CN110100819B - 2-甲基柠檬酸在抑制芽胞杆菌芽胞形成中的应用及抑制芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及2‑甲基柠檬酸在抑制敲除2‑甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成中的应用及在制备抑制敲除2‑甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂中的应用，还提供了一种抑制敲除2‑甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂，包括2‑甲基柠檬酸。本发明首次发现敲除了prpD的芽胞杆菌由于2‑甲基柠檬酸的积累可以抑制其芽胞的形成，抑制率达到100％。同时敲除prpD、prpC和prpD的芽胞杆菌，无法合成2‑甲基柠檬酸，外源添加2‑甲基柠檬酸，可以对芽胞杆菌的芽胞形成产生抑制作用，当2‑甲基柠檬酸的添加浓度达到200μg/mL时，其对芽胞的抑制率达到81％。

Description

2-甲基柠檬酸在抑制芽胞杆菌芽胞形成中的应用及抑制芽胞 杆菌芽胞形成的抑制剂
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及2-甲基柠檬酸在抑制芽胞杆菌形成中的应用以及抑制芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂。
背景技术
芽孢杆菌是一类能够产生具有抗逆性芽胞的革兰氏阳性细菌，广泛分布于自然界中。随着研究的深入，芽胞杆菌被认为是一种重要的微生物资源，在农业、工业、医学等领域具有重要应用价值和经济价值。除此之外，芽胞杆菌还包含能够引起人群致病的种类，如能引起呕吐和腹泻的食源性机会致病菌蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)、产炭疽毒素的炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis) 等。
芽胞杆菌在自然环境中主要以芽胞的形式存在，其芽胞如遇到适宜的生长条件，可萌发成营养体，营养体发育到一定阶段又会形成芽胞，完成生命循环。芽胞具有极强的抗逆性，能耐高温、耐紫外线照射等，这种存在形式能极大的增强芽胞杆菌在自然界的生存能力，既能让有益芽胞杆菌充分发挥其活性功能优势，又能然有害芽胞杆菌的危害得到持续加强。例如：用加热法保存食品时，由于其中的芽胞耐热性极强，往往不能将其彻底杀死，使得芽胞萌发成营养细胞后大量繁殖，导致食品腐败变质；医疗器械灭菌方式不合理，使得少量存活的芽胞大量萌发成营养细胞，严重危害人类健康。因此，通过相关技术手段阻止有害芽胞杆菌的芽胞形成过程，可以有效地控制有害芽胞杆菌产生的危害。
微生物来源的芽胞形成抑制剂因容易获取，绿色环保等突出优势而成为关注的重点。2-甲基柠檬酸是一种广泛存在于细菌中的代谢产物，文献表明， 2-甲基柠檬酸不仅仅是一种胞内代谢产物，还可以抑制中心代谢路径关键酶 (如顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸酶等)的活性，但是关于2-甲基柠檬酸对芽胞形成的作用，并没有相关报道。
发明内容
本发明为解决上述技术问题提供了2-甲基柠檬酸在抑制敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成中的应用。
2-甲基柠檬酸是一种广泛存在于细菌中的代谢产物，芽胞杆菌中存在2- 甲基柠檬酸代谢相关的酶，包括2-甲基柠檬酸合成酶、2-甲基柠檬酸脱水酶和2-甲基异柠檬酸裂解酶，发明人意外的发现敲除2-甲基柠檬酸代谢相关的酶后，能够抑制芽胞杆菌芽胞的形成。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：2-甲基柠檬酸在抑制敲除2- 甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成中的应用。
进一步，所述芽胞杆菌的基因组中还敲除2-甲基柠檬酸合成酶基因prpC 和2-甲基异柠檬酸裂解酶基因prpB。
进一步，所述芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌。
本发明还提供了2-甲基柠檬酸在制备抑制敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂中的应用。
进一步，所述芽胞杆菌的基因组中还敲除2-甲基柠檬酸合成酶基因prpC 和2-甲基异柠檬酸裂解酶基因prpB。
进一步，所述芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌。
本发明还提供了一种抑制敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂，包括2-甲基柠檬酸。
进一步，所述芽胞杆菌的基因组中还敲除2-甲基柠檬酸合成酶基因prpC 和2-甲基异柠檬酸裂解酶基因prpB。
进一步，所述抑制剂还包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。
进一步，所述抑制剂为固体形式或液体形式，所述固体形式为粉末剂、片剂或颗粒剂，所述液体形式为溶液剂或混悬剂。
本发明的有益效果是：本发明首次发现了2-甲基柠檬酸可以抑制敲除 2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞的形成，对于敲除prpD的芽胞杆菌，其体内可以积累2-甲基柠檬酸，本发明首次发现敲除了prpD的芽胞杆菌由于2-甲基柠檬酸的积累可以抑制其芽胞的形成，抑制率达到100％。同时敲除prpD、prpC和prpD的芽胞杆菌，无法合成2-甲基柠檬酸，外源添加2-甲基柠檬酸，可以对芽胞杆菌的芽胞形成产生抑制作用，当2-甲基柠檬酸的添加浓度达到200μg/mL时，其对芽胞的抑制率达到81％，能够为抑制有害芽胞杆菌的芽胞形成提供一条新的防控途径。
附图说明
图1为本发明实施例1实验组苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpD的芽胞形成的显微照片；
图2为 本发明实施例1对照组苏云金芽胞杆菌BMB171的芽胞形成的显微照片；
图3为本发明不添加2-甲基柠檬酸的苏云金芽孢杆菌芽胞形成的显微照片；
图4为本发明加入浓度为50μg/mL的2-甲基柠檬酸后苏云金芽孢杆菌芽胞形成的显微照片；
图5为本发明加入浓度为100μg/mL的2-甲基柠檬酸后苏云金芽孢杆菌芽胞形成的显微照片；
图6为本发明加入浓度为200μg/mL的2-甲基柠檬酸后苏云金芽孢杆菌芽胞形成的显微照片。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
2-甲基柠檬酸(2-methylcitrate)又名2-羟基丁烷-1,2,3-三羧酸，分子式为C7H10O7，相对分子质量为206.1501g/moL。2-甲基柠檬酸为生物体内2- 甲基柠檬酸循环的中间代谢产物，其结构式为
Figure BDA0002045147030000041
本申请中的2-甲基柠檬酸购自SIGMA-ALDRICH公司， CAS号为117041-96-0。
发明人意外发现2-甲基柠檬酸能够抑制敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因 prpD的芽胞杆菌芽胞的形成，本发明提供了2-甲基柠檬酸在抑制敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成中的应用。
优选地，所述芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌。
本发明还提供了2-甲基柠檬酸在制备抑制敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂中的应用。
本发明还提供了一种抑制敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂，包括2-甲基柠檬酸。
优选地，所述抑制剂还包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。
优选地，所述抑制剂为固体或液体形式，所述固体形式为粉末剂、片剂或颗粒剂，所述液体形式为溶液剂或混悬剂。
2-甲基柠檬酸是2-甲基柠檬酸循环的中间代谢物，2-甲基柠檬酸的合成是在2-甲基柠檬酸合成酶PrpC的催化下，以丙酰-CoA和草酰乙酸为底物缩合而成；其降解则是在2-甲基柠檬酸脱水酶PrpD的作用下脱水形成2-甲基顺乌头酸，芽胞杆菌中也存在2-甲基柠檬酸循环，产生的中间产物2-甲基柠檬酸会进入2-甲基柠檬酸循环，在其野生菌的培养中无法检测出2-甲基柠檬酸的积累。
为了验证2-甲基柠檬酸在抑制芽胞形成中的作用，发明人进行了如下实验,实验过程中用到的培养基的配方如下：
LB培养基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，调节pH至7.0左右，定容至1L，121℃高温高压灭菌20min。固体培养基需添加0.8％琼脂粉。
GYS培养基：葡萄糖1g、酵母提取物2g、硫酸铵2g、K2HPO4·3H2O0.655 g、MgSO4·7H2O0.041g、MnSO4·H2O0.0378g、CaCl20.08g，调节pH至7.8-7.9，定容至1L，115℃高温高压灭菌30min。
实验中用到的菌株为苏云金芽胞杆菌，本申请中的苏云金芽胞杆菌为本实验室筛选得到的苏云金芽胞杆菌BMB171。
实施例12-甲基柠檬酸对敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的苏云金芽胞杆菌芽胞形成的抑制作用
1)将苏云金芽胞杆菌BMB171的2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD进行敲除，切断2-甲基柠檬酸的代谢通路，使得2-甲基柠檬酸积累，得到可以高产2-甲基柠檬酸的工程菌BMB171-ΔprpD，并将其作为实验组菌株。
2)菌种活化和转接：将冻存的苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpD划线于固体LB平板上，过夜培养使其形成典型的单菌落，挑取单菌落接种于5mL 液体LB培养基中，于28℃、200r/min震荡过夜培养；将在LB中活化的苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpD按照1％的接种量接种至5mL液体GYS培养基中，于28℃、200r/min振荡培养6-8h；
3)将上述在GYS培养基中获得的菌液接种至200mL液体GYS培养基中(保证初始OD600为0.01)，于28℃、200r/min震荡培养18h，利用相差显微镜观察芽胞形成情况，测定其芽胞形成率，其显微照片如图1所示。
对照组的菌株采用苏云金芽胞杆菌BMB171，其他实验过程同上，利用相差显微镜观察对照组的芽胞形成情况，测定其芽胞形成率，其显微照片如图2所示。
在相差显微镜下，细胞一侧有明显的芽胞亮点出现，则表示该细胞形成芽胞，否则为未形成芽胞，对照组苏云金芽胞杆菌BMB171几乎全部形成了可见的芽胞，但是实验组的苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpD几乎没有芽胞形成，证明苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpD菌体内积累的2-甲基柠檬酸可以抑制敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的苏云金芽胞杆菌芽胞形成。
实施例22-甲基柠檬酸对同时敲除prpC、prpD和prpB基因的苏云金芽胞杆菌芽胞形成的抑制效果
1)将苏云金芽胞杆菌BMB171中与2-甲基柠檬酸代谢相关的关键酶基因2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD(编号：BMB171_C2056)、2-甲基柠檬酸合成酶prpC(编号BMB171_C2056)，2-甲基异柠檬酸裂解酶prpB(编号 BMB171_C2058)同时进行敲除，得到苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpCDB；
2)苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpCDB的活化。将冷冻保存的苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpCDB划线于固体LB平板上，过夜培养使其形成典型的单菌落，挑取单菌落接种于5mL液体LB培养基中，于28℃、200r/min 震荡过夜培养；
3)苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpCDB的转接。将上述在LB活化的菌液按照1％的接种量接种至5mL液体GYS培养基中，于28℃、200r/min振荡培养6-8h；
4)2-甲基柠檬酸对苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpCDB芽胞形成的抑制实验，将上述在GYS培养基中获得的菌液接种至200mL液体GYS培养基中(保证初始OD600为0.01)，分别加入不同浓度梯度的2-甲基柠檬酸 (终浓度分别为0、50、100、200μg/mL，每个浓度梯度设置三个重复)，于28℃、200r/min震荡培养18h，利用相差显微镜观察苏云金芽胞杆菌BMB171-ΔprpCDB的芽胞形成情况，测定其芽胞形成率。
图3、图4、图5和图6分别为2-甲基柠檬酸的浓度为0、50、100、200μg/mL 时的显微照片，结果见表1。
Figure BDA0002045147030000071
实验结果表明2-甲基柠檬酸对苏云金芽孢杆菌BMB171-ΔprpCDB的芽胞形成具有明显的抑制作用，2-甲基柠檬酸的浓度越高，抑制效果越强，当 2-甲基柠檬酸浓度达到200μg/mL时，对芽胞形成的抑制率为81％。
实施例3抑制同时敲除prpC、prpD和prpB基因的苏云金芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂
该抑制剂可以为固体或液体的形式，固体可以直接用2-甲基柠檬酸，液体形式可以为2-甲基柠檬酸的水溶液的形式，2-甲基柠檬酸的浓度为 50～200μg/mL，当2-甲基柠檬酸浓度为200μg/mL时，对芽胞形成的抑制率为81％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.2-甲基柠檬酸在抑制敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芽胞杆菌的基因组中还敲除2-甲基柠檬酸合成酶基因prpC和2-甲基异柠檬酸裂解酶基因prpB。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌。
4.2-甲基柠檬酸在制备抑制敲除2-甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述芽胞杆菌的基因组中还敲除2-甲基柠檬酸合成酶基因prpC和2-甲基异柠檬酸裂解酶基因prpB。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述芽胞杆菌为苏云金芽胞杆菌。
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