 올리고당류가 공급원료로부터 유리되는 공정이다. 공급원료가 옥수수인 일부 실시형태에서, 올리고당류는 액화 동안 옥수수 전분 함유물로부터 유리된다.
본 명세서에서 사용되는 "당화 용기"는 당화(즉, 올리고당류의 단당류로의 분해)가 수행되는 용기를 의미한다. 발효 및 당화가 동시에 발생하는 경우, 당화 용기 및 발효 용기는 동일한 용기에서 하나일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "당"은 올리고당류, 이당류, 단당류 및/또는 그들의 혼합물을 말한다. 또한, 용어 "당류"는 전분, 덱스트란, 글리코겐, 셀룰로스, 펜토산뿐 아니라 당을 비롯한 탄수화물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "당화 효소"는 다당류 및/또는 올리고당류, 예컨대 글리코겐 또는 전분의 알파-1,4-글루코시드 결합을 가수분해할 수 있는 하나 이상의 효소를 의미한다. 당화 효소는 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질을 가수분해시킬 수 있는 효소도 또한 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "용해되지 않은 고형물"은 공급원료의 비-발효가능한 부분, 예컨대 배아, 섬유 및 글루텐을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "생성물 알코올"은 발효가능한 탄소 기질의 공급원으로서 바이오매스를 사용하는 발효 공정에서 미생물에 의해 생성될 수 있는 임의의 알코올을 말한다. 생성물 알코올은 C1 내지 C8 알킬 알코올을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 생성물 알코올은 C2 내지 C8 알킬 알코올이다. 다른 실시형태에서, 생성물 알코올은 C2 내지 C5 알킬 알코올이다. C1 내지 C8 알킬 알코올이 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 펜탄올을 포함하나 이에 한정되지 않음이 인식될 것이다. 마찬가지로, C2 내지 C8 알킬 알코올은 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 펜탄올을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, "알코올"은 본 명세서에서 생성물 알코올에 관련하여 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 "부탄올"은 구체적으로, 개별적으로 또는 그들의 혼합물로서의 부탄올 이성체 1-부탄올(1-BuOH), 2-부탄올(2-BuOH), tert-부탄올 및/또는 아이소부탄올(iBuOH 또는 i-BuOH, 또는 I-BUOH, 2-메틸-1-프로판올로도 공지되어 있음)을 말한다. 때때로, 부탄올의 에스테르를 지칭하는 경우, 용어 "부틸 에스테르" 및 "부탄올 에스테르"는 상호교환하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "프로판올"은 프로판올 이성체 아이소프로판올 또는 1-프로판올을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "펜탄올"은 펜탄올 이성체 1-펜탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 2,2-다이메틸-1-프로판올, 3-펜탄올, 2-펜탄올, 3-메틸-2-부탄올, 또는 2-메틸-2-부탄올을 말한다.본 명세서에 사용되는 용어 "알코올 당량"은 알코올 에스테르의 완벽한 가수분해 및 소정량의 알코올 에스테르로부터의 이후의 알코올의 회수에 의해 수득될 알코올의 중량을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "수상 역가"는 발효 브로쓰 중의 특정 알코올(예컨대, 부탄올)의 농도를 말한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "유효 역가"는 발효 배지 리터당 알코올 에스테르화에 의해 생성되는 알코올 에스테르의 알코올 당량 또는 발효에 의해 생성되는 특정 알코올(예컨대, 부탄올)의 총량을 말한다. 예를 들어, 단위 발효 부피 중의 부탄올의 유효 역가에는 (i) 발효 배지 중의 부탄올의 양; (ii) 유기 추출제로부터 회수되는 부탄올의 양; (iii) 기체 스트리핑(gas stripping)이 사용되는 경우, 기체상으로부터 회수되는 부탄올의 양; 및 (iv) 유기상 또는 수상 중 어느 하나 중의 부탄올 에스테르의 알코올 당량이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "동소 생성물 제거(ISPR)"는 생성물이 생성됨에 따라 생물학적 공정에서 생성물 농도를 조절하기 위한 생물학적 공정, 예컨대 발효로부터의 특정 발효 생성물의 선택적인 제거를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "추출제" 또는 "ISPR 추출제"는 임의의 생성물 알코올, 예컨대 부탄올을 추출하는데 사용되거나, 또는 촉매에 의해 생성물 알코올 및 카르복실산 또는 지질로부터 생성되는 임의의 생성물 알코올 에스테르를 추출하기 위해 사용되는 유기 용매를 의미한다. 때때로, 본 명세서에 사용되는 용어 "용매"는 "추출제"와 동의어로 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법을 위하여, 추출제는 수-비혼화성이다.
용어 "수-비혼화성" 또는 "불용성"은 하나의 액체 상을 형성하는 방식으로, 수용액, 예컨대 발효 브로쓰와 혼합시킬 수 없는 화학 성분, 예컨대 추출제 또는 용매를 말한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "수상"은 발효 브로쓰와 수-비혼화성 유기 추출제를 접촉시켜 수득되는 2상 혼합물의 수상을 지칭한다. 발효 추출을 포함하는 본 명세서에 기재된 방법의 일 실시형태에서, 용어 "발효 브로쓰"는 구체적으로 2상 발효성 추출물 중의 수상을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "유기상"은 발효 브로쓰와 수-비혼화성 유기 추출제를 접촉시켜 수득되는 2상 혼합물의 비-수상을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "카르복실산"은 일반식 -COOH(여기서, 탄소 원자는 이중 결합에 의해 산소 원자에 결합되어 카르보닐기(-C=O)를 생성하고, 단일 결합에 의해 하이드록실기(-OH)에 결합된다)를 갖는 임의의 유기 화합물을 지칭한다. 카르복실산은 양성자화된 카르복실산의 형태, 카르복실산의 염의 형태(예컨대, 암모늄, 나트륨 또는 칼륨 염) 또는 양성자화된 카르복실산 및 카르복실산의 염의 혼합물일 수 있다. 용어 카르복실산은 단일의 화학 종(예컨대, 올레산), 또는 예를 들어, 바이오매스-유래의 지방산 에스테르 또는 트라이글리세리드, 다이글리세리드, 모노글리세리드 및 인지질의 가수분해에 의해 생성될 수 있는 것과 같은 카르복실산의 혼합물을 기술할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "지방산"은 포화되거나 불포화된, C4 내지 C28 탄소 원자(가장 통상적으로는 C12 내지 C24 탄소 원자)를 갖는 카르복실산(예를 들어, 지방족 모노카르복실산)을 지칭한다. 또한, 지방산은 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 지방산은 동물 또는 식물 지방, 오일 또는 왁스로부터 유래되거나, 그 내에 에스테르화된 형태로 포함될 수 있다. 지방산은 천연에서 지방 및 지방산 오일 내의 글리세리드의 형태로 발생할 수 있거나, 지방의 가수분해 또는 합성에 의해 수득될 수 있다. 용어 지방산은 단일의 화학종 또는 지방산의 혼합물을 기재할 수 있다. 또한, 용어 지방산은 유리 지방산도 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "지방산 알코올"은 포화되거나 불포화된 C4 내지 C22 탄소 원자의 지방족 사슬을 갖는 알코올을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "지방산 알데히드"는 포화되거나 불포화된 C4 내지 C22 탄소 원자의 지방족 사슬을 갖는 알데히드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "지방산 아미드"는 포화 또는 불포화된, C4 내지 C22 탄소 원자의 긴 지방족 사슬을 갖는 아미드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "지방산 에스테르"는 포화되거나 불포화된 C4 내지 C22 탄소 원자의 긴 지방족 사슬을 갖는 에스테르를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 "천연의 오일"은 식물(예컨대, 바이오매스) 또는 동물로부터 수득되는 지질을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 "식물-유래의 오일"은 특히 식물로부터 수득되는 지질을 지칭한다. 때때로, "지질"은 "오일" 및 "아실 글리세리드"와 동의어로 사용될 수 있다. 천연의 오일은 우지, 옥수수유, 카놀라유, 카프르산/카프릴산 트라이글리세리드, 피마자유, 코코넛유, 면실유, 어유, 호호바유, 라드, 아마인유, 니이츠풋 오일, 오이티시카 오일, 팜유, 땅콩유, 평지씨유, 쌀겨기름, 홍화유, 콩기름, 해바라기씨유, 동유, 자트로파유 및 식물성 오일 배합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 용어 "분리"는 "회수"와 동의어이며, 초기 혼합물 중의 화합물의 순도 또는 농도보다 더 큰 순도 또는 더 높은 농도로 상기 화합물을 얻도록 초기 혼합물로부터 상기 화합물을 제거하는 것을 말한다.
본 명세서에 사용되는 "재조합 미생물"은 예를 들어, 숙주 세포를 생합성 경로, 예컨대 알코올, 예컨대 부탄올을 생성하는 생합성 경로를 포함하도록 조작함에 의한, 재조합 DNA 기법의 사용으로 변형된 미생물, 예컨대, 박테리아 또는 효모를 말한다.
본 발명은 바이오매스로부터 유래된 오일 글리세리드의 촉매적 가수분해에 의해 수득되는 추출제, 및 추출제의 생성 방법을 제공한다. 특히, 바이오매스 오일 중의 글리세리드는 효소와 같은 촉매를 사용하여, 지방산으로 촉매적으로 가수분해될 수 있다. 지방산은 발효 브로쓰로부터의 생성물 알코올, 예컨대 부탄올의 동소 제거를 위한 추출제로 소용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 바이오매스 오일로부터 생성되었던 추출제를 사용하여 추출 발효를 통해 생성물 알코올, 예컨대 부탄올을 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 공급원료 슬러리에 존재하는 오일을 발효 전에 지방산으로 촉매적으로 가수분해시키는 방법을 제공하며, 이에 의해, 오일이 지방산으로 전환되고, 발효 용기 내의 오일의 존재가 원인이 되는 시간에 따른 ISPR 추출제의 분배 계수의 저하가 감소될 수 있다. 더욱이, 공급원료 오일의 가수분해에 의해 수득되는 지방산은 발효성 알코올에 대한 분배 계수가 공급원료 오일의 발효성 알코올에 대한 분배 계수보다 더 큰 ISPR 추출제로 소용될 수 있다. 공급원료 오일은 가수분해 전에 공급원료 슬러리로부터 분리되고 ISPR 추출제로 사용될 수 있거나, 오일은 공급원료 슬러리 중에서 지방산으로 가수분해될 수 있다. 추가로, ISPR 추출제로서의 지방산은 통상의 외인성 추출제, 예컨대 올레일 알코올 또는 올레산 대신에, 또는 이에 부가하여 사용되어, 이에 의해 외인성 추출제와 관련된 원료 비용을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 도면을 참조로 하여 기재될 것이다. 도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 발효성 알코올의 생성을 위한 예시적인 공정 흐름도를 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, 공급원료(12)는 액화 용기(10) 내의 입구로 도입되고 액화되어, 공급원료 슬러리(16)를 생성할 수 있다. 공급원료(12)는 발효가능한 탄소원(예컨대, 발효가능한 당, 예컨대 글루코스)을 공급하는 가수분해가능한 전분을 함유하며, 바이오매스, 예컨대 비제한적으로 호밀, 밀, 옥수수, 사탕수수, 보리, 셀룰로스계 물질, 리그노셀룰로스계 물질 또는 그들의 혼합물일 수 있거나, 다르게는 바이오매스로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 공급원료(12)는 분별된 바이매스의 하나 이상의 성분일 수 있으며, 다른 실시형태에서, 공급원료(12)는 밀링되고, 분별되지 않은 바이오매스일 수 있다. 일부 실시형태에서, 공급원료(12)는 옥수수, 예컨대 건식 밀링된, 분별되지 않은 옥수수 알일 수 있으며, 용해되지 않은 고형물은 배아, 섬유 및 글루텐을 포함할 수 있다. 용해되지 않은 고형물은 공급원료(12)의 비-발효가능한 부분이다. 도면에 나타낸 실시형태를 참조한 본 명세서의 논의를 위하여, 공급원료(12)는 종종 구성하는 밀링된 분별되지 않은 옥수수로 기재될 것이며, 여기서, 용해되지 않은 고형물은 이로부터 분리되지 않는다. 그러나, 본 명세서에 기재된 예시적인 방법 및 시스템은 당업자에게 명백한 것처럼, 분별되든지 그렇지 않든지 간에 상이한 공급원료에 대하여 변경될 수 있는 것이 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, 공급원료(12)는 고-올레산 옥수수일 수 있어, 이로부터 유래되는 옥수수유는 올레산 함량이 적어도 약 55 wt% 올레산인 고-올레산 옥수수유이다. 일부 실시형태에서, 고-올레산 옥수수유 중의 올레산 함량은 최대 약 65 wt%일 수 있으며, 이는 일반 옥수수유 중의 올레산 함량이 약 24 wt%인 것과 비교된다. 고-올레산 오일은 본 발명의 방법에서 사용하는데 몇몇 이점을 제공할 수 있는데, 이는 오일의 가수분해가 발효 브로쓰와 접촉시키기 위한 높은 올레산 함량을 갖는 지방산을 제공하기 때문이다. 일부 실시형태에서, 지방산 또는 그들의 혼합물은 불포화 지방산을 포함한다. 불포화 지방산의 존재는 융점을 감소시켜, 취급에 대한 이점을 제공한다. 불포화 지방산 중에, 단일 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 단일불포화된 것은 공정 고려사항에 적절한 열 및 산화 안정성의 희생없이 융점에 대한 이점을 제공할 수 있다.
공급원료(12)의 액화 공정은 공급원료(12) 중의 전분의, 예를 들어, 덱스트린 및 올리고당류를 포함하는 당으로의 가수분해를 포함하며, 이는 통상적인 공정이다. 산 공정, 산-효소 공정 또는 효소 공정을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 공지되어 있는 액화 공정뿐 아니라, 통상적으로 해당 산업에서 사용되는 상응하는 액화 용기가 사용될 수 있다. 이러한 공정은 단독으로 또는 병용하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소 공정이 사용될 수 있으며, 적절한 효소(14), 예컨대 알파-아밀라제는 액화 용기(10) 내의 입구에 도입된다. 물도 또한 액화 용기(10)에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 당화 효소, 예컨대 글루코아밀라제도 또한 액화 용기(10)에 도입될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 리파제도 또한 액화 용기(10)에 도입되어, 오일의 하나 이상의 성분의 지방산으로의 전환을 촉매작용시킬 수 있다.
공급원료(12)의 액화로부터 생성되는 공급원료 슬러리(16)는 공급원료(12)가 형성되는 바이오매스로부터 유래되는 당, 오일(26), 및 용해되지 않은 고형물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 오일은 발효 브로쓰 조성의 약 0 wt% 내지 적어도 약 2 wt%의 양으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 오일은 공급원료의 적어도 약 0.5 wt%의 양으로 존재한다. 공급원료 슬러리(16)는 액화 용기(10)의 출구로부터 배출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 공급원료(12)는 옥수수 또는 옥수수 알이며, 이에 따라, 공급원료 슬러리(16)는 옥수수 매쉬 슬러리이다.
촉매(42)는 공급원료 슬러리(16)로 첨가될 수 있다. 촉매(42)는 오일(26) 중의 글리세리드를 유리 지방산(FFA)(28)으로 가수분해시킬 수 있다. 예를 들어, 공급원료(12)가 옥수수이면, 오일(26)은 공급원료의 구성성분 옥수수유이며, 유리 지방산(28)은 옥수수유 지방산(COFA)이다. 따라서, 공급원료 슬러리(16)로의 촉매(42)의 도입 후에, 오일(26) 중의 적어도 일부의 글리세리드가 FFA(28)로 가수분해되어, 공급원료 슬러리(18)가 FFA(28) 및 촉매(42)를 갖게 한다. 오일(26)의 가수분해로부터 생성되는 산/오일 조성은 전형적으로 적어도 약 17 wt%의 FFA이다. 일부 실시형태에서, 오일(26)의 가수분해로부터 생성되는 산/오일 조성은 적어도 약 20 wt% FFA, 적어도 약 25 wt% FFA, 적어도 약 30 wt% FFA, 적어도 약 35 wt% FFA, 적어도 약 40 wt% FFA, 적어도 약 45 wt% FFA, 적어도 약 50 wt% FFA, 적어도 약 55 wt% FFA, 적어도 약 60 wt% FFA, 적어도 약 65 wt% FFA, 적어도 약 70 wt% FFA, 적어도 약 75 wt% FFA, 적어도 약 80 wt% FFA, 적어도 약 85 wt% FFA, 적어도 약 90 wt% FFA, 적어도 약 95 wt% FFA, 또는 적어도 약 99 wt% FFA이다. 일부 실시형태에서, 발효 용기 내의 지방산(예컨대, 카르복실산)의 농도는 수상 중의 용해도 제한을 초과하며, 유기상 및 수상을 포함하는 2-상 발효 혼합물의 생성을 야기한다. 일부 실시형태에서, 발효 브로쓰 중의 카르복실산(또는 지방산)의 농도는 전형적으로 약 0.8 g/ℓ 이하이며, 브로쓰 중의 카르복실산(또는 지방산)의 용해성에 의해 제한된다.
일부 실시형태에서, 촉매(42)는 하나 이상의 효소, 예컨대 하이드롤라제 효소, 예컨대 리파제 효소일 수 있다. 사용되는 리파제 효소는 예를 들어, 아브시디아(Absidia), 아크로모박터(Achromobacter), 아에로모나스(Aeromonas), 알칼리게네스(Alcaligenes), 알테르나리아(Alternaria), 아스페르길러스(Aspergillus), 아크로모박터(Achromobacter), 아우레오바시디움(Aureobasidium), 바실러스(Bacillus), 브베리아(Beauveria), 브로코트릭스(Brochothrix), 칸디다(Candida), 크로모박터(Chromobacter), 코프리누스(Coprinus), 푸사리움(Fusarium), 게오트리쿰(Geotricum), 한세눌라(Hansenula), 휴미콜라(Humicola), 하이포자이마(Hyphozyma), 락토바실러스(Lactobacillus), 메타리쥼(Metarhizium), 무코르(Mucor), 네크트리아(Nectria), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조크토니아(Rhizoctonia), 리조무코르(Rhizomucor), 리조퍼스(Rhizopus), 로도스포리듐(Rhodosporidium), 로도토룰라(Rhodotorula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 서스(Sus), 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces), 써모마이세스(Thermomyces), 티아로스포렐라(Thiarosporella), 트리코더마(Trichoderma), 베르티실륨(Verticillium) 및/또는 야로위아(Yarrowia)의 스트레인을 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 태양에서, 리파제의 공급원은 아브시디아 블라케슬리나(Absidia blakesleena), 아브시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 아크로모박터 아이오파구스(Achromobacter iophagus), 알칼리게네스 종, 알테르나리아 브라시키올라(Alternaria brassiciola), 아스페르길러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스페르길러스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길러스 튜빈젠시스(Aspergillus tubingensis), 아우레오바시디움 풀룰란즈(Aureobasidium pullulans), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 스트레아로써모필러스(Bacillus strearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 브로코트릭스 써모소하타(Brochothrix thermosohata), 칸디다 실린드라세아(Candida cylindracea)(칸디다 루고사(Candida rugosa)), 칸디다 파라리폴리티카(Candida paralipolytica), 칸디다 안타르크티카 리파제 A(Candida Antarctica lipase A), 칸디다 안타르티카 리파제 B(Candida antartica lipase B), 칸디다 에르노비이(Candida ernobii), 칸디다 데포르만스(Candida deformans), 크로모박터 비스코섬(Chromobacter viscosum), 코프리너스 시네리우스(Coprinus cinerius), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 푸사리움 솔라니 피시(Fusarium solani pisi), 푸사리움 로제움 쿨모룸(Fusarium roseum culmorum), 게오트리쿰 페니실라툼(Geotricum penicillatum), 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala), 휴미콜라 브레비스포라(Humicola brevispora), 휴미콜라 브레비스(Humicola brevis) 변종 써모이데아(thermoidea), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 리조퍼스 오리자에(Rhizopus oryzae), 페니실리움 사이클로피움(Penicillium cyclopium), 페니실리움 크루스토섬(Penicillium crustosum), 페니실리움 엑스판섬(Penicillium expansum), 페니실리움 종 I, , 페니실리움 종 II, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 알칼리게네스(Pseudomonas alcaligenes), 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia)(유의어 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)), 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 프라지(Pseudomonas fragi), 슈도모나스 말토필리아(Pseudomonas maltophilia), 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina), 슈도모나스 메피티카 리폴리티카(Pseudomonas mephitica lipolytica), 슈도모나스 알칼리게네스, 슈도모나스 플란타리(Pseudomonas plantari), 슈도모나스 슈도알칼리게네스(Pseudomonas pseudoalcaligenes), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri) 및 슈도모나스 위스콘시넨시스(Pseudomonas wisconsinensis), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 리조퍼스 야포니쿠스(Rhizopus japonicus), 리조퍼스 미크로스포러스(Rhizopus microsporus), 리조퍼스 노도서스(Rhizopus nodosus), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스포로볼로마이세스 시바타너스(Sporobolomyces shibatanus), 서스 스크로파(Sus scrofa), 써모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosus)(이전에는 휴미콜라 라누기노스(Humicola lanuginose)), 티아로스포렐라 파세올리나(Thiarosporella phaseolina), 트리코더마 하르지아넘(Trichoderma harzianum), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 태양에서, 리파제는 써모마이세스 라누기노서스 리파제, 아스페르길러스 종 리파제, 아스페르길러스 니거 리파제, 아스페르길러스 튜빈젠시스 리파제, 칸디다 안타르티카 리파제 B, 슈도모나스 종 리파제, 페니실리움 로퀘포르티(Penicillium roqueforti) 리파제, 페니실리움 카멤베르티이(Penicillium camembertii) 리파제, 무코르 야바니쿠스(Mucor javanicus) 리파제, 버크홀데리아 세파시아 리파제, 알칼리게네스 종 리파제, 칸디다 루고사 리파제, 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis) 리파제, 칸디다 데포르만스 리파제, 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum)으로부터의 리파제 A 및 B, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 리파제, 넥트리아 해마토코카(Nectria haematococca) 리파제, 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum) 리파제, 리조퍼스 델레마르(Rhizopus delemar) 리파제, 리조무코르 미에헤이 리파제, 리조퍼스 아리저스(Rhizopus arrhizus) 리파제 및 리조퍼스 오리자에 리파제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 효소 촉매(42)로 적절한 상용의 리파제 제제에는 노보자임즈로부터 입수할 수 있는 리폴라제(Lipolase)(등록 상표) 100 L, 리펙스(Lipex)(등록 상표) 100L, 리포클린(Lipoclean)(등록 상표) 2000T, 리포자임(Lipozyme)(등록 상표) CALB L, 노보자임(Novozyme)(등록 상표) CALA L 및 팔라타제(Palatase) 20000L 또는 시그마알드리치(SigmaAldrich)로부터 입수할 수 있는 슈도모나스 플루오레슨스, 슈도모나스 세파시아, 무코르 미에헤이, 호그 판크레아스(Hog pancreas), 칸디다 실린드라세아, 리조퍼스 니베우스(Rhizopus niveus), 칸디다 안타르크티카, 리조퍼스 아리저스 또는 아스페르길러스로부터의 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
포스포리파제는 인지질의 에스테르 결합을 가수분해시키는 효소이나, 많은 포스포리파제는 또한 트라이글리세리드, 다이글리세리드 및 모노글리세리드를 가수분해시킬 수 있다(지질 아실 하이드롤라제(LAH) 활성). 본 명세서에 사용되는 용어 "포스포리파제"는 임의의 포스포리파제 활성을 가지며, 예를 들어, 오일, 예컨대 미정제 오일 또는 식물성 오일에서 글리세롤포스페이트 에스테르 결합을 절단하는(글리세롤포스페이트 에스테르 결합의 가수분해를 촉매작용) 효소를 포함한다. 본 발명의 포스포리파제 활성은 수-추출가능한 인산화된 염기 및 다이글리세리드를 생성할 수 있다. 포스포리파제 활성은 포스포리파제 C(PLC) 활성; PI-PLC 활성, 포스포리파제 A(PLA) 활성, 예컨대 포스포리파제 A1 또는 포스포리파제 A2 활성; 라이소포스포리파제(LPL) 활성 및/또는 라이소포스포리파제-트랜스아실라제(LPT A) 활성을 포함하는 포스포리파제 B(PLB) 활성, 예컨대 포스포리파제 B1 또는 포스포리파제 B2 활성; 포스포리파제 D(PLD) 활성, 예컨대 포스포리파제 D1 또는 포스포리파제 D2 활성; 및/또는 파타틴(patatin) 활성 또는 그들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "포스포리파제"는 또한 라이소포스포리파제 활성을 갖는 효소를 포함하며, 여기서, 이러한 효소의 2개의 기질은 2-라이소포스파티딜콜린 및 H2O이며, 그의 2가지 생성물은 글리세로포스포콜린 및 카르복실레이트이다. 포스포리파제 A1(PLA1) 효소는 1-위치 지방산을 제거하여, 유리 지방산 및 1-라이소-2-아실포스포리피드를 생성한다. 포스포리파제 A2(PLA2) 효소는 2-위치 지방산을 제거하여, 유리 지방산 및 1-아실-2-라이소포스포리피드를 생성한다. PLA1 및 PLA2 효소는 세포내 또는 세포외 막-결합 또는 용해성일 수 있다. 포스포리파제 C(PLC) 효소는 포스페이트 부분을 제거하여, 1,2 다이아실글리세롤 및 포스페이트 에스테르를 생성한다. 포스포리파제 D(PLD) 효소는 1,2-다이아실글리세로포스페이트 및 염기 기를 생성한다. 본 발명에 유용한 포스포리파제는 예를 들어 푸사리움 속에서의 사상 진균종, 예컨대 푸사리움 쿨모룸, 푸사리움 헤테로스포룸, 푸사리움 솔라니 또는 푸사리움 옥시스포룸의 스트레인; 또는 아스페르길러스 속에서의 사상 진균종, 예컨대 아스페르길러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길러스 포에티더스(Aspergillus foetidus), 아스페르길러스 야포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길러스 니거 또는 아스페르길러스 오리자에(Aspergillus oryzae)의 스트레인에 한정되지 않는 다양한 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 또한, 써모마이세스 라누기노서스 포스포리파제 변이체, 예컨대 상용의 제품 레시타제(Lecitase)(등록 상표) 울트라(Ultra)(덴마크 소재의 노보자임즈 에이'에스)가 본 발명에서 유용하다. 하나 이상의 포스포리파제는 동결건조된 분말로 적용되거나, 고정화되거나 수용액 중에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 일부의 글리세리드가 가수분해된 후에, 촉매(42)를 불활성화시킬 수 있다. 해당 분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 사용하여 촉매(42)가 불활성이게 만들 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 촉매(42)는 열의 적용에 의해, 반응 물질의 pH를 촉매(42)가 비가역적으로 불활성화되는 pH로 조정함에 의해, 및/또는 촉매 활성을 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 화학 또는 생화학 종을 첨가함에 의해 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 도 1의 실시형태에 나타낸 바와 같이, 열(q)을 공급원료 슬러리(18)에 가하고, 이에 의해 촉매(42)는 불활성이 된다. 공급원료 슬러리(18)를 발효 용기(30)에 공급하기 전에, 열(q)의 적용을 공급원료 슬러리(18)에 가할 수 있다. 이어서, 열-처리된 공급원료 슬리러(18)(불활성 촉매(42)가 있는)를 발효 용기(30) 내에 보유되는 발효 브로쓰에 포함될 미생물(32)과 함께 발효 용기(30)에 도입시켰다. 대안적으로, 공급원료 슬러리(18)를 발효 용기(30)에 공급하고, 미생물(32)의 발효 용기 접종 전에, 발효 용기 중에서 열(q)로 처리할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 촉매 불활성화 처리는 공급원료 슬리러(18)를 열(q)로 적어도 약 5분 동안 적어도 약 75℃, 적어도 약 10분 동안 적어도 약 75℃, 적어도 약 15분 동안 적어도 약 75℃, 적어도 약 5분 동안 적어도 약 80℃, 적어도 약 10분 동안 적어도 약 80℃, 적어도 약 15분 동안 적어도 약 80℃, 적어도 약 5분 동안 적어도 약 85℃, 적어도 약 10분 동안 적어도 약 85℃, 또는 적어도 약 15분 동안 적어도 약 85℃의 온도로 가열함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 열(q)로 처리한 후에, 공급원료 슬러리(18)를 발효 용기(30)로의 도입 전에(또는 열(q)의 적용이 발효 용기에서 행해지는 경우에는 발효 용기 접종 전에), 발효에 적절한 온도로 냉각시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 공급원료 슬러리(18)의 온도는 발효 브로쓰와의 접촉 전에 약 30℃이다.
발효 용기에서 촉매(42)가 알코올과 지방산(28)을 에스테르화하는 것을 방지하는 것이 바람직한 경우에, 촉매(42)의 불활성화는 바람직하다. 일부 실시형태에서, 발효 배지 중의 생성물 알코올과 유기산(예컨대, 지방산) 및 촉매(예컨대, 리파제)의 에스테르화에 의한 알코올 에스테르의 생성은 모두 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 공동-계류 중인 공동 소유의 미국 가출원 제61/368,429호(출원일: 2010년 7월 28일); 미국 가출원 제61/379,546호(출원일: 2010년 9월 2일); 및 미국 가출원 제61/440,034호(출원일: 2011년 2월 7일)에 추가로 기재되어 있는 바와 같이 바람직하다. 예를 들어, 부탄올 생성을 위하여, 발효 용기 중의 활성 촉매(42)(슬러리(18)를 통해 도입)는 부탄올과 지방산(28)(슬러리(18)를 통해 도입)의 에스테르화를 촉매작용시켜, 동소에서 지방산 부틸 에스테르(FABE)를 형성할 수 있다.
발효 용기(30)는 슬러리(18)를 발효 시켜, 생성물 알코올, 예컨대 부탄올을 생성하도록 구성된다. 특히, 미생물(32)은 슬러리(18) 중의 발효가능한 당을 대사작용시키며, 생성물 알코올을 분비한다. 미생물(32)은 박테리아, 시아노박테리아, 사상진균 및 효모의 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 미생물(32)은 박테리아, 예컨대 에스케리키아 콜라이(E.coli)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물(32)은 발효성 재조합 미생물일 수 있다. 슬러리는 예컨대 올리고당류의 형태의 당 및 물을 포함할 수 있으며, 약 20 g/ℓ 미만의 모노머 글루코스, 더욱 바람직하게는 약 10 g/ℓ 미만 또는 약 5 g/ℓ 미만의 모노머 글루코스를 포함할 수 있다. 모노머 글루코스의 양을 결정하기에 적절한 방법은 해당 분야에 널리 알려져 있다. 해당 분야에 공지되어 있는 이러한 적절한 방법은 HPLC를 포함한다.
일부 실시형태에서, 슬러리(18)를 당화 공정으로 처리하여, 슬러리(18) 중의 복합당(complex sugar)(예컨대, 올리고당류)을 미생물(32)에 의해 용이하게 대사작용될 수 있는 단당류로 분해한다. 산 공정, 산-효소 공정 또는 효소 공정을 포함하나 이에 한정되지 않는 산업에서 통상 사용되는 임의의 공지되어 있는 당화 공정이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동시 당화 및 발효(SSF)는 도 1에 나타낸 바와 같은 발효 용기(30) 내부에서 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소(38), 예컨대 글루코아밀라제를 발효 용기(30) 내의 입구에 도입시켜, 전분 또는 올리고당류를 미생물(32)에 의해 대사작용될 수 있는 글루코스로 분해시킬 수 있다.
임의로, 에탄올(33)이 발효 용기(30)에 공급되어, 발효 브로쓰에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 부탄올 생합성 경로를 갖는 재조합 미생물을 부탄올 생성을 위한 미생물(32)로 사용하는 경우, 미생물(32)은 생존하고 성장하기 위하여 2원자-탄소 기질(예컨대, 에탄올)의 보충을 필요로 할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 에탄올(33)을 발효 용기(30)에 공급할 수 있다.
그러나, 유리 지방산(예컨대, FFA(28))이 발효 용기에 존재하는 본 발명의 방법이 재조합 미생물의 생활력을 해치지 않고, 주어진 재조합 미생물에 전형적으로 공급되는 에탄올(33)의 양을 감소시킬 수 있는 것이 놀랍게도 발견되었다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 에탄올 보충 없이, 에탄올(33)이 보충되는 경우 실현될 수 있는 생성 속도와 유사한 알코올(예컨대, 부탄올) 생성 속도를 제공한다. 하기 실시예 1 내지 14에 제시된 비교예에 의해 추가로 입증된 바와 같이, 지방산이 발효 용기 중에 존재하나 에탄올은 존재하지 않는 경우의 부탄올 생성 속도는 지방산 또는 에탄올 중 어느 것도 발효 용기에 존재하지 않는 경우의 부탄올 생성 속도보다 더 클 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 에탄올(33) 보충량은 통상적인 공정에 비하여 감소된다. 예를 들어, 2원자-탄소 기질의 보충을 필요로 하는 미생물을 위해 발효 용기에 첨가되는 에탄올의 전형적인 양은 약 5 g/ℓ의 무수 에탄올(즉, 발효 배지 리터당 5 g의 무수 에탄올)이다. 일부 실시형태에서, 부탄올 발효에는 임의의 에탄올(33)을 보충하지 않는다. 후자의 경우에, 에탄올(33)의 스트림은 완전히 발효 용기로부터 생략된다. 따라서, 본 발명의 일부 실시형태에서, 보충적인 에탄올(33)과 관련된 비용뿐 아니라 에탄올(33)의 저장통(storing vat) 및 부탄올 발효 동안 에탄올을 발효 용기에 공급하는 것과 관련된 불편함을 줄이거나 없앨 수 있다.
더욱이, 에탄올 보충과 관계 없이, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 발효 동안 지방산의 존재 덕분에 미생물(32)에 의한 더 큰 글루코스 활용 속도를 제공할 수 있다. 공급된 오일(26)로부터 가수분해되고/거나 슬러리(16)의 구성 바이오매스 오일의 가수분해로부터 유래되는 지방산은 카르복실산(28)으로서 발효 용기(30)에 도입될 수 있다. 지방산을 공정 중의 한 단계에서 생성하고, 미생물 성장 속도 및 글루코스 소모를 향상시키기 위하여 발효 용기 내의 미생물 배양물과 접촉시키는 발효 공정으로부터의 생성물 알코올의 생성 방법은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 공동-계류 중인 공동 소유의 미국 가출원 제61/368,451호(출원일: 2010년 7월 28일)에 기재되어 있다.
발효 용기(30)에서, 알코올은 미생물(32)에 의해 생성된다. 동소 생성물 제거(ISPR)를 사용하여 발효 브로쓰로부터 생성물 알코올을 제거할 수 있다. 일부 실시형태에서, ISPR은 액체-액체 추출을 포함한다. 액체-액체 추출은 그 전문이 본 명세서에 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2009/0305370호에 기재된 공정에 따라 수행될 수 있다. 미국 특허 출원 공개 제2009/0305370호에는 액체-액체 추출을 사용하여 발효 브로쓰로부터 부탄올을 생성하고 회수하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 발효 브로쓰를 수-비혼화성 추출제와 접촉시켜, 수상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 발효 브로쓰와 접촉하고, 수상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성하는 추출제는 포화, 단일-불포화, 다중-불포화(및 그들의 혼합물) C12 내지 C22 지방산 알코올, C12 내지 C22 지방산, C12 내지 C22 지방산의 에스테르, C12 내지 C22 지방산 알데히드, C12 내지 C22 지방산 아미드, 트라이글리세리드 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 추출제일 수 있다. 또한, 발효 브로쓰와 접촉하고, 수상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성하는 추출제는 포화, 단일-불포화, 다중-불포화(및 그들의 혼합물) C4 내지 C22 지방산 알코올, C4 내지 C28 지방산, C4 내지 C28 지방산의 에스테르, C4 내지 C22 지방산 알데히드, C4 내지 C22 지방산 아미드, 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 추출제일 수 있다. 또한, 슬러리(18)로부터의 유리 지방산(28)은 ISPR 추출제(28)로 소용될 수 있다. 예를 들어, 유리 지방산(28)이 옥수수유 지방산(COFA)인 경우, ISPR 추출제(28)는 COFA이다. ISPR 추출제(FFA)(28)는 발효 브로쓰와 접촉되며, 수상(34) 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물이 형성된다. 발효 브로쓰에 존재하는 생성물 알코올은 우선적으로 유기상으로 분배되어, 알코올-함유 유기상(36)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 발효 용기(30)는 수상, 및 생성물 알코올이 분배된 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성하는 하나 이상의 추가의 ISPR 추출제(29)를 수용하기 위한 하나 이상의 입구를 갖는다.
2상 혼합물은 스트림(39)으로 발효 용기(30)로부터 제거될 수 있으며, 용기(35) 내로 도입되고, 여기서, 알코올-함유 유기상(36)은 수상(34)으로부터 분리된다. 알코올-함유 유기상(36)은 사이퍼닝(siphoning), 흡인, 디캔테이션(decantation), 원심분리, 중력 침강기의 사용, 막-보조 상분리 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 2상 혼합물 스트림(39)의 수상(34)으로부터 분리된다. 수상(34)의 모두 또는 일부는 발효 배지(나타낸 바와 같은)로서 발효 용기(30) 내로 재순환되거나, 다르게는 폐기되고 새로운 배지로 대체되거나, 임의의 남아 있는 생성물 알코올의 제거를 위해 처리된 다음 발효 용기(30)로 재순환될 수 있다. 이어서, 알코올-함유 유기상(36)을 분리기(50)에서 처리하여, 생성물 알코올(54)을 회수하고, 이어서 생성된 알코올-희박(lean) 추출제(27)를 생성물 알코올의 추가의 추출을 위하여, 보통 슬러리(18)로부터의 새로운 FFA(28)와 조합하고/거나 신선한 추출제(29)와 함께, 다시 발효 용기(30)로 재순환시킨다. 대안적으로, 신선한 FFA(28)(슬러리(18)로부터의) 및/또는 추출제(29)를 계속적으로 발효 용기에 첨가하여, 2상 혼합물 스트림(39)에서 제거되는 ISPR 추출제(들)를 대체할 수 있다.
일부 실시형태에서, 임의의 추가의 ISPR 추출제(29)는 외인성 유기 추출제, 예컨대 올레일 알코올, 베헤닐 알코올, 세틸 알코올, 라우릴 알코올, 미리스틸 알코올, 스테아릴 알코올, 1-운데카놀, 올레산, 라우르산, 미리스트산, 스테아르산, 메틸 미리스테이트, 메틸 올레에이트, 운데카날, 라우르산 알데히드, 20-메틸운데카날 및 그들의 혼합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, ISPR 추출제(29)는 카르복실산일 수 있으며, 일부 실시형태에서, ISPR 추출제(29)는 지방산일 수 있다. 일부 실시형태에서, 카르복실산 또는 지방산은 탄소 원자수가 4 내지 28개, 다른 실시형태에서는 탄소 원자수가 4 내지 22개, 다른 실시형태에서 탄소 원자수가 8 내지 22개, 다른 실시형태에서 탄소 원자수가 10 내지 28개, 다른 실시형태에서 탄소 원자수가 7 내지 22개, 다른 실시형태에서 탄소 원자수가 12 내지 22개, 다른 실시형태에서 탄소 원자수가 4 내지 18개, 다른 실시형태에서 탄소 원자수가 12 내지 22개, 다른 실시형태에서 탄소 원자수가 12 내지 18개일 수 있다. 일부 실시형태에서, ISPR 추출제(29)는 하나 이상의 하기의 지방산이다: 아잘레산, 카프르산, 카프릴산, 피마자유 지방산, 코코넛유 지방산(즉, 예를 들어, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 카프릴산, 카프르산, 스테아르산, 카프로산, 아라키드산, 올레산, 및 리놀레산을 포함하는 지방산의 자연 발생 조합물로서), 다이머산, 아이소스테아르산, 라우르산, 아마인유 지방산, 미리스트산, 올레산, 올리브유 지방산, 팜유 지방산, 팔미트산, 팜핵유 지방산, 땅콩유 지방산, 펠라르곤산, 리시놀레산, 세바스산, 대두유 지방산, 스테아르산, 톨유 지방산, 우지 지방산, #12 하이드록시스테아르산 또는 임의의 종자유. 일부 실시형태에서, ISPR 추출제(29)는 하나 이상의 2산, 아젤라산, 다이머산 및 세바스산이다. 따라서, 일부 실시형태에서, ISPR 추출제(29)는 둘 이상의 상이한 지방산의 혼합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, ISPR 추출제(29)는 천연 오일로부터 유래된 글리세리드의 화학적 또는 효소적 가수분해로부터 유래된 지방산일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ISPR 추출제(29)는 천연 오일, 예컨대 도 5의 실시형태를 참조로 후술되는 바와 같은 바이오매스 지질의 효소적 가수분해에 의해 수득되는 유리 지방산(28')일 수 있다. 일부 실시형태에서, ISPR 추출제(29)는 예를 들어, 공동 계류 중인 공동 소유의 미국 가출원 제 61/368,436호(출원일: 2010년 7월 28일)에 기재된 바와 같이 천연 오일, 예컨대 바이오매스 지질의 화학적 전환으로부터 수득되는, 지방산, 지방산 알코올, 지방산 아미드, 지방산 메틸 에스테르, 지방산의 저급 알코올 에스테르, 지방산 글리콜 에스테르, 하이드록실화된 트라이글리세리드 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 지방산 추출제일 수 있다. 이러한 실시형태에서, 추출제(29)를 생성하기 위한 바이오매스 지질은 공급원료(12)가 수득되는 동일하거나 상이한 바이오매스 공급원으로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 추출제(29)를 생성하기 위한 바이오매스 지질은 대두로부터 유래될 수 있는 반면에, 공급원료(12)의 바이오매스 공급원은 옥수수이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 추출제(29) 대 공급원료(12)에 대한 상이한 바이오매스 공급원의 임의의 가능한 조합이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가의 ISPR 추출제(29)는 COFA를 포함한다.
동소 추출 발효는 발효 용기(30) 내에서 회분식 또는 연속식으로 수행될 수 있다. 동소 추출 발효에 있어서, 유기 추출제는 발효의 시작 시에 발효 배지와 접촉하여 2상 발효 배지를 형성할 수 있다. 대안적으로, 유기 추출제는, 배양물의 광학 밀도를 측정함으로써 결정될 수 있는, 목적하는 양의 성장을 미생물이 달성한 후에 발효 배지와 접촉될 수 있다. 추가로, 유기 추출제는 발효 배지 내 생성물 알코올 수준이 사전결정된 수준에 도달하는 때에 발효 배지와 접촉될 수 있다. 부탄올 생성의 경우에, 예를 들어, ISPR 추출제는 부탄올 농도가 미생물에게 독성일 수준에 도달하기 전의 시간에 발효 배지와 접촉될 수 있다. 발효 배지를 ISPR 추출제와 접촉시킨 후에, 부탄올 생성물은 추출제 내로 분배되어, 미생물을 함유하는 수상 중의 농도가 감소되고, 이에 의해 생산 미생물의 억제성 부탄올 생성물에 대한 노출이 제한된다.
사용될 ISPR 추출제의 부피는 후술되는 바와 같은 발효 배지의 부피, 발효 용기의 크기, 추출제의 부탄올 생성물에 대한 분배 계수 및 선택된 발효 방식을 포함하는 다수의 인자에 의해 좌우된다. 추출제의 부피는 발효 용기 작업 부피의 약 3% 내지 약 60%일 수 있다. 추출의 효능에 따라, 발효 배지 중의 부탄올의 수상 역가는 예를 들어, 약 1 g/ℓ 내지 약 85 g/ℓ, 약 10 g/ℓ 내지 약 40 g/ℓ, 약 10 g/ℓ 내지 약 20 g/ℓ, 약 15 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ 또는 약 20 g/ℓ 내지 약 60 g/ℓ일 수 있다. 일부 실시형태에서, 알코올 에스테르화 후에 얻어진 발효 브로쓰는 유리(즉, 비에스테르화) 알코올을 포함할 수 있으며, 일부 실시형태에서, 알코올 에스테르화 후의 발효 브로쓰 중의 유리 알코올의 농도는 생성물 알코올이 부탄올인 경우, 1, 3, 6, 10, 15, 20, 25, 30 25, 40, 45, 50, 55 또는 60 g/ℓ 이하이거나, 생성물 알코올이 에탄올인 경우, 알코올 에스테르화 후의 발효 브로쓰 중의 유리 알코올의 농도는 15, 20, 25, 30 25, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 g/ℓ이하이다. 이론에 의해 제한되지 않고, 부분적으로, 발효 배지로부터 독성 부탄올 생성물을 제거하는 것으로부터, 더 높은 부탄올 역가가 추출 발효 방법을 사용하여 수득될 수 있으며, 이에 의해 미생물에 독성인 수준 미만으로 유지할 수 있는 것으로 여겨진다.
회분식의 동소 추출 발효에서, 소정 부피의 유기 추출제를 발효 용기에 첨가하고, 공정 중에 추출제를 제거하지 않는다. 이 방식은 발효 배지 중의 억제성 부탄올 생성물의 농도를 최소화하기 위해 더 큰 부피의 유기 추출제를 필요로 한다. 결과적으로, 연속식을 사용하여 수득되는 것보다 발효 배지의 부피는 더 작고, 생성되는 생성물의 양은 더 적다. 예를 들어, 회분식에서 추출제의 부피는, 일 실시형태에서는 발효 용기 작업 부피의 20% 내지 약 60%일 수 있고, 다른 실시 형태에서는 약 30% 내지 약 60%일 수 있다.
ISPR 추출제와 동시에 기체 스트리핑(미도시)을 사용하여 발효 배지로부터 생성물 알코올을 제거할 수 있다.
도 1의 실시형태에서, 생성물 알코올은 발효 브로쓰로부터 동소에서 추출되며, 2상 혼합물(39)의 분리는 별개의 용기(35) 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 2상 혼합물(39)의 분리는 알코올-함유 유기상 스트림(36)이 발효 용기(30)로부터 직접 빠져 나오는 후술되는 도 2 및 3의 실시형태에 도시되는 바와 같이, 발효 용기에서 발생할 수 있다. 수상 스트림(34)도 또한 발효 용기(30)로부터 직접 빠져 나오거나, 임의의 잔류 생성물 알코올의 제거를 위해 처리되고 재순환되거나, 또는 폐기되고 새로운 발효 배지로 대체될 수 있다. 유기 추출제(들)에 의한 생성물 알코올의 추출은 발효 브로쓰로부터의 미생물의 제거와 함께 또는 이것 없이, 행해질 수 있다. 미생물은 여과 또는 원심분리를 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 수단에 의해 발효 브로쓰로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 수상 스트림(34)은 효모와 같은 미생물(32)을 포함할 수 있다. 미생물(32)은 예를 들어, 원심분리기(미도시)에서 수상 스트림으로부터 용이하게 분리될 수 있다. 이어서, 미생물 (32)은 발효 용기 (30)로 재순환시킬 수 있으며, 시간이 지남에 따라 알코올 생성의 생성 속도를 증가시켜, 알코올 생성의 효율을 증가시킬 수 있다.
연속식의 동소 추출 발효에서, 추출제의 부피는 일 실시형태에서는 발효 용기 작업 부피의 약 3% 내지 약 50%, 다른 실시형태에서는 약 3% 내지 약 30%, 다른 실시형태에서는 3% 내지 약 20%; 다른 실시형태에서는 3% 내지 약 10%일 수 있다. 생성물이 반응기로부터 계속적으로 제거되기 때문에, 더 작은 부피의 추출제가 필요하여 더 큰 부피의 발효 배지의 사용이 가능해진다.
동소 추출 발효의 대안으로서, 발효 용기(30)의 발효 브로쓰 다운스트림으로부터 생성물 알코올을 추출할 수 있다. 이러한 경우에, 발효 브로쓰를 발효 용기(30)로부터 제거하여 용기(35) 내로 도입시킬 수 있다. 이어서, 추출제(28)를 용기(35)에 도입시키고, 발효 브로쓰와 접촉시켜 용기(35) 내에 2상 혼합물(39)을 얻을 수 있으며, 이이서, 이는 유기상(36) 및 수상(34)으로 분리된다. 대안적으로, 용기(35)로의 도입 전에, 별개의 용기(미도시) 내에서 발효 브로쓰에 추출제(28)를 첨가할 수 있다.
비제한적인 예측예로서, 도 1의 실시형태를 참조하여, 공칭 약 4 wt%의 옥수수유를 함유할 수 있는 분쇄된 전체 옥수수(공급원료(12)로서)의 수성 현탁액을 약 85℃ 내지 120℃에서 30분 내지 2시간 동안 아밀라제(액화 효소(14)로서)로 처리하여, 생성된 액화된 매쉬(16)를 65℃ 내지 30℃로 냉각시키고, 지질 중의 이용가능한 지방산 함유물의 유리 지방산으로의 적어도 30% 내지 적어도 99%만큼 높은 전환을 생성하기에 충분한 시간 동안 pH 4.5 내지 7.5(일부 실시형태에서, pH 5.5 내지 6.5)에서 리파제(촉매(42)로서) 0.1 ppm 내지 10 ppm(일부 실시 형태에서, 0.5 ppm 내지 1.0 ppm)으로 처리할 수 있다. 임의로, 액화되고 리파제-처리된 매쉬(18)를 발효 전에 가열하여 리파제(42)를 불활성화시킬 수 있다. 매쉬(18)를 약 30℃(예를 들어, 열-교환기를 사용하여)로 냉각시키고, 약 25% 내지 30 wt% 건조 옥수수 고형물로 발효 용기(30)에 로딩할 수 있다. 글루코아밀라제(당화 효소(38)로서)의 첨가에 의한 발효 동안의 액화된 매쉬(18)의 당화에 의해, 글루코스가 생성될 수 있다. 생성된 발효 브로쓰는 리파제(42)로 처리되지 않은 액화된 매쉬를 사용하는 발효 브로쓰에 존재할 수 있는 옥수수유의 양(예를 들어, 약 1.2 wt%의 옥수수유)보다 유의미하게 적게 함유할 수 있다. 특히, 리파제(42) 처리는 옥수수유 지질(26)(트라이글리세리드(TG))의 FFA(28)(및 일부 다이글리세리드(DG) 또는 모노글리세리드(MG))로서의 COFA로의 전환을 야기하여, 임의의 ISPR 추출제(29)(예컨대, 올레일 알코올) 중의 지질(26)의 축적 속도를 감소시킬 수 있으며, ISPR 동안의 COFA(28)의 유기상(36)으로의 용해는 지질(TG)의 유기상(36)으로의 용해만큼 크게 유기상(36) 중의 부탄올의 분배 계수를 감소시키지 않아야 한다.
일부 실시형태에서, 도 1의 시스템 및 공정은 공급원료 슬러리(16)(오일(26)을 갖는) 및 촉매(42)를 발효 용기(30)에 도입시키고 접촉시켜, 슬러리(18)(FFA(28)를 갖는)가 생성되도록 변경될 수 있다. 이어서, 발효 용기 온도를 증가시켜, 촉매(42)를 열 불활성화시킬 수 있다. 이어서, 발효 용기 온도를 감소시키고, 발효 용기에 미생물(32)을 접종하고, 이에 의해, 슬러리(18)의 당을 발효시켜, 생성물 알코올을 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 당업자에게 자명할 바와 같이, 도 1의 시스템 및 공정은 발효 용기(30) 내에서의 동시 당화 및 발효(SSF)가 발효 용기(30) 전의 별개의 당화 용기(60)(도 2 참조)로 대체되도록 변경될 수 있다. 따라서, 슬러리(18)는 SSF 공정에서, 발효 전에 또는 발효 동안 당화될 수 있다. 또한, 공급원료 오일(26)의 가수분해용 촉매(42)를 당화 효소(38) 전에, 후에 또는 그와 동시에 도입시킬 수 있음이 자명할 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 효소(38) 및 촉매(42)의 첨가는 단계적이거나(예를 들어, 촉매 (42)에 이어서 효소(38) 또는 그 반대), 실질적으로 동시일 수 있다(즉, 사람 또는 기계가 첨가를 단번에 수행하는데 걸리는 시간과 정확하게 동일한 시간에, 또는 사람 또는 기계가 첨가를 2번에 수행하는데 걸리는 시간에서와 같이 하나의 효소/촉매 직후에 다른 효소/촉매).
예를 들어, 도 2의 실시형태에 도시된 바와 같이 도 1의 시스템 및 공정은 발효 용기(30)에서의 동시 당화 및 발효(SSF)가 발효 용기(30) 전에 별개의 당화 용기(60)로 대체되도록 변경될 수 있다. 도 2는 효소(38)를 수용하는 별개의 당화 용기(60)를 포함하며, 촉매(42)가 액화되고 당화된 공급원료 스트림(62)에 도입되는 것을 제외하고는, 도 1과 실질적으로 동일하다. 공급원료 슬러리(16)는 글루코아밀라제와 같은 효소(38)와 함께 당화 용기(60)에 도입되고, 이에 의해, 슬러리(16) 중의 올리고당류 형태의 당은 단당류로 분해될 수 있다. 액화되고 당화된 공급원료 스트림(62)은 촉매(42)가 도입되는 당화 용기(60)를 빠져 나온다. 공급원료 스트림(62)은 공급원료로부터 유래된 단당류, 오일(26) 및 용해되지 않은 고형물을 포함한다. 오일(26)은 촉매(42)의 도입에 의해 가수분해되어, 유리 지방산(28) 및 촉매(42)를 갖는 액화되고 당화된 공급원료 슬러리(64)를 생성한다.
대안적으로, 일부 실시형태에서, 촉매(42)는 당화 효소(38)와 함께 첨가되어, 동시에 글루코스를 생성시키고 오일 지질(26)을 유리 지방산(28)으로 가수분해시킬 수 있다. 효소(38) 및 촉매(42)의 첨가는 단계적이거나(예를 들어, 촉매(42)에 이어서, 효소(38), 또는 그 반대) 동시에 이루어질 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 슬러리(62)는 발효 용기에 도입될 수 있으며, 촉매(42)는 발효 용기(30)에 직접 첨가된다.
도 2의 실시형태에서, 열(q)을 공급원료 슬러리(64)에 가하여, 이에 의해, 촉매(42)가 불활성화되게 한 다음, 열-처리된 슬러리(64)를 알코올-생성 미생물(32)과 함께 발효 용기(30)에 도입시키는데, 이 알코올-생성 미생물은 단당류를 대사작용시켜, 생성물 알코올(예컨대, 부탄올)을 생성한다. 대안적으로, 슬러리(64)를 발효 용기(30)에 공급하고, 미생물(32)의 접종 전에, 발효 용기 중에서 열(q)로 처리할 수 있다.
도 1을 참조하여 상술된 바와 같이, 유리 지방산(28)은 또한 수상으로부터 생성물 알코올을 우선적으로 분배하기 위한 ISPR 추출제로서 소용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 ISPR 추출제(29)도 또한 발효 용기 (30)로 도입될 수 있다. 2상 혼합물의 분리는 발효 용기(30) 내에서 발생하며, 이에 의해 알코올-함유 유기상 스트림(36) 및 수상 스트림(34)이 발효 용기(30)로부터 직접 빠져나온다. 대안적으로, 2상 혼합물의 분리는 도 1의 실시형태에 제공된 바와 같이 별개의 용기(35) 내에서 행해질 수 있다. 도 2의 실시형태의 나머지 공정 운영은 도 1과 동일하므로, 다시 상세히 설명되지 않을 것이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 공급원료(12)로부터 유래된 오일(26)은 액화 전에 또는 액화 동안 FFA(28)로 촉매적으로 가수분해될 수 있다. 예를 들어, 도 3의 실시형태에서, 오일(26)을 갖는 공급원료(12)를 오일(26) 중의 적어도 일부의 글리세리드의 FFA(28)로의 가수분해를 위한 촉매와 함께 액화 용기(10)에 공급한다. 공급원료(12) 중의 전분을 가수분해하기 위한 효소(14)(예컨대, 알파-아밀라제)도 또한 용기(10)에 도입시켜, 액화된 공급원료를 생성할 수 있다. 효소(14) 및 촉매(42)의 첨가는 단계적이거나 동시에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 촉매(42)를 도입시킨 다음, 적어도 일부의 오일(26)을 가수분해시킨 후에 효소(14)를 도입시킬 수 있다. 대안적으로, 효소(14)를 도입시킨 다음, 촉매(42)를 도입시킬 수 있다. 액화 공정은 열(q)의 적용을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 공정 온도가 촉매(42)를 불활성화시키는 온도 미만이어서, 오일(26)이 가수분해될 수 있는 경우에, 촉매(42)를 액화 전에, 또는 액화 동안 도입시키는 것이 바람직하다. 따라서, 열(q)의 적용은 액화 및 촉매(42)의 불활성화의 2가지 목적을 제공할 수 있다.
임의의 경우에, 공급원료(12) 중의 오일(26)은 액화 용기(10)에서 FFA(28)로 전환되어, 2상의 공급원료 슬러리(18)가 액화 용기(10)를 빠져나오게 한다. 2상의 슬러리(18)는 FFA(28)의 유기상뿐 아니라 수상의 당, 물 및 용해되지 않은 고형물 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수상은 오일 중의 글리세리드를 지방산으로 전환시키는 것으로부터의 글리세롤(글리세린)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 글리세롤은 존재한다면, 발효 용기(30) 내로의 도입 전에 스트림(18)으로부터 제거될 수 있다.
도 3을 참조하여, 2상의 스트림(18)은 발효 용기(30) 내의 발효 브로쓰와 접촉하여 2상 혼합물을 형성한다. 발효 용기(30)에서, SSF에 의해 생성되는 생성물 알코올은 FFA(28)를 포함하는 유기상으로 분배된다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 도 2와 관련하여 논의된 별개의 당화 용기를 포함하도록 공정이 변경될 수 있다. 2상 혼합물의 분리는 발효 용기(30) 내에서 발생하며, 이에 의해 알코올-함유 유기상 스트림(36) 및 수상 스트림(34)이 발효 용기(30)로부터 직접 빠져 나온다. 대안적으로, 2상 혼합물의 분리는 도 1의 실시형태에 제공된 바와 같이 별개의 용기(35) 내에서 행해질 수 있다. 임의로, 하나 이상의 추가의 추출제(29)는 발효 용기(30)에 도입되어, 수상으로부터 생성물 알코올을 우선적으로 분배하는 유기상을 형성할 수 있다. 알코올-함유 유기상(36)은 생성물 알코올(54)의 회수 및 도 1에 나타낸 바와 같은 회수되는 추출제(27)의 임의의 재순환을 위해 분리기(50)에 도입될 수 있다. 도 3의 실시형태의 나머지 공정 운영은 이전에 기재된 도면과 동일할 수 있으므로, 다시 상세히 설명되지 않을 것이다.
도 1 내지 3에 관하여 이전에 기재된 임의의 실시형태를 포함하는 일부 실시형태에서, 용해되지 않은 고형물은 발효 용기(30)로의 도입 전에 공급원료 슬러리로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 도 4의 실시형태에 나타낸 바와 같이, 공급원료 슬러리(16)는 용해되지 않은 고형물을 고형물 상으로 또는 습윤 케익(24)으로 배출하도록 구성된 분리기(20)의 입구에 도입된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 분리기(20)는 공급원료 슬러리(16)로부터 용해되지 않은 고형물을 분리하기 위한 필터 프레스, 진공 여과 또는 원심분리기를 포함할 수 있다. 임의로, 일부 실시형태에서, 분리기(20)는 또한 공급원료 슬러리(16)에 존재하는 일부 또는 실질적으로 모든 오일(26)을 제거하도록 구성될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 분리기(20)는 사이퍼닝, 디캔테이션, 흡인, 원심분리, 중력 침강기의 사용, 막-보조 상분리 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 수성 공급스트림으로부터 오일을 제거하기 위한 당업계에 공지되어 있는 임의의 적절한 분리기일 수 있다. 당 및 물을 포함하는 남아있는 공급원료는 수성 스트림(22)으로서 발효 용기(30)에 배출된다.
일부 실시형태에서, 분리기(20)는 오일(26)을 제거하나, 용해되지 않은 고형물을 제거하지는 않는다. 따라서, 발효 용기(30)에 공급되는 수성 스트림(22)은 용해되지 않은 고형물을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 분리기(20)는 공급원료 슬러리(16)를 교반하거나 회전시켜, 당 및 물(즉, 스트림(22))을 함유하는 수층, 용해되지 않은 고형물을 함유하는 고형물 층(즉, 습윤 케익(24)) 및 오일층(즉, 오일 스트림(26))을 포함하는 원심분리 생성물을 생성하는 트라이캔터 원심분리기(20)를 포함한다. 이러한 경우에, 촉매(42)는 도 4에 나타낸 바와 같이 제거된 오일(26)과 접촉하여, 촉매(42)를 포함하는 FFA(28)의 스트림을 생성할 수 있다. 이어서, 열(q)을 FFA(28)의 스트림에 가하고, 이에 의해, 촉매(42)가 불활성화되게 할 수 있다. 이어서, FFA(28)의 스트림 및 불활성 촉매(42)는 스트림(22) 및 미생물(32)과 함께 발효 용기(30) 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, FFA(28) 및 활성 촉매(42)가 용기(40)로부터 발효 용기(30)로 공급될 수 있으며, 활성 촉매(42)는 이후에, 미생물(32)의 접종 전에, 발효 용기 중에서 열(q)로 처리되고 불활성화될 수 있다.
FFA(28)는 ISPR 추출제(28)로 소용될 수 있으며, 발효 용기(30) 내에서 2상 혼합물을 형성한다. SSF에 의해 생성되는 생성물 알코올은 FFA(28)로 구성되는 유기상(36)으로 분배된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 ISPR 추출제(29)도 또한 발효 용기 (30)로 도입될 수 있다. 따라서, 오일(26)(예컨대, 공급원료로부터의)을 FFA(28)로 촉매적으로 가수분해시켜, 이에 의해, ISPR 추출제의 생성 동안에도 ISPR 추출제 중의 지질의 축적 속도를 감소시킬 수 있다. 유기상(36)은 용기(35)에서 2상 혼합물(39)의 수상(34)으로부터 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2상 혼합물(39)의 분리는 알코올-함유 유기상 스트림(36)이 발효 용기(30)로부터 직접 빠져 나오는 도 2 및 3에 기재된 실시형태에 도시된 바와 같이, 발효 용기에서 발생할 수 있다. 유기상(36)은 생성물 알코올(54)의 회수 및 도 1에 나타낸 바와 같은 회수되는 추출제(27)의 임의의 재순환을 위해 분리기(50)에 도입될 수 있다. 도 4의 실시형태의 나머지 공정 운영은 도 1과 동일하므로, 다시 상세히 설명되지 않을 것이다.
습윤 케익(24)을 원심분리기(20)를 통해 제거하는 경우, 일부 실시형태에서, 공급원료(12)로부터의 일부의 오일, 예컨대 공급원료가 옥수수인 경우에는 옥수수유가 습윤 케익(24)에 남아있다. 습윤 케익(24)은 일단 수용액(22)이 원심분리기(20)로부터 배출되면, 원심분리기에서 추가의 물로 세정될 수 있다. 습윤 케익(24)의 세정에 의해 습윤 케익 내에 존재하는 당(예컨대, 올리고당류)이 회수될 것이며, 회수된 당 및 물은 액화 용기(10)로 재순환시킬 수 있다. 세정 후에, 습윤 케익(20)을 건조시켜, 임의의 적절한 공지되어 있는 공정을 통하여 주정박(DDGS)을 형성할 수 있다. 원심분리기(20) 내에 형성된 습윤 케익(24)으로부터의 DDGS의 형성은 몇몇 이점을 갖는다. 용해되지 않은 고형물이 발효 용기로 가지 않기 때문에, DDGS는 포획된 추출제 및/또는 생성물 알코올, 예컨대 부탄올을 갖지 않으며, 이는 발효 용기의 조건에 처해지지 않고, 이는 발효 용기 내에 존재하는 미생물과 접촉되지 않는다. 이들 모든 이점은 DDGS가 예를 들어, 동물 사료로서 더 용이하게 처리되고 판매되게 한다. 일부 실시형태에서, 오일(26)은 습윤 케익(24)과 따로 배출되지 않으며, 오히려, 오일(26)은 습윤 케익(24)의 일부로 포함되고, 이는 결국 DDGS에 존재한다. 이러한 예에서, 오일은 DDGS로부터 분리될 수 있으며, 동일하거나 상이한 알코올 발효 공정에서 이후의 사용을 위하여 ISPR 추출제(29)로 전환될 수 있다. 원심분리를 통하여 공급원료(16)로부터 용해되지 않은 고형물을 제거하기 위한 방법 및 시스템은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 공동 계류 중인 공동 소유의 미국 특허 출원 제61/356,290호(출원일: 2010년 6월 18일)에 상세히 기재되어 있다.
다른 실시형태(미도시)에서, 당화는 당업자에게 명백할 것처럼, 분리기(20)와 액화 용기(10) 사이에 위치한 별개의 당화 용기(60)(도 2 참조)에서 발생할 수 있다.
다른 실시형태에서, 예를 들어, 도 5의 실시형태에 나타낸 바와 같이, 천연 오일(26')은 촉매(42)가 또한 공급되는 용기(40)에 공급되며, 이에 의해, 오일(26') 중의 적어도 일부의 글리세리드가 가수분해되어 FFA(28')를 형성한다. 촉매(42)는 이후에 예컨대, 열(q)의 적용에 의해 불활성화될 수 있다. 이어서, FFA(28') 및 불활성 촉매(42)를 함유하는 용기(40)로부터의 생성물 스트림은 공급원료 오일(26) 및 일부 실시형태에서는 용해되지 않은 고형물이 이전에 분리기(20)(예컨대, 도 4의 실시형태 참조)의 수단에 의해 제거된 수성 공급원료 스트림(22)과 함께, 발효 용기(30) 내로 도입된다. 당화 효소(38) 및 미생물(32)도 또한 발효 용기(30)에 도입되어, 이에 의해 생성물 알코올이 SSF에 의해 생성된다.
대안적으로, 오일(26') 및 촉매(42)는 용기(40)를 사용하는 것보다는 발효 용기(30)에 직접 공급되고, 여기서, 오일(26')이 FFA(28')로 가수분해될 수 있다. 이후에, 활성 촉매(42)가 미생물(32)의 접종 전에, 발효 용기 중에서 열(q)로 처리되고 불활성화될 수 있다. 대안적으로, FFA(28') 및 활성 촉매(42)가 용기(40)로부터 발효 용기(30)로 공급될 수 있으며, 이후에 활성 촉매(42)는 미생물(32)의 접종 전에, 발효 용기 중에서 열(q)로 처리되고 불활성화될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 오일(26)을 제거한 스트림(22)보다는 오일(26)을 포함하는 공급원료 슬러리(16)를 발효 용기(30)에 공급하고 활성 촉매(42)와 접촉시킬 수 있다. 그러므로, 활성 촉매(42)는 오일(26)을 FFA(28)로 가수분해시켜, 발효 용기 중의 오일의 존재에 기인한 시간에 따른 추출제의 분배 계수의 저하 및/또는 그의 소실을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 당업자에게 명백할 것처럼, 발효 용기(30)에서의 동시 당화 및 발효가 발효 용기(30) 전의 별개의 당화 용기(60)로 대체되도록 도 5의 시스템 및 공정이 변경될 수 있다(예컨대, 도 2의 실시형태 참조).
일부 실시형태에서, 천연 오일(26')은 우지, 옥수수유, 카놀라유, 카프르산/카프릴산 트라이글리세리드, 피마자유, 코코넛유, 면실유, 어유, 호호바유, 라드, 아마인유, 니이츠풋 오일, 오이티시카 오일, 팜유, 땅콩유, 평지씨유, 쌀겨기름, 홍화유, 콩기름, 해바라기씨유, 동유, 자트로파유, 식물성 오일 배합물 및 그들의 혼합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 천연 오일(26')은 둘 이상의 천연 오일의 혼합물, 예컨대 팜유 및 대두유의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 천연 오일(26')은 식물-유래의 오일이다. 일부 실시형태에서, 식물-유래의 오일은 반드시 그러한 것은 아니지만, 발효 공정에서 사용될 수 있는 바이오매스로부터 유래될 수 있다. 바이오매스는 공급원료(12)(도 5에 스트림(22)으로 도시)가 수득되는 것과 동일하거나 상이한 공급원일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 오일(26')은 옥수수로부터 유래될 수 있는 한편, 공급원료(12)는 사탕수수일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 오일(26')은 옥수수로부터 유래될 수 있으며, 공급원료(12)의 바이오매스 공급원도 또한 옥수수이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 오일(26') 대 공급원료(12')에 대한 상이한 바이오매스 공급원의 임의의 가능한 조합이 사용될 수 있다.
FFA(28')는 ISPR 추출제(28')로 소용되어, 수상 및 유기상을 포함하는 2-상 혼합물을 형성할 수 있으며, 발효 배지에서 생성되는 생성물 알코올은 ISPR 추출제(28')로 구성되는 유기상으로 우선적으로 분배된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 ISPR 추출제(29)도 또한 도 1에 관하여 상술된 바와 같이 발효 용기 (30)로 도입될 수 있다. 유기상(36)은 용기(35)에서 2상 혼합물(39)의 수상(34)으로부터 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2상 혼합물(39)의 분리는 알코올-함유 유기상 스트림(36)이 발효 용기(30)로부터 직접 빠져 나오는 도 2 및 3에 기재된 실시형태에 도시된 바와 같이, 발효 용기에서 발생할 수 있다. 유기상(36)은 생성물 알코올(54)의 회수 및 도 1에 나타낸 바와 같은 회수되는 추출제(27)의 임의의 재순환을 위해 분리기(50) 내로 도입될 수 있다. 도 5의 실시형태의 나머지 공정 운영은 도 1과 동일하므로, 다시 상세히 설명되지 않을 것이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 공급원료(12) 중에 존재하는 바이오매스 오일은 알코올 발효 후의 한 단계에서 FFA(28)로 전환될 수 있다. 이어서, FFA(28)는 발효 용기에 ISPR 추출제(28)로서 도입될 수 있다. 예를 들어, 도 6의 실시형태에서, 공급원료(12)는 액화되어, 공급원료로부터 유래되는 오일(26)을 포함하는 공급원료 슬러리(16)를 형성한다. 또한, 공급원료 슬러리(16)는 공급원료로부터의 용해되지 않은 고형물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 용해되지 않은 고형물은 분리기, 예컨대 원심분리기(미도시)를 통해 슬러리(16)로부터 분리될 수 있다. 오일(26)을 함유하는 공급원료 슬러리(16)는 당화 효소(38) 및 미생물(32)을 포함하는 발효 브로쓰를 함유하는 발효 용기(30)에 직접 도입된다. 생성물 알코올은 발효 용기(30)에서 SSF에 의해 생성된다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 도 2와 관련하여 논의된 별개의 당화 용기를 포함하도록 공정이 변경될 수 있다.
ISPR 추출제(29)는 발효 용기(30)에 도입되어, 2상 혼합물을 형성하며, 생성물 알코올은 ISPR 추출제(29)의 유기상으로의 분배에 의해 제거된다. 오일(26)도 또한 유기상으로 분배된다. 2상 혼합물의 분리는 발효 용기(30) 내에서 발생하며, 이에 의해 알코올-함유 유기상 스트림(36) 및 수상 스트림(34)이 발효 용기(30)로부터 직접 빠져 나온다. 대안적으로, 2상 혼합물의 분리는 도 1의 실시형태에 제공된 바와 같이 별개의 용기(35) 내에서 행해질 수 있다. 오일(26)을 포함하는 유기상 스트림(36)이 분리기(50)에 도입되어 추출제(29)로부터 생성물 알코올(54)이 회수된다. 생성된 알코올-희박 추출제(27)는 회수된 추출제(29) 및 오일(26)을 포함한다. 추출제(27)는 촉매(42)와 접촉하며, 이에 의해, 오일(26) 중의 적어도 일부의 글리세리드는 가수분해되어, FFA(28)를 형성한다. 이어서, 발효 용기(30)로 다시 재순환시키기 전에, 열(q)을 FFA(28)를 포함하는 추출제(27)에 적용하여, 촉매(42)를 불활성화시킬 수 있다. 이러한 재순환 추출제 스트림(27)은 별개의 스트림이거나, 신선한 구성 추출제 스트림(29)과 조합된 스트림일 수 있다. 이어서, 이후에 발효 용기(30)로부터 제거되는 알코올-함유 유기상(36)은 새로 도입된 공급원료 슬러리(16)로부터의 추가의 오일(26) 및 생성물 알코올에 더하여, FFA(28) 및 ISPR 추출제(29)(신선한 추출제(29) 및 재순환 추출제(27)로서)를 포함할 수 있다. 이어서, 직전에 기재된 바와 동일한 방식으로, 유기상(36)을 처리하여, 생성물 알코올을 회수하고, 추가의 오일(26)의 가수분해를 위하여 촉매(42)와 접촉시킨 후에, 발효 용기(30)로 재순환시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 구성 ISPR 추출제(29)의 사용은 발효 공정이 시간이 지남에 따라 운영되면서 단계적으로 폐지될 수 있는데, 이는 공정 그 자체가 생성물 알코올을 추출하기 위한 구성 ISPR 추출제로서의 FFA(28)를 생성할 수 있기 때문이다. 따라서, ISPR 추출제는 FFA(28)가 있는 재순환 추출제(27)의 스트림일 수 있다.
따라서, 도 1 내지 5는 발효 공정 및 바이오매스 유래의 오일(26)의 촉매적 가수분해로부터 생성되는 FFA(28) 및 천연 오일(26'), 예컨대 식물-유래의 오일의 촉매적 가수분해로부터 생성되는 FFA(28')(이들은 ISPR 추출제(28 및 28')로 사용되어 추출 발효에서 생성물 알코올을 제거할 수 있다)를 포함하는 방법 및 시스템의 다양한 비제한적인 실시형태를 제공한다.
도 1 내지 6을 참조하여 기재된 상술된 임의의 실시형태를 비롯한 일부 실시형태에서, 발효 용기(30) 내의 발효 브로쓰는 생합성 경로를 통하여 적어도 하나의 발효가능한 탄소원으로부터 부탄올을 생성하도록 유전적으로 변경된(즉, 유전자 조작된) 적어도 하나의 재조합 미생물(32)을 포함한다. 특히, 재조합 미생물은 적합한 탄소 기질을 함유하는 발효 브로쓰에서 성장할 수 있다. 추가의 탄소 기질은 단당류, 예컨대 프룩토스; 올리고당류, 예컨대, 락토스, 말토스 또는 수크로스; 다당류, 예컨대 전분 또는 셀룰로스; 또는 그들의 혼합물 및 재생가능한 공급원료로부터의 미정제 혼합물, 예를 들어 유청 투과액, 옥수수 침지수, 사탕무우 당밀 및 보리 맥아를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 다른 탄소 기질은 에탄올, 락테이트, 석시네이트 또는 글리세롤을 포함할 수 있다.
부가적으로 탄소 기질은 또한 1원자-탄소 기질, 예를 들어 이산화탄소, 또는 메탄올일 수 있으며, 이에 대한 주요한 생화학적 중간체로의 대사적 전환이 입증되었다. 메틸요구성 유기체(methylotrophic organism)는 또한, 대사 활성을 위하여 1원자-탄소 및 2원자-탄소 기질에 더하여 다수의 다른 탄소 함유 화합물, 예를 들어 메틸아민, 글루코사민 및 다양한 아미노산을 이용하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 메틸요구성 효모는 메틸아민 유래의 탄소를 이용하여 트레할로스 또는 글리세롤을 형성하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Bellion et, al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32, Editor(s): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK]). 마찬가지로, 다양한 종의 칸디다는 알라닌 또는 올레산을 대사작용시킬 것이다(문헌[Sulter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489, 1990]). 그러므로, 본 발명에 이용되는 탄소 공급원은 광범위한 탄소 함유 기질을 포함할 수 있으며 유기체의 선택에 의해서만 한정될 것으로 생각된다.
상술된 탄소 기질 및 그의 혼합물 모두가 적합한 것으로 고려되지만, 일부 실시형태에서, 탄소 기질은 글루코스, 프룩토스 및 수크로스, 또는 C5 당을 사용하도록 변형된 효모 세포를 위한 자일로스 및/또는 아라비노스와 같은 C5 당과의 그들의 혼합물이다. 수크로스는 재생산가능한 당 공급원, 이를 테면 사탕수수, 사탕무, 카사바(cassava), 단 수수(sweet sorghum) 및 그들의 혼합물로부터 유래될 수 있다. 글루코스 및 덱스트로스는 옥수수, 밀, 호밀, 보리, 귀리 및 그들의 혼합물과 같은 곡물을 비롯한 전분 계의 공급원료의 당화를 통하여 재생산가능한 곡물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 또한, 발효가능한 당은 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는, 미국 특허 출원 공개 제2007/0031918 A1호에 기재된 바와 같이, 전처리 및 당화 공정을 통하여 재생산가능한 셀룰로오스계 또는 리그노셀룰로오스계 바이오매스로부터 유래될 수 있다. 적절한 탄소원(수성 스트림(22)으로부터의)에 더하여, 발효 브로쓰는 적합한 미네랄, 염, 보조인자, 완충액 및 다이하이드록시산 탈수효소(DHAD)를 포함하는 효소적 경로의 증진 및 배양물의 성장에 적합한, 당업자에게 공지되어 있는 다른 성분을 함유해야 한다.
생합성 경로를 통하여 부탄올을 생성하는 재조합 미생물은 클로스트리듐(Clostridium), 자이모모나스(Zymomonas), 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 시겔라(Shigella), 로도코커스(Rhodococcus), 슈도모나스, 바실러스, 락토바실러스, 엔테로코커스(Enterococcus), 알칼리게네스, 클레브시엘라, 파에니바실러스(Paenibacillus), 아스로박터(Arthrobacter), 코리네박테리움(Corynebacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아, 피키아(Pichia), 칸디다, 한세눌라(Hansenula), 또는 사카로마이세스 속의 구성원을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서 재조합 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 및 사카로마이세스 세레비지애로 이루어진 군으부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 재조합 미생물은 사카로마이세스, 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 덱케라(Dekkera), 토룰롭시스(Torulopsis), 브레타노마이세스(Brettanomyces) 및 일부 칸디다 종으로부터 선택되는 크랩트리(crabtree)-양성 효모이다. 크랩트리-양성 효모의 종에는 사카로마이세스 세레비지애, 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 미키타에(Saccharomyces mikitae), 사카로마이세스 파라독서스(Saccharomyces paradoxus), 자이고사카로마이세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii) 및 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 미생물을 사용한 발효를 사용하는 부탄올의 생성뿐 아니라 부탄올을 생성하는 미생물이 알려져 있으며, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2009/0305370호에 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 미생물은 부탄올 생합성 경로를 포함한다. 적합한 아이소부탄올 생합성 경로는 해당 분야에 알려져 있다(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2007/0092957호 참조). 일부 실시형태에서, 경로의 기질의 생성물로의 전환을 촉매작용시키는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 폴리펩티드는 미생물 내의 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, 경로의 기질의 생성물로의 전환을 촉매작용시키는 모든 폴리펩티드는 미생물 내의 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, 미생물은 피루베이트 탈탄산효소 활성의 감소 또는 제거를 포함한다. 피루베이트 탈탄산효소 활성이 실질적으로 없는 미생물은 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2009/0305363호에 기재되어 있다.
실시예에 사용된 것을 포함하는 특정 스트레인의 구축이 본 명세서에 제공된다.
사카로마이세스 세레비지애 스트레인 BP1083("NGCI-070")의 구축
스트레인 BP1064는 CEN.PK 113-7D (CBS 8340; CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures) 진균류 생물다양성 센터, 네덜란드)로부터 유래하며, 하기의 유전자의 결실을 함유한다: URA3, HIS3, PDC1, PDC5, PDC6 및 GPD2. BP1064를 플라스미드 pYZ090(서열 번호 1, 미국 가출원 제61/246,844호에 기재) 및 pLH468(서열 번호 2)로 형질전환시켜, 스트레인 NGCI-070(BP1083, PNY1504)을 생성하였다.
전체 암호화 서열이 완전히 제거되는 결실을 형질전환체의 선택을 위한 G418 저항성 마커 또는 URA3 유전자 중 어느 하나, 및 표적 유전자의 상동성 업스트림 및 다운스트림의 영역을 함유하는 PCR 단편과의 상동성 재조합에 의해 생성하였다. loxP 부위가 플랭킹된 G418 저항성 마커를 Cre 재조합효소(recombinase)를 사용하여 제거하였다. URA3 유전자를 상동성 재조합에 의해 제거하여, 스카리스 결실(scarless deletion)을 생성하거나, LoxP 부위에 의해 플랭킹된다면, Cre 재조합 효소를 사용하여 제거하였다.
스카리스 결실 절차를 아카다(Akada) 등의 문헌(Yeast 23:399-405, 2006)으로부터 조정하였다. 일반적으로, 각각의 스카리스 결실을 위한 PCR 카세트를 오버랩핑 PCR에 의하여 4개의 단편, 즉, A-B-U-C를 조합함으로써 만들었다. 프로모터 (URA3 유전자의 250 bp 업스트림) 및 터미네이터 (URA3 유전자의 150 bp 다운스트림)와 함께 고유 CEN.PK 113-7D URA3 유전자로 이루어진 PCR 카세트는 선택가능한/반대-선택가능한 마커, URA3 (단편 U)을 함유하였다. 각각 500 bp 길이의 단편 A 및 C는 표적 유전자의 500 bp 인접 업스트림 (단편 A) 및 표적 유전자의 3' 500 bp (단편 C)에 해당한다. 단편 A 및 C를 상동성 재조합에 의한 염색체 내로의 카세트의 통합을 위하여 사용하였다. 단편 B (500 bp 길이)는 표적 유전자의 500 bp 인접 다운스트림에 해당하며, 단편 B에 해당하는 서열의 직접 반복이 염색체 내로의 카세트의 통합 시에 생성되었기 때문에, 상동성 재조합에 의한 염색체로부터의 URA3 마커 및 단편 C의 절제 (excision)를 위해 사용하였다. PCR 생성물 ABUC 카세트를 사용하여, URA3 마커를 먼저 상동성 재조합에 의하여 염색체 내로 통합시킨 다음, 염색체로부터 절제하였다. 초기의 통합에 의하여 3' 500 bp를 제외한 유전자가 결실되었다. 절제 시에, 유전자의 3' 500 bp 영역도 또한 결실되었다. 이러한 방법을 사용한 유전자의 통합을 위하여, 통합될 유전자는 단편 A 및 B 사이의 PCR 카세트에 포함시켰다.
URA3 결실
내인성 URA3 암호화 영역을 결실시키기 위하여, ura3::loxP-kanMX-loxP 카세트를 pLA54 주형 DNA (서열 번호 3)로부터 PCR 증폭시켰다. pLA54는 클루이베로마이세스 락티스 TEF1 프로모터 및 kanMX 마커를 함유하며, loxP 부위가 플랭킹되어, Cre 재조합효소를 사용한 재조합 및 마커의 제거를 가능하게 하였다. PCR을 퓨젼(Phusion)(등록 상표) DNA 중합효소(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England BioLabs Inc.)) 및 프라이머 BK505 및 BK506(서열 번호 4 및 5)을 사용하여 행하였다. 각 프라이머의 URA3 부분은 URA3 프로모터의 5' 영역 업스트림 및 암호화 영역의 3' 영역 다운스트림으로부터 유래되어, loxP-kanMX-loxP 마커의 통합이 URA3 암호화 영역의 대체를 야기하게 하였다. PCR 생성물을 표준 유전자 기법(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여 CEN.PK 113-7D 내로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서 G418(100 ㎍/㎖)을 함유하는 YPD에서 선택하였다. 형질전환체를 스크리닝하여, 프라이머 LA468 및 LA492(서열 번호 6 및 7)를 사용하는 PCR에 의하여 정확한 통합을 확인하고, CEN.PK 113-7D Δura3::kanMX로 명명하였다.
HIS3 결실
스카리스 HIS3 결실을 위한 PCR 카세트를 위한 4개의 단편을 퓨젼(등록 상표) 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(High Fidelity PCR Master Mix)(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 젠트라(Gentra)(등록 상표) 퓨어진(Puregene)(등록 상표) 이스트/백트(Yeast/Bact) 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen))로 제조된 주형으로서의 CEN.PK 113-7D 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. HIS3 단편 A를 프라이머 oBP452(서열 번호 14) 및 HIS3 단편 B의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일(tail)을 함유하는 프라이머 oBP453(서열 번호 15)으로 증폭시켰다. HIS3 단편 B를 HIS3 단편 A의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP454(서열 번호 16) 및 HIS3 단편 U의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP455(서열 번호 17)로 증폭시켰다. HIS3 단편 U를 HIS3 단편 B의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP456(서열 번호 18) 및 HIS3 단편 C의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP457(서열 번호 19)로 증폭시켰다. HIS3 단편 C를 HIS3 단편 U의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP458(서열 번호 20) 및 프라이머 oBP459(서열 번호 21)로 증폭시켰다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. HIS3 단편 AB를 HIS3 단편 A 및 HIS3 단편 B를 혼합하고, 프라이머 oBP452(서열 번호 14) 및 oBP455(서열 번호 17)를 사용하여 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 생성하였다. HIS3 단편 UC를 HIS3 단편 U 및 HIS3 단편 C를 혼합하고, 프라이머 oBP456(서열 번호 18) 및 oBP459 (서열 번호 21)를 사용하여 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 생성하였다. 생성된 PCR 생성물을 아가로스 겔에 이어서 겔 추출 키트(Gel Extraction kit)(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)에서 정제하였다. HIS3 ABUC 카세트를 HIS3 단편 AB 및 HIS3 단편 UC를 혼합하고, 프라이머 oBP452(서열 번호 14) 및 oBP459(서열 번호 21)를 사용하여 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 생성하였다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 정제하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::kanMX의 형질전환성 세포(competent cell)를 만들고, 프로즌-이지 이스트 트랜스포메이션(Frozen-EZ Yeast Transformation) II(상표명) 키트(미국 캘리포니아주 어바인 소재의 자이모 리서치 코포레이션(Zymo Research Corporation))를 사용하여 HIS3 ABUC PCR 카세트로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 30℃에서 2% 글루코스가 보충되고 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에 플레이팅하였다. his3 낙아웃이 있는 형질전환체를 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조한 게놈 DNA를 사용하여 프라이머 oBP460(서열 번호 22) 및 oBP461(서열 번호 23)을 사용한 PCR에 의해 스크리닝하였다. 정확한 형질전환체를 스트레인 CEN.PK 113-7D Δura3::kanMX Δhis3::URA3으로 선택하였다.
Δ ura3 부위로부터의 KanMX 마커 제거 및 Δ his3 부위로부터의 URA3 마커 제거
KanMX 마커는 CEN.PK 113-7D Δura3::kanMX Δhis3::URA3을 프로즌-이지 이스트 트랜스포메이션 II(상표명) 키트(미국 캘리포니아주 어바인 소재의 자이모 리서치 코포레이션)를 사용하여 pRS423::PGAL1-cre(서열 번호 66, 미국 가출원 제61/290,639호에 기재)로 형질전환시키고, 30℃에서 2% 글루코스가 보충되고 히스티딘 및 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에서 플레이팅함으로써 제거하였다. 형질전환체를 30℃에서 약 6시간 동안 1% 갈락토스가 보충된 YP에서 성장시켜, Cre 재조합효소 및 KanMX 마커 절제를 유도하고, 회복을 위하여 30℃에서 YPD(2% 글루코스) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 분리주를 YPD에서 하룻밤 성장시키고, 30℃에서 5-플루오로-오로트산(5-FOA, 0.1%)을 함유하는 합성 완전 배지 상에 플레이팅하여, URA3 마커가 소실된 분리주를 선택하였다. 5-FOA 저항성 분리주를 pRS423::PGAL1-cre 플라스미드의 제거를 위하여 YPD에서 성장시키고, 플레이팅하였다. 분리주를 YPD+G418 플레이트, 우라실이 결여된 합성 완전 배지 플레이트 및 히스티딘이 결여된 합성 완전 배지 플레이트 상에서의 성장을 분석함으로써 KanMX 마커, URA3 마커 및 pRS423::PGAL1-cre 플라스미드의 소실에 대하여 확인하였다. G418에 대하여 감수성이며, 우라실 및 히스티딘에 대한 영양요구성인 정확한 분리주를 스트레인 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3으로 선택하고, BP857로 명명하였다. 결실 및 마커 제거를 PCR, 및 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조된 게놈 DNA를 사용하여, Δura3을 위하여 프라이머 oBP450(서열 번호 24) 및 oBP451(서열 번호 25), 및 Δhis3을 위하여 프라이머 oBP460(서열 번호 22) 및 oBP461(서열 번호 23)을 사용한 시퀀싱에 의해 확인하였다.
PDC6 결실
스카리스 PDC6 결실을 위한 PCR 카세트를 위한 4개의 단편을 퓨젼(등록 상표) 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조된 주형으로서의 CEN.PK 113-7D 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. PDC6 단편 A를 프라이머 oBP440(서열 번호 26) 및 PDC6 단편 B의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP441(서열 번호 27)로 증폭시켰다. PDC6 단편 B를 PDC6 단편 A의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP442(서열 번호 28) 및 PDC6 단편 U의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP443(서열 번호 29)으로 증폭시켰다. PDC6 단편 U를 PDC6 단편 B의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP444(서열 번호 30) 및 PDC6 단편 C의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP445(서열 번호 31)로 증폭시켰다. PDC6 단편 C를 PDC6 단편 U의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP446(서열 번호 32) 및 프라이머 oBP447(서열 번호 33)로 증폭시켰다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. PDC6 단편 AB를 PDC6 단편 A 및 PDC6 단편 B를 혼합하고, 프라이머 oBP440(서열 번호 26) 및 oBP443(서열 번호 29)으로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 생성하였다. PDC6 단편 UC를 PDC6 단편 U 및 PDC6 단편 C를 혼합하고, 프라이머 oBP444(서열 번호 30) 및 oBP447(서열 번호 33)로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 생성하였다. 생성된 PCR 생성물을 아가로스 겔에 이어서 겔 추출 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)에서 정제하였다. PDC6 ABUC 카세트를 PDC6 단편 AB 및 PDC6 단편 UC를 혼합하고, 프라이머 oBP440(서열 번호 26) 및 oBP447(서열 번호 33)로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 생성하였다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 정제하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3의 형질전환성 세포를 만들고, 프로즌-이지 이스트 트랜스포메이션 II(상표명) 키트(미국 캘리포니아주 어바인 소재의 자이모 리서치 코포레이션)를 사용하여 PDC6 ABUC PCR 카세트로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 30o에서 2% 글루코스가 보충되고 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에 플레이팅하였다. pdc6 낙아웃이 있는 형질전환체를 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조한 게놈 DNA를 사용하여 프라이머 oBP448(서열 번호 34) 및 oBP449(서열 번호 35)를 사용한 PCR에 의해 스크리닝하였다. 정확한 형질전환체를 스트레인 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3으로 선택하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6::URA3을 YPD에서 하룻밤 성장시키고, 30℃에서 5-플루오로-오로트산(0.1%)을 함유하는 합성 완전 배지 상에 플레이팅하여, URA3 마커가 소실된 분리주를 선택하였다. 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조한 게놈 DNA를 사용하여 결실 및 마커 제거를 프라이머 oBP448(서열 번호 34) 및 oBP449(서열 번호 35)를 사용한 PCR 및 시퀀싱에 의해 확인하였다. 분리주로부터의 PDC6 유전자의 부재를 PDC6의 암호화 서열에 대하여 특이적인 프라이머, oBP554(서열 번호 36) 및 oBP555(서열 번호 37)를 사용한 음성 PCR 결과에 의해 증명하였다. 정확한 분리주를 스트레인 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6으로 선택하고, BP891로 명명하였다.
PDC1 결실 ilvDSm 통합
PDC1 유전자를 결실시키고, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) ATCC 번호 700610로부터의 ilvD 암호화 영역으로 대체하였다. A 단편에 이은, PDC1 결실-ilvDSm 통합을 위한 PCR 카세트를 위한 스트렙토코커스 뮤탄스로부터의 ilvD 암호화 영역을 퓨젼(등록 상표) 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조된 주형으로서의 NYLA83(본 명세서 및 미국 가출원 제61/246,709호에 기재된) 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. PDC1 단편 A-ilvDSm(서열 번호 141)을 프라이머 oBP513(서열 번호 38) 및 PDC1 단편 B의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP515(서열 번호 39)로 증폭시켰다. PDC1 결실-ilvDSm 통합을 위한 PCR 카세트를 위한 B, U 및 C 단편을 퓨젼(등록 상표) 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조된 주형으로서의 CEN.PK 113-7D 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. PDC1 단편 B를 PDC1 단편 A-ilvDSm의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP516(서열 번호 40) 및 PDC1 단편 U의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP517(서열 번호 41)로 증폭시켰다. PDC1 단편 U를 PDC1 단편 B의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP518(서열 번호 42) 및 PDC1 단편 C의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP519(서열 번호 43)로 증폭시켰다. PDC1 단편 C를 PDC1 단편 U의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP520(서열 번호 44) 및 프라이머 oBP521(서열 번호 45)로 증폭시켰다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 정제하였다. PDC1 단편 A-ilvDSm-B를 PDC1 단편 A-ilvDSm 및 PDC1 단편 B를 혼합하고, 프라이머 oBP513(서열 번호 38) 및 oBP517(서열 번호 41)로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 생성하였다. PDC1 단편 UC를 PDC1 단편 U 및 PDC1 단편 C를 혼합하고, 프라이머 oBP518(서열 번호 42) 및 oBP521(서열 번호 45)로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 생성하였다. 생성된 PCR 생성물을 아가로스 겔에 이어서 겔 추출 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)에서 정제하였다. PDC1 A-ilvDSm-BUC 카세트(서열 번호 142)를 PDC1 단편 A-ilvDSm-B 및 PDC1 단편 UC를 혼합하고, 프라이머 oBP513(서열 번호 38) 및 oBP521(서열 번호 45)로 증폭시킴으로써 오버랩핑 PCR에 의해 생성하였다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 정제하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6의 형질전환성 세포를 만들고, 프로즌-이지 이스트 트랜스포메이션 II(상표명) 키트(미국 캘리포니아주 어바인 소재의 자이모 리서치 코포레이션)를 사용하여 PDC1 A-ilvDSm-BUC PCR 카세트로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 30℃에서 2% 글루코스가 보충되고 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에 플레이팅하였다. pdc1 낙아웃 ilvDSm 통합이 있는 형질전환체를 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조한 게놈 DNA를 사용하여 프라이머 oBP511(서열 번호 46) 및 oBP512(서열 번호 47)를 사용한 PCR에 의해 스크리닝하였다. 분리주로부터의 PDC1 유전자의 부재를 PDC1의 암호화 서열에 대하여 특이적인 프라이머, oBP550(서열 번호 48) 및 oBP551(서열 번호 49)을 사용하여 음성 PCR 결과에 의해 증명하였다. 정확한 형질전환체를 스트레인 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3으로 선택하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm-URA3을 YPD에서 하룻밤 성장시키고, 30℃에서 5-플루오로-오로트산(0.1%)을 함유하는 합성 완전 배지 상에서 플레이팅시켜, URA3 마커가 소실된 분리주를 선택하였다. PDC1의 결실, ilvDSm의 통합 및 마커 제거를 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조된 게놈 DNA를 사용하여 프라이머 oBP511 (서열 번호 46) 및 oBP512(서열 번호 47)를 사용한 PCR 및 시퀀싱에 의해 확인하였다. 정확한 분리주를 스트레인 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm으로 선택하고, BP907로 명명하였다.
PDC5 결실 sadB 통합
PDC5 유전자를 결실시키고, 아크로모박터 자일로족시단스(Achromobacter xylosoxidans)로부터의 sadB 암호화 영역으로 대체하였다. 먼저, PDC5 결실-sadB 통합을 위한 PCR 카세트의 세그먼트를 플라스미드 pUC19-URA3MCS 내로 클로닝하였다.
pUC19-URA3MCS는 pUC19 기반의 것이며, 다중 클로닝 부위 (MCS) 내에 위치한 사카로마이세스 세레비지애로부터의 URA3 유전자의 서열을 함유한다. pUC19는 에스케리키아 콜라이에서의 복제 및 선택을 위한 베타-락타마제를 암호화하는 유전자 및 pMB1 레플리콘을 함유한다. URA3에 대한 암호화 서열에 더하여, 이러한 유전자의 업스트림 및 다운스트림으로부터의 서열을 효모에서의 URA3 유전자의 발현을 위해 포함시켰다. 벡터는 클로닝 목적을 위해 사용될 수 있으며, 효모 통합 벡터로서 사용될 수 있다.
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK 113-7D 게놈 DNA로부터의 URA3 암호화 영역의 250 bp 업스트림 및 150 bp 다운스트림과 함께 URA3 암호화 영역을 포함하는 DNA를 퓨젼(등록 상표) 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드)를 사용하여 BamHI, AscI, PmeI 및 FseI 제한 부위를 함유하는 프라이머 oBP438(서열 번호 12) 및 XbaI, PacI 및 NotI 제한 부위를 함유하는 oBP439(서열 번호 13)로 증폭시켰다. 게놈 DNA를 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 제조하였다. PCR 생성물 및 pUC19(서열 번호 143)를 BamHI 및 XbaI으로의 분해 후에 T4 DNA 리가제(ligase)로 라이게이션시켜, 벡터 pUC19-URA3MCS를 생성하였다. 벡터를 프라이머 oBP264(서열 번호 10) 및 oBP265(서열 번호 11)를 사용한 PCR 및 시퀀싱에 의해 확인하였다.
sadB 및 PDC5 단편 B의 암호화 서열을 pUC19-URA3MCS 내로 클로닝하여, PDC5 A-sadB-BUC PCR 카세트의 sadB-BU 부분을 생성하였다. sadB의 암호화 서열을 주형으로서 pLH468-sadB(서열 번호 67)를 사용하여, AscI 제한 부위를 함유하는 프라이머 oBP530(서열 번호 50) 및 PDC5 단편 B의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP531(서열 번호 51)로 증폭시켰다. PDC5 단편 B를 sadB의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP532(서열 번호 52) 및 PmeI 제한 부위를 함유하는 프라이머 oBP533(서열 번호 53)으로 증폭시켰다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 정제하였다. sadB-PDC5 단편 B를 sadB 및 PDC5 단편 B PCR 생성물을 혼합하고, 프라이머 oBP530(서열 번호 50) 및 oBP533(서열 번호 53)으로 증폭시킴으로써 중첩 PCR에 의해 생성하였다. 생성된 PCR 생성물을 AscI 및 PmeI으로 분해하고, T4 DNA 리가제를 사용하여 적절한 효소로의 분해 후에 pUC19-URA3MCS의 상응하는 부위 내로 라이게이션시켰다. 생성된 플라스미드를 프라이머 oBP536(서열 번호 54) 및 PDC5 단편 C의 5' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 oBP546(서열 번호 55)을 사용하는 sadB-단편 B-단편 U의 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. PDC5 단편 C를 PDC5 sadB-단편 B-단편 U의 3' 말단에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP547(서열 번호 56) 및 프라이머 oBP539(서열 번호 57)로 증폭시켰다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. PDC5 sadB-단편 B-단편 U-단편 C를 PDC5 sadB-단편 B-단편 U 및 PDC5 단편 C를 혼합하고, 프라이머 oBP536(서열 번호 54) 및 oBP539(서열 번호 57)로 증폭시킴으로써 생성하였다. 생성된 PCR 생성물을 아가로스 겔에 이어서 겔 추출 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)에서 정제하였다. PDC5 A-sadB-BUC 카세트(서열 번호 144)를 고유 PDC5 암호화 서열의 인접 50개 뉴클레오티드 업스트림에 대하여 상동성을 갖는 5' 테일을 함유하는 프라이머 oBP542(서열 번호 58) 및 oBP539(서열 번호 57)로 PDC5 sadB-단편 B-단편 U-단편 C를 증폭시킴으로써 생성하였다. PCR 생성물을 PCR 정제 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 정제하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm의 형질전환성 세포를 만들고, 프로즌-이지 이스트 트랜스포메이션 II(상표명) 키트(미국 캘리포니아주 어바인 소재의 자이모 리서치 코포레이션)를 사용하여 PDC5 A-sadB-BUC PCR 카세트로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 30℃에서 1% 에탄올을 보충하고(글루코스 없음) 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에 플레이팅하였다. pdc5 낙아웃 sadB 통합이 있는 형질전환체를 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조한 게놈 DNA를 사용하여 프라이머 oBP540(서열 번호 59) 및 oBP541(서열 번호 60)로의 PCR에 의해 스크리닝하였다. 분리주로부터의 PDC5 유전자의 부재를 PDC5의 암호화 서열에 대하여 특이적인 프라이머, oBP552(서열 번호 61) 및 oBP553(서열 번호 62)을 사용하여 음성 PCR 결과에 의해 증명하였다. 정확한 형질전환체를 스트레인 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB-URA3으로 선택하였다.
CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB-URA3을 YPE(1% 에탄올)에서 하룻밤 성장시키고, 에탄올을 보충하고(글루코스 없음) 5-플루오로-오로트산 (0.1%)을 함유하는 합성 완전 배지에서 30℃에서 플레이팅하여, URA3 마커가 소실된 분리주를 선택하였다. PDC5의 결실, sadB의 통합 및 마커 제거를 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 이스트/백트 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)로 제조된 게놈 DNA를 사용하여 프라이머 oBP540(서열 번호 59) 및 oBP541(서열 번호 60)을 사용한 PCR에 의해 확인하였다. 정확한 분리주를 스트레인 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB로 선택하고, BP913으로 명명하였다.
GPD2 결실
내인성 GPD2 암호화 영역을 결실시키기 위하여, gpd2::loxP-URA3-loxP 카세트(서열 번호 145)를 주형 DNA로서 loxP-URA3-loxP(서열 번호 68)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. loxP-URA3-loxP는 loxP 재조합효소 부위가 플랭킹된 (ATCC 번호77107)로부터의 URA3 마커를 함유한다. PCR을 퓨젼(등록 상표) DNA 중합효소(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 프라이머 LA512 및 LA513(서열 번호 8 및 9)을 사용하여 행하였다. 각 프라이머의 GPD2 부분은 GPD2 암호화 영역의 5' 영역 업스트림 및 암호화 영역의 3' 영역 다운스트림으로부터 유래되어, loxP-URA3-loxP 마커의 통합이 GPD2 암호화 영역의 대체를 야기하게 하였다. PCR 생성물을 BP913 내로 형질전환시키고, 형질전환체를 1% 에탄올이 보충되고 (글루코스 없음) 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에서 선택하였다. 형질전환체를 스크리닝하여, 프라이머 oBP582 및 AA270 (서열 번호 63 및 64)을 사용하여 PCR에 의해 정확한 통합을 확인하였다.
URA3 마커를 pRS423::PGAL1-cre(서열 번호 66)로의 형질전환 및 30℃에서의 1% 에탄올이 보충되고 히스티딘이 결여된 합성 완전 배지 상에서의 플레이팅에 의하여 다시 이용하였다. 형질전환체를 1% 에탄올이 보충되고, 5-플루오로-오로트산(0.1%)을 함유하는 합성 완전 배지 상에 스트리킹하고, 30℃에서 인큐베이션시켜, URA3 마커가 소실된 분리주를 선택하였다. 5-FOA 저항성 분리주를 pRS423::PGAL1-cre 플라스미드의 제거를 위하여 YPE(1% 에탄올)에서 성장시켰다. 결실 및 마커 제거를 프라이머 oBP582(서열 번호 63) 및 oBP591(서열 번호 65)를 사용한 PCR에 의해 확인하였다. 정확한 분리주를 스트레인 CEN.PK 113-7D Δura3::loxP Δhis3 Δpdc6 Δpdc1::ilvDSm Δpdc5::sadB Δgpd2::loxP로 선택하고, PNY1503(BP1064)으로 명명하였다.
BP1064를 플라스미드 pYZ090(서열 번호 1) 및 pLH468(서열 번호 2)로 형질전환시켜, 스트레인 NGCI-070(BP1083; PNY1504)을 생성하였다.
스트레인 NYLA74, NYLA83 및 NYLA84의 구축
사카로마이세스 세레비지애의 내인성 PDC1 및 PDC6 유전자의 삽입-불활성화. 피루베이트 탈탄산효소의 3가지 주요 동질효소를 암호화하는 PDC1, PDC5 및 PDC6 유전자는 하기에 기재된다:
pRS425::GPM-sadB의 구축
아크로모박터 자일로족시단스로부터의 부탄올 탈수소효소를 암호화하는 DNA 단편(서열 번호 70)(미국 특허 출원 공개 제2009/0269823호 개시)을 클로닝하였다. 2차 알코올 탈수소효소에 대한 sadB로 지칭되는 이러한 유전자의 암호화 영역(서열 번호 69)을 각각 정방향 및 역방향 프라이머 N473 및 N469(서열 번호 74 및 75)를 사용하여, 그램 음성 유기체에 대하여 권고된 프로토콜에 따라 젠트라(등록 상표) 퓨어진(등록 상표) 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 제조된 아크로모 자일로족시단스 게놈 DNA로부터 표준 조건을 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물은 pCR(등록 상표)4 블런트(BLUNT)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(상표명))로 클로닝되어 pCR4Blunt::sadB를 생성하는 TOPO(등록 상표)-블런트였으며, 이를 에스케리키아 콜라이 Mach-1 세포로 형질전환시켰다. 이어서, 플라스미드를 4개의 클론으로부터 분리하였고, 서열을 입증하였다.
sadB 암호화 영역을 pCR4Blunt::sadB로부터 PCR 증폭시켰다. PCR 프라이머는 효모 GPM1 프로모터와 중첩될 추가의 5' 서열 및 ADH1 터미네이터를 함유한다(서열 번호 76 및 77로 제공되는 N583 및 N584). 이어서, PCR 생성물을 다음과 같이 사카로마이세스 세레비지애(문헌[Ma, et al., Gene 58:201-216, 1987])에서 "갭 수선" 방법을 사용하여 클로닝하였다. GPM1 프로모터(서열 번호 72), 락토코커스 락티스로부터의 kivD 암호화 영역(서열 번호 71) 및 ADH1 터미네이터(서열 번호 73)(미국 특허 출원 공개 제2007/0092957 A1호, 실시예 17에 기재)를 함유하는 효모 에스케리키아 콜라이 셔틀 벡터 pRS425::GPM::kivD::ADH를 BbvCI 및 PacI 제한 효소로 분해하여, kivD 암호화 영역을 유리시켰다. 대략 1 ㎍의 남아있는 벡터 단편을 1 ㎍의 sadB PCR 생성물과 함께, 사카로마이세스 세레비지애 스트레인 BY4741로 형질전환시켰다. 형질전환체를 류신이 결여된 합성 완전 배지에서 선택하였다. pRS425::GPM-sadB를 생성하는 적합한 재조합 사건을 프라이머 N142 및 N459(서열 번호 108 및 109)를 사용하는 PCR로 확인하였다.
pdc6:: PGPM1-sadB 통합 카세트의 구축 및 PDC6 결실:
pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t-URA3r 통합 카세트를 pRS425::GPM-sadB(서열 번호 78)로부터의 GPM-sadB-ADHt 세그먼트(서열 번호 79)를 pUC19-URA3r로부터의 URA3r 유전자에 연결시킴으로써 만들었다. pUC19-URA3r(서열 번호 80)은 75 bp 상동성 반복 서열이 플랭킹된 pRS426(ATCC 번호 77107)으로부터의 URA3 마커를 함유하여, 생체 내의 상동성 재조합 및 URA3 마커의 제거를 가능하게 하였다. 퓨전(등록 상표) DNA 중합효소(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 프라이머 114117-11A 내지 114117-11D(서열 번호 81, 82, 83 및 84), 및 114117-13A 및 114117-13B(서열 번호 85 및 86)와 함께, 주형으로서 pRS425::GPM-sadB 및 pUC19-URA3r 플라스미드 DNA를 사용하여 SOE PCR(문헌[Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989]에 기재)에 의해 연결하였다.
SOE PCR(114117-13A 및 114117-13B)을 위한 외측 프라이머에는 제각기 PDC6 프로모터 및 터미네이터의 업스트림 및 다운스트림 영역에 상동성인 5' 및 3'의 대략 50bp 영역이 들어 있었다. 완성한 카세트 PCR 단편을 BY4700(ATCC 번호 200866)으로 형질전환시키고, 형질전환체를 표준 유전자 기법을 사용하여, 30℃에서 우라실이 결여되고 2% 글루코스가 보충된 합성 완전 배지에서 유지시켰다(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202]). 형질전환체를 프라이머 112590-34G 및 112590-34H(서열 번호 87 및 88), 및 112590-34F 및 112590-49E(서열 번호 89 및 90)를 사용하여 PCR에 의해 스크리닝하여, PDC6 암호화 영역의 결실과 함께 PDC6 로커스에서의 통합을 입증하였다. URA3r 마커는 표준 프로토콜에 따라 30℃에서 2% 글루코스 및 5-FOA가 보충된 합성 완전 배지 상에 플레이팅함으로써 재활용하였다. 5-FOA 플레이트로부터 SD-URA 배지 상으로 콜로니를 패칭함으로써 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. 생성한 동정된 스트레인은 다음의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t.
pdc1 :: PPDC1 - ilvD 통합 카세트의 구축 및 PDC1 결실:
pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t-URA3r 통합 카세트를 퓨전(등록 상표) DNA 중합효소(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 프라이머 114117-27A 내지 114117-27D(서열 번호 111, 112, 113 및 114)와 함께, 주형으로서 pLH468 및 pUC19-URA3r 플라스미드 DNA를 사용하는 SOE PCR(문헌[Horton, et al., Gene 77:61-68, 1989]에 기재)에 의해 pLH468(서열 번호 2)로부터의 ilvD-FBA1t 세그먼트(서열 번호 91)를 pUC19-URA3r로부터의 URA3r 유전자에 연결함으로써 만들었다.
SOE PCR(114117-27A 및 114117-27D)을 위한 외측 프라이머에는 PDC1 프로모터의 다운스트림 영역 및 PDC1 암호화 서열의 다운스트림 영역에 상동성인 5' 및 3'의 대략 50bp 영역이 들어 있었다. 완성한 카세트 PCR 단편을 BY4700 pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t로 형질전환시키고, 형질전환체를 표준 유전 기법을 사용하여, 30℃에서 우라실이 결여되고 2% 글루코오스가 보충된 합성 완전 배지 중에 유지시켰다(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202]). 형질전환체를 프라이머 114117-36D 및 135(서열 번호 92 및 93), 및 프라이머 112590-49E 및 112590-30F(서열 번호 90 및 94)를 사용하는 PCR에 의해 스크리닝하여, PCD1 암호화 서열의 결실과 함께 PDC1 로커스에서의 통합을 확인하였다. URA3r 마커는 표준 프로토콜에 따라 30℃에서 2% 글루코스 및 5-FOA가 보충된 합성 완전 배지 상에 플레이팅함으로써 재활용하였다. 5-FOA 플레이트로부터 SD-URA 배지 상으로 콜로니를 패칭함으로써 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. 생성한 동정된 스트레인 "NYLA67"은 다음의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADH1t pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t.
HIS3 결실
내인성 HIS3 암호화 영역을 결실시키기 위하여, his3::URA3r2 카세트를 URA3r2 주형 DNA(서열 번호 95)로부터 PCR 증폭시켰다. URA3r2는 500 bp 상동성 반복 서열이 플랭킹된 pRS426(ATCC 번호 77107)으로부터의 URA3 마커를 함유하여, 생체 내 상동성 재조합 및 URA3 마커의 제거를 가능하게 한다. PCR은 퓨전(등록 상표) DNA 중합효소(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 프라이머 114117-45A 및 114117-45B(서열 번호 96 및 97)를 사용하여 행하여 약 2.3 kb의 PCR 생성물을 생성하였다. HIS3 프로모터의 5' 업스트림 영역, 및 암호화 영역의 3' 다운스트림 영역으로부터 각각의 프라이머의 HIS3 부분을 유도하여, URA3r2 마커의 통합으로 인해 HIS3 암호화 영역이 대체되도록 하였다. PCR 생성물은 표준 유전 기법을 사용해 NYLA67 내로 형질전환시켰고(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202]), 30℃에서 2% 글루코스가 보충되고 우라실이 결여된 합성 완전 배지 상에서 형질전환체를 선택하였다. 30℃에서 2% 글루코스가 보충되고 히스티딘이 결여된 합성 완전 배지 상에서 형질전환체를 복사(replica) 플레이팅함으로써 형질전환체를 스크리닝하여, 정확한 통합을 확인하였다. 표준 프로토콜에 따라 30℃에서 2% 글루코스 및 5-FOA가 보충된 합성 완전 배지 상에서 플레이팅함으로써 URA3r 마커를 재활용하였다. 5-FOA 플레이트로부터 SD-URA 배지 상으로 콜로니를 패칭함으로써 성장의 부재를 입증하여 마커 제거를 확인하였다. NYLA73으로 지칭되는 생성한 동정된 스트레인은 다음의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADH1t pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3.
pdc5 :: kanMX 통합 카세트의 구축 및 PDC5 결실:
pdc5::kanMX4 카세트를 퓨전(등록 상표) DNA 중합효소(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 프라이머 PDC5::KanMXF 및 PDC5::KanMXR(서열 번호 98 및 99)을 사용하여 스트레인 YLR134W 염색체 DNA(ATCC 번호 4034091)로부터 PCR 증폭시켜, 약 2.2 kb PCR 생성물을 생성하였다. PDC5 프로모터의 5' 업스트림 영역, 및 암호화 영역의 3' 다운스트림 영역으로부터 각각의 프라이머의 PDC5 부분을 유도하여, kanMX4 마커의 통합으로 인해 PDC5 암호화 영역이 대체되도록 하였다. PCR 생성물을 표준 유전 기법(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여 NYLA73으로 형질전환시켜, 형질전환체를 30℃에서 1% 에탄올 및 게네티신(200 ㎍/㎖)이 보충된 YP 배지에서 선택하였다. 형질전환체를 PCR로 스크리닝하여, 프라이머 PDC5kofor 및 N175(서열 번호 100 및 101)를 사용하여 PDC5 암호화 영역의 대체가 있는 PDC 로커스에서의 정확한 통합을 확인하였다. 동정된 정확한 형질전환체는 다음의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADH1t pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 pdc5::kanMX4. 스트레인을 NYLA74로 명명하였다.
플라스미드 벡터 pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA 및 pRS426::FBA-budC+GPM-sadB를 NYLA74로 형질전환시켜, 부탄다이올 생성 스트레인(NGCI-047)을 생성하였다.
플라스미드 벡터 pLH475-Z4B8(서열 번호140) 및 pLH468을 NYLA74로 형질전환시켜, 아이소부탄올 생성 스트레인(NGCI-049)을 생성하였다.
HXK2(헥소키나제 II)의 결실:
hxk2::URA3r 카세트를 퓨전(등록 상표) DNA 중합효소(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 및 프라이머 384 및 385(서열 번호 102 및 103)를 사용하여 URA3r2 주형(상술된)으로부터 PCR 증폭시켜, 약 2.3 kb PCR 생성물을 생성하였다. HXK2 프로모터의 5' 영역 업스트림, 및 암호화 영역의 3' 영역 다운스트림으로부터 각각의 프라이머의 HXK2 부분을 유도하여, URA3r2 마커의 통합으로 인해 HXK2 암호화 영역이 대체되도록 하였다. PCR 생성물을 표준 유전 기법(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202])을 사용하여 NYLA73으로 형질전환시키고, 형질전환체를 30℃에서 2% 글루코스가 보충되고 우라실이 결여된 합성 완전 배지에서 선택하였다. 형질전환체를 프라이머 N869 및 N871(서열 번호 104 및 105)을 사용하여 PCR에 의해 스크리닝하여, HXK2 암호화 영역의 대체가 있는 HXK2 로커스에서의 정확한 통합을 확인하였다. URA3r2 마커는 표준 프로토콜에 따라 30℃에서 2% 글루코스 및 5-FOA가 보충된 합성 완전 배지 상에 플레이팅함으로써 재활용하였다. 5-FOA 플레이트로부터 SD-URA 배지 상으로 콜로니를 패치시켜 성장의 부재를 확인하고, 프라이머 N946 및 N947(서열 번호 106 및 107)을 사용하는 PCR에 의해 정확한 마커 제거를 입증함으로써 마커 제거를 확인하였다. NYLA83으로 지칭되는 생성한 동정된 스트레인은 다음의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADH1t pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2.
pdc5::kanMX 통합 카세트의 구축 및 PDC5 결실:
pdc5::kanMX4 카세트를 상술된 바와 같이 PCR 증폭시켰다. PCR 단편을 NYLA83으로 형질전환시키고, 형질전환체를 상술된 바와 같이 선택하고 스크리닝하였다. NYLA84로 명명되는 동정된 정확한 형질전환체는 다음의 유전형을 갖는다: BY4700 pdc6:: PGPM1-sadB-ADH1t pdc1:: PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2 pdc5::kanMX4.
플라스미드 벡터 pLH468 및 pLH532를 표준 유전 기법(문헌[Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY])을 사용하여 스트레인 NYLA84(BY4700 pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t Δhis3 Δhxk2 pdc5::kanMX4)로 동시에 형질전환시키고, 생성된 "부타놀로겐 NYLA84"를 30℃에서 1% 에탄올이 보충되고 히스티딘 및 우라실이 결여된 완전 합성 배지에서 유지시켰다.
발현 벡터 pLH468
pLH468 플라스미드(서열 번호 2)를 효모에서의 DHAD, KivD 및 HADH의 발현을 위해 구축하고, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2009/0305363호에 기재되어 있다. pLH486은 DHAD의 발현을 위한, 사카로마이세스 세레비지애 FBA1 프로모터(뉴클레오티드 2109 - 3105) 및 이에 이은 FBA1 터미네이터(뉴클레오티드 4858 - 5857)로부터 발현되는 스트렙토코커스 뮤탄스로부터의 ilvD 유전자(뉴클레오티드 위치 3313-4849)의 암호화 영역을 갖는 키메라 유전자; ADH의 발현을 위한, 사카로마이세스 세레비지애 GPM1 프로모터(뉴클레오티드 7425-8181) 및 이에 이은 ADH1 터미네이터(뉴클레오티드 5962-6277)로부터 발현되는 코돈 최적화된 말 간 알코올 탈수소효소(뉴클레오티드 6286-7413)의 암호화 영역을 갖는 키메라 유전자; 및 KivD의 발현을 위한, TDH3 프로모터(뉴클레오티드 10896-11918)에 이은 TDH3 터미네이터(뉴클레오티드 8237-9235)로부터 발현되는 락토코커스 락티스로부터의 코돈-최적화된 kivD 유전자(뉴클레오티드 9249-10895)의 암호화 영역을 갖는 키메라 유전자를 함유하도록 작제하였다.
락토코커스 락티스 케토아이소발레레이트 탈탄산효소(KivD) 및 말 간 알코올 탈수소효소(HADH)에 대한 암호화 영역을 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위해 최적화되고(각각 서열 번호 71 및 118), 플라스미드 pKivDy-DNA2.0 및 pHadhy-DNA2.0에 제공되는 코돈에 기초하여 DNA2.0, 인코포레이티드(DNA2.0, Inc.)(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 합성하였다. 암호화된 단백질은 각각 서열 번호 117 및 119이다. KivD 및 HADH에 대한 개개의 발현 벡터를 구축하였다. pLH467(pRS426::PTDH3-kivDy-TDH3t)을 조립하기 위하여, 벡터 pNY8(서열 번호 121; pRS426.GPD-ald-GPDt로도 명명됨, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2008/0182308호, 실시예 17에 기재)을 AscI 및 SfiI 효소로 분해하여, GPD 프로모터 및 ald 암호화 영역을 절제하였다. pNY8로부터의 TDH3 프로모터 단편(서열 번호 122)을 5' 프라이머 OT1068 및 3' 프라이머 OT1067(서열 번호 123 및 124)을 사용하여 PCR 증폭시켜, 5' 말단에 AscI 부위 및 3' 말단에 SpeI 부위를 부가하였다. AscI/SfiI로 분해된 pNY8 벡터 단편을 AscI 및 SpeI로 분해된 TDH3 프로모터 PCR 생성물 및 벡터 pKivD-DNA2.0으로부터 분리한 코돈 최적화된 kivD 암호화 영역을 함유하는 SpeI-SfiI 단편과 라이게이션시켰다. 3중의 라이게이션에 의해, 벡터 pLH467(pRS426::PTDH3-kivDy-TDH3t)을 생성하였다. pLH467을 제한효소 맵핑 및 시퀀싱에 의해 확인하였다.
pLH435(pRS425::PGPM1-Hadhy-ADH1t)는 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 가출원 제61/058,970호, 실시예 3에 기재된 벡터 pRS425::GPM-sadB(서열 번호 78)로부터 유래된다. pRS425::GPM-sadB는 GPM1 프로모터(서열 번호 72), 아크로모박터 자일로족시단스의 부탄올 탈수소효소로부터의 암호화 영역(sadB; DNA 서열 번호 69; 단백질 서열 번호 70: 미국 특허 출원 공개 제2009/0269823호에 개시) 및 ADH1 터미네이터(서열 번호 73)를 함유하는 키메라 유전자가 있는 pRS425 벡터이다. pRS425::GPMp-sadB는 각각 sadB 암호화 영역의 5' 및 3' 말단에 BbvI 및 PacI 부위를 함유한다. NheI 부위를 프라이머 OT1074 및 OT1075(서열 번호 126 및 127)를 사용한 위치-지정 돌연변이생성에 의해 sadB 암호화 영역의 5' 말단에 부가하여, 벡터 pRS425-GPMp-sadB-NheI을 생성하였으며, 이를 시퀀싱에 의해 확인하였다. pRS425::PGPM1-sadB-NheI을 NheI 및 PacI으로 분해하여, sadB 암호화 영역을 이탈시키고, 벡터 pHadhy-DNA2.0으로부터의 코돈 최적화된 HADH 암호화 영역을 함유하는 NheI-PacI 단편과 라이게이션시켜, pLH435를 생성하였다.
단일 벡터에서 KivD 및 HADH 발현 카세트를 합하기 위하여, 효모 벡터 pRS411(ATCC 번호 87474)을 SacI 및 NotI으로 분해하고, 삼중 라이게이션 반응에서 PGPM1-Hadhy-ADH1t 카세트를 함유하는 pLH435로부터의 SalI-NotI 단편과 함께 PTDH3-kivDy-TDH3t 카세트를 함유하는 pLH467로부터의 SacI-SalI 단편과 라이게이션시켰다. 이에 의해, 벡터 pRS411::PTDH3-kivDy-PGPM1-Hadhy(pLH441)를 제공하였으며, 이를 제한효소 맵핑에 의해 확인하였다.
저급 아이소부탄올 경로에서 모든 세 유전자, ilvD, kivDy 및 Hadhy를 위한 공동-발현 벡터를 생성하기 위하여, IlvD 유전자의 공급원으로서 미국 특허 출원 공개 제2010/0081154호에 기재된 pRS423 FBA ilvD(Strep)(서열 번호 128)를 사용하였다 이 셔틀 벡터에는 에스케리키아 콜라이에서의 유지를 위한 F1 복제 원점(뉴클레오티드 1423 내지 1879)이, 그리고 효모에서의 복제를 위한 2 미크론 원점(뉴클레오티드 8082 내지 9426)이 함유되어 있다. 벡터는 FBA1 프로모터(뉴클레오티드 2111 내지 3108; 서열 번호 120) 및 FBA 터미네이터(뉴클레오티드 4861 내지 5860; 서열 번호 129)를 갖는다. 또한, 이는 효모에서의 선택을 위한 His 마커(뉴클레오티드 504 내지 1163), 및 에스케리키아 콜라이에서의 선택을 위한 앰피실린 내성 마커(뉴클레오티드 7092 내지 7949)를 갖고 있다. 스트렙토코커스 뮤탄스 UA159(ATCC 번호 700610)로부터의 ilvD 암호화 영역(뉴클레오티드 3116 내지 4828; 서열 번호 115; 단백질 서열 번호 116)은 FBA 프로모터와 FBA 터미네이터 사이에 존재하여, 발현을 위한 키메라 유전자를 형성한다. 추가로, ilvD 암호화 영역(뉴클레오티드 4829-4849)에 융합된 루미오 태그가 존재한다.
제1 단계는 pRS423 FBA ilvD(Strep) (pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(스트렙토코커스 뮤탄스)-루미오라고도 함)를 SacI 및 SacII(T4 DNA 중합효소를 사용해 SacII 부위가 블런트 말단화된 것)와 함께 선형화해서, 총 길이가 9,482 bp인 벡터를 제공하는 것이었다. 제2 단계는 SacI 및 KpnI (T4 DNA 중합효소를 사용해 KpnI 부위가 블런트 말단화된 것)를 이용해 pLH441로부터 kivDy-hADHy 카세트를 분리하여, 6,063 bp 단편을 제공하는 것이었다. 이 단편을 pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(스트렙토코터스 뮤탄스)-루미오로부터의 9,482 bp 벡터 단편과 라이게이션시켰다. 이에 의해, 벡터 pLH468 (pRS423::PFBA1-ilvD(Strep) 루미오-FBA1t-PTDH3-kivDy-TDH3t-PGPM1-hadhy-ADH1t)를 생성하였으며, 이를 제한효소 맵핑 및 시퀀싱에 의해 확인하였다.
pLH532 구축
pLH532 플라스미드(서열 번호 130)를 효모에서의 ALS 및 KARI의 발현을 위해 구축하였다. pLH532는 하기의 키메라 유전자를 함유하는 pHR81 벡터(ATCC 번호 87541)이다: 1) CUP1 프로모터(서열 번호 139), 바실러스 서브틸리스로부터의 아세토락테이트 합성효소 암호화 영역(AlsS; 서열 번호 137; 단백질 서열 번호 138) 및 CYC1 터미네이터2(서열 번호 133); 2) ILV5 프로모터(서열 번호 134), Pf5.IlvC 암호화 영역(서열 번호 132) 및 ILV5 터미네이터(서열 번호 135); 및 3) FBA1 프로모터(서열 번호 136), 사카로마이세스 세레비지애 KARI 암호화 영역(ILV5; 서열 번호 131); 및 CYC1 터미네이터.
Pf5.IlvC 암호화 영역은 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2009/0163376호에 기재된 슈도모나스 플루오레슨스로부터 유래된 KARI를 암호화하는 서열이다.
Pf5.IlvC 암호화 영역은 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위해 최적화된 코돈에 기초하여, DNA2.0, 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재; 서열 번호 132)에 의해 합성하였다.
pYZ090 구축
pYZ090(서열 번호 1)은 pHR81(ATCC 번호 87541) 백본을 기반으로 하며, ALS의 발현을 위한, 효모 CUP1 프로모터(뉴클레오티드 2-449) 및 이에 이은 CYC1 터미네이터 (뉴클레오티드 2181-2430)로부터 발현되는 바실러스 서브틸리스로부터의 alsS 유전자(뉴클레오티드 위치 457-2172)의 암호화 영역을 갖는 키메라 유전자, 및 KARI의 발현을 위한, 효모 ILV5 프로모터(2433-3626) 및 이에 이은 ILV5 터미네이터(뉴클레오티드 4682-5304)로부터 발현되는 락토코커스 락티스로부터의 ilvC 유전자(뉴클레오티드 3634-4656)의 암호화 영역을 갖는 키메라 유전자를 함유하도록 구축하였다.
pYZ067 구축
pYZ067을 하기의 키메라 유전자를 함유하도록 구축하였다: 1) 다이하이드록시산 탈수효소(DHAD)의 발현을 위한, 효모 FBA1 프로모터(뉴클레오티드 1161-2250)에 이은 FBA 터미네이터(뉴클레오티드 4005-4317)로부터 발현되는 스트렙토코커스 뮤탄스 UA159(뉴클레오티드 위치 2260-3971)로부터의 ilvD 유전자의 암호화 영역, 2) 알코올 탈수소효소의 발현을 위한, 효모 GPM 프로모터(뉴클레오티드 5819-6575)에 이은 ADH1 터미네이터(뉴클레오티드 4356-4671)로부터 발현되는 말 간 ADH(뉴클레오티드 4680-5807)에 대한 암호화 영역, 및 3) 케토아이소발레레이트 탈탄산효소의 발현을 위한, 효모 TDH3 프로모터(뉴클레오티드 8830-9493)에 이은 TDH3 터미네이터(뉴클레오티드 5682-7161)로부터 발현되는 락토코커스 락티스(뉴클레오티드 7175-8821)로부터의 KivD 유전자의 암호화 영역.
pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA 및 pRS426::FBA-budC+GPM-sadB 및 pLH475-Z4B8 구축
pRS423::CUP1-alsS+FBA-budA 및 pRS426::FBA-budC+GPM-sadB 및 pLH475-Z4B8의 구축은 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2009/0305363호에 기재되어 있다.
추가로, 본 발명의 다양한 실시형태가 상술되어 있지만, 이들이 오직 예시의 방식으로 제시되며, 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 다양한 형태 및 상세 사항의 변화가 본 발명의 목적 및 범주로부터 벗어남 없이 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 폭 및 범주는 상술된 예시적인 실시형태 중 임의의 것에 의해 제한되어서는 안되며, 특허청구범위 및 그들의 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
본 상세한 설명에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원서는 본 발명이 속한 당업자의 기술 수준을 나타내며, 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원서가 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타나는 것처럼 동일한 범주로 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예
하기의 비제한적인 실시예는 본 발명을 추가로 예시할 것이다. 하기의 실시예가 공급원료로서의 옥수수 및 카르복실산으로서의 COFA를 포함하지만, 본 발명으로부터 벗어남 없이 다른 바이오매스 공급원이 공급원료로 사용될 수 있으며, COFA 이외의 산이 카르복실산으로 소용될 수 있음이 이해되어야 한다. 더욱이, 하기의 실시예는 부탄올 및 부틸 에스테르 생성을 포함하며, 에탄올을 비롯한 다른 알코올 및 알코올 에스테르가 본 발명으로부터 벗어남 없이 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 약어의 의미는 하기와 같다: "g"는 그램을 의미하고, "㎏"은 킬로그램을 의미하며, "ℓ"는 리터를 의미하고, "㎖"은 밀리리터를 의미하며, "㎕"는 마이크로리터를 의미하고, "㎖/ℓ"은 리터당 밀리리터를 의미하며, "㎖/분"은 분당 밀리리터를 의미하고, "DI"는 탈이온화를 의미하며, "㎛"는 마이크로미터를 의미하고, "nm"은 나노미터를 의미하며, "w/v"는 중량/부피를 의미하고, "OD"는 광학 밀도를 의미하며, "OD600"은 600 nM의 파장에서의 광학 밀도를 의미하고, "dcw"는 건조 세포 중량을 의미하며, "rpm"은 분당 회전수를 의미하고, "℃"는 섭씨 온도를 의미하며, "℃/분"은 분당 섭씨 온도를 의미하고, "slpm"은 분당 표준 리터를 의미하며, "ppm"은 백만분율을 의미하고, "pdc"는 피루베이트 탈탄산효소에 이은 효소 번호를 의미한다.
일반 방법
씨드(seed) 플라스크 성장
pdc1이 결실되고, pdc5가 결실되고, pdc6이 결실된 탄수화물 공급원으로부터 아이소부탄올을 생성하도록 조작된 사카로마이세스 세레비지애 스트레인을 동결된 배양물로부터 씨드 플라스크에서 0.55,-1.1 g/ℓ dcw(OD600 1.3-2.6 - 미국 매사추세츠주 월섬 소재의 써모 헬리오스 알파 써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드(Thermo Helios α Thermo Fisher Scientific Inc.))로 성장시켰다. 배양물을 300 rpm에서 회전하는 인큐베이터에서 26℃에서 성장시켰다. 동결된 배양물을 사전에 - 80℃에서 보관하였다. 제1 씨드 플라스크 배지의 조성은 다음과 같다:
3.0 g/ℓ의 덱스트로스
3.0 g/ℓ의 에탄올, 무수
3.7 g/ℓ의 포미디엄(ForMedium)(상표명) 완전 합성 아미노산(카이저(Kaiser)) 드롭-아웃(Drop-Out): HIS 없음, URA 없음(참조 번호 DSCK162CK)
6.7 g/ℓ의 아미노산이 없는 디프코(Difco) 이스트 니트로겐 베이스(Yeast Nitrogen Base)(번호 291920).
제1 씨드 플라스크 배양물로부터의 12 밀리리터를 2 ℓ 플라스크로 옮기고, 300 rpm에서 회전하는 인큐베이터에서 30℃에서 성장시켰다. 제2 씨드 플라스크는 220 ㎖의 하기의 배지를 갖는다:
30.0 g/ℓ의 덱스트로스
5.0 g/ℓ의 에탄올, 무수
3.7 g/ℓ의 포르미디엄(상표명) 합성 완전 아미노산(카이저) 드롭-아웃: HIS 없음, URA 없음(참조 번호 DSCK162CK)
6.7 g/ℓ의 아미노산이 없는 디프코 이스트 니트로겐 베이스(번호 291920)
pH 5.5-6.0으로 적정된 0.2M MES 완충액.
배양물을 0.55-1.1 g/ℓ dcw(OD600 1.3-2.6)로 성장시켰다. 200 g/ℓ 펩톤 및 100 g/ℓ의 효모 추출물을 함유하는 30 ㎖의 용액을 이러한 세포 농도에서 첨가하였다. 이어서, 300 ㎖의 0.2 ㎛ 필터 멸균된 코그니스, 90-95%의 올레일 알코올을 플라스크에 첨가하였다. 배양물을 수집하고 발효에 첨가하기 전에 4 g/ℓ dcw 초과(10 초과의 OD600 )로 계속 성장시켰다.
발효 준비
초기 발효 용기 준비
유리 재킷형(jacked) 2 ℓ 발효 용기(독일 괴팅겐 소재의 사토리우스 아게(Sartorius AG))에 액화 중량의 66%까지 가정용 물(house water)을 주입하였다. pH 프로브(해밀턴 이지펌 플러스(Hamilton Easyferm Plus) K8, 부품 번호: 238627, 스위스 보나두츠 소재의 해밀턴 보나두츠 아게(Hamilton Bonaduz AG))를 사토리우스 DCU-3 컨트롤 타워 캘리브레이션(Control Tower Calibration) 메뉴를 통해 보정하였다. 0을 pH=7에서 보정하였다. 스팬(span)을 pH=4에서 보정하였다. 이어서 프로브를 스테인리스 강 헤드 플레이트를 통해 발효 용기에 배치하였다. 또한 용존 산소 프로브(pO2 프로브)를 헤드 플레이트를 통해 발효 용기에 배치하였다. 영양소, 씨드 배양물, 추출 용매 및 염기의 전달에 사용되는 튜빙(tubing)을 헤드 플레이트에 부착시키고, 단부를 포일링하였다(foiled). 전체 발효 용기를 스테리스(Steris)(미국 오하이오주 멘토 소재의 스테리스 코포레이션(Steris Corporation)) 오토클레이브에 배치하고, 액체 사이클에서 30분 동안 멸균하였다.
발효 용기를 오토클레이브로부터 제거하고, 로드 셀(load cell)에 배치하였다. 재킷 물 공급 및 복귀 라인을 각각 가정용 물 및 깨끗한 드레인(drain)에 연결하였다. 응축기 냉각수가 들어가고 나오는 라인을 7℃에서 작동시킨 6-ℓ 재순환 온도 배쓰에 연결하였다. 발효 용기로부터 기체를 전달하는 벤트(vent) 라인을 써모(Thermo) 질량 분석기(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드(Thermo Fisher Scientific Inc.)의 프리마 디비(Prima dB))에 연결된 전달 라인에 연결하였다. 스파저(sparger) 라인을 기체 공급 라인에 연결하였다. 영양소, 추출 용매, 시드 배양물 및 염기의 첨가를 위한 튜빙을 펌프를 통해 연결하거나 클램프로 폐쇄하였다.
발효 용기 온도를 열전쌍 및 가정용 물 순환 루프를 사용하여 55℃로 조절하였다. 습윤 옥수수 알(#2 옐로우 덴트(yellow dent))을 1.0 ㎜ 스크린과 함께 해머 밀을 사용하여 분쇄하고, 이어서, 생성한 분쇄된 전체 옥수수 알을 발효 용기에 액화 반응 물질의 29-30%(건조 옥수수 고형물 중량)의 주입으로 첨가하였다.
액화 전의 리파제 처리
리파제 효소 스톡 용액을 10 ppm의 최종 리파제 농도로 발효 용기에 첨가하였다. 발효 용기를 6시간 초과 동안에 55℃, 300 rpm 및 0.3 slpm N2 오버레이에서 유지시켰다. 리파제 처리가 완료된 후에, 액화를 후술되는 바와 같이(액화) 수행하였다.
액화
발효 용기를 300-1200 rpm에서 혼합하고, 멸균, 하우스 N2를 스파저를 통해 0.3 slpm으로 첨가하면서 알파-아밀라제를 그의 설명서에 따라 발효 용기에 첨가하였다 온도 설정점을 55℃에서 85℃로 변경시켰다. 온도가 80℃ 초과였을 때, 액화 조리 시간을 시작하였으며, 액화 사이클은 90 내지 120분 동안 80℃ 초과로 유지하였다. 발효 용기 온도 설정점을 액화 사이클이 완료된 후에 30℃의 발효 온도로 설정하였다. N2를 스파저로부터 헤드 공간으로 재지향시켜, 화학적 소포제의 첨가 없이 거품 발생을 방지하였다.
액화 후의 리파제 처리
발효 용기 온도를 액화 사이클이 완료된 후에(액화) 30℃ 대신에 55℃로 설정하였다. 필요에 따라 산 또는 염기를 볼루스(bolus)로 첨가함으로써 pH를 pH=5.8로 수동으로 조절하였다. 리파제 효소 스톡 용액을 10 ppm의 최종 리파제 농도로 발효 용기에 첨가하였다. 발효 용기를 6시간 초과 동안에 55℃, 300 rpm 및 0.3 slpm N2 오버레이에서 유지시켰다. 리파제 처리가 완료된 후에, 발효 용기 온도를 30℃로 설정하였다.
리파제 열 불활성화 처리(열 사멸 처리 방법)
발효 용기 온도를 15분 초과 동안 80℃ 초과로 유지하여, 리파제를 불활성화시켰다. 열 불활성화 처리가 완료된 후에, 발효 용기 온도를 30℃로 설정하였다.
접종 전의 영양소 첨가
접종 직전에, 에탄올(6.36 ㎖/ℓ, 접종 후 부피, 200 프루프(proof), 무수)을 발효 용기에 첨가하였다. 티아민을 20 ㎎/ℓ의 최종 농도로 첨가하고, 100 ㎎/ℓ 니코틴산을 또한 접종 직전에 첨가하였다.
접종 전의 올레일 알코올 또는 옥수수유 지방산 첨가
접종 직후에 1 ℓ/ℓ(접종 후 부피)의 올레일 알코올 또는 옥수수유 지방산을 첨가하였다.
발효 용기 접종
발효 용기 pO2 프로브를 0으로 보정하면서, N2를 발효 용기에 첨가하였다. 발효 용기 pO2 프로브를 300 rpm에서 살포하는 멸균 공기를 사용하여 그의 스팬으로 보정하였다. 제2 씨드 플라스크가 4 g/ℓ dcw 초과에 도달한 후에, 발효 용기에 접종하였다. 쉐이크 플라스크를 5분 동안 인큐베이터/쉐이커로부터 제거하여, 올레일 알코올상 및 수상의 상 분리를 가능하게 하였다. 수상(110 ㎖)을 멸균, 접종 병에 옮겼다. 접종물을 연동 펌프를 통해 발효 용기 내로 내보냈다.
발효 용기 운영 조건
발효 용기를 전체 성장 및 생성 단계를 위하여 30℃에서 운영하였다. 임의의 산을 첨가하지 않고, pH가 5.7 내지 5.9의 pH로부터 5.2의 조절 설정점으로 떨어지게 하였다. pH를 나머지 성장 및 생성 단계를 위해 수산화암모늄을 사용하여 pH=5.2로 조절하였다. 멸균 공기를 나머지 성장 및 생성 단계를 위해 0.3 slpm에서 스파저를 통해 발효 용기에 첨가하였다. 교반 제어만을 사용하여 사토리우스 DCU-3 컨트롤 박스(Control Box) PID 컨트롤 루프(control loop)에 의해 pO2가 3.0%으로 조절되게 설정하고, 교반기 최소값은 300 rpm으로 설정하고, 최대값은 2000 rpm으로 설정하였다. 글루코스를 α-아밀라제(글루코아밀라제)를 첨가함으로써 액화된 옥수수 매쉬의 동시 당화 및 발효를 통해 공급하였다. 전분이 당화에 이용가능한 한은 글루코스를 과잉으로(1-50 g/ℓ) 유지하였다.
분석
기체 분석
공정 공기를 써모 프리마(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드) 질량 분석기에서 분석하였다. 이는 멸균된 다음 각 발효 용기에 첨가된 동일한 공정 공기였다. 각 발효 용기의 배출 기체를 동일한 질량 분석기에서 분석하였다. 이러한 써모 프리마 디비는 매 월요일 아침 6시에 보정 체크를 시행하였다. 보정 체크는 질량 분석기와 연계된 가스 워크스(Gas Works) v1.0(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드) 소프트웨어를 통해 계획하였다. 보정된 기체는 다음과 같았다:
Figure pct00001
이산화탄소를 다른 공지되어 있는 병에 든 기체를 사용하여 보정 사이클 동안 5% 및 15%에서 점검하였다. 산소를 다른 공지되어 있는 병에 든 기체를 사용하여 15%에서 점검하였다. 각 발효 용기의 배출 기체의 분석에 기초하여, 스트립핑된 아이소부탄올, 소모된 산소 및 배출 기체로 내보내지는 이산화탄소의 양을 질량 분석기의 몰 분율 분석 및 발효 용기 내로의 기체 유속(질량 유동 컨트롤러)을 사용하여 측정하였다. 시간당 기체 발생 속도를 계산한 다음, 발효 과정에 걸친 속도를 적분하였다.
바이오매스 측정
0.08% 트립판 블루 용액을 1X PBS를 사용하여 NaCl 중의 0.4% 트립판 블루(VWR BDH8721-0)의 1:5 희석으로부터 제조하였다. 1.0 ㎖ 시료를 발효 용기로부터 빼내고, 1.5 ㎖ 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리 튜브에 넣고, 14,000 rpm에서 5분 동안 에펜도르프, 5415C에서 원심분리하였다. 원심분리 후에, 상측 용매층을 20-200 ㎕ 바이오히트(BioHit) 피펫 팁과 함께 m200 버라이어블 채널 바이오히트(Variable Channel BioHit) 피펫을 사용하여 제거하였다. 용매층과 수층 사이의 층을 제거하지 않도록 주의하였다. 일단 용매층이 제거되면, 시료를 2700 rpm에서 설정한 보텍스-제니(Vortex-Genie)(등록 상표)를 사용하여 재현탁화시켰다.
혈구계수기 계수를 위한 이상적인 농도를 얻기 위하여 일련의 희석이 필요하였다. OD가 10이었다면, 1:20 희석을 수행하여, 0.5 OD를 달성할 것이며, 이는 사각형(square)당 계수될 세포의 이상적인 양, 20-30개를 제공할 것이다. 옥수수 고형물에 기인한 희석의 비정확성을 감소시키기 위하여, 컷팅된(cut) 100-1000 ㎕ 바이오히트 피펫 팁을 사용한 다수의 희석이 필요하였다. 대략 1 cm를 팁으로부터 컷팅하여 구멍을 증가시켜, 팁이 막히는 것을 방지하였다. 1:20 최종 희석을 위하여, 발효 시료 및 0.9% NaCl 용액의 초기 1:1 희석액을 제조하였다. 이어서, 이전 용액(즉, 초기 1:1 희석액) 및 0.9% NaCl 용액의 1:1 희석액(제2 희석액)을 생성하고, 제2 희석액과 트립판 블루 용액의 1:5 희석으로 이어졌다. 시료를 각 희석 사이에 볼텍싱하고, 컷팅된 팁을 0.9% NaCl 및 트립판 블루 용액 내로 씻어 냈다.
커버 슬립(cover slip)을 조심히 혈구계수기(하우져 사이언티픽 브라이트-라인(Hausser Scientific Bright-Line) 1492)의 상측에 두었다. 분취액(10 ㎕)을 2-20 ㎕ 바이오히트 피펫 팁과 함께 m20 버라이어블 채널 바이오히트 피펫을 사용하여 최종 트립판 블루 희석액으로부터 빼내고, 혈구계수기에 주입하였다. 혈구계수기를 40x 배율에서 제이스 악시오스코프(Zeis Axioskop) 40 현미경 위에 두었다. 중심 사분면을 25개 사각형으로 나누고, 둘 모두의 챔버 내에서 4개의 모서리 및 중심 사각형을 계수하고 기록하였다. 둘 모두의 챔버를 계수한 후에, 평균을 내고, 희석 인자(20)를 곱한 다음, 혈구계수기 내의 사분면 내의 사각형의 개수인 25를 곱한 다음, 계수한 사분면의 부피인 0.0001 ㎖로 나누었다. 이러한 계산의 합계는 ㎖당 세포 개수이다.
수상 중의 발효 생성물의 LC 분석
처리할 준비가 될 때까지 시료를 냉장보관하였다. 시료를 냉장고로부터 치워 실온에 도달되게 하였다(약 1시간). 대략 300 ㎕의 시료를 100-1000 ㎕ 바이오히트 피펫 팁과 함께 m1000 버라이어블 채널 바이오히트 피펫을 사용하여 0.2 ㎛ 원심분리기 필터(나노세프(Nanosep)(등록 상표) MF 변형된 나일론 원심분리기 필터)로 전달한 다음, 14,000 rpm에서 5분 동안 에펜도르프(Eppendorf) 5415C를 사용하여 원심분리하였다. 대략 200 ㎕의 여과된 시료를 폴리머 피트(polymer feet)가 있는 250 ㎕ 유리 바이얼 삽입물이 있는 1.8 오토 샘플러(auto sampler) 바이얼에 전달하였다. PTFE 격벽이 있는 스크루 캡을 사용하여 2700 rpm으로 설정된 볼텍스-제니(등록 상표)로 시료를 볼텍싱시키기 전에 바이얼을 캡핑하였다.
이어서, 시료를 바이너리 등용매 펌프(binary, isocratic pump), 진공 탈기장치, 가열된 컬럼 구획, 샘플러 냉각 시스템, UV DAD 검출기 및 RI 검출기가 장착된 아질런트(Agilent) 1200 시리즈 LC에서 진행시켰다. 사용된 컬럼은 바이오-래드 카타이온(Bio-Rad Cation) H 리필(refill), 30X4.6 가드 컬럼이 있는 아미넥스(Aminex) HPX-87H, 300 X 7.8이었다. 컬럼 온도는 40℃였으며, 이동상은 0.01 N 황산이고, 유속은 40분 동안 0.6 ㎖/분이었다. 결과는 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00002
처리할 준비가 될 때까지 시료를 냉장보관하였다. 시료를 냉장고로부터 치워 실온에 도달되게 하였다(약 1시간). 대략 150 ㎕의 시료를 100-1000 ㎕ 바이오히트 피펫 팁과 함께 m1000 버라이어블 채널 바이오히트 피펫을 사용하여 폴리머 피트가 있는 250 ㎕ 유리 바이얼 삽입물이 있는 1.8 오토 샘플러 바이얼에 전달하였다. PTFE 격벽이 있는 스크루 캡을 사용하여, 바이얼을 캡핑하였다.
이어서, 시료를 7683B 주입기 및 G2614A 오토 샘플러가 있는 아질런트 7890A GC 상에서 진행시켰다. 컬럼은 HP-이노왁스(InnoWax) 컬럼(30 m x 0.32 ㎜ ID, 0.25 ㎛ 필름)이었다. 운반 기체는 불변의 헤드 압력과 함께 45℃에서 측정된 1.5 ㎖/분 유속의 헬륨이었고; 주입기 분할은 225℃에서 1:50이었으며; 오븐 온도는 29분의 시행 시간 동안, 1.5분 동안 45℃, 0분 동안 10℃/분에서 45℃로부터 160℃에 이어서, 14분 동안 35℃/분에서 230℃였다. 불꽃 이온화 검출법은 260℃에서 40 ㎖/분의 헬륨 구성 기체를 이용해 사용하였다. 결과는 표 2에 나타나 있다.
지방산 부틸 에스테르에 대하여 분석한 시료를 7683B 주입기 및 G2614A 오토 샘플러가 있는 아질런트 6890 GC 상에서 진행시켰다. 컬럼은 HP-DB-FFAP 컬럼(15 미터 x 0.53 ㎜ ID(메가보어(Megabore)), 1-마이크로미터 필름 두께 컬럼(30 m x 0.32 ㎜ ID, 0.25 ㎛ 필름)이었다. 운반 기체는 불변의 헤드 압력과 함께, 45℃에서 측정된 3.7 ㎖/분 유속의 헬륨이었고; 주입기 분할은 225℃에서 1:50이었으며; 오븐 온도는 26분의 시행 시간 동안, 2.0분 동안 100℃, 10℃/분에서 100℃로부터 250℃에 이어서, 9분 동안 250℃였다. 불꽃 이온화 검출법은 300℃에서 40 ㎖/분의 헬륨 구성 기체를 이용해 사용하였다. 하기의 GC 표준(미국 미네소타주 엘리시안 소재의 누-체크 프렙(Nu-Chek Prep))을 사용하여, 지방산 아이소부틸 에스테르 생성물의 아이덴티티를 확인하였다: 아이소-부틸 팔미테이트, 아이소-부틸 스테아레이트, 아이소-부틸 올레에이트, 아이소-부틸 리놀레에이트, 아이소-부틸 리놀레네이트, 아이소-부틸 아라키데이트.
실시예 1 내지 14는 청구된 방법을 위해 사용될 수 있는 다양한 발효 조건을 기재한 것이다. 일 예로서, 일부 발효에 액화 전 리파제 처리를 하고, 다른 발효에는 액화 후 리파제 처리를 하였다. 다른 예에서, 발효에는 열 불활성화 처리를 하였다. 발효 후에, 아이소부탄올 유효 역가(Eff Iso Titer), 즉 리터(수성 부피)당 생성되는 그램(총 아이소부탄올)을 측정하였다. 결과는 표 3에 나타나 있다.
실시예 1 - (대조군)
실험 식별번호 2010Y014에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 방법, 접종 방법 전의 영양소 첨가, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 올레일 알코올을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 2
실험 식별번호 2010Y015에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 방법, 액화 후 리파제 처리 방법, 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 올레일 알코올을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 3
실험 식별번호 2010Y016에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 방법, 액화 후 리파제 처리 방법, 에탄올 배제의 예외와 함께 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 올레일 알코올을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 4
실험 식별번호 2010Y017에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 방법, 액화 후 열 사멸 처리 방법, 에탄올 배제의 예외와 함께 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 올레일 알코올을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 5
실험 식별번호 2010Y018에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 방법, 액화 후 오직 7.2 ppm의 리파제 첨가의 예외와 함께, 액화 후 리파제 처리 방법, 액화 후 열 사멸 처리 방법, 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 올레일 알코올을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 6 - (대조군)
실험 식별번호 2010Y019에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 방법, 액화 후 열 사멸 처리 방법, 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 올레일 알코올을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 7 - (대조군)
실험 식별번호 2010Y021에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 전 리파제 처리 방법, 액화 방법, 액화 동안의 열 사멸 처리, 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 올레일 알코올을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 8
실험 식별번호 2010Y022에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 방법, 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 올레일 알코올을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 9
실험 식별번호 2010Y023에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 방법, 액화 후 리파제 처리 방법, 열 사멸 처리 없음, 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 미정제 옥수수유로부터 제조한 옥수수유 지방산을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 10
실험 식별번호 2010Y024에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 전 리파제 처리 방법, 액화 방법, 액화 동안의 열 사멸 처리, 에탄올의 첨가가 없는 예외와 함께 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 올레일 알코올을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 11
실험 식별번호 2010Y029에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 전 리파제 처리 방법, 액화 방법, 액화 동안의 열 사멸 처리, 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 미정제 옥수수유로부터 제조한 옥수수유 지방산을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 12
실험 식별번호 2010Y030에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 전 리파제 처리 방법, 액화 방법, 액화 동안의 열 사멸 처리, 에탄올의 첨가가 없는 예외와 함께 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 미정제 옥수수유로부터 제조된 옥수수유 지방산을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 13 - (대조군)
실험 식별번호 2010Y031에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 방법, 액화 후 리파제 처리 방법, 열 사멸 처리 없음, 에탄올의 첨가가 없는 예외와 함께 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 미정제 옥수수유로부터 제조된 옥수수유 지방산을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
실시예 14
실험 식별번호 2010Y032에는 하기의 것이 포함된다: 씨드 플라스크 성장 방법, 초기 발효 용기 준비 방법, 액화 방법, 액화 후 리파제 처리 방법, 열 사멸 처리 없음, 접종 전 영양소 첨가 방법, 발효 용기 접종 방법, 발효 용기 운영 조건 방법 및 모든 분석 방법. 미정제 옥수수유로부터 제조된 옥수수유 지방산을 접종 후 0.1 내지 1.0시간 사이에 단일의 배치로 첨가하였다. 부타놀로겐은 NGCI-070이었다.
Figure pct00004
실시예 15
실험 식별번호는 GLNOR432A였다. NYLA74(부탄다이올 생성자 - NGCI-047)를 동결된 바이얼로부터 250 ㎖ 플라스크에서 25 ㎖의 배지에서 약 1 OD로 성장시켰다. 씨드-전 배양물을 2 ℓ 플라스크로 옮기고, 1.7-1.8 OD까지 성장시켰다. 둘 모두의 플라스크에 대한 배지는 하기와 같다:
3.0 g/ℓ의 덱스트로스
3.0 g/ℓ의 에탄올, 무수
6.7 g/ℓ의 아미노산이 없는 디프코 이스트 니트로겐 베이스(번호 291920)
1.4 g/ℓ의 이스트 드롭아웃 믹스(시그마 Y2001)
10 ㎖/ℓ의 1% w/v L-류신 스톡 용액
2 ㎖/ℓ의 1% w/v L-트립토판 스톡 용액
1 ℓ, 아플리콘(Applikon) 발효 용기를 60 ㎖의 씨드 플라스크로 접종하였다. 발효 용기에는 700 ㎖의 하기의 멸균 배지가 함유되어 있다:
20.0 g/ℓ의 덱스트로스
8.0 ㎖/ℓ의 에탄올, 무수
6.7 g/ℓ의 아미노산이 없는 디프코 이스트 니트로겐 베이스(번호 291920)
2.8 g/ℓ의 이스트 드롭아웃 믹스(시그마 Y2001)
20 ㎖/ℓ의 1% w/v L-류신 스톡 용액
4 ㎖/ℓ의 1% w/v L-트립토판 스톡 용액
0.5 ㎖의 시그마 204 안티폼(Antifoam)
0.8 ㎖/ℓ의 1:1::트윈(Tween) 80:에탄올 중의 1% w/v 에르고스테롤 용액
잔류 글루코스를 50% w/w 글루코스 용액을 사용하여 과잉으로 유지하였다. 발효 용기의 용존 산소 농도를 교반 조절을 사용하여 30%로 조절하였다. pH를 pH=5.5에서 조절하였다. 발효 용기에 0.3 slpm의 멸균, 하우스 공기를 살포하였다. 온도를 30℃에서 조절하였다.
실시예 16
실험 식별번호는 GLNOR434A였다. 이러한 실시예는 접종 전의 3 g의 올레산의 첨가 및 3 g의 팔미트산의 첨가를 제외하고는 실시예 15와 동일하다. NYLA74(부탄다이올 생성자 - NGCI-047)는 생체촉매였다.
도 7은 지방산을 수용하는 발효 용기에서 소모되는 글루코스(g/ℓ)가 더 많은 것을 보여준다. 사각형은 올레산 및 팔미트산을 수용하는 발효 용기를 나타낸다. 원은 임의의 추가의 지방산을 수용하지 않았던 발효 용기를 나타낸다.
실시예 17
실험 식별번호는 GLNOR435A였다. 본 실시예는 NYLA74(아이소부탄올 생성자 - NGCI-049)를 접종하는 것을 제외하고는 실시예 15와 동일하였다.
실시예 18
실험 식별번호는 GLNOR437A였다. 본 실시예는 NYLA74(아이소부탄올 생성자)(NGCI-049)를 접종하는 것을 제외하고는 실시예 16과 동일하였다.
도 8은 지방산을 수용하는 발효 용기에서 소모되는 글루코스(g/ℓ)가 더 많은 것을 보여준다 사각형은 올레산 및 팔미트산을 수용하는 발효 용기를 나타낸다. 원은 임의의 추가의 지방산을 수용하지 않았던 발효 용기를 나타낸다.
실시예 19
실험 식별번호는 090420_3212였다. 본 실시예는 부타놀로겐 NYLA84(아이소부탄올 생성자)를 접종하는 것을 제외하고는 실시예 15와 유사하게 시행하였다. 이러한 발효를 1 ℓ 사토리우스 발효 용기에서 시행하였다.
실시예 20
실험 식별번호는 2009Y047이었다. 본 실시예는 부타놀로겐 NYLA84(아이소부탄올 생성자)를 접종하는 것을 제외하고는 실시예 16과 유사하게 시행하였다. 이러한 발효를 1 ℓ 사토리우스 발효에서 시행하였다.
도 9는 지방산을 수용하는 발효 용기에서 소모되는 글루코스(g/ℓ)가 더 많은 것을 보여준다 사각형은 올레산 및 팔미트산을 수용하는 발효 용기를 나타낸다. 원은 임의의 추가의 지방산을 수용하지 않았던 발효 용기를 나타낸다.
표 4는 지방산 첨가 유무(+/-), 최대 광학 밀도 및 소모되는 글루코스(g/ℓ)를 보여준다.
Figure pct00005
실시예 21
올레일 알코올을 사용하여 생성물을 동소 제거하는 동시 당화 및 발효를 위한 액화된 옥수수 매쉬의 리파제 처리
실시예 1, 2 및 3에서 상술된 바와 같이 시행한 발효로부터 취한 브로쓰 및 올레일 알코올의 시료를 이. 지. 블라이(E. G. Bligh) 및 더블유. 제이. 다이어(W. J. Dyer)에 의해 기재된 방법(문헌[Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 37:911-17, 1959], 하기에서 참고문헌 1)에 따라 지질 wt%(지방산 메틸 에스테르, FAME로 유도체화) 및 유리 지방산 wt%(FFA, 지방산 메틸 에스테르, FAME로 유도체화)에 대하여 분석하였다. 또한, 각각 3회의 발효에 대해 제조하였던 액화된 옥수수 매쉬를 리폴라제(등록 상표) 100 ℓ(노보자임즈)로의 처리 후에 지질 wt% 및 FFA wt%에 대하여 분석하였다(10 ppm의 리폴라제(등록 상표) 전체 용해성 단백질(BCA 단백질 분석, 시그마 알드리치)/30 wt%의 분쇄된 옥수수 알을 함유하는 액화 반응 물질의 ㎏). 리파제를 실시예 1(대조군)에서 액화된 옥수수 매쉬에 첨가하지 않았으며, 리파제로 처리한 액화된 옥수수 매쉬를 함유하는 실시예 2 및 3에 기재된 발효(리파제의 열 불활성화 없음)는 실시예 3에 기재된 발효에 에탄올을 첨가하지 않은 것을 제외하고 동일하였다.
실시예 2 및 3에 기재된 발효 시행을 위해 제조된 리파제-처리한 액화된 옥수수 매쉬 중의 FFA%는 각각 88% 및 89%였으며, 이는 리파제 처리 없이(실시예 1)의 31 %와 비교된다. 70시간에(시행의 마지막(EOR)), 실시예 2 및 3에 기재된 발효 시행의 OA상(활성 리파제 함유) 중의 FFA 농도는 각각 14% 및 20%였으며, 지질의 상응하는 증가(옥수수유 지방산 메틸 에스테르 유도체로 측정)가 GC/MS에 의해, OA에 의한 ocFA의 리파제-촉매작용된 에스테르화에 기인한 것으로 결정되었으며, 여기서, COFA는 먼저 액화된 옥수수 매쉬 중의 옥수수유의 리파제-촉매작용된 가수분해에 의해 생성된었다. 결과는 표 5에 나타나 있다.
Figure pct00006
실시예 22
옥수수유 유리 지방산의 올레일 알코올 에스테르의 생성을 제한하는 리파제-처리한 액화된 옥수수 매쉬에서의 리파제의 열 불활성화
수돗물(918.4 g)을 재킷형 2-ℓ 수지 케틀에 첨가한 다음, 474.6 g의 습윤 중량(417.6 g 건조 중량)의 분쇄된 전체 옥수수 알(해머 밀 상의 1.0 ㎜ 스크린)을 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 300 rpm에서 교반하면서 55℃로 가열하고, 2 N 황산을 사용하여 pH를 5.8로 조정하였다. 혼합물에 0.672 g의 스페자임(Spezyme)(등록 상표)-FRED L(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 제넨코어(Genencor)(등록 상표))을 함유하는 14.0 g의 수용액을 첨가하고, 600 rpm 및 pH 5.8에서 교반하면서 혼합물의 온도를 85℃로 증가시켰다. 85℃에서 120분 후에, 혼합물을 50℃로 냉각시키고, 생성한 액화된 옥수수 매쉬의 45.0 ㎖ 분취액을 50-㎖ 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 옮기고, -80℃에서 동결 보관하였다.
제1 반응에서, 상술된 바와 같이 제조된 50 g의 액화된 옥수수 매쉬를 10 ppm 리폴라제(등록 상표) 100 L(노보자임즈)과 55℃에서 6시간 동안 혼합하였으며, 85℃에서 1시간 동안의 리파제의 불활성화가 없었으며, 혼합물을 30℃로 냉각시켰다. 제2 반응에서, 50 g의 액화된 옥수수 매쉬를 55℃에서 6시간 동안 10 ppm 리폴라제(등록 상표)와 혼합한 다음, 1시간 동안 85℃로 가열한 다음(리파제 불활성화), 30℃로 냉각시켰다. 제3 반응에서, 첨가되는 리파제 없이, 그리고 85℃에서 1시간 동안의 가열 없이, 50 g의 액화된 옥수수 매쉬를 55℃에서 6시간 동안 혼합하고, 혼합물을 30℃로 냉각시키고, 38 g의 올레일 알코올을 첨가하고, 생성된 혼합물을 30℃에서 73시간 동안 교반하였다. 제4 반응에서, 첨가되는 리파제 없이, 50 g의 액화된 옥수수 매쉬를 55℃에서 6시간 동안 혼합한 다음, 1시간 동안 85℃로 가열한 다음, 30℃로 냉각하였다. 각각의 4개의 반응 혼합물을 6시간에 샘플링한 다음, 38 g의 올레일 알코올을 첨가하고, 생성된 혼합물을 30℃에서 교반하고, 25시간 및 73시간에 샘플링하였다. 시료(둘 모두의 액화된 매쉬 및 올레일 알코올(OA))를 참고문헌 1에 기재된 방법에 따라 지질 wt%(지방산 메틸 에스테르, FAME로 유도체화) 및 유리 지방산 wt%(FFA, 지방산 메틸 에스테르, FAME로 유도체화)에 대하여 분석하였다.
OA 첨가 전에 리파제의 열 불활성화를 사용한 제2 반응 시행의 OA 상 중의 FFA %는 25시간에 99% 및 73시간에 95%였으며, 이는 리파제-처리한 액화된 옥수수 매쉬 중의 리파제를 열 불활성화시키지 않은 경우(제1 반응)에 각각 25시간 및 73시간의 오직 40% FFA 및 21% FFA와 비교된다. FFA %의 유의미한 변화가 첨가되는 리파제 없이 2가지 대조군 반응에서 관찰되지 않았다. 결과는 표 6에 나타나 있다.
Figure pct00007
실시예 23
올레일 알코올을 사용하여 생성물을 동소 제거하는 동시 당화 및 발효를 위한 리파제-처리한 액화된 옥수수 매쉬 중의 리파제의 열 불활성화
3가지 발효를 실시예 4, 5 및 6에서 상술된 바와 같이 시행하였다. 리파제를 발효 전에 실시예 4 및 6에서의 액화된 옥수수 매쉬에 첨가하지 않았으며, 실시예 5에 기재된 발효에서의 액화된 옥수수 매쉬의 리파제 처리(7.2 ppm의 리폴라제(등록 상표) 전체 용해성 단백질)는 바로 열 불활성화 처리(리파제를 완전히 불활성화시킴)로 이어졌으며, 이후에 접종 및 발효 전의 영양소 첨가로 이어졌다. 실시예 4 및 6에 기재된 발효 시행을 위해 리파제 처리 없이 제조한 액화된 옥수수 매쉬 중의 FFA%는 각각 31% 및 34%였으며, 이는 리파제 처리와 함께(실시예 5)의 89%와 비교된다. 표 10에 열거된 발효의 과정에 걸쳐, OA 상 중의 FFA의 농도는 열-불활성화된 리파제를 함유하는 것을 비롯한 3개의 발효 중 임의의 것에서 감소하지 않았다. 실시예 5에 따른 발효 시행(발효 전의 리파제의 열 불활성화를 사용한)의 OA 상 중의 FFA%는 70시간(시행의 마지막(EOR))에 95%였으며, 이는 액화된 옥수수 매쉬를 리파제로 처리하지 않은 남아있는 2가지 발효(실시예 4 및 6)에 대해서의 오직 33%의 FFA와 비교된다. 결과는 표 7에 나타나 있다.
Figure pct00008
실시예 24
액화 후의 분쇄된 전체 옥수수 알의 리파제 처리
수돗물(1377.6 g)을 2개의 재킷형 2-ℓ 수지 케틀 각각에 첨가한 다음, 711.9 g의 습윤 중량(625.8 g 건조 중량)의 분쇄된 전체 옥수수 알(해머 밀 상의 1.0 ㎜ 스크린)을 교반하면서 각 케틀에 첨가하였다. 각각의 혼합물을 300 rpm에서 교반하면서 55℃로 가열하고, 2 N 황산을 사용하여 pH를 5.8로 조정하였다. 각 혼합물에 1.008 g의 스페자임(등록 상표)-FRED L(제네코어(등록 상표), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 함유하는 21.0 g의 수용액을 첨가하였다. 이어서, 하나의 혼합물에, 10.5 ㎖의 리폴라제(등록 상표) 100L 용액(21 ㎎ 전체 용해성 단백질, 10 ppm 리파제 최종 농도)의 수용액을 첨가하고, 제2 혼합물에, 1.05 ㎖의 리폴라제(등록 상표) 100L 용액(2.1 ㎎ 전체 용해성 단백질, 1.0 ppm 리파제 최종 농도)의 수용액을 첨가하였다. 시료를 55℃에서 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간에 각 반응 혼합물로부터 빼내고, 혼합물의 온도를 600 rpm 및 pH 5.8에서 교반하면서, 85℃로 증가시키고, 혼합물이 처음 85℃에 도달하는 때 시료를 취하였다. 85℃에서 120분 후에, 시료를 취하고, 혼합물을 50℃로 냉각시키고, 생성한 액화된 옥수수 매쉬의 최종 시료를 50-㎖ 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 옮기고; 모든 시료를 -80℃에서 동결 보관하였다.
2개의 별개의 반응에서, 10 ppm 리파제-처리한 액화된 옥수수 매쉬의 50 g 시료 또는 상술된 바와 같이 제조한 1.0 ppm 리파제-처리한 액화된 옥수수 매쉬의 55 g 시료를 30℃에서 20시간 동안 올레일 알코올(OA) (38 g)과 혼합한 다음, 각각의 반응 혼합물 중의 액화된 매쉬 및 OA를 원심분리에 의해 분리하고, 각각의 상을 참고문헌 1에 기재된 방법에 따라 지질 wt%(지방산 메틸 에스테르, FAME로 유도체화) 및 유리 지방산 wt%(FFA, 지방산 메틸 에스테르, FAME로 유도체화)에 대하여 분석하였다. 액화 동안 10 ppm 리파제의 열 불활성화를 사용하여 제조한 액화된 매쉬/OA 혼합물의 OA 상 중의 FFA%는 20시간에 98%였으며, 이는 액화 동안 1.0 ppm 리파제의 열 불활성화를 사용하여 제조한 액화된 매쉬/OA 혼합물의 OA 상 중의 오직 62%의 FFA와 비교된다. 결과는 표 8에 나타나 있다.
Figure pct00009
실시예 25
액화 전의 분쇄된 전체 옥수수 알의 처리를 위한 리파제 스크리닝
pH 5.8에서 수돗물(67.9 g) 및 분쇄된 전체 옥수수 알(35.1 g 습윤 중량, 해머 밀을 사용하여 1.0 ㎜ 스크린으로 분쇄)을 함유하는 7개의 반응 혼합물을 마개로 막은 플라스크에서 55℃에서 교반하였다. 3-㎖ 시료(t = 0시간)를 각 플라스크로부터 제거하고, 시료를 드라이 아이스에서 바로 동결시킨 다음, 하기의 리파제(노보자임즈) 중 하나의 1 ㎎ 전체 용해성 단백질(반응 혼합물 중의 10 ppm 최종 농도)을 함유하는 약 0.5 ㎖의 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 각 플라스크 중 하나에 첨가하고: 리폴라제(등록 상표) 100 L, 리펙스(등록 상표) 100L, 리포클린(등록 상표) 2000T, 리포자임(등록 상표) CALB L, 노보자임(등록 상표) CALA L 및 팔라타제 20000L; 리파제를 7번째 플라스크에는 첨가하지 않았다. 생성된 혼합물을 마개로 막은 플라스크에서 55℃에서 교반하고, 3-㎖ 시료를 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간에 각 반응 혼합물로부터 빼내고, 참고문헌 1에 기재된 방법에 따라 지질 wt%(지방산 메틸 에스테르, FAME로 유도체화) 및 유리 지방산 wt%(FFA, 지방산 메틸 에스테르, FAME로 유도체화)에 대하여 분석할 때까지 드라이 아이스에서 바로 동결시키고, 각 시료에 대하여 결정한 지질 및 유리 지방산의 전체 합한 농도에 비하여 유리 지방산 함량 백분율을 계산하였다. 결과는 표 9에 나타나 있다.
Figure pct00010
실시예 26
올레일 알코올을 사용하여 생성물을 동소 제거하는 동시 당화 및 발효 전의 분쇄된 전체 옥수수 알의 리파제 처리
3가지 발효를 실시예 7, 8 및 10에서 상술된 바와 같이 시행하였다. 실시예 7 및 10에 기재된 바와 같은 발효 시행을 위하여, 리파제(10 ppm의 리폴라제(등록 상표) 전체 용해성 단백질)를 분쇄된 옥수수의 현탁액에 첨가하고, 액화 전에 55℃에서 6시간 동안 가열하여, 열-불활성화된 리파제를 함유하는 액화된 옥수수 매쉬를 생성하였다. 실시예 8에 기재된 발효를 위해 액화된 옥수수 매쉬를 제조하는데 사용되는 분쇄된 옥수수의 현탁액에 리파제를 첨가하지 않았으나, 현탁액을 액화 전에 55℃에서 동일한 가열 단계로 처리하였다. 실시예 7 및 10에 기재된 발효 시행을 위해 제조된 리파제-처리한 액화된 옥수수 매쉬 중의 FFA%는 각각 83% 및 86%였으며, 이는 리파제 처리 없이의 41%와 비교된다(실시예 8). 발효의 과정에 걸쳐, FFA의 농도는 열-불활성화된 리파제를 함유하는 것을 비롯한 발효 중 임의의 것에서 감소하지 않았다. 실시예 7 및 10에 따른 발효 시행(발효 전에 리파제의 열 불활성화를 사용한)의 OA 상 중의 FFA%는 70시간(시행의 마지막(EOR))에 97%였으며, 이는 분쇄된 전체 옥수수 알을 액화 전에 리파제로 처리하지 않은 실시예 8에 따른 발효 시행에 대해서의 오직 49%의 FFA와 비교된다. 결과는 표 10에 나타나 있다.
Figure pct00011
실시예 27
옥수수유 지방산(COFA)을 사용하여 생성물을 동소 제거하는 동시 당화 및 발효를 위한 분쇄된 전체 옥수수 알 또는 액화된 옥수수 매쉬의 리파제 처리
5가지 발효를 실시예 9, 11, 12, 13 및 14에서 상술된 바와 같이 시행하였다. 실시예 9, 13 및 14에 기재된 바와 같은 발효 시행을 위하여, 리파제(10 ppm의 리폴라제(등록 상표) 전체 용해성 단백질)를 액화 후에 첨가하고, 리파제의 열-불활성화가 없었다. 실시예 9 및 14에 기재된 발효 시행에는 접종 전에 5 g/ℓ의 에탄올을 첨가하였으나, 실시예 13에 기재된 발효 시행에는 에탄올을 첨가하지 않았다. 실시예 11 및 12에 기재된 바와 같은 발효 시행은 10 ppm 리폴라제(등록 상표) 전체 용해성 단백질을 액화 전에 분쇄된 옥수수의 현탁액에 첨가하여, 액화 동안 리파제의 열 불활성화를 야기하였다. 실시예 11에 기재된 발효 시행에는 접종 전에 5 g/ℓ의 에탄올을 첨가하였으나, 실시예 12에 기재된 발효 시행에는 에탄올을 첨가하지 않았다. 활성 리파제를 함유하는 발효의 COFA 상에 존재하는 아이소부탄올(i-BuOH)의 최종 전체 그램은 불활성 리파제를 함유하는 발효의 COFA 상에 존재하는 i-BuOH의 최종 전체 그램보다 유의미하게 더 컸다. 활성 리파제를 함유하는 발효 브로쓰에 존재하는 아이소부탄올(i-BuOH)의 최종 전체 그램은 불활성 리파제를 함유하는 발효 브로쓰에 존재하는 i-BuOH의 최종 전체 그램보다 오직 약간 더 낮아, i-BuOH의 전체 생성(유리 i-BuOH 및 COFA의 아이소부틸 에스테르의 조합물(FABE))은 활성 리파제의 존재 하에서, 열-불활성화된 리파제의 존재 하에서 수득되는 생성에 비해 유의미하게 더 컸다. 결과는 표 11 및 12에 나타나 있다.
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 28
리파제-촉매작용된 반응에서 아이소부틸-COFA 에스테르 농도의 수성/COFA 비에 대한 의존성
수성 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 완충액(0.20 M, pH 5.2), 아이소부탄올(2-메틸-1-프로판올), 리파제(리폴라제(등록 상표) 100 L; 노보자임즈) 및 옥수수유로부터 제조한 옥수수유 지방산을 함유하는 반응 혼합물(표 13)을 30℃에서 교반하고, 시료를 사전결정된 시간에 각 반응 혼합물로부터 빼내고, 즉시 원심분리하고, 수층 및 유기층을 분리하고, 아이소부탄올(i-BuOH) 및 옥수수유 지방산의 아이소부틸 에스테르(i-BuO-COFA)에 대해 분석하였다(표 14).
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 29
리파제-촉매작용된 반응에서 아이소부틸-COFA 에스테르 농도의 수성/COFA 비에 대한 의존성
수성 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 완충액(0.20 M, pH 5.2), 아이소부탄올(2-메틸-1-프로판올) 또는 n-부탄올, 리파제(리폴라제(등록 상표) 100 L; 노보자임즈) 및 옥수수유로부터 제조한 옥수수유 지방산을 함유하는 반응 혼합물(표 15)을 30℃에서 교반하고, 시료를 사전결정된 시간에 각 반응 혼합물로부터 빼내고, 즉시 원심분리하고, 수층 및 유기층을 분리하고, 아이소부탄올(i-BuOH) 또는 n-부탄올(n-BuOH) 및 옥수수유 지방산의 아이소부틸- 또는 부틸 에스테르(BuO-COFA)에 대해 분석하였다(표 16).
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 30
아이소-부탄올 및 올레산의 리파제-촉매작용된 반응에 의한 아이소-부틸 올레에이트의 생성
수성 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 완충액(0.20 M, pH 5.2), 아이소부탄올(2-메틸-1-프로판올), 리파제(0 ppm 또는 10 ppm 리폴라제(등록 상표) 100 L; 노보자임즈) 및 올레산(알파 아에사르(Alfa Aesar))을 함유하는 반응 혼합물(표 17)을 30℃에서 교반하고, 시료를 사전결정된 시간에 각 반응 혼합물로부터 빼내고, 즉시 원심분리하고, 수층 및 유기층을 분리하고, 아이소부탄올(i-BuOH) 및 아이소-부틸 올레에이트(i-BuO-올레에이트)에 대해 분석하였다(표 18).
Figure pct00018
Figure pct00019
실시예 31
아이소-부탄올 및 올레산의 리파제-촉매작용된 반응에 의한 아이소-부틸 올레에이트의 생성
수성 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 완충액(MES, 0.20 M, pH 5.2), 아이소부탄올(2-메틸-1-프로판올), 올레산(알파 아에사르), 및 리폴라제(등록 상표) 100L, 리펙스(등록 상표) 100L, 리포자임(등록 상표) CALB L, 노보자임(등록 상표) CALA L, 노보자임즈로부터의 팔라타제(등록 상표), 또는 시그마알드리치로부터의 슈도모나스 플루오레슨스, 슈도모나스 세파시아, 무코르 미에헤이, 호그 판크레아스, 칸디다 실린드라세아, 리조퍼스 니베우스, 칸디다 안타르크티카, 리조퍼스 아리저스 또는 아스페르길러스로부터의 리파제(10 ppm)를 함유하는 반응 혼합물(표 19)을 30℃에서 교반하고, 시료를 사전결정된 시간에 각 반응 혼합물로부터 빼내고, 즉시 원심분리하고, 수층 및 유기층을 분리하고, 아이소부탄올(i-BuOH) 및 아이소-부틸 올레에이트(i-BuO-올레에이트)에 대해 분석하였다(표 20).
Figure pct00020
Figure pct00021
실시예 32
아이소-부탄올 및 옥수수유 지방산(COFA)의 포스포리파제-촉매작용된 반응에 의한 아이소-부틸 COFA 에스테르의 생성
수성 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 완충액(0.20 M, pH 5.3), 아이소부탄올(2-메틸-1-프로판올), 포스포리파제(포스포리파제 A; 시그마알드리치, L3295-250) 및 옥수수유로부터 제조된 옥수수유 지방산을 함유하는 반응 혼합물을 30℃에서 교반하고(표 21), 시료를 사전결정된 시간에 각 반응 혼합물로부터 빼내고, 즉시 원심분리하고, 수층 및 유기층을 분리하고, 아이소부탄올(i-BuOH) 및 옥수수유 지방산의 아이소부틸 에스테르(i-BuO-COFA)에 대하여 분석하였다(표 22).
Figure pct00022
Figure pct00023
실시예 33
물과 추출제 간의 아이소부탄올에 대한 분배 계수의 비교
아이소부탄올의 수용액(30 g/ℓ)을 옥수수유 지방산(COFA), 올레산 또는 옥수수유 트라이글리세리드와 혼합하고, 그들의 측정된 분배 계수를 올레일 알코올에 대하여 측정된 분배 계수와 비교하여, 표에 기록하였다. 결과는 표 23에 나타나 있다.
Figure pct00024
실시예 34
옥수수유로부터의 하이드록실화된 트라이글리세리드
기계식 교반기 및 첨가 깔때기가 장착된 3구 500㎖ 플라스크에 옥수수유(50.0 g), 톨루엔(25.0 ㎖), 암베라이트(Amberlyte) IR-120 수지(12.5 g) 및 빙초산(7.5 g)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃로 가열한 다음, 과산화수소(수 중의 30% H2O2 41.8 g)를 1시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 후처리하였다: 수지를 여과에 의해 제거하고, 여액을 에틸 아세테이트(75 ㎖) 및 물(50 ㎖) 사이에 분배하였다. 층을 분리한 후에, 유기층을 NaHCO3 포화 수용액(50 ㎖) 및 염수(50 ㎖)로 세정하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜, 48.9g의 황색 오일을 얻었다. 미정제 반응 생성물의 1H NMR 분석에 의해, 63%의 이중 결합이 에폭시드화된 것이 밝혀졌다.
A. 옥수수유 하이드록실화(63% 하이드록실화)
기계식 교반기 및 첨가 깔때기가 장착된 3구 500㎖ 플라스크에 옥수수유(50.0 g), 톨루엔(25.0 ㎖), 암베라이트(Amberlyte) IR-120 수지(12.5 g) 및 빙초산(7.5 g)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃로 가열한 다음, 과산화수소(수 중의 30% H2O2 41.8 g)를 1시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 후처리하였다: 수지를 여과에 의해 제거하고, 여액을 에틸 아세테이트(75 ㎖) 및 물(50 ㎖) 사이에 분배하였다. 층을 분리한 후에, 유기층을 NaHCO3 포화 수용액(50 ㎖) 및 염수(50 ㎖)로 세정하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜, 48.9g의 황색 오일을 얻었다. 미정제 반응 생성물의 1H NMR 분석에 의해, 63%의 이중 결합이 에폭시드화된 것이 밝혀졌다.
500 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 에폭시드화된 옥수수유(20.0 g), 테트라하이드로푸란(THF)(100.0 ㎖) 및 황산(50 ㎖의 1.7 M 수용액)을 첨가하였다. 탁한 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 물(100 ㎖) 및 에틸 아세테이트(200 ㎖) 사이로의 분배에 의해 후처리하였다. 유기층을 물(3x50 ㎖)에 이어서, 염수(50 ㎖)로 세정하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시켜, 19.9 g의 진황색 오일(63%의 하이드록실화 옥수수유)을 얻었다.
B. 옥수수유 하이드록실화(47% 하이드록실화 )
기계식 교반기 및 첨가 깔때기가 장착된 3구 500 ㎖ 플라스크에 옥수수유(50.0 g), 톨루엔(25.0 ㎖), 암베라이트 IR-120 수지(12.5 g) 및 빙초산(7.5 g)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃로 가열한 다음, 과산화수소(수 중의 30% H2O2 41.8 g)를 1시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 후처리하였다: 수지를 여과에 의해 제거하고, 여액을 에틸 아세테이트(75 ㎖) 및 물(50 ㎖) 사이에 분배하였다. 층을 분리한 후에, 유기층을 NaHCO3 포화 수용액(50 ㎖) 및 염수(50 ㎖)로 세정하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜, 49.8g의 황색 오일을 얻었다. 미정제 반응 생성물의 1H NMR 분석에 의해, 47%의 이중 결합이 에폭시드화된 것이 밝혀졌다.
500 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 에폭시드화된 옥수수유(20.0 g), THF(100.0 ㎖) 및 황산(50 ㎖의 1.7M 수용액)을 첨가하였다. 탁한 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 물(100 ㎖) 및 에틸 아세테이트(200 ㎖) 사이로의 분배에 의해 후처리하였다. 유기층을 물(3x50 ㎖)에 이어서, 염수(50 ㎖)로 세정하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시켜, 19.2 g의 진황색 오일(47%의 하이드록실화 옥수수유)을 얻었다.
C. 옥수수유 하이드록실화(28% 하이드록실화)
기계식 교반기 및 첨가 깔때기가 장착된, 3구 500 ㎖ 플라스크에 옥수수유(50.0 g), 톨루엔(25.0 ㎖), 암베라이트 IR-120 수지(12.5 g) 및 빙초산(7.5g)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃로 가열한 다음, 과산화수소(수 중의 30% H2O2 41.8 g)를 1시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 후처리하였다: 수지를 여과에 의해 제거하고, 여액을 에틸 아세테이트(75 ㎖) 및 물(50 ㎖) 사이에 분배하였다. 층을 분리한 후에, 유기층을 NaHCO3 포화 수용액(50 ㎖) 및 염수(50 ㎖)로 세정하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜, 47.2 g의 황색 오일을 얻었다. 미정제 반응 생성물의 1H NMR 분석에 의해, 28%의 이중 결합이 에폭시드화된 것이 밝혀졌다.
500 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 에폭시드화된 옥수수유(20.0 g), THF(100.0 ㎖) 및 황산(50 ㎖의 1.7M 수용액)을 첨가하였다. 탁한 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 물(100 ㎖) 및 에틸 아세테이트(200 ㎖) 사이로의 분배에 의해 후처리하였다. 유기층을 물(3x50 ㎖)에 이어서, 염수(50 ㎖)로 세정하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시켜, 20.3 g의 진황색 오일(28%의 하이드록실화 옥수수유)을 얻었다.
분배 계수 측정
5 ㎖ 바이얼에 0.910 g의 67% 하이드록실화된 옥수수유 및 0.910 ㎖의 3wt% i-BuOH 수 용액을 첨가하였다. 2상 혼합물을 볼텍스 제니(등록 상표)를 사용하여 10분 동안 격렬하게 교반하였다. 혼합 시에, 피셔 사이언티픽 센트리픽(Fisher Scientific Centrific) 228 원심분리기(3300 rpm)를 사용하여 10분 동안 혼합물을 원심분리시킴으로써 층의 분리를 도왔다. 0.100 g의 둘 모두의 층을 취하였다. 상측의 유기층을 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르의 톨루엔 용액(10.1 ㎎/㎖)을 사용하여 1.00 ㎖로 희석하고, 수층을 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르의 메탄올 용액(10.2 ㎎/㎖)을 사용하여 1.00 ㎖로 희석하였다. 둘 모두의 상 중의 i-BuOH의 농도를 보정 기체 크로마토그래피(GC)를 사용하여 측정하였다. 동일한 절차를 47% 및 28% 하이드록실화된 옥수수유에 대하여 반복하였다. 따라서, 측정된 분배 계수는 67% 하이드록실화된 옥수수유에 대하여 3.2, 47% 하이드록실화된 옥수수유에 대하여 2.3, 및 28% 하이드록실화된 옥수수유에 대하여 2.1이었다.
상기 약술된 절차를 6% i-BuOH 수 용액을 사용하여 반복하였다. 67%-, 47%- 및 28%-하이드록실화된 옥수수유에 대한 분배 계수는 각각 2.9, 2.9 및 2.0이었다.
실시예 34
옥수수유로부터의 지방산 아미드 + 지방산 및 순수 지방산 아미드
옥수수유를 문헌[Roe, et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 29:18-22, 1952]에 기재된 방식과 유사한 방식으로 수성 수산화암모늄과 함께 반응시켰다. 마졸라(Mazola)(등록 상표) 옥수수유(0.818 ℓ, 755 g)를 1 갤런 스테인리스 강 반응기에 두고, 이에 1.71 ℓ(1540 g)의 수성 수산화암모늄(NH3로서 28%)을 첨가하였다. 반응기를 교반하면서 160℃로 가열하고, 7시간 동안 교반하면서 그 온도로 유지시키고, 그 동안 압력은 2.76 MPa(400 psi)에 도달하였다. 반응기를 냉각시키고, 생성물, 즉 연황색 고체를 제거하고, 반응기를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 생성물을 5 ℓ 에틸 아세테이트에 용해시키고, H2SO4로 중화시킨 500 ㎖의 각각의 물로 5회 세정하였다. 이어서, 에틸 아세테이트를 무수 Na2SO4로 건조시키고, 용매를 회전식 진공기에서 제거하여, 연갈색의 연질의 고체가 남겨졌다.
CDCl3에서의 13C NMR에 의해, 생성물에 대략 2:1 비의 지방산 아미드 대 지방산이 포함되어 있으며, 옥수수유의 생성물으로의 전환이 정량적이었음이 나타났다. 생성물은 융점이 57-58℃였으나, 물로 포화되는 경우 약 11℃ 정도 떨어졌다.
순수 옥수수유 지방산 아미드를 촉매로서 암모늄 아세테이트와 함께 무수 암모니아를 사용하여 문헌[Kohlhase, et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 48:265-270, 1971]에 따라 옥수수유로부터 합성하였다.
3그램의 암모늄 아세테이트를 400 ㎖ 스테인리스 강 쉐이커 튜브에 두고, 이에 51.8 g의 옥수수유를 첨가하였다. 이어서, 무수 암모니아(89.7 g)를 첨가하고, 반응기를 밀봉하고, 125℃에서 7시간 동안 가열하고, 그 동안에 압력은 8.96 MPa(1300 psi)에 도달하였다. 반응기를 냉각시키고, 옅은 색의 고체를 제거하고, 반응기를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 이어서, 에틸 아세테이트에 용해된 생성물을 상기 지방산 아미드/지방산 혼합물의 경우에서와 같이 후처리하였다.
지방산을 NaOH를 사용한 염기 가수분해에 의하여 옥수수유로부터 합성하였다. 둥근 바닥 플라스크(5ℓ)에 기계식 교반기, 열전쌍, 가열 맨틀, 응축기 및 질소 티(nitrogen tee)를 장착하였다. 500 g의 식품 등급의 옥수수유, 1 ℓ의 물 및 75 g의 수산화나트륨을 주입하였다. 혼합물을 90℃로 가열하고, 3시간 동안 유지시키고, 이 동안에 이것은 단일의 농후한 에멀젼-유사 단일 상이 되었다. 이 기간의 마지막에, TLC에 의해, 혼합물에 남아있는 옥수수유가 없음이 나타났다. 이어서, 혼합물을 72℃로 냉각하고, 500 ㎖의 25% 황산을 첨가하여 혼합물을 산성화시켰다. 이어서, 이를 실온으로 냉각시키고, 2 ℓ의 다이에틸 에테르를 첨가하였다. 에테르 층을 1% 황산 1 ℓ로 3회, 포화 염수 1 ℓ로 1회 세정하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하였다. 에테르를 회전식 증발기에 의해 제거한 다음, 오일을 하룻밤 질소로 퍼지시켜, 하룻밤 부분적으로 결정화된 470 g의 황색 오일을 수득하였다. AOCS 방법 Ca 5a-40을 통한 유리 지방산에 대한 적정에 의해, 올레산으로 표현되는 95%의 지방산 함량이 나타났다. 104 ㎎을 1 ㎖의 무수 피리딘에서 100 ㎕의 N-메틸-N-(트라이메틸실릴)트라이플루오로아세트아미드와 반응시킴으로써 시료를 실란 처리하였다. 실란 처리된 생성물의 기체 크로마토그래피-질량 분석법(GCMS) 분석에 의해, 16:0, 18:2, 18:1, 18:0 및 20:0 산의 TMS 유도체의 존재가 나타났다.
3가지 제제: (1) 수성 암모니아로부터의 옥수수유 지방산 아미드 및 옥수수유 지방산의 2:1 혼합물, (2) 순수 옥수수유 지방산 아미드:순수 옥수수유 지방산의 2:1 혼합물, 및 (3) 순수 옥수수유 지방산 아미드:옥수수유 지방산의 1:2 혼합물을 모두, 수 중의 3% 용액으로부터 아이소부탄올을 추출하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. 각각의 700 밀리그램을 20 ㎖ 신틸레이션 바이얼 중의 3% 아이소부탄올을 함유하는 2.1 ㎖의 물에 첨가하고, 30℃에서 하룻밤 회전식 쉐이커에 두었다. 모든 3가지 경우에, 유기상은 이러한 온도에서 액체가 되었으며, 이는 아이소부탄올의 포함과 함께, 융점이 추가로 감소되는 것을 나타낸다. 50 마이크로리터의 상부 상을 GC 표준물질로서 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르를 함유하는 톨루엔(10.068 ㎎/㎖) 200 ㎕ 또는 동일한 농도의 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르를 함유하는 아이소프로판올 200 ㎕로 희석하였다. 50 마이크로리터의 하부 상을 150 ㎕의 메탄올 및 동일한 농도의 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르를 함유하는 아이소프로판올 50 ㎕ 중 어느 하나로 희석하였다. 둘 모두의 상 중의 아이소부탄올의 농도를 보정 GC를 사용하여 측정하였다. 측정된 분배 계수는 하기와 같았다: (1)에 대하여 3.81, (2)에 대하여 4.31, 및 (3)에 대하여 3.58.
지방산 아미드/지방산 수성 암모니아 제제(1) 및 순수 옥수수유 지방산과 1:1(1:2 지방산 아미드:지방산과 등가) 혼합된 제제 (1)로 구성된 제제 (1a)를 3부의 브로쓰 대 1부의 아미드/산 혼합물의 비로 사카로마이세스 부타놀로겐 NGCI-070을 함유하는 발효 브로쓰가 있는 쉐이크 플라스크에서 인큐베이션시켰다. 제제 (1)은 연질의 고체였으며, 제제 (1a)는 30℃에서 액체였다. 그 다음, 8.35 g/ℓ의 글루코스 농도에서 시작하여, 쉐이크 플라스크를 인큐베이터 쉐이커에서 25시간 동안 인큐베이션시키고, 글루코스의 소모를 시간의 함수로서 추적하였다. 표 24는 둘 모두의 비에서 지방산 아미드/지방산 혼합물이 부타놀로겐에 대하여 비독성이었음을 나타내며, 심지어, 올레일 알코올에서보다 더 큰 글루코스 활용 속도를 보여주었다.
Figure pct00025
실시예 35
옥수수유로부터의 지방산 알코올
옥수수유로부터 지방산 알코올을 생성하기 위한 상기의 식 IV의 반응을 참고하여, 기계식 교반기, N2 공급원이 있는 환류식 응축기, 첨가 깔때기, 내부 열전쌍 및 고무 격막(rubber septum)이 장착된 22ℓ의 둥근 바닥 플라스크를 질소 하에서 화염 건조시켰다. 플라스크에, 드라이 박스(dry box)에서 칭량하고, 고체 첨가 깔때기로 로딩한 132 g(3.30 몰)의 95% 리튬 알루미늄 하이드라이드 분말을 주입하였다. 22ℓ 플라스크를 아이스 배쓰로 냉각시키고, 9.0 리터의 무수 THF를 캐뉼라를 통해 반응기에 첨가하였다. 생성된 슬러리를 0-5℃로 냉각시키고, 1.00 리터의 무수 THF 중의 956 g(1.10 몰)의 웨슨(Wesson)(등록 상표) 옥수수유의 용액을 2 내지 3시간에 걸쳐 적가하면서, 반응 온도를 5-20℃로 유지시켰다. 옥수수유의 첨가 후에, 슬러리를 주위 온도에서 하룻밤 교반하였다. TLC로 확인시, 반응이 행해진 후에, 이를 370 ㎖의 THF에 용해된 130 g의 물의 용액의 적가에 의해 켄칭시켰다. 이어서, 130 g의 15% NaOH 수용액을 첨가하고, 400 g의 물의 첨가로 이어졌다. 혼합물을 격렬하게 교반하면서, 실온으로 가온시키고, 백색 과립형 고체를 생성하였다. 고체를 용융-유리 필터 깔때기를 사용하여 여과해내고, 추가의 THF로 세정하였다. THF를 회전식 증발기에서 제거하고, 잔류물을 3.00 리터의 에틸 아세테이트에 취하였다. 생성 용액을 1.00 ℓ의 물로 2회, 1.00 ℓ의 염수로 1회 세정하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축시켜, 836 g(97%)의 지방산 알코올을 황색 오일로 제공하였다. 이어서, 미정제 지방산 알코올 혼합물을 증류시키고(140℃/0.13 ㎪(1 mmHg)), 하기의 분배 계수 실험에서 사용하였다.
분배 계수 실험
각각의 5개의 5-㎖ 바이얼에, 1 ㎖의 지방산 알코올 혼합물 및 1 ㎖의 3 wt% i-BuOH 수 용액을 첨가하였다. 2상 혼합물을 볼텍스 제니(등록 상표)를 사용하여 각각 10, 20, 30, 40 및 60분 동안 격렬하게 교반하였다. 혼합 시에, 피셔 사이언티픽 센트리픽 228 원심분리기(3300 rpm)를 사용하여 10분 동안 혼합물을 원심분리시킴으로써 층의 분리를 도왔다. 0.100 ㎖의 둘 모두의 층을 취하였다. 상측의 유기층을 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르의 톨루엔 용액을 사용하여 1.00 ㎖로 희석하고, 수층을 에틸렌 글리콜 다이에틸에테르의 메탄올 용액을 사용하여 1.00 ㎖로 희석하였다. 둘 모두의 상 중의 i-BuOH의 농도를 보정 GC를 사용하여 측정하였다. 이에 따라 측정된 분배 계수는 2.70이었다.
상술된 바와 동일한 분배 계수 측정을 6 wt% i-BuOH 농도에 대하여 시행하였다. 이에 따라 측정된 분배 계수는 3.06이었다.
본 발명의 다양한 실시형태가 상술되어 있지만, 이들이 오직 예시의 방식으로 제시되며 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 다양한 형태 및 상세 사항의 변화가 본 발명의 목적 및 범주로부터 벗어남 없이 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 폭 및 범주는 상술된 예시적인 실시형태 중 임의의 것에 의해 제한되어서는 안되며, 하기의 특허청구범위 및 그들의 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
본 상세한 설명에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원서는 본 발명이 속한 당업자의 기술 수준을 나타내며, 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원서가 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타나는 것처럼 동일한 범주로 본 명세서에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Butamax(TM) Advanced Biofuels <120> EXTRACTION SOLVENTS DERIVED FROM OIL FOR ALCOHOL REMOVAL IN EXTRACTIVE FERMENTATION <130> CL5005 <150> US 61/368,444 <151> 2010-07-28 <160> 145 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11844 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Plasmid <400> 1 tcccattacc gacatttggg cgctatacgt gcatatgttc atgtatgtat ctgtatttaa 60 aacacttttg tattattttt cctcatatat gtgtataggt ttatacggat gatttaatta 120 ttacttcacc accctttatt tcaggctgat atcttagcct tgttactagt tagaaaaaga 180 catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc tagaagcaaa 240 aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca acgcaatatg 300 gattgtcaga atcatataaa agagaagcaa ataactcctt gtcttgtatc aattgcatta 360 taatatcttc ttgttagtgc aatatcatat agaagtcatc gaaatagata ttaagaaaaa 420 caaactgtac aatcaatcaa tcaatcatcg ctgaggatgt tgacaaaagc aacaaaagaa 480 caaaaatccc ttgtgaaaaa cagaggggcg gagcttgttg ttgattgctt agtggagcaa 540 ggtgtcacac atgtatttgg cattccaggt gcaaaaattg atgcggtatt 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10440 gtgacaacag cgcgttagaa ggtacaaaat cttcttgctt tttatctatg tacttgcctt 10500 tatattcaat ttcggacaag tcaagaagag atgatatcag ggattcgaag tcgaaatttt 10560 ggattctttc gttgaaaatt ttaccttcat cgatattcaa ggaaatcatt ttattttcat 10620 taagatggtg agtaaatgca cccgtactag aatcggtaag ctttacaccc aacataagaa 10680 taaaatcagc agattccaca aattccttca agtttggctc tgacagagta ccgttgtaaa 10740 tccccaaaaa tgagggcaat gcttcatcaa cagatgattt accaaagttc aaagtagtaa 10800 taggtaactt agtctttgaa ataaactgag taacagtctt ctctaggccg aacgatataa 10860 tttcatggcc tgtgattaca attggtttct tggcattctt cagactttcc tgtattttgt 10920 tcagaatctc ttgatcagat gtattcgacg tggaattttc cttcttaaga ggcaaggatg 10980 gtttttcagc cttagcggca gctacatcta caggtaaatt gatgtaaacc ggctttcttt 11040 cctttagtaa ggcagacaac actctatcaa tttcaacagt tgcattctcg gctgtcaata 11100 aagtcctggc agcagtaacc ggttcgtgca tcttcataaa gtgcttgaaa tcaccatcag 11160 ccaacgtatg gtgaacaaac ttaccttcgt tctgcacttt cgaggtagga gatcccacga 11220 tctcaacaac aggcaggttc tcagcatagg agcccgctaa gccattaact 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atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 13800 catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 13860 ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 13920 caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 13980 ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 14040 tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 14100 cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 14160 aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 14220 tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 14280 gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 14340 cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 14400 aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 14460 tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 14520 tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 14580 gggcgacacg 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aacctagagg ccttttgatg ttagcagaat tgtcatgcaa 780 gggctcccta tctactggag aatatactaa gggtactgtt gacattgcga agagcgacaa 840 agattttgtt atcggcttta ttgctcaaag agacatgggt ggaagagatg aaggttacga 900 ttggttgatt atgacacccg gtgtgggttt agatgacaag ggagacgcat tgggtcaaca 960 gtatagaacc gtggatgatg tggtctctac aggatctgac attattattg ttggaagagg 1020 actatttgca aagggaaggg atgctaaggt agagggtgaa cgttacagaa aagcaggctg 1080 ggaagcatat ttgagaagat gcggccagca aaactaaaaa actgtattat aagtaaatgc 1140 atgtatacta aactcacaaa ttagagcttc aatttaatta tatcagttat taccctatgc 1200 ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggaaa ttgtaaacgt 1260 taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata 1320 ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt 1380 tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg 1440 aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagataact 1500 tcgtataatg tatgctatac gaacggtacc agtgatgata caacgagtta gccaaggtg 1559 <210> 69 <211> 1047 <212> DNA <213> Achromobacter xylosoxidans <400> 69 atgaaagctc tggtttatca cggtgaccac aagatctcgc ttgaagacaa gcccaagccc 60 acccttcaaa agcccacgga tgtagtagta cgggttttga agaccacgat ctgcggcacg 120 gatctcggca tctacaaagg caagaatcca gaggtcgccg acgggcgcat cctgggccat 180 gaaggggtag gcgtcatcga ggaagtgggc gagagtgtca cgcagttcaa gaaaggcgac 240 aaggtcctga tttcctgcgt cacttcttgc ggctcgtgcg actactgcaa gaagcagctt 300 tactcccatt gccgcgacgg cgggtggatc ctgggttaca tgatcgatgg cgtgcaggcc 360 gaatacgtcc gcatcccgca tgccgacaac agcctctaca agatccccca gacaattgac 420 gacgaaatcg ccgtcctgct gagcgacatc ctgcccaccg gccacgaaat cggcgtccag 480 tatgggaatg tccagccggg cgatgcggtg gctattgtcg gcgcgggccc cgtcggcatg 540 tccgtactgt tgaccgccca gttctactcc ccctcgacca tcatcgtgat cgacatggac 600 gagaatcgcc tccagctcgc caaggagctc ggggcaacgc acaccatcaa ctccggcacg 660 gagaacgttg tcgaagccgt gcataggatt gcggcagagg gagtcgatgt tgcgatcgag 720 gcggtgggca taccggcgac ttgggacatc tgccaggaga tcgtcaagcc cggcgcgcac 780 atcgccaacg tcggcgtgca tggcgtcaag gttgacttcg 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catctgttga tgaagcattg ccctcatttt tggggattta caacggtact 780 ctgtcagagc caaacttgaa ggaatttgtg gaatctgctg attttattct tatgttgggt 840 gtaaagctta ccgattctag tacgggtgca tttactcacc atcttaatga aaataaaatg 900 atttccttga atatcgatga aggtaaaatt ttcaacgaaa gaatccaaaa tttcgacttc 960 gaatccctga tatcatctct tcttgacttg tccgaaattg aatataaagg caagtacata 1020 gataaaaagc aagaagattt tgtaccttct aacgcgctgt tgtcacaaga tagactgtgg 1080 caagctgtcg aaaatttgac ccaaagtaat gagacgatcg tggctgaaca aggcacttct 1140 ttcttcggtg cctcatctat atttctgaaa tcgaaatcac attttattgg tcaacccttg 1200 tggggatcta taggatacac tttccccgca gctctaggca gccaaattgc agataaagaa 1260 tctagacatt tattgtttat cggagatgga tcattgcaac tgactgtcca agaattagga 1320 ctagccatta gagagaagat aaacccaatc tgctttatca ttaataacga tggttacacg 1380 gttgagaggg aaattcatgg tccgaaccag agttataatg acattcctat gtggaattac 1440 tcaaaactgc cagaaagttt cggggcaacg gaagacagag ttgtgtccaa aattgtgaga 1500 acagaaaatg aattcgtatc cgtgatgaaa gaagctcaag cagatccaaa taggatgtat 1560 tggatagaac ttattctagc aaaggagggt gcacctaaag ttttgaaaaa gatgggtaag 1620 ttatttgcag aacaaaacaa gagc 1644 <210> 72 <211> 753 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 72 gcatgcttgc atttagtcgt gcaatgtatg actttaagat ttgtgagcag gaagaaaagg 60 gagaatcttc taacgataaa cccttgaaaa actgggtaga ctacgctatg ttgagttgct 120 acgcaggctg cacaattaca cgagaatgct cccgcctagg atttaaggct aagggacgtg 180 caatgcagac gacagatcta aatgaccgtg tcggtgaagt gttcgccaaa cttttcggtt 240 aacacatgca gtgatgcacg cgcgatggtg ctaagttaca tatatatata tatagccata 300 gtgatgtcta agtaaccttt atggtatatt tcttaatgtg gaaagatact agcgcgcgca 360 cccacacaca agcttcgtct tttcttgaag aaaagaggaa gctcgctaaa tgggattcca 420 ctttccgttc cctgccagct gatggaaaaa ggttagtgga acgatgaaga ataaaaagag 480 agatccactg aggtgaaatt tcagctgaca gcgagtttca tgatcgtgat gaacaatggt 540 aacgagttgt ggctgttgcc agggagggtg gttctcaact tttaatgtat ggccaaatcg 600 ctacttgggt ttgttatata acaaagaaga aataatgaac tgattctctt cctccttctt 660 gtcctttctt aattctgttg taattacctt cctttgtaat tttttttgta attattcttc 720 ttaataatcc aaacaaacac acatattaca ata 753 <210> 73 <211> 316 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 73 gagtaagcga atttcttatg atttatgatt tttattatta aataagttat aaaaaaaata 60 agtgtataca aattttaaag tgactcttag gttttaaaac gaaaattctt attcttgagt 120 aactctttcc tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc atgaggtcgc tcttattgac 180 cacacctcta ccggcatgcc gagcaaatgc ctgcaaatcg ctccccattt cacccaattg 240 tagatatgct aactccagca atgagttgat gaatctcggt gtgtatttta tgtcctcaga 300 ggacaacacc tgtggt 316 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 74 ggaattcaca catgaaagct ctggtttatc 30 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 75 gcgtccaggg cgtcaaagat caggcagc 28 <210> 76 <211> 55 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 76 aaacaaacac acatattaca atagctgagg atgaaagctc tggtttatca cggtg 55 <210> 77 <211> 55 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 77 atcataagaa attcgcttac tcttaattaa tcaggcagcg cctgcgttcg agagg 55 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cctgtattcc tttactatcc tcctttttct ccttcttgat aaatgtatgt agattgcgta 4200 tatagtttcg tctaccctat gaacatattc cattttgtaa tttcgtgtcg tttctattat 4260 gaatttcatt tataaagttt atgtacaaat atcataaaaa aagagaatct ttttaagcaa 4320 ggattttctt aacttcttcg gcgacagcat caccgacttc ggtggtactg ttggaaccac 4380 ctaaatcacc agttctgata cctgcatcca aaaccttttt aactgcatct tcaatggcct 4440 taccttcttc aggcaagttc aatgacaatt tcaacatcat tgcagcagac aagatagtgg 4500 cgatagggtc aaccttattc tttggcaaat ctggagcaga accgtggcat ggttcgtaca 4560 aaccaaatgc ggtgttcttg tctggcaaag aggccaagga cgcagatggc aacaaaccca 4620 aggaacctgg gataacggag gcttcatcgg agatgatatc accaaacatg ttgctggtga 4680 ttataatacc atttaggtgg gttgggttct taactaggat catggcggca gaatcaatca 4740 attgatgttg aaccttcaat gtagggaatt cgttcttgat ggtttcctcc acagtttttc 4800 tccataatct tgaagaggcc aaaagattag ctttatccaa ggaccaaata ggcaatggtg 4860 gctcatgttg tagggccatg aaagcggcca ttcttgtgat tctttgcact tctggaacgg 4920 tgtattgttc actatcccaa gcgacaccat caccatcgtc ttcctttctc ttaccaaagt 4980 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tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 1320 ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 1380 tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 1440 gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 1500 agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 1560 atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 1620 tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 1680 gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 1740 agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 1800 cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 1860 ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 1920 ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 1980 actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 2040 ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 2100 atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 2160 caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 2220 attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt 2280 ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt 2340 ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg 2400 tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 2460 cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca 2520 ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag 2580 ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag 2640 tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa ttcgagctcg gtacccccgg ctctgagaca 2700 gtagtaggtt agtcatcgct ctaccgacgc gcaggaaaag aaagaagcat tgcggattac 2760 gtattctaat gttcagcccg cggaacgcca gcaaatcacc acccatgcgc atgatactga 2820 gtcttgtaca cgctgggctt ccagtgtact gagagtgcac cataccacag cttttcaatt 2880 caattcatca tttttttttt attctttttt ttgatttcgg tttctttgaa atttttttga 2940 ttcggtaatc tccgaacaga aggaagaacg aaggaaggag cacagactta gattggtata 3000 tatacgcata tgtagtgttg aagaaacatg aaattgccca gtattcttaa cccaactgca 3060 cagaacaaaa acctgcagga aacgaagata aatcatgtcg aaagctacat ataaggaacg 3120 tgctgctact catcctagtc ctgttgctgc caagctattt aatatcatgc acgaaaagca 3180 aacaaacttg tgtgcttcat tggatgttcg taccaccaag gaattactgg agttagttga 3240 agcattaggt cccaaaattt gtttactaaa aacacatgtg gatatcttga ctgatttttc 3300 catggagggc acagttaagc cgctaaaggc attatccgcc aagtacaatt ttttactctt 3360 cgaagacaga aaatttgctg acattggtaa tacagtcaaa ttgcagtact ctgcgggtgt 3420 atacagaata gcagaatggg cagacattac gaatgcacac ggtgtggtgg gcccaggtat 3480 tgttagcggt ttgaagcagg cggcagaaga agtaacaaag gaacctagag gccttttgat 3540 gttagcagaa ttgtcatgca agggctccct atctactgga gaatatacta agggtactgt 3600 tgacattgcg aagagcgaca aagattttgt tatcggcttt attgctcaaa gagacatggg 3660 tggaagagat gaaggttacg attggttgat tatgacaccc ggtgtgggtt tagatgacaa 3720 gggagacgca ttgggtcaac agtatagaac cgtggatgat gtggtctcta caggatctga 3780 cattattatt gttggaagag gactatttgc aaagggaagg gatgctaagg tagagggtga 3840 acgttacaga aaagcaggct gggaagcata tttgagaaga tgcggccagc aaaactaaaa 3900 aactgtatta taagtaaatg catgtatact aaactcacaa attagagctt caatttaatt 3960 atatcagtta ttaccctatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 4020 gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat 4080 cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ttcagcccgc ggaacgccag 4140 caaatcacca cccatgcgca tgatactgag tcttgtacac gctgggcttc cagtgatgat 4200 acaacgagtt agccaaggtg agcacggatg tctaaattag aattacgttt taatatcttt 4260 ttttccatat ctagggctag 4280 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 81 gcatgcttgc atttagtcgt gcaatgtatg 30 <210> 82 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 82 gaacattaga atacgtaatc cgcaatgcac tagtaccaca ggtgttgtcc tctg 54 <210> 83 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 83 cagaggacaa cacctgtggt actagtgcat tgcggattac gtattctaat gttc 54 <210> 84 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120 ctttcgctgg caacgccggt tgatgaagcc tgggacggtc cgctctcctt aaacggtaaa 180 cgtatcgcca cctcttatcc tcacctgctc aagcgttatc tcgaccagaa aggcatctct 240 tttaaatcct gcttactgaa cggttctgtt gaagtcgccc cgcgtgccgg actggcggat 300 gcgatttgcg atctggtttc caccggtgcc acgctggaag ctaacggcct gcgcgaagtc 360 gaagttatct atcgctcgaa agcctgcctg attcaacgcg atggcgaaat ggaagaatcc 420 aaacagcaac tgatcgacaa actgctgacc cgtattcagg gtgtgatcca ggcgcgcgaa 480 tcaaaataca tcatgatgca cgcaccgacc gaacgtctgg atgaagtcat ggtacctact 540 gagagtgcac cataccacag cttttcaatt caattcatca tttttttttt attctttttt 600 ttgatttcgg tttctttgaa atttttttga ttcggtaatc tccgaacaga aggaagaacg 660 aaggaaggag cacagactta gattggtata tatacgcata tgtagtgttg aagaaacatg 720 aaattgccca gtattcttaa cccaactgca cagaacaaaa acctgcagga aacgaagata 780 aatcatgtcg aaagctacat ataaggaacg tgctgctact catcctagtc ctgttgctgc 840 caagctattt aatatcatgc acgaaaagca aacaaacttg tgtgcttcat tggatgttcg 900 taccaccaag gaattactgg agttagttga agcattaggt cccaaaattt gtttactaaa 960 aacacatgtg gatatcttga ctgatttttc catggagggc acagttaagc cgctaaaggc 1020 attatccgcc aagtacaatt ttttactctt cgaagacaga aaatttgctg acattggtaa 1080 tacagtcaaa ttgcagtact ctgcgggtgt atacagaata gcagaatggg cagacattac 1140 gaatgcacac ggtgtggtgg gcccaggtat tgttagcggt ttgaagcagg cggcagaaga 1200 agtaacaaag gaacctagag gccttttgat gttagcagaa ttgtcatgca agggctccct 1260 atctactgga gaatatacta agggtactgt tgacattgcg aagagcgaca aagattttgt 1320 tatcggcttt attgctcaaa gagacatggg tggaagagat gaaggttacg attggttgat 1380 tatgacaccc ggtgtgggtt tagatgacaa gggagacgca ttgggtcaac agtatagaac 1440 cgtggatgat gtggtctcta caggatctga cattattatt gttggaagag gactatttgc 1500 aaagggaagg gatgctaagg tagagggtga acgttacaga aaagcaggct gggaagcata 1560 tttgagaaga tgcggccagc aaaactaaaa aactgtatta taagtaaatg catgtatact 1620 aaactcacaa attagagctt caatttaatt atatcagtta ttaccctatg cggtgtgaaa 1680 taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt 1740 gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1800 cggcaaaatc tctagagtgc tggaagaaga gctgcttaac cgccgcgccc agggtgaaga 1860 tccacgctac tttaccctgc gtcgtctgga tttcggcggc tgtcgtcttt cgctggcaac 1920 gccggttgat gaagcctggg acggtccgct ctccttaaac ggtaaacgta tcgccacctc 1980 ttatcctcac ctgctcaagc gttatctcga ccagaaaggc atctctttta aatcctgctt 2040 actgaacggt tctgttgaag tcgccccgcg tgccggactg gcggatgcga tttgcgatct 2100 ggtttccacc ggtgccacgc tggaagctaa cggcctgcgc gaagtcgaag ttatctatcg 2160 ctcgaaagcc tgcctgattc aacgcgatgg cgaaatggaa gaatccaaac agcaactgat 2220 cgacaaactg ctgacccgta ttcagggtgt gatccaggcg cgcgaatcaa aatacatcat 2280 gatgcacgca ccgaccgaac gtctggatga agtcatccag tgatgataca acgagttagc 2340 caaggtg 2347 <210> 96 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 96 cttcgaagaa tatactaaaa aatgagcagg caagataaac gaaggcaaag gcattgcgga 60 ttacgtattc taatgttcag 80 <210> 97 <211> 81 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 97 tatacacatg tatatatatc gtatgctgca gctttaaata atcggtgtca caccttggct 60 aactcgttgt atcatcactg g 81 <210> 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gtaaaatctt tagaaaagac tctttctaag gtgcactctt ctccttcgtc taactccttg 420 aaaagttaca acactcccga gagcagcaac ctgtttatgg gtagcgatga acacaccacc 480 cttgttaatg caaatacagg ctctgcttcc tctgcctcgc atatgcatca gcaacaacag 540 caacagcagc aacaggaaca acaacaagac ttttccagaa gtgcgaacgc caacgcgaat 600 tcctcgtccc tttctatctc aaataaatat gacaacgatg agctggactt aactaaggac 660 tttgatcttt tgcatatcaa aagtaacgga accatccact taggtgccac ccactggttg 720 tctatcatga aaggtgaccc gtacctaaaa cttttgtggg gtcatatctt cgctatgagg 780 gaaaagttaa atgaatggta ctaccaaaaa aattcgtact ctaagctgaa gtcaagcaaa 840 tgtcccatca atcacgcgca agcgccgcct tctgccgctg ccgccgctac cagaaaatgt 900 cctgttgatc actccgcgtt ttcgtctggc atggtggccc caaaggagga gactcctctt 960 cctaggaaat gtccagttga ccacaccatg ttctcttcgg gaatgattcc tcccagagag 1020 gacacttcgt cccagaagag gtgtcccgtt gaccacacca tgtattccgc aggaatgatg 1080 ccgcccaagg acgagacacc ttccccattt tccactaaag ctatgataga ccataacaag 1140 catacaatga atccgcctca gtcaaaatgt cctgtggacc atagaaacta tatgaaggat 1200 tatccctctg acatggcaaa ttcttcttcg aacccggcaa gtcgttgccc cattgaccat 1260 tcaagcatga aaaatacagc ggccttacca gcttcaacgc acaataccat cccacaccac 1320 caaccacagt ccggatctca tgctcgttcg catcccgcac aaagcaggaa acatgattcc 1380 tacatgacag aatctgaagt cctcgcaaca ctttgtgaga tgttgccacc aaagcgcgtc 1440 atcgcattat tcatcgagaa attcttcaaa catttatacc ctgccattcc aatcttagat 1500 gaacagaatt tcaaaaatca cgtgaatcaa atgctttcgt tgtcttcgat gaatcccaca 1560 gttaacaact ttggtatgag catgccatct tcatctacac tagagaacca acccataaca 1620 caaatcaatc ttccaaaact ttccgattct tgtaacttag gtattctgat aataatcttg 1680 agattgacat ggctatccat accttctaat tcctgcgaag tcgacctggg agaagaaagt 1740 ggctcatttt tagtgcccaa cgaatctagc aatatgtctg catctgcatt gacctcgatg 1800 gctaaagaag aatcacttct gctaaagcat gagacaccgg tcgaggcact ggagctatgt 1860 caaaaatact tgattaaatt cgatgaactt tctagtattt ccaataacaa cgttaattta 1920 accacggtgc agtttgccat tttttacaac ttctatatga aaagtgcctc taatgatttg 1980 actaccttga caaataccaa caacactggc atggccaatc ctggtcacga ttccgagtct 2040 caccagatcc tattgtccaa tattactcaa atggccttta gttgtgggtt acacagagac 2100 cctgataatt ttcctcaatt aaacgctacc attccagcaa ccagccagga cgtgtctaac 2160 aacgggagca aaaaggcaaa ccctagcacc aatccaactt tgaataacaa catgtctgct 2220 gccactacca acagcagtag cagatctggc agtgctgatt caagaagtgg ttctaaccct 2280 gtgaacaaga aggaaaatca ggttagtatc gaaagattta aacacacttg gaggaaaatt 2340 tggtattaca ttgttagcat ggatgttaac caatctcttt ccctggggag ccctcgacta 2400 ctaagaaatc tgagggattt cagcgataca aagctaccaa gtgcgtcaag gattgattat 2460 gttcgcgata tcaaagagtt aatcattgtg aagaatttta ctcttttttt ccaaattgat 2520 ttgtgtatta ttgctgtatt aaatcacatt ttgaatgttt ctttagcaag aagcgtgaga 2580 aaatttgaac tggattcatt gattaattta ttgaaaaatc tgacctatgg tactgagaat 2640 gtcaatgatg tagtgagctc cttgatcaac aaagggttat taccaacttc ggaaggtggt 2700 tctgtagatt caaataatga tgaaatttac ggtctaccga aactacccga tattctaaac 2760 catggtcaac ataaccaaaa cttgtatgct gatggaagaa atacttctag tagtgatata 2820 gataagaaat tggaccttcc tcacgaatct acaacgagag ctctattctt ttccaagcat 2880 atgacaatta gaatgttgct gtacttattg aactacattt tgtttactca ttatgaacca 2940 atgggcagtg aagatcctgg tactaatatc ctagctaagg agtacgctca agaggcatta 3000 aattttgcca tggatggcta cagaaactgc atgattttct tcaacaatat cagaaacacc 3060 aattcactat tcgattacat gaatgttatc ttgtcttacc cttgtttgga cattggacat 3120 cgttctttac aatttatcgt ttgtttgatc ctgagagcta aatgtggccc attgactggt 3180 atgcgtgaat catcgatcat tactaatggt acatcaagtg gatttaatag ttcggtagaa 3240 gatgaggacg tcaaagttaa acaagaatct tctgatgaat tgaaaaaaga cgatttcatg 3300 aaagatgtaa atttggattc aggcgattca ttagcagaga ttctaatgtc aagaatgctg 3360 ctatttcaaa aactaacaaa acaactatca aagaagtaca actacgctat tcgtatgaac 3420 aaatccactg gattctttgt ctctttacta gatacacctt caaagaaatc agactcgaaa 3480 tcgggtggta gttcattcat gttgggtaat tggaaacatc caaaggtttc aaacatgagc 3540 ggatttcttg ctggtgacaa agaccaatta cagaaatgcc ccgtgtacca agatgcgctg 3600 gggtttgtta gtccaaccgg tgctaatgaa ggttctgctc cgatgcaagg catgtcctta 3660 cagggctcta ctgctaggat gggagggacc cagttgccac caattagatc atacaaacct 3720 atcacgtaca caagtagtaa tctacgtcgt atgaatgaaa cgggtgaggc agaagctaag 3780 agaagaagat ttaatgatgg ctatattgat aataatagta acaacgatat acctagagga 3840 atcagcccaa aaccttcaaa tgggctatca tcggtgcagc cactattatc gtcattttcc 3900 atgaaccagc taaacggggg taccattcca acggttccat cgttaaccaa cattacttca 3960 caaatgggag ctttaccatc tttagatagg atcaccacta atcaaataaa tttgccagac 4020 ccatctagag atgaagcatt tgacaactcc atcaagcaaa tgacgcctat gacaagtgca 4080 ttcatgaatg ctaatactac aattccaagt tcaactttaa acgggaatat gaacatgaat 4140 ggagctggaa ctgcgaatac agatacaagt gccaacggca gtgctttatc gacactgaca 4200 agcccacaag gctcagactt agcatccaat tctgctacac agtataaacc tgacttagaa 4260 gactttttga tgcaaaattc taactttaat gggctaatga taaatccttc cagtctggta 4320 gaagttgttg gtggatacaa cgatcctaat aaccttggaa gaaatgacgc ggttgatttt 4380 ctacccgttg ataatgttga aattgatggt gttggaataa aaatcaacta tcatctacta 4440 actagtattt acgttactag tatattatca tatacggtgt tagaagatga cgcaaatgat 4500 gagaaa 4506 <210> 111 <211> 99 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 111 tcctttctca attattattt tctactcata acctcacgca aaataacaca gtcaaatcaa 60 tcaaagtatg actgacaaaa aaactcttaa agacttaag 99 <210> 112 <211> 77 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 112 gaacattaga atacgtaatc cgcaatgctt ctttcttttc cgtttaacgt atagacttct 60 aatatatttc tccatac 77 <210> 113 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 113 aaacggaaaa gaaagaagca ttgcggatta cgtattctaa tgttc 45 <210> 114 <211> 88 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 114 tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc 60 caccttggct aactcgttgt atcatcac 88 <210> 115 <211> 1713 <212> DNA <213> Streptococcus mutans <400> 115 atgactgaca aaaaaactct taaagactta agaaatcgta gttctgttta cgattcaatg 60 gttaaatcac ctaatcgtgc tatgttgcgt gcaactggta tgcaagatga agactttgaa 120 aaacctatcg tcggtgtcat ttcaacttgg gctgaaaaca caccttgtaa tatccactta 180 catgactttg gtaaactagc caaagtcggt gttaaggaag ctggtgcttg gccagttcag 240 ttcggaacaa tcacggtttc tgatggaatc gccatgggaa cccaaggaat gcgtttctcc 300 ttgacatctc gtgatattat tgcagattct attgaagcag ccatgggagg tcataatgcg 360 gatgcttttg tagccattgg cggttgtgat aaaaacatgc ccggttctgt tatcgctatg 420 gctaacatgg atatcccagc catttttgct tacggcggaa caattgcacc tggtaattta 480 gacggcaaag atatcgattt agtctctgtc tttgaaggtg tcggccattg gaaccacggc 540 gatatgacca aagaagaagt taaagctttg gaatgtaatg cttgtcccgg tcctggaggc 600 tgcggtggta tgtatactgc taacacaatg gcgacagcta ttgaagtttt gggacttagc 660 cttccgggtt catcttctca cccggctgaa tccgcagaaa agaaagcaga tattgaagaa 720 gctggtcgcg ctgttgtcaa aatgctcgaa atgggcttaa aaccttctga cattttaacg 780 cgtgaagctt ttgaagatgc tattactgta actatggctc tgggaggttc aaccaactca 840 acccttcacc tcttagctat tgcccatgct gctaatgtgg aattgacact tgatgatttc 900 aatactttcc aagaaaaagt tcctcatttg gctgatttga aaccttctgg tcaatatgta 960 ttccaagacc tttacaaggt cggaggggta ccagcagtta tgaaatatct ccttaaaaat 1020 ggcttccttc atggtgaccg tatcacttgt actggcaaaa cagtcgctga aaatttgaag 1080 gcttttgatg atttaacacc tggtcaaaag gttattatgc cgcttgaaaa tcctaaacgt 1140 gaagatggtc cgctcattat tctccatggt aacttggctc cagacggtgc cgttgccaaa 1200 gtttctggtg taaaagtgcg tcgtcatgtc ggtcctgcta aggtctttaa ttctgaagaa 1260 gaagccattg aagctgtctt gaatgatgat attgttgatg gtgatgttgt tgtcgtacgt 1320 tttgtaggac caaagggcgg tcctggtatg cctgaaatgc tttccctttc atcaatgatt 1380 gttggtaaag ggcaaggtga aaaagttgcc cttctgacag atggccgctt ctcaggtggt 1440 acttatggtc ttgtcgtggg tcatatcgct cctgaagcac aagatggcgg tccaatcgcc 1500 tacctgcaaa caggagacat agtcactatt gaccaagaca ctaaggaatt acactttgat 1560 atctccgatg aagagttaaa acatcgtcaa gagaccattg aattgccacc gctctattca 1620 cgcggtatcc ttggtaaata tgctcacatc gtttcgtctg cttctagggg agccgtaaca 1680 gacttttgga agcctgaaga aactggcaaa aaa 1713 <210> 116 <211> 571 <212> PRT <213> Streptococcus mutans <400> 116 Met Thr Asp Lys Lys Thr Leu Lys Asp Leu Arg Asn Arg Ser Ser Val 1 5 10 15 Tyr Asp Ser Met Val Lys Ser Pro Asn Arg Ala Met Leu Arg Ala Thr 20 25 30 Gly Met Gln Asp Glu Asp Phe Glu Lys Pro Ile Val Gly Val Ile Ser 35 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acacagggtt cgacttgtgc agtattcggt 600 ttaggaggag taggactaag cgttattatg gggtgtaaag ctgcaggcgc agcgaggatt 660 ataggtgtag acatcaataa ggacaaattt gcaaaagcta aggaggtcgg ggctactgaa 720 tgtgttaacc ctcaagatta taagaaacca atacaagaag tccttactga aatgtcaaac 780 ggtggagttg atttctcttt tgaagttata ggccgtcttg atactatggt aactgcgttg 840 tcctgctgtc aagaggcata tggagtcagt gtgatcgtag gtgttcctcc tgattcacaa 900 aatttgtcga tgaatcctat gctgttgcta agcggtcgta catggaaggg agctatattt 960 ggcggtttta agagcaagga tagtgttcca aaacttgttg ccgactttat ggcgaagaag 1020 tttgctcttg atcctttaat tacacatgta ttgccattcg agaaaatcaa tgaagggttt 1080 gatttgttaa gaagtggtga atctattcgt acaattttaa ctttt 1125 <210> 119 <211> 375 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 119 Met Ser Thr Ala Gly Lys Val Ile Lys Cys Lys Ala Ala Val Leu Trp 1 5 10 15 Glu Glu Lys Lys Pro Phe Ser Ile Glu Glu Val Glu Val Ala Pro Pro 20 25 30 Lys Ala His Glu Val Arg Ile Lys Met Val Ala Thr Gly Ile Cys Arg 35 40 45 Ser Asp Asp His Val Val Ser Gly Thr Leu Val Thr Pro Leu Pro Val 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tctgactttg actcctcaaa aaaaaaaaat ctacaatcaa cagatcgctt 420 caattacgcc ctcacaaaaa cttttttcct tcttcttcgc ccacgttaaa ttttatccct 480 catgttgtct aacggatttc tgcacttgat ttattataaa aagacaaaga cataatactt 540 ctctatcaat ttcagttatt gttcttcctt gcgttattct tctgttcttc tttttctttt 600 gtcatatata accataacca agtaatacat attcaaatct aga 643 <210> 121 <211> 9089 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> constructed plasmid <400> 121 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accataccac agcttttcaa ttcaattcat catttttttt ttattctttt ttttgatttc 240 ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa cgaaggaagg 300 agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtagtgt tgaagaaaca tgaaattgcc 360 cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatcatgt 420 cgaaagctac atataaggaa cgtgctgcta ctcatcctag tcctgttgct gccaagctat 480 ttaatatcat gcacgaaaag 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gccctgcagg ccctaacctg ctaggacaca 3060 acgtctttgc ctggtaaagt ttctagctga cgtgattcct tcacctgtgg atccggcaat 3120 tgtaaaggtt gtgaaaccct cagcttcata accgacacct gcaaatgact ttgcattctt 3180 aacaaagata gttgtatcaa tttcacgttc gaatctatta aggttatcga tgttcttaga 3240 ataaatgtag gcggaatgtt ttctattctg ctcagctatc ttggcgtatt taatggcttc 3300 atcaatgtcc ttcactctaa ctataggcaa aattggcatc atcaactccg tcataacgaa 3360 cggatggttt gcgttgactt cacaaataat acactttaca ttacttggtg actctacatc 3420 tatttcatcc aaaaacagtt tagcgtcctt accaacccac ttcttattaa tgaaatattc 3480 ttgagtttca ttgttctttt gaagaacaag gtctatcagc ttggatactt ggtcttcatt 3540 gataatgacg gcgttgtttt tcaacatgtt agagatcaga tcatctgcaa cgttttcaaa 3600 cacgaacact tctttttccg cgatacaagg aagattgttg tcaaacgaac aaccttcaat 3660 aatgcttctg ccggccttct cgatatctgc tgtatcgtct acaataaccg gaggattacc 3720 cgcgccagct ccgatggcct ttttaccaga attaagaagg gtttttacca tacccgggcc 3780 acccgtaccg cacaacaatt ttatggatgg atgtttgata atagcgtcta aactttccat 3840 agttgggttc tttatagtag tgacaaggtt 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ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 6420 gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 6480 aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 6540 gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 6600 aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 6660 atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 6720 gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 6780 atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 6840 ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 6900 cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 6960 agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 7020 cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 7080 tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 7140 agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 7200 gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 7260 gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 7320 ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 7380 tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 7440 tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 7500 gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 7560 caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 7620 atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgaa 7680 cgaagcatct gtgcttcatt ttgtagaaca aaaatgcaac gcgagagcgc taatttttca 7740 aacaaagaat ctgagctgca tttttacaga acagaaatgc aacgcgaaag cgctatttta 7800 ccaacgaaga atctgtgctt catttttgta aaacaaaaat gcaacgcgag agcgctaatt 7860 tttcaaacaa agaatctgag ctgcattttt acagaacaga aatgcaacgc gagagcgcta 7920 ttttaccaac aaagaatcta tacttctttt ttgttctaca aaaatgcatc ccgagagcgc 7980 tatttttcta acaaagcatc ttagattact ttttttctcc tttgtgcgct ctataatgca 8040 gtctcttgat aactttttgc actgtaggtc 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ttttcttcac caaccatcag ttcataggtc cattctctta gcgcaactac 660 agagaacagg ggcacaaaca ggcaaaaaac gggcacaacc tcaatggagt gatgcaacct 720 gcctggagta aatgatgaca caaggcaatt gacccacgca tgtatctatc tcattttctt 780 acaccttcta ttaccttctg ctctctctga tttggaaaaa gctgaaaaaa aaggttgaaa 840 ccagttccct gaaattattc ccctacttga ctaataagta tataaagacg gtaggtattg 900 attgtaattc tgtaaatcta tttcttaaac ttcttaaatt ctacttttat agttagtctt 960 ttttttagtt ttaaaacacc aagaacttag tttcgaataa acacacataa actagtaaac 1020 aaa 1023 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 123 caaaagctga gctccaccgc g 21 <210> 124 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 124 gtttactagt ttatgtgtgt ttattcgaaa ctaagttctt ggtg 44 <210> 125 <400> 125 000 <210> 126 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 126 cacacatatt acaatagcta gctgaggatg aaagctctg 39 <210> 127 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 127 cagagctttc atcctcagct 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gtgacttaca catagacgac catcacacca 780 ctgaagactg cgggattgct ctcggtcaag cttttaaaga ggccctactg gcgcgtggag 840 taaaaaggtt tggatcagga tttgcgcctt tggatgaggc actttccaga gcggtggtag 900 atctttcgaa caggccgtac gcagttgtcg aacttggttt gcaaagggag aaagtaggag 960 atctctcttg cgagatgatc ccgcattttc ttgaaagctt tgcagaggct agcagaatta 1020 ccctccacgt tgattgtctg cgaggcaaga atgatcatca ccgtagtgag agtgcgttca 1080 aggctcttgc ggttgccata agagaagcca cctcgcccaa tggtaccaac gatgttccct 1140 ccaccaaagg tgttcttatg tagtgacacc gattatttaa agctgcagca tacgatatat 1200 atacatgtgt atatatgtat acctatgaat gtcagtaagt atgtatacga acagtatgat 1260 actgaagatg acaaggtaat gcatcattct atacgtgtca ttctgaacga ggcgcgcttt 1320 ccttttttct ttttgctttt tctttttttt tctcttgaac tcgacggatc tatgcggtgt 1380 gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggaaattgta aacgttaata 1440 ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 1500 aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 1560 cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 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1500 gagcagaaaa tcctttctga tttaaaacaa tatatgcatg aaggtgagca ggtgcctgca 1560 gattggaaat cagacagagc gcaccctctt gaaatcgtta aagagttgcg taatgcagtc 1620 gatgatcatg ttacagtaac ttgcgatatc ggttcgcacg ccatttggat gtcacgttat 1680 ttccgcagct acgagccgtt aacattaatg atcagtaacg gtatgcaaac actcggcgtt 1740 gcgcttcctt gggcaatcgg cgcttcattg gtgaaaccgg gagaaaaagt ggtttctgtc 1800 tctggtgacg gcggtttctt attctcagca atggaattag agacagcagt tcgactaaaa 1860 gcaccaattg tacacattgt atggaacgac agcacatatg acatggttgc attccagcaa 1920 ttgaaaaaat ataaccgtac atctgcggtc gatttcggaa atatcgatat cgtgaaatat 1980 gcggaaagct tcggagcaac tggcttgcgc gtagaatcac cagaccagct ggcagatgtt 2040 ctgcgtcaag gcatgaacgc tgaaggtcct gtcatcatcg atgtcccggt tgactacagt 2100 gataacatta atttagcaag tgacaagctt ccgaaagaat tcggggaact catgaaaacg 2160 aaagctctct agttaattaa tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc 2220 ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat 2280 ttattttttt atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt 2340 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ttgaagtttt gggacttagc cttccgggtt catcttctca cccggctgaa tccgcagaaa 1200 agaaagcaga tattgaagaa gctggtcgcg ctgttgtcaa aatgctcgaa atgggcttaa 1260 aaccttctga cattttaacg cgtgaagctt ttgaagatgc tattactgta actatggctc 1320 tgggaggttc aaccaactca acccttcacc tcttagctat tgcccatgct gctaatgtgg 1380 aattgacact tgatgatttc aatactttcc aagaaaaagt tcctcatttg gctgatttga 1440 aaccttctgg tcaatatgta ttccaagacc tttacaaggt cggaggggta ccagcagtta 1500 tgaaatatct ccttaaaaat ggcttccttc atggtgaccg tatcacttgt actggcaaaa 1560 cagtcgctga aaatttgaag gcttttgatg atttaacacc tggtcaaaag gttattatgc 1620 cgcttgaaaa tcctaaacgt gaagatggtc cgctcattat tctccatggt aacttggctc 1680 cagacggtgc cgttgccaaa gtttctggtg taaaagtgcg tcgtcatgtc ggtcctgcta 1740 aggtctttaa ttctgaagaa gaagccattg aagctgtctt gaatgatgat attgttgatg 1800 gtgatgttgt tgtcgtacgt tttgtaggac caaagggcgg tcctggtatg cctgaaatgc 1860 tttccctttc atcaatgatt gttggtaaag ggcaaggtga aaaagttgcc cttctgacag 1920 atggccgctt ctcaggtggt acttatggtc ttgtcgtggg tcatatcgct cctgaagcac 1980 aagatggcgg tccaatcgcc tacctgcaaa caggagacat agtcactatt gaccaagaca 2040 ctaaggaatt acactttgat atctccgatg aagagttaaa acatcgtcaa gagaccattg 2100 aattgccacc gctctattca cgcggtatcc ttggtaaata tgctcacatc gtttcgtctg 2160 cttctagggg agccgtaaca gacttttgga agcctgaaga aactggcaaa aaatgagcga 2220 tttaatctct aattattagt taaagtttta taagcatttt tatgtaacga aaaataaatt 2280 ggttcatatt attactgcac tgtcacttac catggaaaga ccagacaaga agttgccgac 2340 agtctgttga attggcctgg ttaggcttaa gtctgggtcc gcttctttac aaatttggag 2400 aatttctctt aaacgatatg tatattcttt tcgttggaaa agatgtcttc caaaaaaaaa 2460 accgatgaat tagtggaacc aaggaaaaaa aaagaggtat ccttgattaa ggaacactgt 2520 ttaaacagtg tggtttccaa aaccctgaaa ctgcattagt gtaatagaag actagacacc 2580 tcgatacaaa taatggttac tcaattcaaa actgccagcg aattcgactc tgcaattgct 2640 caagacaagc tagttgtcgt agatttctac gccacttggt gcggtccatg taaaatgatt 2700 gctccaatga ttgaaaaatg tggctgtggt ttcagggtcc ataaagcttt tcaattcatc 2760 tttttttttt ttgttctttt ttttgattcc ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa 2820 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ttgttggaag aggactattt gcaaagggaa gggatgctaa ggtagagggt gaacgttaca 3720 gaaaagcagg ctgggaagca tatttgagaa gatgcggcca gcaaaactaa aaaactgtat 3780 tataagtaaa tgcatgtata ctaaactcac aaattagagc ttcaatttaa ttatatcagt 3840 tattacccgg gaatctcggt cgtaatgatt tctataatga cgaaaaaaaa aaaattggaa 3900 agaaaaagct tcatggcctt ccactttccc aaacaacacc tacggtatct ctcaagtctt 3960 atggggttcc attggtttca ccactggtgc taccttgggt gctgctttcg ctgctgaaga 4020 aattgatcca aagaagagag ttatcttatt cattggtgac ggttctttgc aattgactgt 4080 tcaagaaatc tccaccatga tcagatgggg cttgaagcca tacttgttcg tcttgaacaa 4140 cgatggttac accattgaaa agttgattca cggtccaaag gctcaataca acgaaattca 4200 aggttgggac cacctatcct tgttgccaac tttcggtgct aaggactatg aaacccacag 4260 agtcgctacc accggtgaat gggacaagtt gacccaagac aagtctttca acgacaactc 4320 taagatcaga atgattgaaa tcatgttgcc agtcttcgat gctccacaaa acttggttga 4380 acaagctaag ttgactgctg ctaccaacgc taagcaataa 4420 <210> 143 <211> 2686 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC19 <400> 143 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat 420 cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 480 gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 540 aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 600 gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 660 agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 720 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 780 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 840 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 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ttaattatat cagttattac 1260 cctatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggaaattg 1320 taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta 1380 accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt 1440 tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca 1500 aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa 1560 gataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatccagt gatgatacaa cgagttagcc 1620 aaggtgacac tctccccccc cctccccctc tgatctttcc tgttgcctct ttttccccca 1680 accaa 1685

Claims (27)

  1. 물, 발효가능한 탄소원 및 오일을 포함하는 바이오매스(biomass)를 하나 이상의 촉매와 접촉시켜, 이에 의해 적어도 일부의 오일이 하나 이상의 촉매에 의해 가수분해되어 추출제(extractant)를 형성하는 단계를 포함하는 방법으로서, 발효가능한 탄소원 및 오일이 둘 모두 바이오매스로부터 유래되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 바이오매스가 옥수수 곡물, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 호밀, 밀짚, 보리, 보릿짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스(switchgrass), 폐지, 사탕수수 버개스(bagasse), 수수, 사탕수수, 콩, 곡물, 셀룰로스계 물질, 리그노셀룰로스계 물질, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 나뭇조각, 톱밥, 관목 및 떨기나무, 야채, 과실, 꽃, 동물 퇴비 및 그들의 혼합물을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 오일이 글리세리드를 포함하며, 하나 이상의 촉매가 글리세리드를 가수분해시켜 지방산을 형성하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 추출제가 지방산, 지방산 아미드, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 트라이글리세리드 또는 그들의 혼합물을 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 하나 이상의 촉매가 에스테라제(esterase), 리파제(lipase), 포스포리파제(phospholipase) 및 라이소포스포리파제(lysophospholipase)로부터 선택되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 추출제의 생성물 알코올에 대한 분배 계수가 바이오매스의 오일의 생성물 알코올에 대한 분배 계수보다 더 큰 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    적어도 일부의 오일이 가수분해된 후에, 촉매를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 촉매에 의한 가수분해 전에, 바이오매스로부터 오일을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    바이오매스를 발효 용기 내의 발효 브로쓰(fermentation broth)와 접촉시키는 단계;
    바이오매스의 탄소원을 발효시켜, 생성물 알코올을 생성하는 단계; 및
    발효 브로쓰를 추출제와 접촉시킴으로써 발효 브로쓰로부터 생성물 알코올을 동소(in situ) 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 생성물 알코올이 부탄올인 방법.
  11. (a) 물, 발효가능한 탄소원 및 오일을 포함하는 바이오매스를 제공하는 단계;
    (b) 바이오매스를 액화시켜, 액화된 바이오매스를 생성하는 단계;
    (c) 액화된 바이오매스를 하나 이상의 촉매와 접촉시켜, 이에 의해 적어도 일부의 오일을 가수분해시켜 추출제를 형성하는 단계;
    (d) 액화된 바이오매스를 올리고당류를 발효가능한 당으로 전환시킬 수 있는 당화 효소와 접촉시키는 단계;
    (e) 액화된 바이오매스를 발효 용기 내의 발효 브로쓰와 접촉시키는 단계;
    (f) 액화된 바이오매스의 탄소원을 발효시켜, 생성물 알코올을 생성하는 단계;
    (g) 발효 브로쓰를 추출제와 접촉시킴으로써 발효 브로쓰로부터 생성물 알코올을 동소 제거하는 단계를 포함하며;
    임의로, 단계 (c) 및 (d)가 동시에 발생하는 알코올의 생성 방법.
  12. 제11항에 있어서, 바이오매스가 옥수수 곡물, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 호밀, 밀짚, 보리, 보릿짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스, 폐지, 사탕수수 버개스, 수수, 사탕수수, 콩, 곡물, 셀룰로스계 물질, 리그노셀룰로스계 물질, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 나뭇조각, 톱밥, 관목 및 떨기나무, 야채, 과실, 꽃, 동물 퇴비 및 그들의 혼합물을 포함하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 오일이 글리세리드를 포함하며, 하나 이상의 촉매가 글리세리드를 가수분해시켜 지방산을 형성하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 추출제가 지방산, 지방산 아미드, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 트라이글리세리드 또는 그들의 혼합물을 포함하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 하나 이상의 촉매가 에스테라제, 리파제, 포스포리파제 및 라이소포스포리파제로부터 선택되는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 추출제의 생성물 알코올에 대한 분배 계수가 바이오매스의 오일의 생성물 알코올에 대한 분배 계수보다 더 큰 방법.
  17. 제11항에 있어서,
    적어도 일부의 오일이 가수분해된 후에, 촉매를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제11항에 있어서, 생성물 알코올이 부탄올인 방법.
  19. (a) 알코올을 생성할 수 있는 재조합 미생물;
    (b) 발효가능한 탄소원;
    (c) 글리세리드를 지방산으로 가수분해시킬 수 있는 하나 이상의 촉매;
    (d) 글리세리드를 포함하는 오일; 및
    (e) 지방산을 포함하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 하나 이상의 촉매가 에스테라제, 리파제, 포스포리파제 및 라이소포스포리파제로부터 선택되는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 오일이 옥수수유, 우지, 카놀라유, 카프르산/카프릴산 트라이글리세리드, 피마자유, 코코넛유, 면실유, 어유, 호호바유, 라드(lard), 아마인유, 니이츠풋(neetsfoot)유, 오이티시카유, 팜(palm)유, 땅콩유, 평지씨유, 쌀겨기름, 홍화유, 콩기름, 해바라기씨유, 동(tung)유, 자트로파(jatropha)유 및 식물성 오일 배합물인 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 발효가능한 탄소원 및 오일이 바이오매스로부터 유래되는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 바이오매스가 옥수수 곡물, 옥수수 속대, 작물 잔류물, 옥수수 껍질, 옥수수 대, 풀, 밀, 호밀, 밀짚, 보리, 보릿짚, 건초, 볏짚, 스위치그래스, 폐지, 사탕수수 버개스, 수수, 사탕수수, 콩, 곡물, 셀룰로스계 물질, 리그노셀룰로스계 물질, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 나뭇조각, 톱밥, 관목 및 떨기나무, 야채, 과실, 꽃, 동물 퇴비 및 그들의 혼합물을 포함하는 조성물.
  24. 제19항에 있어서, 당화 효소를 추가로 포함하는 조성물.
  25. 제18항에 있어서, 용해되지 않은 고형물을 추가로 포함하는 조성물.
  26. 제18항에 있어서, 모노글리세리드, 다이글리세리드, 트라이글리세리드, 글리세롤, 단당류, 올리고당류 또는 알코올 중 적어도 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 알코올이 부탄올인 조성물.
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Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9303225B2 (en) 2005-10-26 2016-04-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for the production of isobutanol by recombinant yeast
US8188250B2 (en) 2008-04-28 2012-05-29 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans
US8652823B2 (en) * 2008-12-03 2014-02-18 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Strain for butanol production with increased membrane unsaturated trans fatty acids
CN106615685A (zh) 2009-05-26 2017-05-10 富禄德奎普有限公司 用于从全酒糟副产品中生产高蛋白玉米粉的方法
US8574406B2 (en) 2010-02-09 2013-11-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Process to remove product alcohol from a fermentation by vaporization under vacuum
US9040263B2 (en) 2010-07-28 2015-05-26 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of alcohol esters and in situ product removal during alcohol fermentation
AU2011268244A1 (en) * 2010-06-18 2012-12-06 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Extraction solvents derived from oil for alcohol removal in extractive fermentation
CA2823222C (en) 2010-06-18 2019-07-16 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Extraction solvents derived from oil for alcohol removal in extractive fermentation
CA2807930A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Butamax (Tm) Advanced Buofuels Llc Process to remove product alcohol from a fermentation by vaporization under vacuum
NZ707800A (en) 2010-09-07 2016-09-30 Butamax Tm Advanced Biofuels Integration of a polynucleotide encoding a polypeptide that catalyzes pyruvate to acetolactate conversion
US20120166158A1 (en) * 2010-12-28 2012-06-28 Kyrolos Paul El Giheny Predicting droplet populations in piping flows
US8765425B2 (en) 2011-03-23 2014-07-01 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
US8759044B2 (en) 2011-03-23 2014-06-24 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
WO2012145230A1 (en) * 2011-04-18 2012-10-26 Poet Research, Inc. Systems and methods for stillage fractionation
WO2013023713A1 (en) 2011-05-18 2013-02-21 Scale Biofuel, ApS Solar-assisted volatile fermentation products production processes
KR20140039292A (ko) * 2011-06-17 2014-04-01 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨 바이오연료 생성 프로세스로부터의 공동-생성물 및 이의 생성 방법
US20130180164A1 (en) 2011-07-28 2013-07-18 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Low sulfur fuel compositions having improved lubricity
US9962623B2 (en) 2011-12-09 2018-05-08 Butamax Advanced Biofuels Llc Process to remove product alcohols from fermentation broth
AU2012362274A1 (en) 2011-12-30 2014-07-03 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Fermentative production of alcohols
US8906657B2 (en) * 2012-03-19 2014-12-09 Api Intellectual Property Holdings, Llc Processes for producing fermentable sugars and energy-dense biomass for combustion
AU2013235391A1 (en) 2012-03-23 2014-09-04 Butamax Advanced Biofuels Llc Acetate supplemention of medium for butanologens
WO2013166458A1 (en) 2012-05-04 2013-11-07 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Processes and systems for alcohol production and recovery
PL2870252T3 (pl) * 2012-07-04 2020-07-13 Coöperatie Avebe U.A. Sposoby zastosowania patatyny
US9605281B2 (en) * 2012-09-12 2017-03-28 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the fermentative production of alcohols
US20140024064A1 (en) * 2012-07-23 2014-01-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentative alcohols
RU2015105943A (ru) * 2012-07-23 2016-09-10 БУТАМАКС ЭДВАНСТ БАЙОФЬЮЭЛЗ ЭлЭлСи Способы и системы для получения продуктов ферментации
US9809520B2 (en) 2012-07-26 2017-11-07 Butamax Advanced Biofuels Llc Butanol purification
EP2888350A1 (en) 2012-08-22 2015-07-01 Butamax Advanced Biofuels LLC Production of fermentation products
US9630894B2 (en) 2012-09-05 2017-04-25 Dynasep Inc. Energy efficient method and apparatus for the extraction of biomolecules from dilute aqueous solution
US9029615B2 (en) 2012-09-05 2015-05-12 Dynasep Inc. Energy efficient method and apparatus for the extraction of lower alcohols from dilute aqueous solution
CA2883627A1 (en) * 2012-09-12 2014-03-20 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentation products
US9109196B2 (en) 2012-09-12 2015-08-18 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentation products
CN104981544B (zh) * 2012-09-21 2018-05-15 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 用于使用两相萃取发酵和可循环利用的提取剂组合物制备丁醇的方法
US9840724B2 (en) 2012-09-21 2017-12-12 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of renewable hydrocarbon compositions
AU2013323396B2 (en) 2012-09-28 2017-04-20 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of fermentation products
US20140106419A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentation products
AU2013329024A1 (en) * 2012-10-11 2015-03-12 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentation products
US20140142352A1 (en) 2012-11-20 2014-05-22 Butamax Advanced Biofuels Llc Butanol purification
WO2014105840A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentative production of alcohols
US20160002131A1 (en) 2013-02-21 2016-01-07 Butamax Advanced Biofuels Llc Vapor recompression
US9523104B2 (en) 2013-03-12 2016-12-20 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of alcohols
US9517985B2 (en) 2013-03-15 2016-12-13 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for producing butanol using extractive fermentation
US9771602B2 (en) 2013-03-15 2017-09-26 Butamax Advanced Biofuels Llc Competitive growth and/or production advantage for butanologen microorganism
BR112015020685A2 (pt) * 2013-03-15 2017-07-18 Butamax Advanced Biofuels Llc método para a recuperação do butanol, composição, métodos para a extração de álcool e de secagem
WO2015002919A2 (en) * 2013-07-03 2015-01-08 Butamax Advanced Biofuels Llc Regulation of production pathways in host cells
WO2015038885A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Butamax Advanced Biofuels Llc Hydrolysis at high ester to water ratios
EP3074107B8 (en) * 2013-11-27 2020-08-12 Sinomine Resources (US) Inc. Method to separate brine from invert emulsions used in drilling and completion fluids
WO2015099109A1 (ja) * 2013-12-27 2015-07-02 東レ株式会社 糖液の製造方法
MX2016013359A (es) 2014-04-11 2017-02-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Mitigacion de la contaminacion.
US20160201152A1 (en) * 2014-07-21 2016-07-14 Xyleco, Inc. Processing biomass
CA2957920A1 (en) 2014-08-11 2016-02-18 Butamax Advanced Biofuels Llc Yeast preparations and methods of making the same
HUE051469T2 (hu) * 2014-09-16 2021-03-01 Roar Holding Llc Energiaitalok és egyéb táplálkozási segédanyagok, amelyek agavé alapú szeszes italokból származnak
CN105779517B (zh) * 2014-12-22 2019-10-29 武汉轻工大学 降低酶法酯化脱酸过程中甘油二酯含量的方法
WO2016205596A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 Poet Research, Inc. Propagating microorganisms & related methods & systems
US9777303B2 (en) 2015-07-23 2017-10-03 Fluid Quip Process Technologies, Llc Systems and methods for producing a sugar stream
US11718863B2 (en) 2015-11-25 2023-08-08 Poet Grain (Octane), Llc Processes for recovering products from a slurry
CA3006293A1 (en) 2015-11-25 2017-06-01 Flint Hills Resources, Lp Processes for recovering products from a corn fermentation mash
US10059966B2 (en) 2015-11-25 2018-08-28 Flint Hills Resources, Lp Processes for recovering products from a corn fermentation mash
DE102015224139A1 (de) * 2015-12-03 2017-06-08 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung von Methanol aus einem Gärrest und einem Biogas einer Fermentationsanlage und Vorrichtung zur Herstellung von Methanol aus dem Gärrest und dem Biogas einer Fermentationsanlage
EP3538545A1 (en) 2016-11-09 2019-09-18 Danisco US Inc. Yeast with improved alcohol production
US10604776B2 (en) 2017-05-24 2020-03-31 Poet Research, Inc. Use of an esterase to enhance ethyl ester content in fermentation media
US20210388401A1 (en) * 2017-05-24 2021-12-16 Poet Research, Inc. Methods of refining a grain oil composition, and related systems, compositions and uses
CN107043794A (zh) * 2017-06-12 2017-08-15 浙江工业大学 一种酶催化红花油醇解制备脂肪酸乙酯的方法
US11484842B2 (en) * 2017-09-05 2022-11-01 Vito Nv Method and apparatus for in situ product recovery
CA3025239A1 (en) 2017-11-27 2019-05-27 Fluid Quip Process Technologies, Llc Method and system for reducing the unfermentable solids content in a protein portion at the back end of a corn dry milling process
US11053557B2 (en) 2018-03-15 2021-07-06 Fluid Quip Technologies, Llc System and method for producing a sugar stream using membrane filtration
US11519013B2 (en) 2018-03-15 2022-12-06 Fluid Quip Technologies, Llc System and method for producing a sugar stream with front end oil separation
US11505838B2 (en) 2018-04-05 2022-11-22 Fluid Quip Technologies, Llc Method for producing a sugar stream
US10480038B2 (en) 2018-04-19 2019-11-19 Fluid Quip Technologies, Llc System and method for producing a sugar stream
CA3103242C (en) 2018-06-11 2023-08-29 Poet Research, Inc. Methods of refining a grain oil composition feedstock, and related systems, compositions and uses
CN113395907A (zh) 2018-11-26 2021-09-14 罗艾尔控股有限责任公司 改善饮料质量的方法
US10875889B2 (en) 2018-12-28 2020-12-29 Fluid Quip Technologies, Llc Method and system for producing a zein protein product from a whole stillage byproduct produced in a corn dry-milling process
US10443017B1 (en) * 2019-01-21 2019-10-15 Trucent, Inc. Process and method for the recovery of oil from the processing of grains into biofuels and other chemicals
US10981087B2 (en) * 2019-01-21 2021-04-20 Trucent, Inc. Process and method for the recovery of oil from the processing of grains into biofuels and other chemicals
US11730172B2 (en) 2020-07-15 2023-08-22 Poet Research, Inc. Methods and systems for concentrating a solids stream recovered from a process stream in a biorefinery
US10995351B1 (en) 2020-09-14 2021-05-04 Fluid Quip Technologies, Llc System and method for producing a carbohydrate stream from a cellulosic feedstock
DE112022002275T5 (de) * 2021-04-22 2024-02-29 Desmet Belgium Neuartiges Verfahren und Anlage zur Lösungsmittelfraktionierung

Family Cites Families (210)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5221357A (en) 1979-03-23 1993-06-22 Univ California Method of treating biomass material
JPS5992094A (ja) 1982-11-18 1984-05-28 Agency Of Ind Science & Technol 有機廃棄物の嫌気性消化方法
JPS6058936A (ja) 1983-09-12 1985-04-05 Kao Corp 脂肪酸低級アルコ−ルエステルから脂肪酸を製造する方法
JPS61192291A (ja) 1985-02-20 1986-08-26 Ngk Insulators Ltd 抽出発酵法
JPH0134077Y2 (ko) 1985-05-20 1989-10-17
US5036005A (en) 1987-05-22 1991-07-30 Georgia Tech Research Corporation Alcohol recovery by continuous fermentation
US4865973A (en) * 1985-09-13 1989-09-12 Queen's University At Kingston Process for extractive fermentation
CA1280705C (en) 1985-09-13 1991-02-26 Finn Kollerup Solvents and process for extractive fermentation
JP2719667B2 (ja) 1987-08-31 1998-02-25 名糖産業株式会社 エステル交換脂の製造法
US5071754A (en) 1990-01-23 1991-12-10 Battelle Memorial Institute Production of esters of lactic acid, esters of acrylic acid, lactic acid, and acrylic acid
DE4230645C2 (de) 1992-09-12 1996-03-07 Bernd Hansen Ampulle
JP3502419B2 (ja) 1993-03-02 2004-03-02 株式会社武蔵野化学研究所 乳酸および乳酸エステルの製造方法
WO1995028476A1 (en) 1994-04-15 1995-10-26 Midwest Research Institute Recombinant zymomonas for pentose fermentation
US5712133A (en) 1994-04-15 1998-01-27 Midwest Research Institute Pentose fermentation by recombinant zymomonas
US5514583A (en) 1994-04-15 1996-05-07 Midwest Research Institute Recombinant zymomonas for pentose fermentation
WO1996041854A1 (fr) 1995-06-08 1996-12-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Arome
EP0789079B1 (en) 1995-09-07 2002-06-12 Kansai Paint Co., Ltd. Coupling process of fermentation and microbial transformation reaction
JPH0971594A (ja) 1995-09-07 1997-03-18 Mitsubishi Chem Corp 酵素法による糖又は糖アルコールの脂肪酸エステルの製造方法
US5710030A (en) 1995-09-13 1998-01-20 Henkel Corporation Process for preparing fuels, fuel substitutes, and fuel supplements from renewable resources
US5723639A (en) 1995-10-16 1998-03-03 University Of Chicago Esterification of fermentation-derived acids via pervaporation
US5936069A (en) * 1995-12-06 1999-08-10 Iowa State University Research Foundation Process for producing improved soy protein concentrate from genetically-modified soybeans
CZ289151B6 (cs) 1996-06-18 2001-11-14 Unilever N. V. Způsob výroby esterů alifatických monokarboxylových kyselin
WO1998031784A1 (en) * 1997-01-16 1998-07-23 The Regents Of The University Of California Improved wine yeast cultures
EP1026234A4 (en) 1997-09-04 2001-04-04 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESSES FOR THE PREPARATION OF DISTILLED LIQUOR
US6350890B1 (en) 1998-07-22 2002-02-26 Axiva Gmbh Method for obtaining fatty acids from biomass by combined in/situ extraction, reaction and chromatography using compressed gases
CN1248617A (zh) 1998-09-18 2000-03-29 孙开卷 八粮液酒酿制方法
US6664413B1 (en) 1998-11-19 2003-12-16 A. E. Staley Manufacturing Co. Process for production of esters
US7083954B2 (en) 1999-02-11 2006-08-01 Renessen Llc Method of producing fermentation-based products from corn
US6703227B2 (en) 1999-02-11 2004-03-09 Renessen Llc Method for producing fermentation-based products from high oil corn
US7074603B2 (en) 1999-03-11 2006-07-11 Zeachem, Inc. Process for producing ethanol from corn dry milling
US6291708B1 (en) 1999-04-28 2001-09-18 A.E. Staley Manufacturing Co. Process for production of organic acids and esters thereof
US7045607B2 (en) 1999-05-18 2006-05-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Method and system for extraction of zein from corn
EP1078910A1 (en) 1999-08-20 2001-02-28 HaltermannAscot GmbH Non-corrosive catalytic hydrolysis of fatty acid esters to fatty acids.
US6279250B1 (en) 1999-09-07 2001-08-28 Crown Iron Works Company Apparatus for enhanced solvent recovery from solvent extracted material
JP3853552B2 (ja) 1999-12-17 2006-12-06 花王株式会社 ジグリセリドの製造方法
US6509051B1 (en) 2000-03-03 2003-01-21 Crown Iron Works Company Process for removing residual solvent from solids
US7223575B2 (en) 2000-05-01 2007-05-29 Midwest Research Institute Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
EP1373539A2 (en) 2001-03-19 2004-01-02 Novozymes A/S Improved fermentation process
US6398707B1 (en) 2001-05-31 2002-06-04 Wen-Teng Wu Method of preparing lower alkyl fatty acids esters and in particular biodiesel
PT1270734E (pt) 2001-06-21 2008-03-24 T & T Oleochemie Gmbh Processo para a clivagem enzimática de óleos e gorduras
DE10231029A1 (de) 2001-07-09 2003-01-23 Biopract Gmbh Verfahren zur biologischen Synthese von Methanol
US6996917B2 (en) 2001-10-15 2006-02-14 Crown Iron Works Company Two stage apparatus for desolventizing food grain meal
US6732454B2 (en) 2001-10-30 2004-05-11 Crown Iron Works Company Apparatus for extracting solvent from a mass of vegetable particles
FR2831886B1 (fr) 2001-11-02 2004-07-16 Pernod Ricard Boissons fermentees comprenant des levures transformees par le gene atf2
US20060057251A1 (en) 2001-12-04 2006-03-16 Larry Dawley Mid-level protein distillers dried grains with solubles (DDGS) - production and use
JP4095392B2 (ja) * 2002-03-11 2008-06-04 水澤化学工業株式会社 バイオ燃料の製造方法
US7612221B2 (en) 2002-04-02 2009-11-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Production of fatty acid alkyl esters
GB0218019D0 (en) 2002-08-05 2002-09-11 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Production of a fermentation product
GB0218012D0 (en) 2002-08-05 2002-09-11 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Production of a fermentation product
US20040063184A1 (en) 2002-09-26 2004-04-01 Novozymes North America, Inc. Fermentation processes and compositions
EP1905821B1 (en) 2002-09-26 2016-08-10 Novozymes North America, Inc. Fermentation methods and compositions
US7301060B2 (en) * 2003-03-28 2007-11-27 Ab-Cwt, Llc Process for conversion of organic, waste, or low-value materials into useful products
CN1183238C (zh) * 2003-03-28 2005-01-05 刘阳 生物酶法制造植物油脂肪酸甲酯的新方法
JP2007525942A (ja) 2003-04-14 2007-09-13 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 二相反応媒体におけるパラ−ヒドロキシケイ皮酸の生体触媒的脱炭酸によってパラ−ヒドロキシスチレンを製造するための方法
US20070014905A1 (en) * 2003-06-30 2007-01-18 Purdue Research Foundation Starchy material processed to produce one or more products comprising starch, ethanol, sugar syrup, oil, protein, fiber, gluten meal, and mixtures thereof
WO2005014765A1 (en) 2003-07-21 2005-02-17 Petroleo Brasileiro S.A.-Petrobras Process for producing biodiesel
CA2536991C (en) 2003-08-29 2009-03-24 Ultraforce Technology Llc Alcohol production using sonication
US7378549B2 (en) 2004-01-26 2008-05-27 Shell Oil Company Process for the reactive extractive extraction of levulinic acid
GB0402470D0 (en) 2004-02-04 2004-03-10 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Production of a fermentation product
BRPI0507559A (pt) 2004-02-09 2007-07-03 Cargill Inc tratamento de efluente
EP1723248A2 (en) 2004-03-10 2006-11-22 Broin and Associates, Inc. Methods and systems for producing ethanol using raw starch and fractionation
ES2810026T3 (es) 2004-03-25 2021-03-08 Novozymes Inc Métodos para la degradación o la conversión de polisacáridos de la pared celular vegetal
BRPI0512229A (pt) 2004-06-16 2008-02-19 Texas A & M Univ Sys métodos e sistemas para conversão de biomassa em ácidos carboxìlicos e álcoois
US7481890B2 (en) 2004-08-05 2009-01-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Corn oil and dextrose extraction apparatus and method
US7601858B2 (en) 2004-08-17 2009-10-13 Gs Cleantech Corporation Method of processing ethanol byproducts and related subsystems
US7670633B2 (en) 2004-08-23 2010-03-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Removal of fiber from grain products including distillers dried grains with solubles
US7473539B2 (en) 2004-09-20 2009-01-06 Sunho Biodiesel Corporation Methods for producing alkyl esters
EP1836286A2 (en) 2004-11-15 2007-09-26 Cargill, Incorporated Integrated corn processing
US7569671B2 (en) 2005-01-06 2009-08-04 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Method and system for corn fractionation
CN101103118B (zh) 2005-01-10 2012-04-18 诺维信公司 使用两种脂解酶的混合物从甘油三酯和醇产生脂肪酸烷基酯的方法
DE102005002700A1 (de) 2005-01-19 2006-07-27 Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg Zusammensetzungen verwendbar als Biotreibstoff
US7419108B2 (en) 2005-02-07 2008-09-02 Glen Foster Corn fractionation process
US7501062B2 (en) 2005-02-22 2009-03-10 Shell Oil Company Process for permeation enhanced reactive extraction of levulinic acid
CN101160388B (zh) 2005-04-12 2013-05-01 纳幕尔杜邦公司 生物质处理的系统和工艺
EP1885823A2 (en) 2005-05-26 2008-02-13 Ben Gurion University of the Negev Research and Development Authority Ltd. Production of biodiesel from balanites aegyptiaca
ATE420196T1 (de) 2005-06-13 2009-01-15 Novozymes As Enzymatische herstellung von degummierten fettsäurealkylestern
DE102005037989A1 (de) 2005-08-11 2007-02-15 Cognis Ip Management Gmbh Verfahren zur chemo-enzymatischen Herstellung von Fettsäureestern
US9297028B2 (en) 2005-09-29 2016-03-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
CN100424170C (zh) 2005-10-11 2008-10-08 北京化工大学 脂肪酶、其基因、产生该酶的亚罗解脂酵母及其应用
US7857872B2 (en) 2005-10-21 2010-12-28 Regents Of The University Of Minnesota Co-production of biodiesel and an enriched food product from distillers grains
US20080274526A1 (en) 2007-05-02 2008-11-06 Bramucci Michael G Method for the production of isobutanol
WO2007050671A2 (en) * 2005-10-26 2007-05-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fermentive production of four carbon alcohols
US8945899B2 (en) 2007-12-20 2015-02-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Ketol-acid reductoisomerase using NADH
US8956850B2 (en) 2008-06-05 2015-02-17 Butamax Advanced Biofuels Llc Enhanced pyruvate to acetolactate conversion in yeast
WO2007120210A2 (en) 2005-11-23 2007-10-25 Natureworks Llc Process for fractionating lignocellulosic biomass into liquid and solid products
US7666282B2 (en) 2005-12-28 2010-02-23 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for providing ethanol
BRPI0707942A2 (pt) 2006-02-16 2011-05-17 Gs Ind Design Inc método e sistema para recuperar óleo de resìduos de destilação
WO2007121100A2 (en) 2006-04-13 2007-10-25 Ambrozea, Inc. Compositions and methods for producing fermentation products and residuals
US8206970B2 (en) 2006-05-02 2012-06-26 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Production of 2-butanol and 2-butanone employing aminobutanol phosphate phospholyase
WO2007130577A2 (en) 2006-05-05 2007-11-15 Corn Plus Lllp Products from biofuel manufacturing process
MY144452A (en) * 2006-05-26 2011-09-30 Dong Energy Power As Method for syngas-production from liquefied biomass
EP1865048A1 (en) 2006-06-09 2007-12-12 Cognis IP Management GmbH Process for the production of fatty acid alkyl esters by integrating fermentation and esterification
CA2655645A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Iogen Energy Corporation Enzyme compositions for the improved enzymatic hydrolysis of cellulose and methods of using same
ITRM20060377A1 (it) 2006-07-19 2008-01-20 Angelis Nazzareno De Procedimento integrato per la produzione di biocombustibili e biocarburanti da diverse tipologie di materie prime e relativi prodotti
US7897798B2 (en) 2006-08-04 2011-03-01 Mcneff Research Consultants, Inc. Methods and apparatus for producing alkyl esters from lipid feed stocks and systems including same
WO2008017145A1 (en) 2006-08-07 2008-02-14 Emicellex Energy Corporation Process for recovery of holocellulose and near-native lignin from biomass
DE102006040567A1 (de) 2006-08-30 2008-03-06 Bayer Technology Services Gmbh Verfahren zur Herstellung von Bioethanol
WO2008039859A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Verasun Energy Corporation Solvent extraction of oil from distillers dried grains and methods of using extraction products
US7741119B2 (en) 2006-09-28 2010-06-22 E. I. Du Pont De Nemours And Company Xylitol synthesis mutant of xylose-utilizing zymomonas for ethanol production
US7670813B2 (en) 2006-10-25 2010-03-02 Iogen Energy Corporation Inorganic salt recovery during processing of lignocellulosic feedstocks
US20100331580A1 (en) 2006-11-15 2010-12-30 Growmark, Inc. Oil recovery and syngas production from biomass-based processes
US20080176298A1 (en) 2006-11-15 2008-07-24 Randhava Sarabjit S Oil recovery from dry corn milling ethanol production processes
US20080289248A1 (en) 2007-05-23 2008-11-27 Southern Illinois University Carbondale Immobilized esterification catalysts for producing fatty acid alkyl esters
WO2008086115A2 (en) 2007-01-03 2008-07-17 Colusa Biomass Energy Corporation Hydrolyzation of cellulose using carbonic acid
KR20090121298A (ko) 2007-02-02 2009-11-25 달리아다 미트 피티와이 엘티디 바이오디젤 제품
WO2008100837A2 (en) 2007-02-13 2008-08-21 Renessen Llc Fermentation process for the preparation of ethanol from a corn fraction having low oil content
US8017796B2 (en) 2007-02-13 2011-09-13 Mcneff Research Consultants, Inc. Systems for selective removal of contaminants from a composition and methods of regenerating the same
BRPI0807389A2 (pt) 2007-03-02 2014-05-20 Archer Daniels Midland Co Moinho de milho seco como uma fábrica de biomassa
CA2681328C (en) 2007-03-14 2015-10-06 Danisco Us Inc. Production of ethanol from barley and ddgs containing reduced beta-glucan and phytic acid
WO2008111941A2 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Fangxiao Yang Process and system for butanol production
WO2008125574A1 (en) 2007-04-11 2008-10-23 Novozymes A/S Method for producing biodiesel
MX2009011192A (es) 2007-04-18 2009-10-30 Du Pont Produccion fermentativa de isobutanol con el uso de enzimas reductoisomerasas con alta actividad acida y cetolica.
US8426174B2 (en) 2007-05-02 2013-04-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 2-butanol
US8426173B2 (en) 2007-05-02 2013-04-23 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 1-butanol
CN101689638A (zh) 2007-05-04 2010-03-31 埃克民公司 固定化酶及其用途
CN101058740A (zh) 2007-05-30 2007-10-24 吴江市方霞企业信息咨询有限公司 混合法制取生物柴油
US8193324B2 (en) 2007-05-31 2012-06-05 Lignol Innovations Ltd. Continuous counter-current organosolv processing of lignocellulosic feedstocks
EP2162545A4 (en) 2007-06-27 2012-05-16 Novozymes As PROCESS FOR PRODUCING FERMENTATION PRODUCTS
ATE554176T1 (de) 2007-07-03 2012-05-15 Petroleo Brasileiro Sa Verfahren zur fermentativen herstellung von ethanol aus einem aus zuckerrohrbagasse gewonnenem hemicellulose hydrolysat unter verwendung von pichia stipitis
WO2009009323A1 (en) 2007-07-06 2009-01-15 Best Energies, Inc. Improved homoacidogenic fermentation and indirect process for producing alcohols
WO2009009320A1 (en) 2007-07-06 2009-01-15 Best Energies Inc. Improved indirect process for producing ethanol
WO2009009322A1 (en) 2007-07-06 2009-01-15 Best Energies, Inc. Integrated facility for producing alcohol using homoacidogenic fermentation
WO2009009391A2 (en) 2007-07-06 2009-01-15 Ls9, Inc. Systems and methods for the production of fatty esters
US20090029432A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Charles Abbas Dry fractionation of corn
WO2009029344A1 (en) 2007-08-27 2009-03-05 Endicott Biofuels Ii, Llc Production of ester-based fuels such as biodiesel from renewable starting materials
BRPI0816477A2 (pt) 2007-08-27 2014-10-14 Iogen Energy Corp Método para a produção de um produto de fermentação a partir de uma matéria-prima lignocelulósica pré-tratada
US7695747B2 (en) 2007-09-17 2010-04-13 Russell Meier Method of producing dried distillers grain agglomerated particles
US8313934B2 (en) 2007-09-27 2012-11-20 Ls9, Inc. Reduction of the toxic effect of impurities from raw materials by extractive fermentation
JP5498005B2 (ja) 2007-10-11 2014-05-21 志朗 坂 有機酸を経由したアルコール類の製造方法
WO2009058938A2 (en) 2007-10-30 2009-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for the production of ethanol from a medium comprising xylose, employing a recombinant zymomonas strain having a reduced hima expression
AU2008322634A1 (en) 2007-11-13 2009-05-22 Tantillus Synergy, Ltd. Systems and methods for production of biofuel
US7790429B2 (en) 2007-11-28 2010-09-07 Transbiodiesel Ltd. Robust multi-enzyme preparation for the synthesis of fatty acid alkyl esters
KR20100095004A (ko) 2007-12-03 2010-08-27 게보 인코포레이티드 재생 조성물
CN101896612A (zh) 2007-12-14 2010-11-24 布特马斯先进生物燃料公司 用于控制发酵液中的丁醇浓度的方法
EP2222841B1 (en) 2007-12-20 2015-08-26 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Ketol-acid reductoisomerase using nadh
MX2010007210A (es) 2007-12-27 2010-10-08 Gevo Inc Recuperacion de alcoholes superiores a partir de soluciones acuosas diluidas.
US8580329B2 (en) 2008-01-08 2013-11-12 Daniel W. Sonnek Dry-mill ethanol plant extraction enhancement
US8641910B2 (en) 2008-02-05 2014-02-04 Syngenta Participations Ag Systems and processes for producing biofuels from biomass
JP2011511639A (ja) 2008-02-07 2011-04-14 ジーケム インコーポレイテッド ブタノールおよびヘキサノールの間接生産
CA2716585C (en) 2008-03-27 2017-05-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Zymomonas recombinant for substituted glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter and xylose isomerase gene for improved xylose utilization
US8088958B2 (en) 2008-04-14 2012-01-03 Trans Ionics Corporation Methods for recovery of alcohols from dilute aqueous alcohol feed streams
DK2276352T3 (da) 2008-04-15 2020-04-06 Us Agriculture Proteinkoncentrat af stivelsesholdigt korn: sammensætning, fremgangsmåde til fremstilling og anvendelser deraf
US8188250B2 (en) 2008-04-28 2012-05-29 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans
WO2009140674A2 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Novozymes A/S Methods for producing fermentation products
US8828695B2 (en) 2008-06-04 2014-09-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for producing butanol using two-phase extractive fermentation
EP2283141B1 (en) 2008-06-04 2014-04-23 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC A method for producing butanol using extraction and gas stripping
CN101285078A (zh) 2008-06-10 2008-10-15 华南理工大学 一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法
CN102144035B (zh) 2008-07-08 2014-10-08 科技研究局 通过酶促水解及随后的化学/酶促酯化生产生物柴油
WO2010022090A1 (en) 2008-08-18 2010-02-25 Ls9, Inc. Systems and methods for the production of mixed fatty esters
US8702819B2 (en) 2008-09-10 2014-04-22 Poet Research, Inc. Oil composition and method of recovering the same
CN102186973B (zh) 2008-09-29 2017-08-15 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 细菌的[2Fe‑2S]二羟酸脱水酶的鉴定和用途
BRPI0804354A2 (pt) 2008-10-17 2011-01-11 Oswaldo Theodoro Peckolt processo de produção de biodiesel
CN102272317A (zh) 2008-10-31 2011-12-07 诺维信公司 脂肪酸乙酯的酶法产生
US8357519B2 (en) 2008-11-19 2013-01-22 The Ohio State University Methods and processes for producing esters
WO2010059919A2 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Karges-Faulconbridge, Inc. Method for separating oil from an oil containing material, method for the production of ethanol, and ethanol production facility
EP2189535A1 (en) 2008-11-21 2010-05-26 Centre National de la Recherche Scientifique Use of ionic liquids for implementing a process for the preparation of biodiesel
US20100143995A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for Fermentive Preparation of Alcohols and Recovery of Product
DE102008060967A1 (de) 2008-12-06 2010-06-10 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Substituierte Phenylsulfonyltriazolone und ihre Verwendung
WO2010068637A1 (en) 2008-12-09 2010-06-17 Jerry Wayne Horton Ensiling biomass and multiple phase apparatus for hydrolyzation of ensiled biomass
CN101418320B (zh) * 2008-12-10 2011-05-18 中国科学院微生物研究所 一种生产丁醇的方法
CN101412989B (zh) 2008-12-10 2012-09-12 领先生物农业股份有限公司 一种利用解脂亚罗酵母菌脂肪酶分两步催化油脂合成生物柴油的方法与所得到的柴油
US20100146844A1 (en) 2008-12-17 2010-06-17 Bp Corporation North America Inc. Process, Plant And Biofuel From Lignocellulosic Feedstock
US8152867B2 (en) 2008-12-17 2012-04-10 Bp Biofuels Uk Ltd. Process, plant and biofuel for integrated biofuel production
US8247208B2 (en) 2008-12-22 2012-08-21 Alliance For Sustainable Energy Llc Zymomonas with improved xylose utilization in stress conditions
US8603786B2 (en) 2008-12-23 2013-12-10 Poet Research, Inc. System for production of ethanol and co-products with apparatus for solvent washing of fermentation product
EP2381760B1 (en) 2008-12-31 2016-12-28 POET Research, Inc. Zein composition
SE534278C2 (sv) 2009-02-17 2011-06-28 Alfa Laval Corp Ab Ett kontinuerligt förfarande för isolering av oljor från alger eller mikroorganismer
KR101547287B1 (ko) 2009-02-26 2015-08-25 김기협 해조류를 이용한 바이오연료의 생산방법
BRPI1006492A2 (pt) 2009-04-13 2019-09-24 Butamax Advanced Biofuels Llc método para a recuperação de butanol a partir de um meio de fermentação, método para a produção de butanol e mistura de duas fases
CN101532038A (zh) 2009-04-24 2009-09-16 北京金骄生物质化工有限公司 一种利用植物秸秆制备燃料乙醇的方法
US8968523B2 (en) 2009-07-15 2015-03-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Recovery of butanol isomers from a mixture of butanol isomers, water, and an organic extractant
US8968522B2 (en) 2009-07-15 2015-03-03 Butamax Advanced Biofuels Llc Recovery of butanol isomers from a mixture of butanol isomers, water, and an organic extractant
CN102753674B (zh) 2009-08-13 2015-09-30 地理合成燃料有限责任公司 由生物量生产高价值产品的方法
CA2775892A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Fermentive production of isobutanol using highly effective ketol-acid reductoisomerase enzymes
AU2010300653B2 (en) 2009-09-29 2016-01-28 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Improved yeast production host cells
FR2951461B1 (fr) 2009-10-16 2011-11-25 Lorraine Inst Nat Polytech Procede d'extraction enzymatique en milieu aqueux d'huiles et de proteines a partir de matiere vegetale
MX2012005684A (es) 2009-11-23 2012-06-19 Butamax Tm Advanced Biofuels Metodo para producir butanol usando fermentacion extractiva con adiccion de electrolitos.
US8373009B2 (en) 2009-11-23 2013-02-12 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Recovery of butanol from a mixture of butanol, water, and an organic extractant
US8373008B2 (en) 2009-11-23 2013-02-12 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Recovery of butanol from a mixture of butanol, water, and an organic extractant
JP2013511284A (ja) 2009-11-23 2013-04-04 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー オスモライトの添加を伴う抽出発酵を用いたブタノールの生成方法
US8906204B2 (en) 2009-12-21 2014-12-09 Butamax Advanced Biofuels Llc Methods for alcohol recovery and concentration of stillage by-products
AU2010339511A1 (en) 2009-12-29 2012-07-05 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Expression of hexose kinase in recombinant host cells
US8574406B2 (en) 2010-02-09 2013-11-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Process to remove product alcohol from a fermentation by vaporization under vacuum
US20130252297A1 (en) 2010-06-14 2013-09-26 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for Controlling Butanol Concentration in Fermentation Broth
CA2823222C (en) 2010-06-18 2019-07-16 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Extraction solvents derived from oil for alcohol removal in extractive fermentation
US9040263B2 (en) 2010-07-28 2015-05-26 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of alcohol esters and in situ product removal during alcohol fermentation
US8697404B2 (en) 2010-06-18 2014-04-15 Butamax Advanced Biofuels Llc Enzymatic production of alcohol esters for recovery of diols produced by fermentation
US9012190B2 (en) 2011-06-15 2015-04-21 Butamax Advanced Biofuels Llc Use of thiamine and nicotine adenine dinucleotide for butanol production
AU2011268244A1 (en) * 2010-06-18 2012-12-06 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Extraction solvents derived from oil for alcohol removal in extractive fermentation
US8192627B2 (en) 2010-08-06 2012-06-05 Icm, Inc. Bio-oil recovery methods
CA2807930A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Butamax (Tm) Advanced Buofuels Llc Process to remove product alcohol from a fermentation by vaporization under vacuum
NZ707800A (en) 2010-09-07 2016-09-30 Butamax Tm Advanced Biofuels Integration of a polynucleotide encoding a polypeptide that catalyzes pyruvate to acetolactate conversion
WO2012036857A2 (en) 2010-09-17 2012-03-22 Archer Daniels Midland Company Improved milling process with oil recovery
US8765425B2 (en) 2011-03-23 2014-07-01 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
US8759044B2 (en) 2011-03-23 2014-06-24 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
KR20140039292A (ko) 2011-06-17 2014-04-01 부타맥스 어드밴스드 바이오퓨얼스 엘엘씨 바이오연료 생성 프로세스로부터의 공동-생성물 및 이의 생성 방법
US9962623B2 (en) 2011-12-09 2018-05-08 Butamax Advanced Biofuels Llc Process to remove product alcohols from fermentation broth
WO2013166458A1 (en) 2012-05-04 2013-11-07 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Processes and systems for alcohol production and recovery
US9605281B2 (en) 2012-09-12 2017-03-28 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the fermentative production of alcohols
US20140024064A1 (en) 2012-07-23 2014-01-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentative alcohols
US9109196B2 (en) 2012-09-12 2015-08-18 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentation products
CN104981544B (zh) 2012-09-21 2018-05-15 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 用于使用两相萃取发酵和可循环利用的提取剂组合物制备丁醇的方法
AU2013323396B2 (en) 2012-09-28 2017-04-20 Butamax Advanced Biofuels Llc Production of fermentation products
US20140106419A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of fermentation products
US20140142352A1 (en) 2012-11-20 2014-05-22 Butamax Advanced Biofuels Llc Butanol purification
US9523104B2 (en) 2013-03-12 2016-12-20 Butamax Advanced Biofuels Llc Processes and systems for the production of alcohols
US9771602B2 (en) 2013-03-15 2017-09-26 Butamax Advanced Biofuels Llc Competitive growth and/or production advantage for butanologen microorganism
BR112015020685A2 (pt) 2013-03-15 2017-07-18 Butamax Advanced Biofuels Llc método para a recuperação do butanol, composição, métodos para a extração de álcool e de secagem
US9663759B2 (en) 2013-07-03 2017-05-30 Butamax Advanced Biofuels Llc Partial adaptation for butanol production

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