CN106834394B - 一种丙谷二肽的制备方法 - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y207/02001—Acetate kinase (2.7.2.1)
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)

Abstract

本发明涉及一种丙谷二肽的制备方法，利用大肠杆菌分别表达来自于枯草芽孢杆菌的氨基酸连接酶和来自于丙酮丁醇梭菌的乙酸激酶，经纯化后混合形成双酶偶联体系。氨基酸连接酶催化L‑丙氨酸和L‑谷氨酰胺生成丙谷二肽，同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP，乙酸激酶则催化乙酰磷酸和ADP形成ATP，从而实现ATP的循环再生。利用上述双酶偶联体系，在合适的反应条件下反应8h可以得到32.5mM的丙谷二肽，摩尔转化率为64.5％。本发明提供的丙谷二肽生产方法具有原料价格低廉、酶转化时间短、操作简便以及生产成本低等优点，具有较好的工业应用价值。

Description

一种丙谷二肽的制备方法
技术领域
本发明涉及核苷类产品生物技术生产领域，尤其是一种丙谷二肽的制备方法。
背景技术
L-谷氨酰胺作为一种人体代谢所必需氨基酸，其在体内转变成为糖胺，作为合成粘蛋白的前体，可促进溃疡愈合，作为肠外营养药品应用于严重感染、复合性骨折、创伤、大手术、大面积烧伤，化学毒物伤害、辐射伤害、有害物伤害病人的治疗和恢复；还可用作脑功能改善剂，用于改善智力发育不良儿童和精神障碍、酒精中毒、癫痫病人脑功能；此外，它还可以作为免疫缺乏综合征如艾滋病、危重病或骨髓移植后伴发的免疫功能低下的治疗药物，因而广泛应用于医疗行业。由于L-谷氨酰胺对酸敏感，加热时易产生有毒的焦谷氨酸和氨，水溶性差(35g/L，20℃)，长期储存时化学稳定性不足等化学性质大大限制了其在临床上的应用。为了解决L-谷氨酰胺的这些缺陷，研究人员做了一系列的研究，其中一种方法就是通过与其它氨基酸连接形成二肽，作为L-谷氨酰胺的替代品应用于临床。在这些二肽中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(简称丙谷二肽)的水溶性和热稳定性均优于L-谷氨酰胺与其它氨基酸形成的二肽，是国际公认的L-谷氨酰胺的最适载体。
丙谷二肽是由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺缩合形成的二肽，属于氨基酸类的化学药剂，由德国费森尤斯(Fresenius AG)于1995年研发成功，首先在德国批准上市，1999年作为进口药物进入中国市场。目前，工业生产丙谷二肽的方法主要为化学法(ZL201210371136.4；ZL201210382194.7；ZL201310169606.3；ZL 201310700449.4)。近年来，已有报道采用氨基酸酯酰基转移酶催化L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺生成丙谷二肽(201410663050.8；201410670694.X；201510064439.5)，但由于原料L-丙氨酸甲酯盐酸盐合成工艺复杂，导致该方法的生产成本较高，不利于工业化放大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种低成本的丙谷二肽的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种丙谷二肽的制备方法，以L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、ADP和乙酰磷酸为原料(底物)，加入氨基酸连接酶和乙酸激酶，在pH 6.5-9.5、32-42℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成丙谷二肽。
优选的，上述丙谷二肽的制备方法，具体步骤如下：
(1)分别构建氨基酸连接酶的基因重组表达载体pET-His-ywfE和乙酸激酶的基因重组表达载体pET-His-ack，其中，所述氨基酸连接酶编码基因来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(ATCC 15245)，其核苷酸序列为序列表400<1>所示序列；乙酸激酶编码基因来源于丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum(ATCC 4259)，其核苷酸序列为序列表400<2>所示序列，质粒pET-His的核苷酸序列为序列表400<3>所示序列；
(2)分别将步骤(1)中的重组表达载体转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(ACCC11171),获得基因工程重组菌株E.coli pET-His-ywfE和E.coli pET-His-ack；
(3)培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达氨基酸连接酶和乙酸激酶的菌体；
(4)破碎步骤(3)中的菌体获得粗酶液，经镍柱纯化后混合；
(5)将步骤(4)中获得的混合酶液加入含有30-60mM丙氨酸、30-60mM谷氨酰胺、3.0-6.0mM ADP和30-60mM乙酰磷酸的催化液中，在pH值为7.0-9.0，温度为32-42℃条件下进行酶促反应合成丙谷二肽。
优选的，上述丙谷二肽的制备方法，所述步骤(3)中重组菌株中的培养方法为：重组菌株从甘油保菌管中以0.1％(v/v)的接种量接种至100mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基，于37℃200rpm培养12h，再按1％(v/v)接种量转接400mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基，于37℃200rpm继续培养；待菌株浓度OD600nm达到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG，28℃诱导培养8-10h表达蛋白。
优选的，上述丙谷二肽的制备方法，所述LB液体培养基为：每10g NaCl与5g酵母粉、10g蛋白胨用去离子水定容到1L。
优选的，上述丙谷二肽的制备方法，所述催化液为浓度50mM的PBS缓冲液中含有L-丙氨酸、L-谷氨酰胺和乙酰磷酸的浓度均为50mM，ADP的浓度为5mM。
上述丙谷二肽的制备方法所得反应液中丙谷二肽的检测方法为：取适量体积的反应液于13000rpm离心10min后，取上清用20％的水杨酸稀释至10-50mg/L，静止10min后，用0.22um的无菌膜过滤至液相瓶待分析。采用全自动氨基酸分析仪，阳离子交换树脂色谱柱，130℃反应，柱温57℃，进样量50uL，检测波长为570nm，保留时间为23min。
本发明的有益效果是：
上述丙谷二肽的制备方法，在氨基酸连接酶催化反应中所需要的ATP由乙酸激酶催化反应不断提供，只需消耗少量的ADP即可实现ATP的循环再生；且原料来源广泛，成本较低，操作简单，易于规模化工业生产。
附图说明
图1为双酶偶联反应示意图；
图2为丙谷二肽标准品的色谱图(丙谷二肽出峰时间为23.1min)；
图3为双酶催化反应液的色谱图(丙谷二肽出峰时间为23.1min)。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1氨基酸连接酶菌株的构建
①根据Genbank上B.subtilis ATCC 15245的氨基酸连接酶编码基因ywfE的核苷酸序列，用大肠杆菌中常用的密码子软件对其进行密码子优化，将优化后序列加上酶切位点BamH I和Hind III(序列表400<1>所示序列)送到金唯智公司进行合成。
②使用Takara限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切步骤①中的目的基因片段及pET-His载体质粒，获得带有相同粘性末端的ywfE和pET-His线性片段。
③使用Takara T4DNA连接酶连接步骤②中的两个基因片段，得到重组表达载体pET-His-ywfE。
④将步骤③中的重组表达载体转化入E.coli BL21(ACCC11171)中，获得产氨基酸连接酶菌株E.coli pET-His-ywfE。
实施例2乙酸激酶菌株的构建
①采用PCR技术以丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 4259基因组为模板，根据乙酸激酶编码基因ack的核苷酸序列序列(序列表400<2>所示序列)设计一对基因扩增引物(上游引物为序列表400<4>所示序列，下游引物为序列表400<5>所示序列)，扩增获取ack基因片段。所述一对引物分别包含酶切位点BamH I和EcoRI。
②使用Takara限制性内切酶BamH I和EcoRI双酶切步骤①中获得目的片段及pET-His载体质粒，获得带有相同粘性末端的ack和pET-His线性片段。
③使用Takara T4DNA连接酶连接步骤②中获得的两个两个基因片段，得到重组表达载体pET-His-ack。
④将步骤③重组表达载体转化入E.coli BL21(ACCC11171)中，获得产乙酸激酶菌株E.coli pET-His-ack。
实施例3氨基酸连接酶和乙酸激酶的制备
①将(1)和(2)中的菌株从甘油保菌管中以0.1％(v/v)的接种量接种至100mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基，于37℃200rpm培养12h，再按1％(v/v)接种量转接400mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基，于37℃200rpm继续培养。待菌株浓度OD600nm达到0.6时添加终浓度为0.1mmol/L的IPTG，28℃诱导培养10h表达蛋白。
②培养结束后，将发酵液于4℃，6000rpm离心收集菌体。使用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤三次后，再用pH 7.4的PBS缓冲液重悬，超声破碎20min，4℃，10000rpm离心取上清液。
③将上清液以1mL/min的流速通过Ni+-NTA树脂后，用50mM的咪唑溶液以1mL/min的流速洗脱，再用250mM的咪唑溶液以1mL/min的流速洗脱目的蛋白。
④将洗脱下来的目的蛋白用pH 7.4的PBS缓冲液于4℃下透析脱盐，每2h更换一次透析液，重复透析四次之后，将所获的目的蛋白混合得到混合酶液。
实施例4双酶偶联催化合成丙谷二肽
①配制反应体系，其中L-丙氨酸，L-谷氨酰胺和乙酰磷酸的浓度均为50mM，ADP的浓度为5mM，PBS缓冲液浓度为50mM，pH值为8.0。
②向步骤①中的反应体系内添加混合酶液使得氨基酸连接酶的终浓度为0.2mg/mL，乙酸激酶的终浓度为0.4mg/mL。于37℃恒温水浴摇床，200rpm，反应8h。
实施例5反应液中丙谷二肽的检测
使用氨基酸分析仪(Sykam S7130)测定丙谷二肽的含量，进样量为50uL，色谱柱为PEEK色谱柱，柱温为57℃，反应器为130℃，流动相为pH 3.4和pH 10.8的钠盐，检测波长为440和570nm，保留时间为23min。经液氨基酸分析仪检测，如附图3所示，反应液中丙谷二肽浓度为32.5mM。
上述参照具体实施方式对该一种丙谷二肽的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种丙谷二肽的制备方法
<130> 2017
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<220>
<221> 氨基酸连接酶编码基因ywfE
<222> (1)..(1419)
<400> 1
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tataaaagcg ccgccgagaa gtacaatctg gtgagcttca ttccgcgccc ttttgccatc 120
acagcaagcc atgcagccct gatcgagaaa tatagcgtgg ccgttattaa agataaggac 180
tactttcaga gcctggccga tttcgaacac ccggatagca tctactgggc acacgaggat 240
catgacaaac cggaggaaga agtggtggag caaatcgtga aagttgccca gatgttcgag 300
gccgacgcca tcaccaccaa taatgagctg ttcatcgccc ctatggccaa agcatgtgaa 360
cgtctgggcc tgcgtggtgc aggtgtgcaa gcagcagaaa acgcccgtga caaaaacaaa 420
atgcgcgacg ccttcaacaa ggccggcgtt aagagcatca agaacaagcg cgtgaccacc 480
ctggaagatt tccgtgcagc cctggaagaa atcggcaccc cgctgatcct gaaaccgaca 540
tacctggcca gtagcatcgg cgtgacactg attaccgata ccgaaaccgc agaggatgaa 600
tttaatcgcg tgaacgatta tctgaaaagc atcaacgttc cgaaggcagt gaccttcgag 660
gccccgttca ttgccgaaga gtttttacaa ggcgagtatg gtgattggta tcaaaccgag 720
ggttacagcg actatattag cattgaaggc attatggcag acggcgagta ctttccgatt 780
gcaatccatg acaaaacccc gcagatcggt ttcaccgaaa ccagccacat tacccctagc 840
atcctggatg aagaagctaa gaagaaaatt gtggaggcag ccaagaaggc aaatgaaggc 900
ctgggtctgc aaaactgcgc aacccacacc gagatcaagc tgatgaaaaa ccgcgaaccg 960
ggtctgatcg aaagcgccgc ccgttttgcc ggctggaaca tgatcccgaa tatcaaaaag 1020
gttttcggcc tggatatggc ccagctgctg ctggatgtgt tatgcttcgg caaggacgca 1080
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ccgcagcatt ttaagcagaa tggccagatc ccggagaccg cagaagacct ggtgatcgaa 1200
gccatcgaca tcccggatgg tctgctgaag ggcgataccg aaattgtgac cttcagcgcc 1260
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<211> 1206
<212> DNA
<213> 丙酮丁醇梭菌
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<221> 乙酸激酶编码基因ack
<222> (1)..(1206)
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gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 1980
actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 2040
gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 2100
agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 2160
ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 2220
aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 2280
cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 2340
gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 2400
cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 2460
cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 2520
gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 2580
aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag gatctcgatc ccgcgaaatt 2640
aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct agaaataatt ttgtttaact 2700
ttaagaagga gatataccat gcatcatcac catcaccatc tgctgccgcg cggatccgca 2760
gaattcagcg ctagctaaca tatcatcatc attaagctt 2799
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 引物
<220>
<221> ack 基因扩增上游引物
<222> (1)..(35)
<400> 4
cgggatccat gaaaaactta gttattaact gcggt 35
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物
<220>
<221> ack 基因扩增下游引物
<222> (1)..(37)
<400> 5
cggaattctt attttaactt gcctactata tctttgg 37

Claims (4)

1.一种丙谷二肽的制备方法，其特征在于：以L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、ADP和乙酰磷酸为原料，加入氨基酸连接酶和乙酸激酶，通过酶促反应偶联催化合成丙谷二肽,具体步骤如下：
（1）分别构建氨基酸连接酶的基因重组表达载体pET-His-ywfE和乙酸激酶的基因重组表达载体pET-His-ack，其中，所述氨基酸连接酶编码基因来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，其核苷酸序列为序列表400<1>所示序列；乙酸激酶编码基因来源于丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum，其核苷酸序列为序列表400<2>所示序列，质粒pET-His的核苷酸序列为序列表400<3>所示序列；
（2）分别将步骤（1）中的重组表达载体转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,获得基因工程重组菌株E.coli pET-His-ywfE和E.coli pET-His-ack；
（3）培养步骤（2）中的重组菌株，从而获得表达氨基酸连接酶和乙酸激酶的菌体；
（4）破碎步骤（3）中的菌体获得粗酶液，经镍柱纯化后混合；
（5）将步骤（4）中获得的混合酶液加入含有30-60 mM L-丙氨酸、30-60 mM L-谷氨酰胺、3.0-6.0 mM ADP和30-60 mM乙酰磷酸的催化液中，在pH值为8.0-9.0，温度为32-42 ℃条件下进行酶促反应合成丙谷二肽。
2. 根据权利要求1所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中重组菌株中的培养方法为：重组菌株从甘油保菌管中以0.1%（v/v）的接种量接种至100 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基，于37 ℃ 200 rpm培养12 h，再按1%（v/v）接种量转接400 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基，于37 ℃ 200 rpm继续培养；待菌株浓度OD600nm达到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3 mmol/L的IPTG，28 ℃诱导培养8-10 h表达蛋白。
3.根据权利要求2所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：所述LB液体培养基为：每10 g NaCl与5 g酵母粉、10 g蛋白胨用去离子水定容到1 L。
4.根据权利要求1所述的丙谷二肽的制备方法，其特征在于：所述催化液为浓度50 mM的PBS缓冲液中含有L-丙氨酸、L-谷氨酰胺和乙酰磷酸的浓度均为50 mM，ADP的浓度为5mM。
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