CN103014045A

CN103014045A - 表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN103014045A
Application number: CN2012105841593A
Authority: CN
Inventors: 李俊刚; 毛青; 王宇明
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2012-12-30
Filing date: 2012-12-30
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-12-30
Also published as: CN103014045B

Abstract

本发明涉及表达特异性HBVshRNA的重组HBV载体及其构建方法和应用，重组HBV载体由LJ196载体删除2111-2643位、187-680位或1060-1500位碱基后，在删除序列处替换识别所述删除序列的shRNA转录结构单元而得，制备方法简单，该重组HBV载体能够利用野生型乙型肝炎病毒基因组的Core蛋白和Pol蛋白高效合成RCDNA，并且合成效率高于野生型乙型肝炎病毒基因组DNA，竞争野生型乙型肝炎病毒的复制，同时利用重组HBV载体合成效率高的特性，高效表达shRNA，然后干扰乙型肝炎病毒DNA复制和HBsAg合成，能够用于制备干扰乙型肝炎病毒基因组DNA复制的药物，为慢性乙型肝炎病毒感染的治疗提供了新的思路。

Description

表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体，还涉及该载体的构建方法和应用。

背景技术

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus ）是引起人类急、慢性肝炎的DNA病毒，也称丹氏颗粒，简称HBV。HBV属嗜肝DNA 病毒科 (hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，有四个ORF，编码以下蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白和S蛋白（L，M，S）。Core是核衣壳蛋白；X蛋白对病毒复制是重要的，并与肝癌的发生有关；S蛋白是病毒的包膜蛋白，与病毒进入细胞有关。

HBV超螺旋共价、闭合、环状DNA分子（covalently closed circularDNA，cccDNA）的持续存在是HBV慢性感染的根源，松弛环状DNA（RC DNA）是cccDNA形成的前体，故阻断RC DNA的合成将致cccDNA减少。研究发现缺失某些序列的突变型rHBV的RC DNA合成效率更高，rHBV与HBV共存于细胞内时，由于rHBV具有如下特性：①合成效率高，rHBV将在数量上占优；②rHBV自身不能合成复制所必需的Core、Pol蛋白，需利用野生HBV的Core、Pol蛋白进行复制，从而竞争性抑制野生HBV的复制，但不能完全抑制。因此寻找一种能够完全抑制野生HBV的方法是解决HBV持续慢性感染的关键。

发明内容

本发明的目的之一在于提供表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体，能够依赖野生型HBV进行复制，并且形成RC DNA，为慢性HBV感染的治疗提供了新的工具。

为实现上述发明目的，技术方案为：

表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体，所述乙型肝炎病毒shRNA表达载体由LJ196载体删除2111-2643位、187-680位或1060-1500位碱基后，在删除序列处替换识别所述删除序列的shRNA转录结构单元而得。

优选的，所述shRNA转录结构单元由启动子和shRNA编码序列组成。

优选的，所述启动子为H1启动子。

更优选的，所述shRNA编码序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.25所示。

本发明的目的之二在于提供表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体的制备方法，其制备方法简单，重复性好，技术方案为：

所述重组HBV载体的制备方法，根据LJ196载体序列设计引物，然后以LJ196载体为模板，进行PCR扩增，得删除LJ196载体2111-2643位、187-680位和1060-1500位碱基的序列，同时克隆H1启动子并分别与所得序列连接，环化后在H1启动子3’端连入识别所述删除序列的shRNA的转录结构单元，得重组HBV载体。

优选的，所述引物为SEQ ID NO.2-7所示的核酸序列。

更优选的，所述克隆H1启动子的具体方法为：以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示核酸序列为引物，以pLVTHM质粒为模板，进行PCR扩增，得H1启动子。

本发明的目的之三在于提供乙型肝炎病毒shRNA表达载体的应用，技术方案为：

所述重组HBV载体在制备干扰乙型肝炎病毒基因组DNA复制的药物中的应用。

本发明有益效果在于：本发明公开的重组HBV载体，删除病毒蛋白表达元件，并保留RC DNA合成必须顺式元件，并在删除序列处替代shRNA转录结构单元（由H1启动子和shRNA序列组成，不足300bp），用以表达靶向被删除序列的shRNA，使其特异性降解野生型HBV pgRNA，阻断RC DNA合成及cccDNA的形成；该重组HBV载体依赖野生型HBV复制并且不会整合入宿主基因组中，因此重组HBV载体只能在感染HBV病毒的细胞中存活，在正常细胞中会很快消失，不会影响正常细胞的生长，也不会引起转基因细胞发生突变。

重组HBV载体因删除了靶序列而不受RNAi的影响，并能在野生型HBV表达的Core、Pol蛋白辅助下转化为cccDNA，后者持续表达siRNA达到持久抗HBV复制效应：①在半衰期方面，野生型HBV cccDNA和rHBV cccDNA相同，同时在肝细胞内可能存在降解cccDNA的未知机制；②在复制效率方面，rHBV高于野生型HBV；③受RNAi抑制作用方面，野生型HBV在pgRNA水平受到大量降解，RC DNA合成受阻，而rHBV的pgRNA不受RNAi影响，可以合成RC DNA进而形成cccDNA；在这些效应下，随着肝细胞的分裂，最终野生型HBV cccDNA先于rHBV cccDNA被耗竭，达到治疗乙型肝炎病毒感染的目的。

附图说明

图1 rHBV载体与LJ96辅助质粒共转染HepG2细胞后Southern blot结果。

图2为rHBV-H1载体与LJ96辅助质粒共转染HepG2细胞后Southern blot结果图。

图3为shRNA541双链结构图。

图4为shRNA456双链结构图。

图5为shRNA1436双链结构图。

图6为shRNA1302双链结构图。

图7为shRNA1573双链结构图。

图8为 rHBV-shRNA表达载体的结构示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

本发明中使用的LJ196和LJ96质粒由Daniel D. Loeb教授惠赠，并在公开的文献中有记载（Liu N，Ji L，Maguire ML，Loeb DD．cis-Acting sequences that contribute to the synthesis of relaxed-circular DNA of human hepatitis B virus．J Virol．Jan 2004；78(2)：642-649．）。

一、缺失突变rHBV构建过程

在不表达任何病毒蛋白的质粒LJ196 （SEQ ID NO.1）的基础上，利用反向PCR技术删除LJ196质粒的DNA片段，使删除后RC DNA合成效率更高。分别删除LJ196的第2111至2643位核苷酸（简记为rHBV1）、删除LJ196的第187至680位核苷酸（简记为rHBV2）、删除LJ196的第1060至1500位核苷酸（简记为rHBV3）、删除LJ196的第2111至2643位核苷酸和1060至1500位核苷酸（简记为rHBV1.3）、删除LJ196的第2111至2643位核苷酸和187至1500位核苷酸（简记为rHBV1.23）。

rHBV1-3载体的构建方法：

设计合成以下引物：

HBV187-163：5'-aggggtcctagggatccttatgtga-3'（SEQ ID NO.2）；

HBV1060-1036：5'-caaaggcatcaacgcaggataacca-3'（SEQ ID NO.3）

HBV2111-2087：5'-agtcattagttccccccagcaaaga-3'（SEQ ID NO.4）

HBV680-704：5'-agtgccatttgttcagtggttcgta-3'（SEQ ID NO.5）

HBV1500-1518：5'-tgccgttccgaccgaccac-3'（SEQ ID NO.6）

HBV2643-2667：5'-attatgcctgccaggttttatccaa-3'（SEQ ID NO.7）

按表1引物配对，以LJ196质粒为模板，分别进行反向PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃预变性2分钟；然后96℃变性15秒，55℃退火30秒，68℃延伸6分钟40秒，共21个循环。

表1.反向PCR扩增引物对

序号	删除片段名称	上游引物	下游引物
				rHBV1	2111-2643	HBV2111-2087	HBV2643-2667
rHBV2	187-680	HBV187-163	HBV680-704
				rHBV3	1060-1500	HBV1060-1036	HBV1500-1518

将PCR扩增产物进行电泳分离，从胶上切取目的条带，用DNA纯化试剂盒回收胶中DNA，然后用DpnⅠ消化模板质粒DNA，再用T4多核苷酸激酶处理使PCR产物，使DNA序列的5' 端加上磷酸基团，分别得删除LJ196载体2111-2643位、187-680位和1060-1500位碱基的序列，最后分别用T4连接酶连接，分别得rHBV1载体、rHBV2载体和rHBV3载体。

rHBV1.3的构建方法：

以rHBV1载体为模板，再用HBV1060-1036和HBV1500-1518引物对按上述PCR条件扩增，将PCR扩增产物进行电泳分离，从胶上切取目的条带，用DNA纯化试剂盒回收胶中DNA，然后用DpnⅠ消化掉模板质粒DNA，再用T4多核苷酸激酶处理，使PCR产物DNA的5'端加上磷酸基团，最后用T4连接酶连接，得rHBV1.3载体。

rHBV1.23的构建方法：

以rHBV1为模板，用HBV187-163和HBV1500-1518引物对按上述PCR条件扩增，将PCR扩增产物进行电泳分离，从胶上切取目的条带，用DNA纯化试剂盒回收胶中DNA，然后用DpnⅠ消化模板质粒DNA，再用T4多核苷酸激酶处理，使PCR产物DNA的5'端加上磷酸基团，最后用T4连接酶连接，得rHBV1.23载体。

将构建的rHBV1、rHBV2、rHBV3、rHBV1.3和rHBV1.23载体分别与提供病毒蛋白Core和Pol的辅助质粒LJ96共转染HepG2细胞，然后用Southern blot检测，验证各质粒相对于野生型HBV的RC DNA合成效率，具体为：

HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM中，当细胞长到60%-70%汇片时转染。每平皿细胞分别用rHBV1、rHBV2、rHBV3、rHBV1.3和rHBV1.23（5μg）与辅助质粒LJ96（5μg）共转染。每天更换新培养液，直到转染后5天收获细胞提取病毒DNA。将收获的细胞先用PBS洗细胞一次，然后用0.5mL细胞裂解液（50 mM Tris，pH 8.0，2.5mM MgCl，0.4% NP-40）裂解细胞。裂解产物经台式离心机1000rpm，4℃离心5分钟去细胞核，上清转新管再13000rpm，4℃离心10分钟去细胞碎片；上清转新管，加入4μL 300mM CaCl₂至终浓度约为2mM（上清有600μL），加入10U DNaseI，混匀，37℃消化2小时；加入 400μL 20%PEG（终浓度8%），混匀，13000rpm，4℃离心20分钟；吸弃上清，沉淀用100μL蛋白酶K缓冲液于37℃条件下消化过夜；再用100μL酚：氯仿抽提一次，乙醇沉淀，最后用TE溶液溶解15μL。取5μL上样1%琼脂糖凝胶电泳，转膜杂交。用地高辛标记的探针检测HBV DNA，化学发光法和胶片显影记录检测结果，结果如图1所示。

由图1可知，野生型HBV DNA（LJ196）的参照显影较弱，可见略小于4.8kb的RC DNA（松弛环状DNA）带和介于3.4kb和1.8kb之间的SS DNA（单链DNA）带，位于约3.2kb的DL DNA（双链线性DNA）带因太弱未能显影。rHBV1、rHBV2和rHBV3与LJ96共转染的分离较好，显影十分清楚，RC DNA带较浓，与SS DNA带相当，DL DNA带不及RC DNA带浓。表明HBV DNA在分别删除2111-2643位核苷酸、187-680位核苷酸和1060-1500位核苷酸三个区段的序列后，能在辅助蛋白协助下高效率地复制。rHBV1.3与LJ196共转染，显影稍弱，已不见RC带，表明RC DNA的形成大大减弱。rHBV1.23与LJ196共转染，rHBV1.23与HBV基因组相比几乎删除基因组一半片段，其核衣壳DNA集中约为1.4kb和1.7kb，而rHBV1.23为小于1.8kb的较窄区带，可能是DL带。由此可知，HBV基因组的2111~2643nt，187~680nt和1060~1500nt三个区段一并删除后会严重影响病毒复制。

二、rHBV-H1构建过程

根据pLVTHM质粒中H1启动子序列设计引物，上游引物为：EcoH1-F：5'-caggaattcgaacgctgacgtcat-3'（SEQ ID NO.8），下游引物为：ClaH1-R：5' -ggtatcgataagcttggagacgcgt-3'（SEQ ID NO.9），下划线分别为MluI和ClaI酶切位点，然后以pLVTHM质粒为模板进行PCR扩增，得H1启动子，如SEQ ID NO.10所示。（pLVTHM质粒由Didier Trono教授赠，公开于Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Wiznerowicz et al. J Virol. 2003.77(16): 8957-61.）。将所得的H1启动子与删除LJ196载体2111-2643位、187-680位和1060-1500位碱基的序列连接，使H1启动子连入rHBV1、rHBV2和rHBV3载体中，得rHBV1-H1、rHBV2-H1和rHBV3-H1载体。同时将H1启动子连入rHBV1.3载体中作为对照，得rHBV1.3-H1载体。

将构建的rHBV1-H1、rHBV2-H1、rHBV3-H1和rHBV1.3-H1载体分别与LJ196共转染HepG2细胞，同时以单独转染LJ196载体为对照，然后用Southern blot检测，验证各质粒相对于野生型HBV的RC DNA合成效率，结果如图2所示。由图2可知，rHBV1-H1（在删除了2111-2643位核苷酸处替换了约240bp的H1启动子序列）、rHBV2-H1和rHBV3-H1的RC DNA条带明显与rHBV1的相应条带类似，表明在删除序列处插入H1启动子后并不影响RC DNA的形成，rHBV1-H1能够正常的复制。而rHBV1.3-H1载体转染组未见RC DNA条带，可能是因为删除序列过长影响了RC DNA的形成。

由于分别删除2111-2643位核苷酸、187-680位核苷酸、1060-1500位核苷酸片段后，RC DNA合成不受明显影响，将H1启动子连入载体后也能在辅助蛋白支持下较高效率地复制。因此，在辅助蛋白存在下，能够用rHBV-H1表达目标基因。

三、设计shRNA靶位

在rHBV1-H1、rHBV2-H1和rHBV3-H1载体的H1启动子的3’端插入发夹状shRNA。按照发夹状shRNA 设计原则，经Medline Blast 查询，选择与人类基因组无同源性，删除片段中高度保守的序列，设计合成5个靶序列长度为21-25个碱基的shRNA序列，shRNA的正、负链退火形成具有突出粘端双链，与MluI和ClaI酶切末端互补，分别构建5个rHBV-shRNA质粒。所设计的shRNA均正义链中引入1~3个C→T或A→G的突变，由于反义链不影响RNAi作用因此将反义链序列保持不变，这样在形成的发夹结构中存在G：T（在shRNA中为G：U）不稳定碱基配对，不稳定碱基配对的好处有：在工程菌中扩增质粒时发夹状部分DNA不易被删除；有利于DNA测序，因为完全互补的shRNA难以测序。

首先设计对照载体，具体为，不针对HBV靶序列的shRNA编码序列shNON 5'-cgcgttcccgactccagtggtaatctacttcaagagagtagattaccactggagtcttttttat-3'，形成双链后连入HBV1-H1、rHBV2-H1和rHBV3-H1载体H1启动子的3’端，获得rHBV1shNON、rHBVshNON和rHBV3shNON，为空白对照载体。

细胞核中rHBVshNON cccDNA检测

将rHBV1shNON、rHBV2 shNON、rHBV3 shNON和LJ196分别与辅助质粒LJ96共转染HepG2细胞后第5天，通过Hirt法提取cccDNA，并用DpnI内切酶特异性彻底消化转染入细胞的质粒DNA，再用Plasmid-Safe ATP-Dependent Dnase降解含单链的RC DNA，通过cccDNA特异性荧光定量PCR检测试剂盒检测其cccDNA含量。结果显示，转染rHBV1shNON、rHBV2shNON和rHBV3shNON的HepG2细胞中cccDNA量分别为1.69E+5、3.31E+5、2.83E+5 IU/mL，与LJ196对照的4.87E+5 IU/mL相当。因此，分别删除2111-2643位核苷酸、187-680位核苷酸、1060-1500位核苷酸片段并表达shRNA的rHBVshRNA，能与野生型HBV一样形成cccDNA。

rHBV2 -shRNA的构建

以5’-gaacctctatgtatccctcctg-3’ （SEQ ID NO.11）为靶序列，设计识别该靶序列的shRNA541，具体为5' -cgcgttcccgaacctctatgtatccctcctgttcaagagacaggagggatacatagaggttcttttttat-3'（SEQ ID NO.12），为了方便测序和防止序列重组，在正义链序列处进行突变，突变后的序列为5' –cgcgttcccgaacttctatgtgtcccttctgttcaagagacaggagggatacatagaggttcttttttat-3'（SEQ ID NO.13），黑体为突变序列。同时合成反义链序列，与正义链序列退火形成双链后，5'端为MluI粘性末端，3’端为ClaI粘性末端，如图3所示。将上述序列连入rHBV2-H1载体的MluI和ClaI位点之间，得rHBV2-shRNA541载体。

以5’-ggtatgttgcccgtttgtc-3’ （SEQ ID NO.14）为靶序列，设计识别该靶序列的shRNA456，具体为5'- cgcgttcccggtatgttgcccgtttgtcttcaagagagacaaacgggcaacataccttttttat-3'（SEQ ID NO.15），为了方便测序和防止序列重组，在正义链序列处进行突变，突变后的序列为5'- cgcgttcccggtatgttgtccgtttgtcttcaagagagacaaacgggcaacataccttttttat-3’ （SEQ ID NO.16），黑体为突变序列。同时合成反义链序列，与正义链序列退火形成双链后，5'端为MluI粘性末端，3’端为ClaI粘性末端，如图4所示。将形成的双链序列连入rHBV2-H1载体的MluI和ClaI位点之间，得rHBV2-shRNA456载体。

rHBV3-shRNA的构建：

以5’-gcgctgaatcctgcggacgac-3’（SEQ ID NO.17）为靶序列，设计识别该靶序列的shRNA1436，具体为5'-cgcgttcccgcgctgaatcctgcggacgacttcaagagagtcgtccgcaggattcagcgcttttttat-3'（SEQ ID NO.18），为了方便测序和防止序列重组，在正义链序列处进行突变，突变后的序列为5'- cgcgttcccgcgctgaatcttgcgggcgacttcaagagagtcgtccgcaggattcagcgcttttttat-3'（SEQ ID NO.19），黑体为突变序列，同时合成反向序列，与正义链序列退火形成双链后，5'端为MluI粘性末端，3’端为ClaI粘性末端，如图5所示。将上述序列连入rHBV3-H1载体的MluI和ClaI位点之间，得rHBV3-shRNA1436载体。

以5’-gcaggtctggagcaaacattatcg-3’ （SEQ ID NO.20）为靶序列，设计识别该靶序列的shRNA1032，具体为5' -cgcgttcccgcaggtctggagcaaacattatcgttcaagagacgataatgtttgctccagacctgcttttttat-3’ （SEQ ID NO.21），为了方便测序和防止序列重组，在正义链序列处进行突变，突变后的序列为5’- cgcgttcccgcaggtttggagcagacattatcgttcaagagacgataatgtttgctccagacctgcttttttat-3’（SEQ ID NO.22），黑体为突变位点，同时合成反义链序列，与正义链序列退火形成双链后，该序列形成双链后，5'端为MluI粘性末端，3’端为ClaI粘性末端，如图6所示。将突变后的shRNA突变后的序列形成双链后连入rHBV3-H1载体的MluI和ClaI，得rHBV3-shRNA1302载体。

rHBV1-shRNA的构建

以5’-ccgtgtgcacttcgcttcacctctg-3’ （SEQ ID NO.23）为靶序列，设计识别该靶序列的shRNA1573，具体为5'-cgcgttcccccgtgtgcacttcgcttcacctctgttcaagagacagaggtgaagcgaagtgcacacggttttttat-3'（SEQ ID NO.24），为了方便测序和防止序列重组，在正义序列处进行突变，突变后的序列为5'- cgcgttcccccgtgtgtacttcgtttcacttctgttcaagagacagaggtgaagcgaagtgcacacggttttttat-3'（SEQ ID NO.25），同时合成反义序列，与正义序列退火形成双链后，5'端为MluI粘性末端，3’端为ClaI粘性末端，如图7所示。将突变后的shRNA突变后的序列形成双链后连入rHBV1-H1载体的MluI和ClaI位点之间，得rHBV1-shRNA1573载体。

其rHBV1-shRNA1573、rHBV2-shRNA541、rHBV2-shRNA456、rHBV3-shRNA1436和rHBV3-shRNA1302载体结构如附图8所示。

培养HepG2细胞至50%-70%融合状态，上述构建的5个载体和HBV表达载体pCH-9/3091按1:1的比例分别共转染细胞，24小时后更换新鲜培养液（该载体由Michael Nassal教授惠赠，公开于Nassal M. The arginine-rich domain of the hepatitis B virus core protein is required for pregenome encapsidation and productive viral positive-strand DNA synthesis but not for virus assembly. J Virol. Jul 1992;66(7):4107-4116.）。

感染后3天、10天、17天和24天四个时间点，更换新鲜培养液，收集培养上清，用雅培公司I2000化学发光定量检测仪及试剂测定上清中HBsAg含量。检测结果显示，rHBV2-shRNA456对HBsAg表达的抑制率分别达到86.60%、96.54%、98.20%和98.08%，rHBV2-shRNA1436对HBsAg表达的抑制率分别达到78.35%、67.71%、74.48%和83.85%。因此，rHBV2-shRNA456干扰效果最好，大于85%；rHBV2-shRNA1436干扰效率次之，约为79%；rHBV3-shRNA1573和rHBV3-shRNA1302的干扰效果较差，分别为66%和58%，而rHBV2-shRNA541几乎无干扰活性，对HBsAg几乎没有影响。

在共转染后培养第10日各孔培养上清用DNaseⅠ处理过夜，彻底消化转染带入的质粒DNA后，用罗氏LightCycler480荧光定量PCR测定HBV DNA量。结果显示，rHBV2-shRNA541、rHBV2-shRNA456、rHBV2-shRNA1436和rHBV3-shRNA1573干扰组HBV DNA拷贝数分别为：8.08E+6、1.51E+6、2.70E+6和2.26E+6 IU/mL；表明rHBV2-shRNA456、rHBV2-shRNA1436和rHBV3-shRNA1573对HBV DNA复制的抑制效率分别为：81.3%、66.6%和70.0%，与HBsAg的抑制效率基本一致。

本发明研究结果显示HBV DNA的2111-2643nt、187-680nt、1060-1500nt三处较大片段删除后对RC DNA合成没有明显影响，H1启动子和shDNA序列插入载体后也能较高效率地复制，并能形成cccDNA，同时删除2111-2643和1060-1500或三个片段都删除后严重阻碍其RC DNA的形成；构建了识别5个靶序列的HBV1-shRNA载体，验证出其中rHBV2-shRNA456抑制效率为85%，rHBV2-shRNA1436抑制效率为79%；并且在辅助蛋白协助下，rHBV-shRNA结构能够和野生型HBV一样形成cccDNA，并且rHBV2-shRNA456和rHBV2-shRNA1436对HBV复制和HBsAg的表达具有长期抑制效果，抑制效率增强。因此，利用本发明的策略，用于制备干扰乙型肝炎病毒基因组DNA复制和HBsAg表达的药物，为慢性HBV感染的治疗提供了新的思路。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明。

<110> 中国人民解放军第三军医大学

<120> 表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体及其构建方法和应用

<160> 25

<210> 1

<211> 6627

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LJ196序列

<400> 1

ccacaacctt ccaccaaact ctgcaagatc ccagagtgag aggcctgtat ttccctgctg 60

gtggctccag ttcaggaaca gtaaaccctg ttctgactac tgcctctccc ttatcgtcaa 120

tcttctcgag gattggggac cctgcgctga acacggagaa catcacataa ggatccctag 180

gaccccttct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc acaataccgc 240

agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggaactacc gtgtgtcttg 300

gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct ccaacttgtc 360

ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc ctgctgctat 420

gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt tgtcctctaa 480

ttccaggatc ctcaacaacc agcacgggac catgccggac ctgcatgact actgctcaag 540

gaacctctat gtatccctcc tgttgctgta ccaaaccttc ggacggaaat tgcacctgta 600

ttcccatccc atcatcctgg gctttcggaa aattcctatg ggagtgggcc tcagcccgtt 660

tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt tcccccactg 720

tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac agcatcttga 780

gtcccttttt accgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt taaaccctaa 840

caaaacaaag agatggggtt actctctaaa ttttatgggt tatgtcattg gatgttatgg 900

gtccttgcca caagaacaca tcatacaaaa aatcaaagaa tgttttagaa aacttcctat 960

taacaggcct attgattgga aagtatgtca acgaattgtg ggtcttttgg gttttgctgc 1020

cccttttaca caatgtggtt atcctgcgtt gatgcctttg tatgcatgta ttcaatctaa 1080

gcaggctttc actttctcgc caacttacaa ggcctttctg tgtaaacaat acctgaacct 1140

ttaccccgtt gcccggcaac ggccaggtct gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac 1200

tggctggggc ttggtcatgg gccatcagcg catgcgtgga accttttcgg ctcctctgcc 1260

gatccatact gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc agcaggtctg gagcaaacat 1320

tatcgggact gataactctg ttgtcctatc ccgcaaatat acatcgtttc catggctgct 1380

aggctgtgct gccaactgga tcctgcgcgg gacgtccttt gtttacgtcc cgtcggcgct 1440

gaatcctgcg gacgaccctt ctcggggtcg cttgggactc tctcgtcccc ttctccgtct 1500

gccgttccga ccgaccacgg ggcgcacctc tctttacgcg gactccccgt ctgtgccttc 1560

tcatctgccg gaccgtgtgc acttcgcttc acctctgcac gtcgcatgga gaccaccgtg 1620

aacgcccacc aaatattgcc caaggtctta cataagagga ctcttggact ctcagcaatg 1680

tcaacgaccg accttgaggc atacttcaaa gactgtttgt ttaaagactg ggaggagttg 1740

ggggaggaga ttaggttaaa ggtctttgta ctaggaggct gtaggcataa attggtctgc 1800

gcaccagcac catgcaactt tttcacctct gcctaatcat ctcttgttca tgtcctactg 1860

ttcaagcctc caagctgtgc cttgggtggc tttggggcat ggacatcgac ccttataaag 1920

aatttggagc tactgtggag ttactctcgt ttttgccttc tgacttcttt ccttcagtac 1980

gagatccccg ggcgagctcg aattaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 2040

gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 2100

cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 2160

gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 2220

tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg 2280

ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa 2340

gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 2400

gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg 2460

gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 2520

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 2580

caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 2640

ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 2700

gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 2760

aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 2820

ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 2880

atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 2940

gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 3000

gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 3060

atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 3120

aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta 3180

actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 3240

aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 3300

tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 3360

ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 3420

agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 3480

tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gctctaggtg 3540

aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 3600

gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 3660

atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 3720

gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 3780

gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 3840

tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 3900

accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 3960

ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 4020

cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 4080

agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 4140

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 4200

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 4260

ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 4320

cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 4380

gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt 4440

tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag 4500

cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg 4560

cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc 4620

tatgaccatg attacgccaa gctagatctg tcgaccagct tggctgcaga ttattgacta 4680

gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 4740

ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgccctttga 4800

cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 4860

gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 4920

gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 4980

tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 5040

tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 5100

ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggtaccaa aatcaacggg 5160

actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 5220

ggtgggaggt ctatataagc agagctcgta cgcaccatgc aactttttca cctctgccta 5280

atcatctctt gttcatgtcc tactgttcaa gcctccaagc tgtgccttgg gtggctttgg 5340

ggcatggaca tctaagctta taaagaattt ggagctactg tggagttact ctcgtttttg 5400

ccttctgact tctttccttc agtacgagat cttctagata ccgcctcagc tctgtatcgg 5460

gaagccttag agtctcctga gcattgttca cctcaccata ctgcactcag gcaagcaatt 5520

ctttgctggg gggaactaat gactctagct acctgggtgg gtgttaattt ggaagatcca 5580

gcgtctagag acctagtagt cagttatgtc aacactaata tgggcctaaa gttcaggcaa 5640

ctcttgtggt ttcacatttc ttgtctcact tttggaagag aaacagttat agagtatttg 5700

gtgtctttcg gagtgtggat tcgcactcct ccagcttata gaccaccaaa tgcccctatc 5760

ctatcaacac ttccggagac tactgtagtt agacgacgag gcaggtcccc tagaagaaga 5820

actccctcgc ctcgcagacg aaggtctcaa tcgccgcgtc gcagaagatc tcaatctcgg 5880

gaatctcaat gttagtattc cttggactca taaggtgggg aactttactg ggctttattc 5940

ttctactgta cctgtcttta atcctcattg gaaaacacca tcttttccta atatacattt 6000

acaccaagac attatcaaaa aatgtgaaca gtttgtaggc ccactcacag ttaatgagaa 6060

aagaagattg caattgatta tgcctgccag gttttatcca aaggttacca aatatttacc 6120

attggataag ggtattaaac cttattatcc agaacatcta gttaatcatt acttccaaac 6180

tagacactat ttacacactc tatggaaggc gggtatatta tataagagag aaacaacaca 6240

tagcgcctca ttttgtgggt caccatattc ttgggaacaa gatctacagc atggggcaga 6300

atctttccac cagcaatcct ctgggattct ttcccgacca ccagttggat ccagccttca 6360

gagcaaacac cgcaaatcca gattgggact tcaatcccaa caaggacacc tggccagacg 6420

ccaacaaggt aggagctgga gcattcgggc tgggtttcac cccaccgcac ggaggccttt 6480

tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tacaaacttt gccagcaaat ccgcctcctg 6540

cctccaccaa tcgccagtca ggaaggcagc ctaccccgct gtctccacct ttgagaaaca 6600

ctcatcctca ggccatgcag tggaatt 6627

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV187-163

<400> 2

aggggtccta gggatcctta tgtga 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV1060-1036

<400> 3

caaaggcatc aacgcaggat aacca 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV2111-2087

<400> 4

agtcattagt tccccccagc aaaga 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV680-704

<400> 5

agtgccattt gttcagtggt tcgta 25

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV1500-1518

<400> 6

tgccgttccg accgaccac 19

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV2643-2667

<400> 7

attatgcctg ccaggtttta tccaa 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1启动子上游引物EcoH1-F

<400> 8

caggaattcg aacgctgacg tcat 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1启动子下游引物ClaH1-R

<400> 9

ggtatcgata agcttggaga cgcgt 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1启动子

<400> 10

caggaattcg aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact 60

aggcgggaac acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga 120

gtggcgccct gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa 180

atgtctttgg atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccacgcgtct ccaagcttat 240

cgatacc 247

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列的shRNA541

<400> 11

gaacctctat gtatccctcc tg 22

<210> 12

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA541

<400> 12

cgcgttcccg aacctctatg tatccctcct gttcaagaga caggagggat acatagaggt 60

tcttttttat 70

<210> 13

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA541突变序列

<400> 13

cgcgttcccg aacttctatg tgtcccttct gttcaagaga caggagggat acatagaggt 60

tcttttttat 70

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列的shRNA456

<400> 14

ggtatgttgc ccgtttgtc 19

<210> 15

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA456

<400> 15

cgcgttcccg gtatgttgcc cgtttgtctt caagagagac aaacgggcaa catacctttt 60

ttat 64

<210> 16

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA456突变序列

<400> 16

cgcgttcccg gtatgttgtc cgtttgtctt caagagagac aaacgggcaa catacctttt 60

ttat 64

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列的shRNA1436

<400> 17

gcgctgaatc ctgcggacga c 21

<210> 18

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA1436

<400> 18

cgcgttcccg cgctgaatcc tgcggacgac ttcaagagag tcgtccgcag gattcagcgc 60

ttttttat 68

<210> 19

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA1436突变序列

<400> 19

cgcgttcccg cgctgaatct tgcgggcgac ttcaagagag tcgtccgcag gattcagcgc 60

ttttttat 68

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列的shRNA1032

<400> 20

gcaggtctgg agcaaacatt atcg 24

<210> 21

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA1302

<400> 21

cgcgttcccg caggtctgga gcaaacatta tcgttcaaga gacgataatg tttgctccag 60

acctgctttt ttat 74

<210> 22

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA1302突变序列

<400> 22

cgcgttcccg caggtttgga gcagacatta tcgttcaaga gacgataatg tttgctccag 60

acctgctttt ttat 74

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列的shRNA1573

<400> 23

ccgtgtgcac ttcgcttcac ctctg 25

<210> 24

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA1573

<400> 24

cgcgttcccc cgtgtgcact tcgcttcacc tctgttcaag agacagaggt gaagcgaagt 60

gcacacggtt ttttat 76

<210> 25

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA1573突变序列

<400> 25

cgcgttcccc cgtgtgtact tcgtttcact tctgttcaag agacagaggt gaagcgaagt 60

gcacacggtt ttttat 76

Claims

1.表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体，其特征在于：所述表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体由LJ196载体删除2111-2643位、187-680位或1060-1500位碱基后，在删除序列处替换识别所述删除序列的shRNA转录结构单元而得。

2.根据权利要求1所述表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体，其特征在于：所述shRNA转录结构单元由启动子和shRNA编码序列组成。

3.根据权利要求1所述表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体，其特征在于：所述启动子为H1启动子。

4.根据权利要求1-3任一项所述表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体，其特征在于：所述shRNA编码序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.25所示。

5. 权利要求1-4任一项所述重组HBV载体的制备方法，其特征在于：根据LJ196载体序列设计引物，然后以LJ196载体为模板，进行PCR扩增，得删除LJ196载体2111-2643位、187-680位和1060-1500位碱基的序列，同时克隆H1启动子并分别与所得序列连接，环化后在H1启动子3’端连入识别所述删除序列的shRNA的转录结构单元，得重组HBV载体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述引物为SEQ ID NO.2-7所示的核酸序列。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述克隆H1启动子的方法为，以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示核苷酸序列为引物，以pLVTHM质粒为模板，进行PCR扩增，得H1启动子。

8.权利要求1-4任一项所述重组HBV载体在制备干扰乙型肝炎病毒基因组DNA复制的药物中的应用。