CN112680450A - 一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于CRISPR‑Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用，所述全基因组随机突变方法基于CRISPR‑Cas系统，通过随机gRNA文库的引导，对生命体的全基因组进行散弹式随机切割，在非保真式DNA修补作用下，引发全基因组尺度上的随机突变。该全基因组随机突变方法可用于定向进化以及迭代进化，本发明以酿酒酵母生产β‑胡萝卜素为验证模型，在两个月内，完成了7轮迭代突变筛选，获得产量提高到10.5倍的进化菌株。组学分析表明平均每次操作可引入约122个突变，有50％左右基因的转录水平发生了显著的变化，说明经过突变进化，酵母代谢发生了深度重塑，实验证实本发明是一项简易可控的基因组变异新技术。

Description

一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地涉及一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用。

背景技术

模拟自然进化，在实验室对生命体进行快速进化，是研究细胞复杂代谢性状、发展细胞新功能和实现生物育种的重要手段。实验室进化的思想由来已久，物理或化学“诱变”作为一种实验室进化的手段早在1920年代就已经出现，经过近百年的发展，形成了完备的技术和理论体系，积极推动了抗生素、有机酸、维生素、甾体制药、现代酿造、酶制剂、农作物育种等生物产业的快速发展。时至今日，诱变仍是许多企业和实验室育种的重要手段，在生物工业中发挥着举足轻重的作用。

然而，随着时代的发展，诱变技术的不足之处也日益突显，例如：①单一诱变手段所产生的变异类型较为单一，连续使用效果差，通常需要多种诱变技术复合使用；②操作危险，特别是化学诱变和辐照诱变，对操作人员有潜在的危害；③许多诱变方法需要特殊的设备、药剂或工作环境；④突变子稳定性差，易回复突变；⑤工作量大，周期长。然而不可否认的是，诱变是一种行之有效的实验室进化手段。鉴于此，若能克服上述问题，开发一种能够模拟复合诱变效果的新型基因组变异技术，将具有十分重要的科学意义和应用价值。

2000年以来，陆续出现了多重自动化基因组工程(MAGE)和基因组复制工程(GREACE)等几种较为典型的实验室进化技术。GREACE从破坏基因组复制的保真性入手，构建具有高频突变特性的细胞，使其能够自发、连续地发生基因组突变，但不足之处在于其变异类型单一，且突变子稳定性差，需要开发严谨的基因组复制调控系统，以防筛选后的菌株进一步发生高频突变。MAGE是一种依赖于基因组复制的变异技术，以人为设计合成的单链DNA寡核苷酸(30-110bp)为突变载体，通过在基因复制叉附近与基因组发生非保真性匹配，从而整合进入滞后链而导致基因组变异。对于错配修复能力较强的微生物，MAGE的使用效果不佳，需要对微生物的错配修复能力进行抑制；此外，其只能在基因组复制起点附近发挥作用，远离复制点的突变效率会快速下降，在20kb处只有约1％的突变率。上述技术在展现良好应用效果的同时，也显现出了明显缺陷。

近几年，得益于CRISPR系统在基因编辑领域的空前成功，出现了诸如CREATE，CHAnGE,MAGSTIC，iSTOP和EvolvR等许多设计巧妙的基因组变异技术。这些CMGE技术为基因组的高效变异带来了前所未有的体验，极大丰富了实验室进化的技术手段。然而，这些技术多是以研究基因型与表型的对应关系为重点，直接用于生物育种还有一些局限。例如，CREATE，CHAnGE和MAGSTIC这三种技术，均是通过外源提供含有gRNA和同源重组供体模板的工具盒，来引发基因组产生大量特定变异，尽管在跟踪特定表型与基因型的对应关系、解析生物体复杂代谢机制方面有强大的作用，但为了追求变异的精确性和易跟踪性，在单细胞内通常仅能引入一处或少数几处变异，且变异的类型也过于单一。此外，这些技术均需要基于基因组测序信息，通过计算机辅助设计来合成工具盒，操作过程繁琐、技术门槛和使用成本也偏高。尽管iSTOP和EvolvR无需设计合成含有同源重组供体模板的工具盒，但二者所能引发的变异类型也十分单一，iSTOP是一种单碱基编辑技术，通常用于在基因内部引入终止密码子，从而使基因功能失活，而EvolvR则是一种基因组局部变异技术，适用于靶点附近350nt范围内的高频变异。更为重要的是，上述这些技术往往只适用于特定微生物，缺乏通用性。鉴于从传统诱变技术到上述CRISPR-Cas辅助的基因工程技术，在突变类型、突变子稳定性、基因组突变覆盖率、操作简易性、安全性、通用性和使用成本等方面，或多或少都存在各种不足，因此针对这些问题，有必要进一步开发简单实用且能靶向全基因组进行随机多样化突变的基因组变异新技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用，从而解决从传统诱变技术到CRISPR-Cas辅助的基因工程技术，在突变类型、突变子稳定性、基因组突变覆盖率、操作简易性、安全性、通用性和使用成本等方面存在各种不足的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法，基于CRISPR-Cas系统，通过随机gRNA文库的引导，对生命体的全基因组进行散弹式随机切割，在非保真式DNA修补作用下，引发全基因组尺度上的随机突变。

所述随机gRNA文库是一种以gRNA通用表达框为模板，通过包含20个连续简并性碱基的长引物库和一条常规上游引物，经PCR扩增获得的gRNA表达框文库，其中20个连续简并性碱基的区域对应于gRNA识别靶序列区域。

所述非保真式DNA修补是指不依赖于外源同源重组片段的宿主本身基因组修补机制，这种宿主自身修复方式在DNA断裂后自动触发。

所述gRNA表达框文库包括启动子、20个连续简并性碱基的靶向识别序列、tracRNA序列和终止子的核苷酸序列。

包含20个连续简并性碱基的长引物库的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的发明点之一即在于提供这样一种包含20个连续简并性碱基的长引物库序列。该序列除了20个连续简并性碱基根据gRNA识别靶序列区域的变化而变化之外，其他部分唯一确定。

所述常规上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述CRISPR-Cas系统包括但不限于SpCas9-NG。

根据本发明的第二方面，还提供一种上述基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法的应用，所述应用包括在酿酒酵母全基因组定向进化以及迭代进化中的应用。

根据本发明的一个优选方案，所述应用包括以下步骤：S1：SpCas9-NG表达载体质粒pCas9-NG的构建：以pTCL载体为模板，分别利用pCas9-NG-F1/pCas9-NG-R1和pCas9-NG-F2/pCas9-NG-R2两对引物扩增，使得突变后的Cas蛋白Cas9-NG识别NG序列，再通过Gibson组装将两个PCR片段环化成质粒pCas9-NG；S2：PCR扩增得到gRNA表达框文库：以gRNA通用表达框为模板，通过包含20个连续简并性碱基的长引物库和一条常规上游引物，PCR扩增得到gRNA表达框文库；S3：以pSCM质粒为模板，得到与所述gRNA表达框文库两端有50bp同源片段的pSCM线性化质粒；S4：提供一株产β-胡萝卜素的酿酒酵母，电转化步骤S1获得的质粒pCas9-NG进入酿酒酵母细胞得到菌株C0，再将各1μg PCR扩增的gRNA表达框文库和pSCM线性化质粒电转化进入菌株C0的感受态细胞，梯度稀释转化后的C0感受态细胞，并分别涂布于SD-Leu-Ura平板，挑选菌落，获得β-胡萝卜素生产能力显著提高的菌株。

根据本发明的另一优选方案，该应用还包括步骤：S5：针对步骤S4筛选获得的β-胡萝卜素生产能力显著提高的酿酒酵母菌株，涂布含有5’-氟尿嘧啶的SD-Leu平板，通过Ura3营养缺陷型标记与5’-氟尿嘧啶的不兼容性，去除表达随机gRNA的工具盒的pSCM质粒，对于去除表达随机gRNA的工具盒质粒的进化菌株，进行下一轮或多轮定向进化，直到得到高产β-胡萝卜素酿酒酵母菌株。

在CRISPR-Cas9系统中，Cas9蛋白和gRNA中的tracrRNA部分结合，并在20bp的crRNA的指引下可靶向基因组特定位点，引发DNA损伤并激发DNA非保真修补机制。基于这种认识，本发明提出一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组定向进化技术。本发明的作用原理在于，基于CRISPR-Cas系统，在通过gRNA简并性PCR获得的随机gRNA文库的引导下，对生命体的全基因组进行散弹式随机打靶切割，在不提供外源同源重组片段的情况下，经非保真式DNA修补作用，引发全基因组尺度上的随机突变(如图1所示)。此外，该技术应用于酿酒酵母生产β-胡萝卜素的定向进化，证实该技术是一种强有力的基因组变异新方法。

根据本发明提供的方法可用于定向进化以及迭代进化，本发明以酿酒酵母生产β-胡萝卜素为验证模型，在两个月的时间内，完成了7轮迭代突变筛选，获得产量提高到10.5倍的进化菌株。组学分析表明平均每次操作可引入约122个突变，有50％左右基因的转录水平发生了显著的变化，由此证明经过突变进化，酵母代谢发生了深度重塑。经过实验证实该全基因组随机突变方法是一项简易可控的基因组变异新技术。

根据本发明提供的一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用，相比现有技术具有以下优越性：

1)与传统诱变育种相比，具有突变率更高，突变类型更多样化等优势；

2)与现有的CRISPR-Cas辅助基因组工程相比，具有操作简单、成本低、单细胞突变位点多且突变类型多样化等优势；

3)与现有的CRISPR-Cas辅助基因组工程相比，解除了gRNA文库规模的限制，实现了基因组突变位点的完全随机化。

附图说明

图1为基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变，及其用于定向进化的原理示意图，N代表简并性碱基，即该位点等概率存在A、T、C、G四种碱基；

图2为本技术定向进化产β-胡萝卜素酿酒酵母的正突变率分析；

图3为β-胡萝卜素酿酒酵母迭代进化菌株产量分析；

图4为酿酒酵母全基因组迭代进化菌株突变位点分布，C7-143(内圈)为第七轮筛选的最终进化菌株，C3-06(外圈)和C5-63(中圈)分别为第三轮和第五轮筛选的过程进化菌株；

图5为酿酒酵母全基因组迭代进化菌株突变位点数量、类型和位置分析；

图6为β-胡萝卜素高产进化菌株C7-143在3L发酵罐发酵数据分析。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明提供了一种基于CRISPR-Cas系统的基因组突变技术，所述的CRISPR-Cas系统，本发明仅以识别序列为NG的SpCas9-NG为例，其它Cas蛋白也可发挥类似作用。

所述CRISPR-Cas系统包括SpCas9-NG表达载体pCas9-NG。

本发明还提供了随机gRNA文库表达框构建方法，即通过合成包含20个简并性碱基的长引物库和一条常规引物，以gRNA通用表达框为模板，通过PCR扩增来构建表达gRNA的工具盒随机文库。

实施例1

1.1 SpCas9-NG表达载体pCas9-NG的构建：

以pTCL载体(Addgene：#43802)为模板，分别利用pCas9-NG-F1/pCas9-NG-R1和pCas9-NG-F2/pCas9-NG-R2两对引物扩增，突变SpCas9 DNA序列的5个密码子，具体为L1111R/D1135V/A1322R/R1335V/T1337R，使得突变后的Cas蛋白Cas9-NG识别NG序列，扩大了Cas蛋白靶点；然后，再通过Gibson组装将两个PCR片段环化成质粒pCas9-NG。

其中，pCas9-NG-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：

GCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGTTTCTCCTACAGTCGCTTAC；

pCas9-NG-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：

CTTTCTGTCTATGGTGGTGTCGAAGTACTTGAAGGCTCGAGGCGCGCCCAAGTTGGTC；

pCas9-NG-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：

ACCACCATAGACAGAAAGGTGT ACCGCTCTACAAAGGAGGTCCTG；

pCas9-NG-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：

TTTTTGCGTGCGATCAGCTTGTCGCTGTTCCTTTTCGGGCGGATACTTTCCTTGGAGAAG；

质粒pCas9-NG的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

1.2 PCR扩增表达gRNA的gRNA表达框文库

以gRNA表达框为模板(SEQ ID NO.3)，利用含20个连续简并性碱基的长引物库gRNAL-R和常规上游引物gRNAL-F，PCR扩增得到表达gRNA的gRNA表达框文库。以pSCM(Addgene：#43803)质粒为模板，利用pSCM-F和pSCM-R进行PCR扩增，得到与gRNA表达框文库两端有50bp同源片段的pSCM线性化质粒。

其中，长引物库gRNAL-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

GTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGATCATTTATCTTTCACTGC；

常规上游引物gRNAL-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

TAATGTG AGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC；

pSCM-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG；

pSCM-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：

AGCTCCAGCTTTTGTTCCC。

实施例2

2.1本发明方法应用于产β-胡萝卜素酿酒酵母定向进化及效率验证

针对一株产β-胡萝卜素的酿酒酵母，电转化质粒pCas9-NG进入细胞得到菌株C0，再将各1μg PCR扩增的表达gRNA的工具盒随机文库片段和pSCM线性化质粒骨架电转化进入C0感受态细胞，梯度稀释转化的C0感受态细胞，并分别涂布于SD-Leu-Ura平板。选取生长菌落数量在50-200个的平板，最终选择菌落176个的平板，与出发菌株C0生产β-胡萝卜素能力对比，最终2个菌落β-胡萝卜素生产能力显著提高(如图2所示)。

2.2本发明方法应用于产β-胡萝卜素酿酒酵母迭代进化

针对本发明基于的CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变技术，应用于β-胡萝卜素酿酒酵母迭代定向进化。针对前一轮筛选获得的高产β-胡萝卜素酿酒酵母菌株，涂布含有5’-氟尿嘧啶的SD-Leu平板，通过Ura3营养缺陷型标记与5’-氟尿嘧啶的不兼容性，去除表达随机gRNA的工具盒的pSCM质粒。

对于去除表达随机gRNA的工具盒质粒的进化菌株，可以进行下一轮定向进化，接着，在2个月时间，通过7轮进化，得到高产β-胡萝卜素酿酒酵母菌株C7-143，菌株β-胡萝卜素产量达到28.4mg/g CDW，为C0的10.5倍(如图3所示)。

实施例3

3.1迭代进化菌株全基因组突变分析

利用基因组三代测序平台，分析最终进化菌株C7-143，过程进化菌株C3-06和C5-63，以及出发菌株C0全基因组序列，比较进化菌株相比于C0的突变位点，分析结果如图4和图5所示。

平均每轮进化能引发酿酒酵母基因组122个突变，突变类型多样化，包括碱基插入/缺失，重复，反转及染色体重排。

突变位点在染色体位置多样化，分布于外显子、内含子、间隔序列、3’非编码区、5’非编码区。

实施例4

4.1进化菌株的生产性能分析

为了评估C7-143放大以后的生产性能，我们对高产β-胡萝卜素菌株C7-143进行了3L发酵罐分批发酵实验，结果如图6所示，菌株类胡萝卜从伴随着细胞的生长而不断积累，并在94.3小时达到产量最值1.09g/L(26.1mg/g CDW)，达到目前报道的酿酒酵母生产β-胡萝卜素最高水平，这充分说明CARM系统对菌种的进化的确是一种强有力的手段，可快速提高菌株的生产性能。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法及其应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

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tcctggacaa tgaggagaac gaggacattc ttgaggacat tgtcctcacc cttacgttgt 5100

ttgaagatag ggagatgatt gaagaacgct tgaaaactta cgctcatctc ttcgacgaca 5160

aagtcatgaa acagctcaag aggcgccgat atacaggatg ggggcggctg tcaagaaaac 5220

tgatcaatgg gatccgagac aagcagagtg gaaagacaat cctggatttt cttaagtccg 5280

atggatttgc caaccggaac ttcatgcagt tgatccatga tgactctctc acctttaagg 5340

aggacatcca gaaagcacaa gtttctggcc agggggacag tcttcacgag cacatcgcta 5400

atcttgcagg tagcccagct atcaaaaagg gaatactgca gaccgttaag gtcgtggatg 5460

aactcgtcaa agtaatggga aggcataagc ccgagaatat cgttatcgag atggcccgag 5520

agaaccaaac tacccagaag ggacagaaga acagtaggga aaggatgaag aggattgaag 5580

agggtataaa agaactgggg tcccaaatcc ttaaggaaca cccagttgaa aacacccagc 5640

ttcagaatga gaagctctac ctgtactacc tgcagaacgg cagggacatg tacgtggatc 5700

aggaactgga catcaatcgg ctctccgact acgacgtgga tcatatcgtg ccccagtctt 5760

ttctcaaaga tgattctatt gataataaag tgttgacaag atccgataaa aatagaggga 5820

agagtgataa cgtcccctca gaagaagttg tcaagaaaat gaaaaattat tggcggcagc 5880

tgctgaacgc caaactgatc acacaacgga agttcgataa tctgactaag gctgaacgag 5940

gtggcctgtc tgagttggat aaagccggct tcatcaaaag gcagcttgtt gagacacgcc 6000

agatcaccaa gcacgtggcc caaattctcg attcacgcat gaacaccaag tacgatgaaa 6060

atgacaaact gattcgagag gtgaaagtta ttactctgaa gtctaagctg gtctcagatt 6120

tcagaaagga ctttcagttt tataaggtga gagagatcaa caattaccac catgcgcatg 6180

atgcctacct gaatgcagtg gtaggcactg cacttatcaa aaaatatccc aagcttgaat 6240

ctgaatttgt ttacggagac tataaagtgt acgatgttag gaaaatgatc gcaaagtctg 6300

agcaggaaat aggcaaggcc accgctaagt acttctttta cagcaatatt atgaattttt 6360

tcaagaccga gattacactg gccaatggag agattcggaa gcgaccactt atcgaaacaa 6420

acggagaaac aggagaaatc gtgtgggaca agggtaggga tttcgcgaca gtccggaagg 6480

tcctgtccat gccgcaggtg aacatcgtta aaaagaccga agtacagacc ggaggcttct 6540

ccaaggaaag tatccgcccg aaaaggaaca gcgacaagct gatcgcacgc aaaaaagatt 6600

gggaccccaa gaaatacggc ggattcgttt ctcctacagt cgcttacagt gtactggttg 6660

tggccaaagt ggagaaaggg aagtctaaaa aactcaaaag cgtcaaggaa ctgctgggca 6720

tcacaatcat ggagcgatca agcttcgaaa aaaaccccat cgactttctc gaggcgaaag 6780

gatataaaga ggtcaaaaaa gacctcatca ttaagcttcc caagtactct ctctttgagc 6840

ttgaaaacgg ccggaaacga atgctcgcta gtgcgggcga gctgcagaaa ggtaacgagc 6900

tggcactgcc ctctaaatac gttaatttct tgtatctggc cagccactat gaaaagctca 6960

aagggtctcc cgaagataat gagcagaagc agctgttcgt ggaacaacac aaacactacc 7020

ttgatgagat catcgagcaa ataagcgaat tctccaaaag agtgatcctc gccgacgcta 7080

acctcgataa ggtgctttct gcttacaata agcacaggga taagcccatc agggagcagg 7140

cagaaaacat tatccacttg tttactctga ccaacttggg cgcgcctcga gccttcaagt 7200

acttcgacac caccatagac agaaaggcgt accgctctac aaaggaggtc ctggacgcca 7260

cactgattca tcagtcaatt acggggctct atgaaacaag aatcgacctc tctcagctcg 7320

gtggagacag cagggctgac cccaagaaga agaggaaggt gtgatctctt ctcgagtcat 7380

gtaattagtt atgtcacgct tacattcacg ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa 7440

ggaaggagtt agacaacctg aagtctaggt ccctatttat ttttttatag ttatgttagt 7500

attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc 7560

atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 7620

ttgcggccgg tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt acgcgcgctc actggccgtc 7680

gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca 7740

catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa 7800

cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 7860

gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 7920

cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 7980

aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 8040

cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 8100

ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 8160

aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 8220

ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt 8280

acaatttcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat 8340

cgacggtcga ggagaacttc tagtatatcc acatacctaa tattattgcc ttattaaaaa 8400

tggaatccca acaattacat caaaatccac attctcttca aaatcaattg tcctgtactt 8460

ccttgttcat gtgtgttcaa aaacgttata tttataggat aattatactc tatttctcaa 8520

caagtaattg gttgtttggc cgagcggtct aaggcgcctg attcaagaaa tatcttgacc 8580

gcagttaact gtgggaatac tcaggtatcg taagatgcaa gagttcgaat ctcttagcaa 8640

ccattatttt tttcctcaac ataacgagaa cacacagggg cgctatcgca cagaatcaaa 8700

ttcgatgact ggaaattttt tgttaatttc agaggtcgcc tgacgcatat acctttttca 8760

actgaaaaat tgggagaaaa aggaaaggtg agaggccgga accggctttt catatagaat 8820

agagaagcgt tcatgactaa atgcttgcat cacaatactt gaagttgaca atattattta 8880

aggacctatt gttttttcca ataggtggtt agcaatcgtc ttactttcta acttttctta 8940

ccttttacat ttcagcaata tatatatata tttcaaggat ataccattct aatgtctgcc 9000

cctatgtctg cccctaagaa gatcgtcgtt ttgccaggtg accacgttgg tcaagaaatc 9060

acagccgaag ccattaaggt tcttaaagct atttctgatg ttcgttccaa tgtcaagttc 9120

gatttcgaaa atcatttaat tggtggtgct gctatcgatg ctacaggtgt cccacttcca 9180

gatgaggcgc tggaagcctc caagaaggtt gatgccgttt tgttaggtgc tgtgggtggt 9240

cctaaatggg gtaccggtag tgttagacct gaacaaggtt tactaaaaat ccgtaaagaa 9300

cttcaattgt acgccaactt aagaccatgt aactttgcat ccgactctct tttagactta 9360

tctccaatca agccacaatt tgctaaaggt actgacttcg ttgttgtcag agaattagtg 9420

ggaggtattt actttggtaa gagaaaggaa gacgatggtg atggtgtcgc ttgggatagt 9480

gaacaataca ccgttccaga agtgcaaaga atcacaagaa tggccgcttt catggcccta 9540

caacatgagc caccattgcc tatttggtcc ttggataaag ctaatgtttt ggcctcttca 9600

agattatgga gaaaaactgt ggaggaaacc atcaagaacg aattccctac attgaaggtt 9660

caacatcaat tgattgattc tgccgccatg atcctagtta agaacccaac ccacctaaat 9720

ggtattataa tcaccagcaa catgtttggt gatatcatct ccgatgaagc ctccgttatc 9780

ccaggttcct tgggtttgtt gccatctgcg tccttggcct ctttgccaga caagaacacc 9840

gcatttggtt tgtacgaacc atgccacggt tctgctccag atttgccaaa gaataaggtc 9900

aaccctatcg ccactatctt gtctgctgca atgatgttga aattgtcatt gaacttgcct 9960

gaagaaggta aggccattga agatgcagtt aaaaaggttt tggatgcagg tatcagaact 10020

ggtgatttag gtggttccaa cagtaccacc gaagtcggtg atgctgtcgc cgaagaagtt 10080

aagaaaatcc ttgcttaaaa agattctctt tttttatgat atttgtacat aaactttata 10140

aatgaaattc ataatagaaa cgacacgaaa ttacaaaatg gaatatgttc atagggtaga 10200

cgaaactata tacgcaatct acatacattt atcaagaagg agaaaaagga ggatgtaaag 10260

gaatacaggt aagcaaattg atactaatgg ctcaacgtga taaggaaaaa gaattgcact 10320

ttaacattaa tattgacaag gaggagggca ccacacaaaa agttaggtgt aacagaaaat 10380

catgaaacta tgattcctaa tttatatatt ggaggatttt ctctaaaaaa aaaaaaatac 10440

aacaaataaa aaacactcaa tgacctgacc atttgatgga gtttaagtca ataccttctt 10500

gaaccatttc ccataatggt gaaagttccc tcaagaattt tactctgtca gaaacggcct 10560

tacgacgtag tcgatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 10620

ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 10680

atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 10740

gtcatcaccg aaacgcgcga 10760

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctgatcgca cgcaaaaaag attgggaccc caagaaatac ggcggattcg tttctcctac 60

agtcgcttac 70

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctttctgtct atggtggtgt cgaagtactt gaaggctcga ggcgcgccca agttggtc 58

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

accaccatag acagaaaggt gtaccgctct acaaaggagg tcctg 45

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttttgcgtg cgatcagctt gtcgctgttc cttttcgggc ggatactttc cttggagaag 60

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gttttagagc tagaaatagc aag 23

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agctccagct tttgttccc 19

Claims (10)

1.一种基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法，其特征在于，基于CRISPR-Cas系统，通过随机gRNA文库的引导，对生命体的全基因组进行散弹式随机切割，在非保真式DNA修补作用下，引发全基因组尺度上的随机突变。

2.根据权利要求1所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述随机gRNA文库是一种以gRNA通用表达框为模板，通过包含20个连续简并性碱基的长引物库和一条常规上游引物，经PCR扩增获得的gRNA表达框文库，其中20个连续简并性碱基的区域对应于gRNA识别靶序列区域。

3.根据权利要求1所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述非保真式DNA修补是指不依赖于外源同源重组片段的宿主本身基因组修补机制。

4.根据权利要求2所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述gRNA表达框文库包括启动子、20个连续简并性碱基的靶向识别序列、tracRNA序列和终止子的核苷酸序列。

5.根据权利要求2所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述包含20个连续简并性碱基的长引物库的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求2所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述常规上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求1所述的全基因组随机突变方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统包括SpCas9-NG。

8.一种根据权利要求1～7中任意一项所述的基于CRISPR-Cas系统的全基因组随机突变方法的应用，其特征在于，所述应用包括在酿酒酵母全基因组定向进化以及迭代进化中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

S1：SpCas9-NG表达载体质粒pCas9-NG的构建：以pTCL载体为模板，分别利用pCas9-NG-F1/pCas9-NG-R1和pCas9-NG-F2/pCas9-NG-R2两对引物扩增，使得突变后的Cas蛋白Cas9-NG识别NG序列，再通过Gibson组装将两个PCR片段环化成质粒pCas9-NG；

S2：PCR扩增得到gRNA表达框文库：以gRNA通用表达框为模板，通过包含20个连续简并性碱基的长引物库和一条常规上游引物，PCR扩增得到gRNA表达框文库；

S3：以pSCM质粒为模板，得到与所述gRNA表达框文库两端有50bp同源片段的pSCM线性化质粒；以及

S4：提供一株产β-胡萝卜素的酿酒酵母，电转化步骤S1获得的质粒pCas9-NG进入酿酒酵母细胞得到菌株C0，再将各1μg PCR扩增的gRNA表达框文库和pSCM线性化质粒电转化进入菌株C0的感受态细胞，梯度稀释转化后的C0感受态细胞，并分别涂布于SD-Leu-Ura平板，挑选菌落，获得β-胡萝卜素生产能力显著提高的菌株。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用还包括以下步骤：

S5：针对步骤S4筛选获得的β-胡萝卜素生产能力显著提高的酿酒酵母菌株，涂布含有5’-氟尿嘧啶的SD-Leu平板，通过Ura3营养缺陷型标记与5’-氟尿嘧啶的不兼容性，去除表达随机gRNA的工具盒的pSCM质粒，对于去除表达随机gRNA的工具盒质粒的进化菌株，进行下一轮或多轮定向进化，直到得到高产β-胡萝卜素酿酒酵母菌株。

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