CN107686860A - 一种提高多引物rca特异性的方法 - Google Patents

一种提高多引物rca特异性的方法 Download PDF

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张云威
戚智青
刁勇
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种提高多引物RCA特异性的方法，其通过改良商品化多引物RCA试剂盒TempliPhi(Amersham Biosciences)中的各成分含量，替换成市面上容易购买并且价格低廉的2.5mMdNTP，10×BSA，phi29DNA聚合酶buffer。同时在多引物RCA反应过程中加入适当浓度的聚乙二醇(PEG，8000)，可以显著地提高多引物RCA的特异性，填补多引物RCA反应中一直以来难以消减的非特异性扩增产生的拖尾现象。实现了对市售多引物RCA试剂盒的显著优化。

Description

一种提高多引物RCA特异性的方法
技术领域
本发明是基于对商品化多引物RCA试剂盒的改良，涉及一种提高改良多引物RCA特异性的方法。
背景技术
滚环扩增(Rolling circle amplification，多引物RCA)是1998年建立的一种体外等温核酸扩增方法。该方法借鉴了环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式，实现环状DNA的高速循环复制。作为一种有效的DNA扩增工具，RCA具有很多的优势。如对设备要求低，操作简单，检测所有感染体中环型DNA成分，不需要知道任何的基因序列信息等特点。目前RCA技术已经被广泛的应用于DNA测序，蛋白质表达，生物传感器，诊断，药物发现和纳米技术等。
滚环扩增主要利用了具有稳定性强和链置换活性的DNA聚合酶，如Phi 29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶等。根据寡核苷酸引物的数量和种类，滚环扩增又可分为线性扩增(Linear多引物RCA，L多引物RCA)、指数扩增(Hyperbranched多引物RCA，H多引物RCA)、多引物滚环扩增(multiply-primed多引物RCA)和锁式探针扩增(Ligation-多引物RCA，L多引物RCA)等。其中，多引物RCA主要利用了Phi 29DNA聚合酶和引物六聚体，实现对不同的核酸分子进行扩增，如质粒、人工细菌染色体(Bacteria artificial chromosome,BAC)、粘粒等大的环状DNA等，同时也可以扩增未知序列的环状DNA和无法克隆的环状模板，产物为双链，可用于测序、酶切、克隆、标记和检测等方面，市售的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒即应用了多引物RCA技术。
多引物RCA技术已得到广泛应用，但该技术仍存在一定的不足。尤其是当反应体系中的DNA模板复杂或含量很低时，大量引物不能与模板有效配对，引物之间易形成二聚体结构，导致错配的产生，产生大量非特异性扩增产物，降低了目的DNA的滚环扩增效率。这一点，即使我们使用优化过的反应条件(比如：使用修改过的随机引物)，非特异性扩增产物也不能被完全消除，特别是，当多引物RCA体系中不含有或含有少量的DNA，非特异性扩增现象依然存在。目前，据文献报道，有一种利用突变的单链DNA结合蛋白TthSSB来改善多引物RCA扩增的方法。该方法是将突变TthSSB蛋白加入到市售的多引物RCA试剂盒体系中(TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒)，提高了多引物RCA的扩增特异性同时消减了多引物RCA非特异性扩增的现象。因TthSSB蛋白具备单链结合蛋白(single-stranded nucleicacid binding protein，SSB)的特性，在多引物RCA反应过程中，通过与体系中的单链DNA结合，不仅使得单链DNA保持稳定，防止其重新配对成双链或被核酸酶降解，还能促进同源的核苷酸链互补配对，从而实现了对多引物RCA技术的优化。但是，该文献中没有明确的指出蛋白的用量，同时该方法需要先纯化出有活性的TthSSB蛋白，步骤繁琐、费时费力，价格昂贵，同时不利于运输和保存，在实际应用中相对困难。因此，本申请人对此进行深入研究，旨在开发一种容易应用，简单、廉价、快速、高效的提高多引物RCA扩增特异性的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高多引物RCA特异性的方法，该方法可高效地扩增目标核酸序列。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高多引物RCA特异性的方法，包括以下步骤：
(1)配置浓度为0.1mg/ml的PEG8000溶液，备用；
(2)变性：以pUC19-hupB重组质粒DNA作为模板，在5ul ddH2O中加入1ng pUC19-hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；
(3)培育：将2ul的2.5mM dNTP，2ul的10×BSA，1ul的phi29DNA聚合酶buffer，以及0.2ul的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒中的Phi29DNA酶混合液，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物RCA反应液；在此多引物RCA反应液中加入0～1.6ul的所述PEG8000溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃，得到改良的多引物RCA扩增产物。
采用上述方案后，本发明的优点在于：其通过改良商品化多引物RCA试剂盒TempliPhi(Amersham Biosciences)中的各成分含量，替换成市面上容易购买并且价格低廉的2.5mMdNTP、10×BSA和phi29DNA聚合酶buffer，得到改良的多引物RCA反应液，然后在改良的多引物RCA反应液中加入一定浓度的PEG8000溶液，可以减少非特异性扩增，显著提高滚环扩增的特异性，填补了多引物RCA反应中一直以来难以克服的非特异性扩增拖尾现象，实现了对市售多引物RCA试剂盒(TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒)的进一步优化。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1是本发明在改良的多引物RCA体系中分别加入0.5ul和1ul的PEG8000溶液后与试剂盒多引物RCA对比的电泳检测示意图；
图2是本发明中不同含量的PEG8000溶液对改良的多引物RCA扩增特异性影响情况的电泳示意图；
图3是本发明中单酶切鉴定改良的多引物RCA产物质量情况的电泳示意图；
图4是本发明中PCR鉴定改良的多引物RCA产物质量情况的电泳示意图；
图5是本发明中不同含量的PEG8000溶液对改良的多引物RCA扩增产物的数据统计图。
具体实施方式
实施例1：改良多引物RCA体系
一种提高多引物RCA特异性的方法，包括以下步骤：
(1)配置浓度为0.1mg/ml的PEG8000(聚乙二醇8000)溶液，备用；
(2)变性：以pUC19-hupB重组质粒DNA作为模板，在5ul ddH2O中加入1ng pUC19-hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；其中，重组质粒pUC19-hupB的基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
(3)培育：将2ul的2.5mM dNTP，2ul的10×BSA，1ul的phi29DNA聚合酶buffer，以及0.2ul的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒中的Phi29DNA酶混合液(该酶混合液包括Phi29DNA聚合酶和引物六聚体)，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物RCA反应液；在多引物RCA反应液中加入0～1.6ul的所述PEG8000溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；得到改良的多引物RCA扩增产物。
本实施例中，使用Amersham Biosciences公司的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒，按照试剂盒的说明进行操作作为对照组；并且在本发明方法的步骤(3)中，所述PEG8000溶液的用量分别选取0.5ul和1ul，进行效果比较。
多引物RCA扩增产物检测：取3ul所述改良的多引物RCA扩增产物以1％(W/V)琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和90V电压下电泳40min，然后在0.5μg/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图1。
上述各多引物RCA扩增产物的电泳结果见图1，图1中各泳道表示：
M为1kb DNA Ladder Marker；
3为市售多引物RCA试剂盒的滚环扩增情况；
2表示在改良的多引物RCA反应体系中加入1ul的0.1mg/ml的PEG 8000溶液；
1表示在改良的多引物RCA反应体系中加入0.5ul的0.1mg/ml的PEG 8000溶液。
由图1可以看出，市售的多引物RCA试剂盒出现显著的非特异性拖尾现象，而改良的多引物RCA中2泳道与1泳道，拖尾现象显著减弱。说明本发明方法可显著的减少多引物RCA反应中出现的非特异性扩增现象。
实施例2：PEG8000对改良多引物RCA特异性的影响(以重组质粒pUC19-hupB为模板)
一种提高多引物RCA特异性的方法，包括以下步骤：
1、重组质粒pUC19-hupB的构建：将来源于大肠杆菌的hupB基因插入pUC19质粒中，并通过菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，得到重组质粒pUC19-hupB；其中，大肠杆菌的hupB的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
2、变性：以pUC19-hupB重组质粒DNA作为模板，在5ul ddH2O中加入1ng pUC19-hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；
3、培育：将2ul的2.5mM dNTP，2ul的10×BSA，1ul的phi29DNA聚合酶buffer，以及0.2ul的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒中的Phi29DNA酶混合液(该酶混合液包括Phi29DNA聚合酶和引物六聚体)，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物RCA反应液；在多引物RCA反应液中加入0.1mg/ml的PEG8000溶液0～1.6ul，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；得到改良的多引物RCA扩增产物。
本实施例中，在步骤(3)中，所述PEG8000溶液的用量分别选取0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6ul，进行效果比较。
多引物RCA扩增产物检测：取3ul所述改良的多引物RCA扩增产物以1％(W/V)琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和90V电压下电泳40min，然后在0.5μg/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图2。
图2中各泳道表示：
M为1kb DNA Ladder Marker；
6，5，4，3，2，1分别表示在反应体系中加入0.1mg/ml的PEG8000溶液0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6ul。
由图2可以看出：以重组质粒pUC19-hupB为模板时，随着加入的PEG8000的量的增加，DNA条带逐渐变粗、变亮，DNA滚环扩增的特异性提高，尤其是非特异性扩增的拖尾现象显著减少。
实施例3：单酶切鉴定改良多引物RCA产物质量(以重组质粒pUC19-hupB为模板)
一种提高多引物RCA特异性的方法，包括以下步骤：
1、重组质粒pUC19-hupB的构建：将来源于大肠杆菌的hupB基因插入pUC19质粒中，并通过菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，得到重组质粒pUC19-hupB；
2、变性：以pUC19-hupB重组质粒DNA作为模板，在5ul ddH2O中加入1ng pUC19-hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；
3、培育：将2ul的2.5mM dNTP，2ul的10×BSA，1ul of phi29DNA聚合酶buffer，以及0.2ul的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒中的Phi29DNA酶混合液(该酶混合液包括Phi29DNA聚合酶和引物六聚体)，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物RCA反应液；在多引物RCA反应液中加入0.5ul的0.1mg/ml的PEG8000溶液；多引物RCA反应液分别于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；得到改良的多引物RCA扩增产物。
将所述改良的多引物RCA扩增产物，市售多引物RCA试剂盒反应产物，pUC19-hupB质粒分别用FastDigest EcoRI(Thermo Scientific)进行酶切试验验证。
多引物RCA扩增产物检测：取3ul所述改良的多引物RCA扩增产物以1％(W/V)琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和90V电压下电泳40min，然后在0.5μg/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图3。
图3各泳道表示：
M为1kb DNA Ladder Marker；
3为市售多引物RCA试剂盒的滚环扩增产物酶切情况；
2表示pUC19-hupB质粒的酶切情况；
1表示在本发明的多引物RCA反应体系中加入0.5ul的0.1mg/ml的PEG 8000溶液后产物酶切情况。
由图3可以看出：以重组质粒pUC19-hupB为模板时，改良的多引物RCA扩增产物经酶切后片段大小与pUC19-hupB质粒酶切片段大小一致，说明改良的多引物RCA可以正确的扩增pUC19-hupB质粒，与试剂盒RCA反应产物相比非特异性扩增的拖尾现象显著减少。
实施例4：PCR鉴定改良多引物RCA产物质量(以重组质粒pUC19-hupB为模板)
一种提高多引物RCA特异性的方法，包括以下步骤：
1、重组质粒pUC19-hupB的构建：将来源于大肠杆菌的hupB基因插入pUC19质粒中，并通过菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，得到重组质粒pUC19-hupB；
2、变性：以pUC19-hupB重组质粒DNA作为模板，在5ul ddH2O中加入1ng pUC19-hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；
3、培育：将2ul的2.5mM dNTP，2ul的10×BSA，1ul of phi29DNA聚合酶buffer，以及0.2ul的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒中的Phi29DNA酶混合液(该酶混合液包括Phi29DNA聚合酶和引物六聚体)，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物RCA反应液；在多引物RCA反应液中加入0.5ul的0.1mg/ml的PEG8000溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；得到改良的多引物RCA扩增产物。
PCR操作：5′-AGGATCCATATGACCAAGTCAGAATTGATAG-3′(hupB上游引物)5′-TACCCGGAATTCTTAACCGTAAATATTG-3′(hupB下游引物)。10ul的体系中包含02.ul改良的多引物RCA产物(模板)，5ul的2×Phusion Master Mix(Thermo Scientific)和5pmol的引物，其余用ddH2O补齐；PCR反应温度：一个循环95℃1min；34个循环95℃30s,55℃30s,72℃30s；最后72℃5min；使用的是ABI ProFlexTMPCR(Application Biosystems,USA)。
多引物RCA扩增产物检测：取3ul所述改良的多引物RCA产物以1％(W/V)琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和90V电压下电泳40min，然后在0.5μg/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图4。
图4各泳道表示：
M为1kb DNA Ladder Marker；
1，2，3，4，5分别为重复了5次以改良的多引物RCA产物为模板的PCR结果。
由图4可以看出：PCR条带大小与hupB基因大小一致，说明改良多引物RCA可以准确的扩增重组质粒pUC19-hupB。
实施例5：PEG8000对改良多引物RCA效率影响的数据统计(以重组质粒pUC19-hupB为模板)
一种提高多引物RCA特异性的方法，包括以下步骤：
1、重组质粒pUC19-hupB的构建：将来源于大肠杆菌的hupB基因插入pUC19质粒中，并通过菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，得到重组质粒pUC19-hupB；
2、参照实施例2步骤2的方法，制备21管变性样品液。
3、参照实施例2步骤3的方法，制备21管多引物RCA反应液，其中每3管为一组，向每组中分别加入PEG8000溶液(0.1mg/ml)0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2ul，在30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃，得到含有PEG8000不同含量的改良的多引物RCA扩增产物。
数据统计：利用UV/Visible蛋白核酸分析仪(BioMate3from Thermo FisherScientific)对每组改良的多引物RCA反应产物进行含量测定。结果如图5所示。
由图5可以看出：以重组质粒pUC19-hupB为模板时，电泳条件下所展现的图像与数据统计的结果呈现相似的结果，随着加入的PEG8000溶液的量的增加，DNA条带逐渐变粗、变亮，DNA滚环扩增特异性显著提高，不同之处在于随着PEG8000溶液的量继续增加，多引物RCA反应产物出现减少的情况，说明PEG8000对多引物RCA反应的增强效果存在一定的计量依赖。
总结：本发明通过对试剂盒多引物RCA反应体系进行改良，并添加一定浓度的PEG8000溶液，不仅可以显著的减少多引物RCA反应中常见的非特异性扩增出现的拖尾现象，而且可以将分散在体系中的目标DNA模板和随机引物聚集起来，提高了多引物RCA各组分的相对浓度，增加了目标核酸模板和引物之间的配对几率，从而实现对目标核酸序列的特异性的增强，在很大程度上解决了多引物RCA技术反应速度慢、灵敏度低、非特异扩增严重等问题。总之，本发明可以显著地减少非特异性扩增现象，提高滚环扩增的特异性，增强滚环扩增的灵敏度，实现了对市售多引物RCA试剂盒的显著优化。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种提高多引物RCA特异性的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 273
<212> DNA
<213> 大肠杆菌的hupB
<400> 1
GTGAATAAAT CTCAATTGAT CGACAAGATT GCTGCAGGGG CTGATATCTC TAAAGCTGCG 60
GCTGGCCGTG CGTTAGATGC TATTATTGCT TCCGTAACTG AATCTCTGAA AGAAGGGGAT 120
GATGTAGCAC TGGTAGGTTT TGGTACTTTT GCCGTTAAAG AGCGTGCTGC CCGTACTGGC 180
CGCAACCCGC AGACCGGTAA AGAGATCACC ATCGCTGCTG CTAAAGTACC GAGCTTCCGT 240
GCAGGTAAAG CACTGAAAGA CGCGGTAAAC TAA 273
<210> 2
<211> 2966
<212> DNA
<213> 重组质粒pUC19-hupB
<400> 2
GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA 60
CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT 120
CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT TGTGTGGAAT 180
TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTTGC 240
ATGCCTGCAG GTCGACTCTA GAGGATCCAT ATGAATAAAT CTCAATTGAT CGACAAGATT 300
GCTGCAGGGG CTGATATCTC TAAAGCTGCG GCTGGCCGTG CGTTAGATGC TATTATTGCT 360
TCCGTAACTG AATCTCTGAA AGAAGGGGAT GATGTAGCAC TGGTAGGTTT TGGTACTTTT 420
GCCGTTAAAG AGCGTGCTGC CCGTACTGGC CGCAACCCGC AGACCGGTAA AGAGATCACC 480
ATCGCTGCTG CTAAAGTACC GAGCTTCCGT GCAGGTAAAG CACTGAAAGA CGCGGTAAAC 540
TAAGAATTCC GGGTACCGAG CTCGAATTCA CTGGCCGTCG TTTTACAACG TCGTGACTGG 600
GAAAACCCTG GCGTTACCCA ACTTAATCGC CTTGCAGCAC ATCCCCCTTT CGCCAGCTGG 660
CGTAATAGCG AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC AGTTGCGCAG CCTGAATGGC 720
GAATGGCGCC TGATGCGGTA TTTTCTCCTT ACGCATCTGT GCGGTATTTC ACACCGCATA 780
TGGTGCACTC TCAGTACAAT CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGCC CCGACACCCG 840
CCAACACCCG CTGACGCGCC CTGACGGGCT TGTCTGCTCC CGGCATCCGC TTACAGACAA 900
GCTGTGACCG TCTCCGGGAG CTGCATGTGT CAGAGGTTTT CACCGTCATC ACCGAAACGC 960
GCGAGACGAA AGGGCCTCGT GATACGCCTA TTTTTATAGG TTAATGTCAT GATAATAATG 1020
GTTTCTTAGA CGTCAGGTGG CACTTTTCGG GGAAATGTGC GCGGAACCCC TATTTGTTTA 1080
TTTTTCTAAA TACATTCAAA TATGTATCCG CTCATGAGAC AATAACCCTG ATAAATGCTT 1140
CAATAATATT GAAAAAGGAA GAGTATGAGT ATTCAACATT TCCGTGTCGC CCTTATTCCC 1200
TTTTTTGCGG CATTTTGCCT TCCTGTTTTT GCTCACCCAG AAACGCTGGT GAAAGTAAAA 1260
GATGCTGAAG ATCAGTTGGG TGCACGAGTG GGTTACATCG AACTGGATCT CAACAGCGGT 1320
AAGATCCTTG AGAGTTTTCG CCCCGAAGAA CGTTTTCCAA TGATGAGCAC TTTTAAAGTT 1380
CTGCTATGTG GCGCGGTATT ATCCCGTATT GACGCCGGGC AAGAGCAACT CGGTCGCCGC 1440
ATACACTATT CTCAGAATGA CTTGGTTGAG TACTCACCAG TCACAGAAAA GCATCTTACG 1500
GATGGCATGA CAGTAAGAGA ATTATGCAGT GCTGCCATAA CCATGAGTGA TAACACTGCG 1560
GCCAACTTAC TTCTGACAAC GATCGGAGGA CCGAAGGAGC TAACCGCTTT TTTGCACAAC 1620
ATGGGGGATC ATGTAACTCG CCTTGATCGT TGGGAACCGG AGCTGAATGA AGCCATACCA 1680
AACGACGAGC GTGACACCAC GATGCCTGTA GCAATGGCAA CAACGTTGCG CAAACTATTA 1740
ACTGGCGAAC TACTTACTCT AGCTTCCCGG CAACAATTAA TAGACTGGAT GGAGGCGGAT 1800
AAAGTTGCAG GACCACTTCT GCGCTCGGCC CTTCCGGCTG GCTGGTTTAT TGCTGATAAA 1860
TCTGGAGCCG GTGAGCGTGG GTCTCGCGGT ATCATTGCAG CACTGGGGCC AGATGGTAAG 1920
CCCTCCCGTA TCGTAGTTAT CTACACGACG GGGAGTCAGG CAACTATGGA TGAACGAAAT 1980
AGACAGATCG CTGAGATAGG TGCCTCACTG ATTAAGCATT GGTAACTGTC AGACCAAGTT 2040
TACTCATATA TACTTTAGAT TGATTTAAAA CTTCATTTTT AATTTAAAAG GATCTAGGTG 2100
AAGATCCTTT TTGATAATCT CATGACCAAA ATCCCTTAAC GTGAGTTTTC GTTCCACTGA 2160
GCGTCAGACC CCGTAGAAAA GATCAAAGGA TCTTCTTGAG ATCCTTTTTT TCTGCGCGTA 2220
ATCTGCTGCT TGCAAACAAA AAAACCACCG CTACCAGCGG TGGTTTGTTT GCCGGATCAA 2280
GAGCTACCAA CTCTTTTTCC GAAGGTAACT GGCTTCAGCA GAGCGCAGAT ACCAAATACT 2340
GTTCTTCTAG TGTAGCCGTA GTTAGGCCAC CACTTCAAGA ACTCTGTAGC ACCGCCTACA 2400
TACCTCGCTC TGCTAATCCT GTTACCAGTG GCTGCTGCCA GTGGCGATAA GTCGTGTCTT 2460
ACCGGGTTGG ACTCAAGACG ATAGTTACCG GATAAGGCGC AGCGGTCGGG CTGAACGGGG 2520
GGTTCGTGCA CACAGCCCAG CTTGGAGCGA ACGACCTACA CCGAACTGAG ATACCTACAG 2580
CGTGAGCTAT GAGAAAGCGC CACGCTTCCC GAAGGGAGAA AGGCGGACAG GTATCCGGTA 2640
AGCGGCAGGG TCGGAACAGG AGAGCGCACG AGGGAGCTTC CAGGGGGAAA CGCCTGGTAT 2700
CTTTATAGTC CTGTCGGGTT TCGCCACCTC TGACTTGAGC GTCGATTTTT GTGATGCTCG 2760
TCAGGGGGGC GGAGCCTATG GAAAAACGCC AGCAACGCGG CCTTTTTACG GTTCCTGGCC 2820
TTTTGCTGGC CTTTTGCTCA CATGTTCTTT CCTGCGTTAT CCCCTGATTC TGTGGATAAC 2880
CGTATTACCG CCTTTGAGTG AGCTGATACC GCTCGCCGCA GCCGAACGAC CGAGCGCAGC 2940
GAGTCAGTGA GCGAGGAAGC GGAAGA 2966

Claims (1)

1.一种提高多引物RCA特异性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配置浓度为0.1mg/ml的PEG8000溶液，备用；
(2)变性：以pUC19-hupB重组质粒DNA作为模板，在5ul ddH2O中加入1ng pUC19-hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；
(3)培育：将2ul的2.5mM dNTP，2ul的10×BSA，1ul的phi29DNA聚合酶buffer，以及0.2ul的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒中的Phi29DNA酶混合液，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物RCA反应液；在此多引物RCA反应液中加入0～1.6ul的所述PEG8000溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃，得到改良的多引物RCA扩增产物。
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