CN113717862A - 一种抑制尖孢镰刀菌的哈茨木霉及其应用 - Google Patents

一种抑制尖孢镰刀菌的哈茨木霉及其应用 Download PDF

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Abstract

一种抑制尖孢镰刀菌的哈茨木霉及其应用，该菌株已作为专利菌种保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号：CCTCC NO:M 2021468，保藏日期：2021年4月27日。室内对峙拮抗试验表明，T334菌株对尖孢镰刀菌具有良好的抑菌效果，接种后72h,两菌落接触处形成明显的抗菌线，T334开始包围黄瓜枯萎病菌，抑制率达到78.0%；96小时后，T334的菌丝进入尖孢镰刀菌，菌丝无法正常发育而死亡，并在尖孢镰刀菌的白色菌落上开始产生T334的簇生孢子，此时抑菌率达到100.0%。进一步以优化的麸皮和竹粉为培养基进行固体发酵，T334的孢子产量较优化前增加了268.8%。

Description

一种抑制尖孢镰刀菌的哈茨木霉及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种抑制尖孢镰刀菌的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T334及其应用。
背景技术
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。尖孢镰刀菌既可以浸染植物体，又能够在土壤中生存，是一种兼性寄生真菌，具有很强的生存能力，可以在土壤中存活十年以上并保持很强的生物活性，这也是尖孢镰刀菌较难防治的原因之一。
目前植物枯萎病的防治技术主要包括选育抗病品种、避免连作、嫁接和使用化学农药，其中化学农药的广泛使用虽然控制了病害，但同时也杀死了环境中的有益微生物，严重破坏了农业生态系统，造成了环境污染。此外，尖孢镰刀菌的耐药性逐年增加，导致该病发病率高，防治难度大。因此，开发高效、安全、无污染的绿色生物农药显得尤为迫切。
应用于防治尖孢镰刀菌的真菌主要有木霉菌属(Trichoderma)、丛枝菌根菌属(Arbuscular mycorrhize)以及非致病尖孢镰刀菌等。其中木霉菌属在农业病害的防治中研究最为深入、应用最为广泛，同时也是目前在拮抗尖孢镰刀菌的研究中效果最为显著的真菌，而哈茨木霉因其寄生能力强、能够抑制植物病原真菌、促进植物生长、诱导植物防御和产生抗生素，包括聚酮类、氨基酸及其衍生物、萜类、咪唑等受到众多研究人员的关注。虽然哈茨木霉发酵技术有了明显的改进，部分产品已经投入市场，但与化学农药相比，生产技术落后，防治效果低，限制了哈茨木霉的广泛应用。此外，在哈茨木霉生产过程中容易出现菌丝生长过于旺盛，而分生孢子产量不足的问题。分生孢子数量高，菌剂货架期就会比较长，菌剂也能够在田间迅速萌发繁殖，形成优势菌落，从而起到生防和促进植株生长作用。因此提高哈茨木霉的抑菌性和分生孢子产量是急需解决的问题。
发明内容
解决的技术问题：为解决上述技术问题，本发明提供一种抑制尖孢镰刀菌的哈茨木霉及其应用，该菌株对尖孢镰刀菌具有较高的抑制活性，由该菌株培养的孢子粉可用于由尖孢镰刀菌引起的黄瓜枯病的生物防治。
技术方案：一株哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T334，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号：CCTCC NO:M 2021468，保藏日期为2021年4月27日，保藏地点为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号(武汉大学)。
上述菌株在抑制尖孢镰刀菌中的应用。
抑制尖孢镰刀菌的产品，有效成分为上述的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T334。
有益效果：采用本发明获得哈茨木霉高产菌株T334对尖孢镰刀菌的抑制率由23.8％提高到78.0％；其孢子产量达到1.0×1010～1.1×1010cfu/g，较优化前增加了268.8％。该方法为哈茨木霉抑制尖孢镰刀菌提供了技术支持。
附图说明
图1为微波诱变哈茨木霉致死率曲线图；
图2为哈茨木霉突变率图；
图3为突变菌株对黄瓜枯萎病菌抑制效果图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
哈茨木霉Trichoderma harzianum微波诱变条件的确定
将出发菌株哈茨木霉(Trichoderma harzianum)CGMCC 3.5488在PDA斜面进行活化培养5～7d，培养温度28℃，用10mL生理盐水将斜面孢子全部刮下，转移到150mL三角瓶中，在三角瓶中加入30个玻璃珠(直径4mm)，转速250转/分钟，震荡30min，将孢子打散，孢子浓度控制在107～108个/mL。孢子悬液移入1.5mL离心管中，将离心管放入装有冰块的微波消解管中，分别以200W、400W、600W、800W和1000W的功率照射诱变处理孢子悬浮液，处理时间为0～180s。取微波辐照后的孢子悬液涂布于分离培养基平板上，28℃恒温培养2d后进行菌落计数，同时计算微波不同辐照功率和时间下的致死率，致死率曲线见图1，其中在辐照功率为600W，辐照时间为30～70s的条件下，哈茨木霉的致死率集中于40～80％，该条件处于菌株致死率从急剧增加到趋向平稳的转折点上，所以将后续的微波诱变功率确定为600W，并在30～70s的范围内确定最佳辐照时间。具体操作为挑取生长成熟的单菌落接于PDA斜面培养基，置于温度为28℃的培养箱中继续培养至成熟，然后采用点对峙实验对哈茨木霉进行初筛。具体操作为在灭过菌的PDA培养基上同时对称接种尖孢镰刀菌和微波辐照后的哈茨木霉菌，它们之间的距离大约是3cm左右。另做两个空白实验，一个只接哈茨木霉，另一个只接尖孢镰刀菌。定期测定哈茨木霉的菌落指向尖孢镰刀菌的半径，尖孢镰刀菌指向哈茨木霉的半径以及空白对照的直径，以此计算哈茨木霉对尖孢镰刀菌的抑制效率，并筛选出抑菌效率高的突变菌株。根据哈茨木霉对黄瓜枯萎病菌的抑制率计算各个辐照时间的突变率，以正突变率最高的时间为最佳辐照时间。本实施例中在辐照功率为600W的条件下，最佳辐照时间40s，正突变率达到28.0％(见图2)。以下实施例均以该辐照实验进行微波诱变。
抑制尖孢镰刀菌的哈茨木霉高产菌株的诱变选育
从辐照功率为600W，辐照时间40s的条件下获得的突变菌株中选取对尖孢镰刀菌抑制率最高的初筛突变菌株作为出发菌株继续进行微波诱变。具体操作为将该菌株继续在PDA斜面进行活化培养5～7d，培养温度28℃，用10mL生理盐水将斜面孢子全部刮下，转移到150mL三角瓶中，在三角瓶中加入30个玻璃珠(直径4mm)，转速250转/分钟，震荡30min，将孢子打散，孢子浓度控制在107～108个/mL。孢子悬液移入1.5mL离心管中，将离心管放入装有冰块的微波消解管中，以600W的功率照射诱变处理孢子悬浮液，处理时间为40s。取微波辐照后的孢子悬液涂布于分离培养基平板上，28℃恒温培养2d后挑取生长成熟的单菌落接于PDA斜面培养基，置于温度为28℃的培养箱中继续培养，根据哈茨木霉对尖孢镰刀菌的抑制率初选出高抑制性突变菌株，再通过发酵产孢实验进行复筛，从而选育出抑制尖孢镰刀菌的哈茨木霉高产突变株。具体操作为选取抑菌效率明显增加的菌株进行液体培养，然后按5％的接种量接入固体发酵培养基中，置于28℃培养箱中培养7～10d，通过测定发酵产物中的孢子量筛选出抑菌效率高且孢子产量高的突变菌株作为下一轮微波诱变的出发菌株。如此重复3次，获得一株哈茨木霉突变菌株T334，与出发菌株相比，T334对黄瓜枯萎病的抑制率由23.8％提高到78.0％；进一步以优化的麸皮和竹粉为培养基进行固体发酵，T334的孢子产量的可达到1.0×1010～1.1×1010cfu/g，较优化前增加了268.8％。
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)T334，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2021年4月27日，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2021468。地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮政编码：430072。
哈茨木霉高产菌株对尖孢镰刀菌的抑制效果分析
本发明以点对峙实验对突变菌株T334对尖孢镰刀菌的抑制效果进行分析(试验结果见表1)。
表1突变菌株T334对尖孢镰刀菌的抑制试验结果
实验项目 48h 72h 96h
周对峙实验 12％ 37％ 100％
点对峙实验 30％ 78％ 100％
点对峙实验的具体步骤为：在灭过菌的PDA培养基上同时对称接种哈茨木霉T334和尖孢镰刀菌，它们之间的接种距离是3cm左右。另做两个空白实验。一个只接种哈茨木霉T334，另一个只接种尖孢镰刀菌。然后定期测定哈茨木霉T334和尖孢镰刀菌的半径及空白实验的半径。接种24h后，哈茨木霉T334的菌落明显大于尖孢镰刀菌，48h后，两种菌的部分菌落开始相互接触。在显微镜下观察到哈茨木霉T334与尖孢镰刀菌接触后菌丝变厚。72h后，两菌落之间形成了明显的抗菌线，哈茨木霉T334开始包围尖孢镰刀菌。96小时后，T334基本完全包围尖孢镰刀菌。在显微镜下可以看到，尖孢镰刀菌原有菌丝被T334紧紧地锁住而不能向前移动，锁住的武器是抗生素和细胞壁水解酶的分泌，菌丝无法正常发育而死亡。此时T334对尖孢镰刀菌的抑菌率达到100％。
周对峙实验的具体步骤为：在灭过菌的PDA培养基的平板中心接种尖孢镰刀菌，3d后再以尖孢镰刀菌为中心，半径3cm的圆周上等距离接种4点同质等量的哈茨木霉T334菌丝，定期测哈茨木霉的菌落指向病菌的半径，尖孢镰刀菌指向哈茨木霉T334的半径及空白对照菌落的半径。试验发现两种菌丝接触24h后，尖孢镰刀菌菌落上发现了T334的菌丝和孢子。随着培养时间的延长，两侧孢子数量逐渐增加，96h以后，在尖孢镰刀菌的白色菌落上开始产生T334的绿色簇生孢子，并逐渐增多。最终，尖孢镰刀菌菌落解体。此时T334对尖孢镰刀菌的抑菌率达亦到100％。
菌种及培养基
本发明所采用的出发菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 3.5488。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum)，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC 2532。
固体培养基为PDA平板和斜面培养基，分离培养基的配制方法为在PDA培养基中加入0.5％的脱氧胆酸钠。
液体培养基为PDB培养基，在250mL三角瓶中装液体培养基50mL，用接种环挑取少许哈茨木霉菌菌丝于灭菌的培养瓶中，置于28℃摇床，150r/min，振荡培养120小时。
固体培养基为麸皮毛竹粉培养基，组成为麸皮16g，竹粉64g，培养液100mL，其中培养液组成为葡萄糖2.0％，KH2PO4 0.3％，MgSO4 0.15％。
哈茨木霉生物量测定
取0.5g固体培养物，用含1％吐温的无菌水稀释100倍，在磁力搅拌器上搅拌20min，用血球计数板在显微镜下计数孢子数。

Claims (3)

1.一株哈茨木霉（Trichoderma harzianum）T334，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）, 保藏编号：CCTCC NO:M 2021468，保藏日期为2021年4月27日。
2.权利要求1所述的菌株在抑制尖孢镰刀菌中的应用。
3.抑制尖孢镰刀菌的产品，其特征在于有效成分为权利要求1所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）T334。
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