CN101343637A - 饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，涉及通过自然饲喂沉默特定基因的dsRNA调控昆虫的生长发育领域。它选择了几丁质合成酶基因SeCHS－A上的基因片段SeA3，通过自然饲喂后研究对昆虫的影响。主要包括：选择合适的表达载体L4440与目的基因片段SeA3构建重组表达载体L4440－SeA3；然后把该重组载体在特定的受体细胞大肠杆菌HT115(DE3)中、在体外适应条件下诱导表达；再把已经表达出dsRNA的受体菌htLSA3加入昆虫的饲料中，用该饲料对昆虫幼虫进行自然饲喂，检测饲喂后昆虫抑制该基因表达情况并记录昆虫的表现型的改变。采用自然取食抑制昆虫基因的表达，探索害虫控制的新途径。

Description

饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法

技术领域

本发明涉及昆虫的生长发育调控领域，且其涉及饲喂沉默特定基因的dsRNA在害虫的防治中之用途。具体而言，本发明涉及通过饲喂含有干扰昆虫几丁质合成酶基因的dsRNA对鳞翅目昆虫的基因表达进行抑制，从而调控其生长发育。

背景技术

RNA干扰或称RNA interference或RNAi，是dsRNA介导的的特异性基因表达沉默现象，是生物界一种古老且在进化上高度保守的基因表达调节机制，1998年首次在线虫.Caenorhabditis elegans中发现这种现象。RNAi作用的大致过程是：导入体内的或内源性转录生成的dsRNA被Dicer酶切割成21~25nt(碱基)的siRNA，siRNA进一步与其它多种蛋白成份结合形成RISC，最后由RISC介导siRNA反义链与靶mRNA分子互补结合引起同源性靶mRNA分子的切割效应。RNAi现已成为一种替代基因敲除而研究基因功能的有力工具。在昆虫基因功能的研究方面，RNAi已得到了广泛应用并取得了令人激动的结果。Caplen等2002年发现在白纹伊蚊Aedes albopictus C6/36细胞内，dsRNA可以特异性抑制C6/36细胞中质粒和SFV复制子的表达，并能显著的调节DEN1 RNA和病毒复制的活力。这项研究揭示在蚊子细胞中dsRNA可以抑制基因的表达和病毒的复制，并显示这种机理可以被用来阻断昆虫寄主体内病毒的复制进而达到阻止疾病传播的目的(N.J.Caplen，Z.Zheng，B.Falgout，R.A.Morgan，Molecular Therapy 6，243(2002).)。这就说明RNAi不仅可以作为一种研究基因功能的工具，而且有可能开发成一种治疗疾病和控制害虫的药物。Amdam等2003年将意大利蜜蜂Apismellifera 504bp的卵黄蛋白基因的dsRNA注射入工蜂卵内，发现15％的卵黄蛋白mRNA水平显著降低；而对刚羽化的蜜蜂成虫注射dsRNA，发现有96％的个体都产生了突变表型(G.Amdam，Z.Simoes，K.Guidugli，K.Norberg，S.Omholt，BMC Biotechnology 3，1(2003).)。Tomoyasu等2004年研究发现把GFP dsRNA注射入转GFP基因的赤拟谷盗Tribolium castaneum幼虫体内，在注射后不久即可观察到幼虫体内GFP表达受到抑制，而且在整个蛹期和成虫期这种抑制现象还可以持续性的观察到；他们同时对T.castaneum刚毛基因的RNAi研究得到了成虫体表刚毛的缺失(Y.Tomoyasu，R.E.Denell，Development Genes and Evolution 214，575(2004).)。上述实验证明dsRNA不仅在单个细胞内可以特异性的抑制目标基因的表达，而且在整个昆虫个体及其所有的发育阶段也可以对基因的表达产生阻抑，并且可以观察到目标基因受到阻抑后的RNAi表型。这充分说明RNAi可以作为一种研究昆虫基因功能的有力工具。

在昆虫中现在用RNAi研究基因功能的方法主要是注射法，一般通过把dsRNA或siRNA用微量注射器导入昆虫胚胎或体腔对靶mRNA进行沉默来研究所需基因的功能。注射法RNAi虽然在昆虫基因功能的研究方面取得了很大的成果，但是它亦有如下的缺点：首先是对实验操作人员有较高的注射技术要求，劳动强度大；其次注射dsRNA或siRNA基本都需要用试剂盒来制备比较纯的双链RNA，这增加了实验的成本；再次注射法仅可以用于研究某种昆虫中某个基因的功能，无法说明如果某种昆虫如果取食某个基因的dsRNA是否对其生长发育的影响；还有注射法需要人工单个实施，注射法RNAi研究无法直接广泛使用在害虫的有效控制上。

近几年来，人们开始尝试通过使昆虫取食dsRNA或siRNA降低靶基因的表达，可以消除以上注射所带来的大部分缺点。在昆虫中已经有了如下的报道：在2006年报道Araujo等喂食吸血蝽Rhodnius prolixus含针对抗凝血剂基因NP2的dsRNA，降低了NP2基因mRNA的表达水平，并使吸血椿的血凝启动时间比对照组缩短了4倍(R.N.Araujo et al.，InsectBiochemistry and Molecular Biology 36，683(2006).)；但是这种喂食法RNAi研究尚有如下的缺陷：dsRNA采用试剂盒合成、纯化，成本高昂，不能满足大规模应用研究的要求。在2006年报道Turner等喂食苹果透翅蛾Epiphyas postvittana针对EposCXE1和EposPBP1的dsRNA溶液，喂食2天后EposCXE1 mRNA转录水平降低一半，成虫触角的EposPBP1 mRNA转录水平降低(C.T.Turner et al.，Insect Molecular Biology 15，383(2006).)；但该喂食法RNAi研究也采用纯化的试剂盒合成，成本高昂，而且采用微量进样器将dsRNA溶液送入每头试虫口器中，这样的取食只是另一种意义上的注射，操作复杂，工作量大，无法大规模的进行基因功能的研究和对感兴趣的基因进行筛选。

为了能满足方便地研究昆虫基因功能的需要，特别是为探索新的害虫控制的有效方法，需要更好的饲喂法RNAi研究。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是：为克服了以上的缺点，本发明提供一种饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，它通过自然饲喂含有特定基因dsRNA饲料来有效的抑制昆虫靶基因mRNA表达，以控制昆虫正常的生长发育，该方法不仅操作简单，还不需要对特定dsRNA介质高度纯化，研究应用成本低，可以广泛地使用，探索出新的害虫控制的方法。

本发明提供了一种采用自然饲喂的方法，通过经RNA触发的基因沉默来抑制特定基因昆虫几丁质合成酶基因SeCHS-A在昆虫细胞中表达的方法，特别提供了几丁质合成酶基因SeCHS-A上特异性的基因片段SeA3通过自然饲喂后对鳞翅目昆虫如甜菜夜蛾生长发育的影响。

本发明所采用方案是：

本发明用于干扰鳞翅目昆虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua的正常生长发育的方法。通过喂食含有沉默几丁质合成酶SeCHS-A(GeneBank DQ062165)的dsRNA片段，从而抑制昆虫体内几丁质合成酶mRNA的翻译进而达到降低甜菜夜蛾体内几丁质含量的目的，控制昆虫正常的生长发育。本发明可以进一步揭示害虫防治的一种潜在的新方法。

几丁质含量与昆虫正常的生长发育有密切的关系：几丁质是昆虫的表皮和中肠围食膜的重要组成部分，昆虫的表皮和中肠围食膜使昆虫获得了抵御外来有害物质的能力，任何干扰几丁质正常合成的物质都会对昆虫的生长发育带来不利的影响。几丁质合成酶(又叫NDP-GlcNAc转移酶，E2.4.1.16)是催化NDP-乙酰氨基葡萄糖(NDP-GlcNAc)聚合形成几丁质的关键酶(R.L.Tellam，T.Vuocolo，S.E.Johnson，J.Jarmey，R.D.Pearson，EuropeanJournal of Biochemistry 267，6025(2000).)。本发明的生物学原理就是通过沉默昆虫几丁质合成酶基因mRNA，进而降低昆虫体内几丁质合成酶的量，抑制几丁质的合成，从而来达到调控昆虫生长发育之目的。采用这种办法，通过抑制有害昆虫的生长发育，也是防治有害昆虫的新的手段。

总体来说，本发明所指的饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，也是提供了一种通过经RNA触发的基因沉默来干扰选定基因在昆虫细胞中之表达的新方法。首先，选定具有特定性能的基因片段——几丁质合成酶SeCHS-A的一核酸区段，即基因片段SeA3，其基因序列如SEQID NO1所示，作为特定功能的dsRNA片段。也就是说SeA3为几丁质合成酶上的一个片段，为表达目的dsRNA片段；选择合适的表达载体如L4440(该表达载体可由美国Addgene机构提供)，然后与选定的目的基因片段如SeA3构建重组表达载体如L4440-SeA3。然后，该重组载体如L4440-SeA3(简称LSA3)含重组基因成份具有选定基因几丁质合成酶SeCHS-A的一核酸区段，该重组载体在特定的受体细胞大肠杆菌HT115(DE3)(美国斯坦福大学Fire教授赠送，美国CGC提供，现保存在中山大学昆虫学研究所)中，在体外适应条件下进行诱导表达。经过诱导后，从而使受体菌大肠杆菌HT115(DE3)表达出dsRNA如SeA3dsRNA。再次，把已经表达出dsRNA的受体菌如htLSA3(即可以表达LSA3dsRNA的大肠杆菌HT115(DE3))加入昆虫的饲料中，通过对昆虫幼虫进行自然饲喂含有针对几丁质合成酶基因SeCHS-A的SeA3dsRNA的饲料，从而研究特定昆虫基因如甜菜夜蛾SeCHS-A的功能及抑制该基因表达后对该昆虫的表现型的改变。此干扰效果可通过检测昆虫mRNA水平或表现型的改变来确定，如可通过检测甜菜夜蛾SeCHS-A mRNA表达情况和其表现型来确定干扰效果。如实验表明，甜菜夜蛾取食htLSA3后，SeCHS-A基因mRNA的表达水平降低，表现型为其幼虫出现蜕皮障碍，终因无法正常完成蜕皮而死亡。

具体来说，该饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，是通过dsRNA触发的基因沉默来干扰一选定基因在昆虫的发育过程中调控作用，它对昆虫直接饲喂含有特定dsRNA基因片段的受体菌中表达的dsRNA引发，导致昆虫mRNA水平或表现型的变化，通过该方法对昆虫对应的某一特定基因的表达进行抑制。所述方法主要包括以下步骤：

(1)选定特定功能基因的dsRNA片段：

考虑到昆虫几丁质合成酶基因是催化昆虫体内NDP-乙酰氨基葡萄糖(NDP-GlcNAc)聚合形成几丁质的关键酶，因此本发明选择该特定功能的基因为昆虫几丁质合成酶基因SeCHS-A，选定特定功能的dsRNA片段为SeCHS-A基因上一段特异性的基因片段SeA3，其基因序列如SEQID NO1所示。

(2)用Trizol法提取昆虫总RNA，利用RT-PCR扩增出cDNA；

(3)通过PCR技术扩增出基因片断SeA3：根据选用昆虫几丁质合成酶基因SeCHS-A，结合PCR反应体系有关引物设计技术原则，设计一对特异引物：正向引物SeCHSA3_F和反向引物SeCHSA3_R，该特异引物分别为：

正向引物SeCHSA3_F的基因序列为：

5’-TCGCCATGGTTGTATTCTTCTTCGCCTTG-3’

反向引物SeCHSA3_R的基因序列为：

5’-GACAAGCTTGTCGCCTATGGTGGTTTCGT-3’。

该引物由广州赛百盛生物技术公司合成。以上一步通过RT-PCR得到的cDNA为模板，通过PCR扩增出SeA3片断，将扩增后的片段如SeA3送交上海英俊生物技术公司测序，将测序正确的片段用割胶回收，用美国Omega公司产品E.Z.N.A Gel Extraction Kit纯化回收产物。PCR技术是目前成熟的分子生物学技术，本发明不再详细说明了。

(4)构建含有选定的dsRNA片段的重组表达载体：如本发明选用L4440为构建重组表达载体的空载体，用NcoI和HindIII分别消化载体L4440和PCR产物SeA3，分别将L4440消化后的2737bp和SeA3消化后的641bp(因为此时消化的SeA3包含酶切位点两端共增加的6个碱基，所以此时的实际片段大小是635+6bp)割胶回收，用E.Z.N.A的Gel ExtractionKit纯化回收目的基因片段。然后用T4DNA连接酶，将此纯化后641bp的SeA3目的基因片段和2737bp L4440载体片段连接24小时，构建重组表达载体L4440-SeA3，然后，将重组表达载体L4440-SeA3转化入宿主菌DH5α中。

(5)将重组表达载体转入受体菌：如本发明中再将重组表达载体L4440-SeA3利用CaCl₂法转化入dsRNA表达受体菌HT115(DE3)中。

(6)通过IPTG诱导使受体菌表达目的基因dsRNA：本发明中在一定的温度、转速和时间下诱导转化入受体菌HT115(DE3)中的重组表达载体L4440-SeA3表达相应昆虫基因片段的dsRNA。如本发明中将1ml培养14小时后的htLSA3菌液加入100ml 2×YT培养基中，在37℃，250rpm培养，OD₅₉₅＝0.4时加入1M IPTG40μl，培养4小时。

(7)对表达了dsRNA的受体菌进行纯化、富集：将前一步获得的已经表达了dsRNA的受体菌即大肠杆菌HT115(DE3)进行初步纯化、富集菌体，弃掉上清液。

(8)将富集的表达了dsRNA的受体菌的菌液均匀加入饲料并喂养昆虫幼虫：将饲料切成薄片或细粒，将富集表达了目的基因dsRNA的大肠杆菌如htLSA3用适当的无菌水稀释，按照一定的比例均匀加入昆虫人工饲料如甜菜夜蛾人工饲料中，让菌液渗透到饲料的各部分。然后，将充分的吸收到菌液的饲料放进培养昆虫的盒子，饲喂适当龄期的昆虫幼虫，饲料每天更换一次，保证昆虫每天进食有相同的表达了dsRNA的新鲜饲料。

为说明实验对比效果，饲喂实验需同时设置饲喂不含表达目的基因dsRNA的大肠杆菌和不含大肠杆菌正常饲喂的昆虫为对照组，分别如本发明中的空载体L4440组和去离子水ddH₂O组。

(9)用RT-PCR检测饲喂表达了dsRNA的大肠杆菌后昆虫体内目的基因的表达：待昆虫饲喂特定的时间如连续1-15天任意时间后，取昆虫幼虫提取总RNA或mRNA，用RT-PCR扩增得到相应的cDNA，然后用特定的引物以上述得到的相应的cDNA为模板，检测目的基因如本发明中的SeCHS-A mRNA的表达情况并观察、记录抑制昆虫幼虫特定基因表达后的表现型，如本发明中抑制甜菜夜蛾SeCHS-A mRNA后甜菜夜蛾的表现型变化；并持续饲养为取材检测的幼虫，继续取昆虫幼虫做RT-PCR检测，检测其基因的表达情况并继续观察、记录幼虫经RNAi后的表现型，本发明中的抑制幼虫基因mRNA表达后的表现型主要表现为幼虫蜕皮至身体一半，无法完成蜕皮而死亡或无法正常化蛹表现为畸形蛹而死亡。

前述的昆虫可为鳞翅目昆虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua，也可以是斜纹夜蛾Spodoptera litura、棉铃虫Helicoverpa armigera或褐飞虱Nilaparvata lugens等。

前述的表达dsRNA的载体L4440含有两个反向的T7启动子。

前述表达的dsRNA的SeA3基因片段大小为200b到1000bp之间的任一碱基数目。

前述基因诱导的所述温度、转速和时间还可以分别为：温度为25℃-40℃之间任一温度，转速为150rpm-300rpm之间任一转速，时间为2~24小时之间任一时间长度。

所述饲喂昆虫幼虫的方法是直接自然喂养。所述饲喂昆虫幼虫的适当龄期为幼虫发育一龄到五龄之间的任一龄期。所述饲喂特定的时间为连续饲喂幼虫后1～15天的任一时间。

通过实验发现，经过饲喂含有表达选定的dsRNA的片段的大肠杆菌饲料后，昆虫体内的也发生了SeCHS-A基因的表达沉默，目的基因mRNA表达水平降低，进而导致几丁质合成酶酶量减少，昆虫表皮内的几丁质含量减少，从而对新表皮的形成产生影响，导致无法形成完整的新表皮而在幼虫蜕皮时出现障碍。表现型为幼虫无法完全蜕皮或预蛹无法形成正常的蛹。对于许多有害的昆虫，我们也可以采用这种办法，通过喂食含有特定基因表达的食物或饲料抑制害虫的生长发育，来实现控制害虫蔓延。

本发明的有益效果是：本发明由于采用大肠杆菌表达特定的dsRNA如SeA3dsRNA，成本低廉，而且可以一次表达针对多个基因的dsRNA，方法简便；由于把所表达的dsRNA直接添加入昆虫的人工饲料即可，不需要其他的特殊操作，技术难度小，且是真正意义上的自然取食，可以广泛地推广。因此，采用本方法抑制昆虫基因的表达，可以更快速的筛选出控制昆虫生长发育的重要基因，为探索新的害虫控制的方法提供新的方法。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明：

附图说明：

图1为构建重组表达载体的空载体L4440的质粒图谱。

图2为重组表达载体L4440-SeA3的质粒图谱。

图3为PCR反应扩增SeA3片段1％琼脂糖凝胶电泳图。

其中M3为Marker3(4500bp，3000bp，2000bp，1200bp，800bp，500bp，200bp)；1和2号泳道为PCR反应扩增SeA3片段目的带(635bp)。双泳道是作为重复，该图说明通过PCR得到了欲插入L4440载体的目的基因片段。

图4为重组表达载体L4440-SeA3单酶切和双酶切鉴定1％琼脂糖凝胶电泳图。

其中M3：Marker3(分子量大小参见图3)；1：L4440单酶切(HindIII)；2：L4440双酶切(ApalI)；3：L4440-SeA3单酶切(HindIII)；4：L4440-SeA3双酶切(ApalI)。

图5为诱导表达SeA3dsRNA的1％琼脂糖凝胶电泳图。

其中表达目的带如图中箭头所示，2、3号泳道分别为L4440空载体和不含任何外源载体的HT115(DE3)所诱导。

图6为饲喂SeA3dsRNA后对甜菜夜蛾SeCHS-A mRNA表达情况检测的电泳图。

其中A表示检测的为SeCHS-A片段(3280-3871，592bp)，B为β-actin(477bp，GeneBankAY507963)检测；1、2、3：喂食表达SeA3dsRNA的大肠杆菌；4：喂食含有L4440空载体的大肠杆菌；5：饲料中含有ddH₂O的对照组。

图7为饲喂表达SeA3dsRNA组后的甜菜夜蛾幼虫体表现型。

图8为饲喂表达SeA3dsRNA组后的甜菜夜蛾在化蛹前预蛹不能蜕皮表现型。

图9为饲喂L4440的对照组甜菜夜蛾幼虫体表现型。

图10为饲喂ddH₂O的对照组甜菜夜蛾幼虫体表现型。

具体实施方式：

以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对本发明只是进一步的说明作用，而没有限制作用。

实施例1：

培植、配制好已经表达dsRNA即L4440-SeA3的饲料，同时准备用相同分量空载体L4440配制好对比饲料，和相同分量去离子水ddH₂O配制的饲料，分三个对比组分别喂食三批同样的四龄甜菜夜蛾的幼虫。

具体说明如下：

第一步：SeA3目的基因片段的获得

考虑到昆虫几丁质合成酶基因是催化昆虫体内几丁质形成的关键酶，因此本实施例选择几丁质合成酶基因SeCHS-A，选定SeCHS-A基因上的一段特异性的基因片段SeA3作为特定功能的dsRNA片段，该dsRNA片段SeA3目的基因长度为635bp，其基因序列如SEQ ID NO1(序列表附录2)所示。

取甜菜夜蛾五龄幼虫用Trizol法(Life-Tech，Rockville，MD)提取总RNA，然后用日本Takara公司的反转录酶(reverse transcriptase)AMV利用RT-PCR方法合成cDNA，方法参见Chen(X.Chen et al.，Insect Biochemistry and Molecular Biology 37，409(2007).)。RT-PCR程序为37℃10min，42℃1hr，99℃5min，5℃5min。Trizol法是指按Trizol试剂盒上说明书进行方法，Trizol为美国Invitrogen公司产品。

以上述得到的甜菜夜蛾cDNA为模板，以针对几丁质合成酶基因SeCHS-A mRNA设计的一对特异性引物进行PCR扩增。引物分别为正向引物SeCHSA3_F，反向引物SeCHSA3_R，如下所示：

SeCHSA3_F：5′-TCGCCATGGTTGTATTCTTCTTCGCCTTG-3′

                                  NcoI

SeCHSA3_R：5′-GACAAGCTTGTCGCCTATGGTGGTTTCGT-3′

                                 HindIII

其中NcoI和HindIII分别为引入正向引物SeCHSA3_F和反向引物SeCHSA3_R的特异性酶切位点，便于后面用NcoI和HindIII酶切消化后与表达载体L4440进行重组。正向引物SeCHSA3_F 5′端的TCG和反向引物SeCHSA3_R 5′端的GAC为引入的保护碱基，为便于限制性内切酶NcoI和HindIII识别。

PCR反应体系为模板cDNA 1μl，正反向引物(浓度10μM)各1μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTP 4μl，rTaq 0.5μl，ddH₂O 17μl，PCR反应总体积为25μl。以上反应中的10×PCR buffer、dNTP、rTaq均为日本Takara公司产品；PCR反应循环数为94℃40s，58℃40s，72℃50s，35个循环，72℃延伸10min。得到SeA3片段635bp，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，如附图3所示，其中M3为Marker3(4500bp，3000bp，2000bp，1200bp，800bp，500bp，200bp)；1和2号泳道为PCR反应扩增SeA3片段目的带(位于635bp)，双泳道是作为重复，图3说明通过PCR得到了欲插入L4440载体的目的基因片段。将此片段割胶回收，用E.Z.N.A Gel ExtractionKit纯化，将纯化后的产物连接pMD 18-T vector(日本Takara公司产品)12小时，反应体系如Takara pMD 18-T vector试剂盒所示，然后转化大肠杆菌DH5α，使用抗生素Ampicillin筛选，挑取阳性克隆送交上海英俊生物技术公司测序。测序结果表明得到了目的基因片段SeA3。

第二步：L4440-SeA3重组表达载体的构建

质粒L4440含有两个T7双向启动子，由于T7启动子是RNA polymerase的强启动子，因此每个T7启动子均可以沿5′→3′合成单链RNA(single strand RNA，ssRNA)，则两个反向的T7启动子就可以形成两个反向互补的ssRNA，这两条互补的ssRNA结合就可以形成双链RNA(double strand RNA，dsRNA)。T7启动子分别位于20-38和240-222位置，19bp。其他标签和多克隆位点见附图1所示，有关空载体L4440更详细的信息可在互联网上查询到(具体网址为http://www.addgene.org/pgvec1？f＝c&identifier＝1654&cmd＝findpl)。

空载体L4440的基因序列如SEQ ID NO2(序列表附录3)所示，其结构示意图见附图1所示，其中，各主要特征部分分别为：T7promoter起始点20长度19，M13f20primer起始点267长度17，Amp promoter起始点925长度29，Ampicillin起始点995长度861，Orf1起始点995长度861，pBR322origin起始点2010长度620，LacZ a起始点260长度149，T7promoter起始点240长度19，f1 origin起始点426长度307。

将上述得到的目的基因片段SeA3和表达载体L4440用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切消化；然后将酶切后635bp的SeA3和2737bp的L4440片段用T4DNA连接酶连接24hr，连接体系为L4440片段3μl，SeA3片段14μl，Ligation buffer 2μl，T4DNA连接酶1μl(其中Liagation buffer和T4DNA连接酶为Promega公司产品)。将连接产物用CaCl₂法转入大肠杆菌DH5α，使用抗生素Ampicillin进行筛选。将挑选的阳性转化子在LB培养基(1％Tryptone，0.5％Yeast，1％NaCl，0.1mg/ml Ampicillin)中过夜培养，富集菌液，使用E.Z.N.APlasmid Extraction Kit纯化重组表达载体L4440-SeA3(以下简称LSA3)。

将重组表达载体LSA3和空载体L4440分别用HindIII单酶切，用ApalI进行双酶切(L4440上有两个ApalI酶切位点，酶切点分别位于1111和2357位点)，酶切时间均为12hr。HindIII单酶切体系为质粒LSA3或L4440 4μl，10×M buffer 1μl，HindIII 1μl，ddH₂O 4μl；ApalI双酶切体系为质粒LSA3或L4440 4μl，10×L buffer 1μl，ApalI 1μl，ddH₂O 4μl。L4440和LSA3用HindIII单酶切的片段大小分别是2790bp和3378bp，L4440用ApalI双酶切的片段大小分别是1544bp和1246bp，LSA3用ApalI双酶切的片段大小分别是2132bp和1246bp。以上HindIII和ApalI限制性内切酶均采用日本Takara公司产品。

用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物，如附图4所示，其中M3为Marker3(4500bp，3000bp，2000bp，1200bp，800bp，500bp，200bp)；1为L4440单酶切(HindIII)；2为L4440双酶切(ApalI)；3为L4440-SeA3单酶切(HindIII)；4为L4440-SeA3双酶切(ApalI)。实验结果表明得到了正确的重组表达载体L4440-SeA3，该重组表达载体L4440-SeA3结构示意图即质粒图谱见附图2。

第三步：SeA3dsRNA的表达

将构建好的含有SeCHS-A基因片段SeA3的重组表达载体LSA3从宿主菌DH5α中使用E.Z.N.A Plasmid Extraction Kit回收纯化，然后将纯化的载体LSA3采用CaCl₂法转化入受体菌HT115(DE3)感受态细胞，将含有重组表达载体LSA3的HT115(DE3)命名为htLSA3。因为HT115(DE3)具有Tetracycline抗性基因，且LSA3重组表达载体上具有Ampicillin抗性基因，所以选用Tetracycline和Ampicillin双抗生素进行筛选，37℃培养24hr。挑取htLSA3阳性克隆，在LB培养基(Ampicillin+Tetracycline)中摇菌12hr，37℃，250rmp。

将活化后的菌株htLSA3按1∶100的比例加入到100ml 2×YT培养基(1.6％Tryptone，1％Yeast Extract，0.5％NaCl，0.1mg/ml Ampicillin，12.5μg/ml Tetracycline)中，在37℃，250rpm中培养至OD₅₉₅＝0.4，加入无菌IPTG至终浓度为0.4mM进行诱导表达dsRNA，37℃，250rpm诱导4hr；取2ml离心收集菌体，用Trizol法提取菌体的总RNA(方法按Trizol试剂盒上说明书进行)，提取的总RNA溶解在10μl DEPC(焦碳酸二乙酯)水中，加入1μl 1mg/ml RNaseA去掉总RNA中的单链RNA。同时含有L4440空载体的HT115(DE3)和不含任何外源载体的HT115(DE3)以与上述诱导htLSA3相同的方法进行，总RNA提取方法及后续处理方法均相同。

将上述提取的各组处理后的RNA进行1％琼脂糖RNA电泳，如附图5所示，其中表达目的带如图5中箭头所示，2、3号泳道分别为L4440空载体和不含任何外源载体的HT115(DE3)所诱导。结果表明在htLSA3中诱导表达除了目的基因dsRNA，而在含空载体L4440的HT115(DE3)和不含外源载体的HT115(DE3)菌株没有表达，此结果表明htLSA3中已经表达出了SeA3dsRNA。

第四步：饲喂htLSA3对甜菜夜蛾SeCHS-A mRNA表达的影响

将按上述诱导表达好SeA3dsRNA的大肠杆菌htLSA3，在室温条件下12000g离心2min富集菌体，按照250∶1(250ml 2×YT培养基诱导表达后的菌体用1ml ddH₂O溶解)的比例添加ddH₂O溶解富集的菌体，充分混匀。

挑选大小一致的甜菜夜蛾三龄幼虫，将人工饲料切成大小均一的小块，把上述当日离心富集的htLSA3新鲜菌体添加到人工饲料上，每块饲料约添加菌液50μl。每组挑选35头三龄幼虫，单头饲养，25℃，每日光：暗为14∶8hr，相对湿度为75％；设置饲喂含L4440空载体的HT115(DE3)和添加ddH₂O的饲料为对照；每天定时更换饲料和菌液，饲喂72hr后分别取htLSA3组、L4440组、ddH₂O组幼虫各10头，提取总RNA，通过RT-PCR，用特异性引物SeCHSA3_F和SeCHSA3_R进行PCR对SeCHS-A mRNA的表达水平进行检测，实验方法与前面第一步相似。提取的每个RNA样品以甜菜夜蛾β-actin基因作为内参，正向引物Seβa_F和反向引物Seβa_R的具体序列如附录所示，扩增β-actin的目的是为了检验RNA提取的质量和电泳上样量的均一性。其中正向引物Seβa_F的具体序列为：5′-GGTTGGTATGGGTCAGAAGGA-3′，反向引物Seβa_R的具体序列为：5′-GCGGTGGTGGTGAAAGAGTA-3′。

用1％琼脂糖凝胶电泳对各组的PCR产物进行检测，结果如附图6所示。图6中，A表示检测的为SeCHS-A片段(3280-3871，592bp)，B为β-actin(477bp，GeneBank AY507963)检测；1、2、3：喂食表达SeA3dsRNA的大肠杆菌；4：喂食含有L4440空载体的大肠杆菌；5：饲料中含有ddH₂O的对照组。大肠杆菌为含有dsRNA的受体菌，饲料中含有去ddH₂O作用-因为含有重组载体L4440-SeA3和空载体L4440的菌饲喂时均用水稀释，在对照组饲料中添加去离子水是为了证明水是否对昆虫生长发育会产生影响，保证了实验的准确性。由图6可以看出，甜菜夜蛾取食表达SeA3dsRNA的大肠杆菌htLSA3后，SeCHS-A mRNA的表达受到了抑制，其中从1和2号泳道几乎看不到SeCHS-A mRNA的表达，3号泳道中SeCHS-A mRNA尚有少量表达，4和5号泳道的对照组中甜菜夜蛾SeCHS-A mRNA均正常表达；β-actin的检测表明各组提取的RNA质量稳定可靠。此实施例表明，通过喂食表达昆虫特定基因的dsRNA，可以有效的抑制昆虫靶基因mRNA表达。

实施例2：饲喂htLSA3对甜菜夜蛾生长发育的影响

采用实施例1前三步相同的步骤。SeA3dsRNA的诱导表达以及菌液的富集方法同实施例1第四步。以实施例1中的一致方法每日喂食甜菜夜蛾幼虫，采用的是甜菜夜蛾三龄幼虫。htLSA3处理组和L4440、ddH₂O对照组每组35头试虫，单头饲养，每日统计存活率，并观察记录表现型，直到化蛹时至。

饲喂表达SeA3dsRNA的大肠杆菌htLSA3后，甜菜夜蛾幼虫主要表现为在各龄期初不能正常完成蜕皮，皮蜕至身体的一半，如附图7所示，最终因无法完成蜕皮而死亡；在化蛹前表现为预蛹不能蜕皮形成正常蛹，常常是头部形成了蛹并且色素沉着，但胸腹部仍然为幼虫的样子，如附图8所示，最终无法形成正常蛹而死亡。能够正常完成蜕皮的幼虫和蛹分别如附图9和图10所示。结果如下列表1所示：

表1饲喂htLSA3饲料后对甜菜夜蛾的存活率的对比统计

由上表可以看出饲喂表达SeA3dsRNA的大肠杆菌htLSA3后，4龄到5龄处理组幼虫的死亡率明显高于L4440和ddH₂O对照组，但从预蛹到蛹期则无明显差别。

因此可以得出饲喂甜菜夜蛾表达SeA3dsRNA的大肠杆菌，不仅在降低了mRNA水平上SeCHS-A mRNA的表达，而且也对昆虫的生长发育造成了一定影响，可以使昆虫幼虫畸形并增加其死亡的几率。根据实验结果，可推导出进入昆虫体内的SeA3dsRNA降低了靶基因SeCHS-AmRNA的表达，进一步使昆虫体内合成几丁质合成酶SeCHS-A的途径受阻，产生的酶量减少，更进一步使昆虫体内的几丁质含量减少特别是表皮的几丁质含量较少，从而虫体由于缺少几丁质而使新表皮无法正常合成，表现为旧表皮不能完全蜕下而最终使虫子死亡。此发明也揭示了dsRNA有可能作为一种潜在的控制害虫生长发育的新途径。

实施例3：饲喂htLSA3对斜纹夜蛾Spodoptera litura生长发育的影响

采用实施例1前三步相同的步骤。SeA3dsRNA的诱导表达以及菌液的富集方法同实施例1第四步。以实施例1中的一致方法每日喂食斜纹夜蛾幼虫，采用的是斜纹夜蛾三龄幼虫。同样设置htLSA3处理组和L4440、ddH₂O对照组每组35头试虫，单头饲养，每日统计存活率，并观察记录表现型，直到化蛹时至。

饲喂表达SeA3dsRNA的大肠杆菌htLSA3后，斜纹夜蛾幼虫主要表现为在各龄期初也不能正常完成蜕皮，皮蜕至身体的小部分或一半左右，最后也因无法完成蜕皮而死亡；在化蛹前也表现为预蛹不能蜕皮形成正常蛹，常常是头部形成了蛹但胸腹部仍然为幼虫的样子，最终无法形成正常蛹而死亡。结果如下列表2所示：

表2饲喂htLSA3后对斜纹夜蛾的存活率对比统计

由上表可以看出饲喂表达SeA3dsRNA的大肠杆菌htLSA3后，4龄到5龄htLSA3处理组幼虫的死亡率明显高于含L4440和ddH₂O饲料的对照组。

总之，本方法所包含的昆虫包括但不仅包含甜菜夜蛾Spodoptera exigua，也可以是斜纹夜蛾Spodoptera litura、棉铃虫Helicoverpa armigera、褐飞虱Nilaparvata lugens等其他所有可以用人工饲料在实验室人工饲养的昆虫；应用本法法研究的基因包括但不仅包含几丁质合成酶基因SeCHS-A，也可以是蜕皮激素受体基因、转录因子、组织蛋白酶基因等。

序列表

附录1：本发明所涉及的引物及核苷酸序列

扩增SeA3片段的引物：

SeCHSA3_F：5′-TCGCCATGGTTGTATTCTTCTTCGCCTTG-3′

SeCHSA3_R：5′-GACAAGCTTGTCGCCTATGGTGGTTTCGT-3′

扩增β-actin片段的引物：

Seβa_F：5′-GGTTGGTATGGGTCAGAAGGA-3′

Seβa_R：5′-GCGGTGGTGGTGAAAGAGTA-3′

附录2：SeCHS-AmRNA的部分核苷酸序列SeA3

SEQ ID NO1(SeA3)：

<110>中山大学

<120>饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法

<160>2

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>635

<212>cDNA

<213>甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)

<400>1

ttgtattctt cttcgccttg atcctggtga tacagttctc cgccatgttg ttccatagat     60

ttggaaccct ttcacacata ttagcgtcga cagaactgaa ctggttctgt tctaagaagt    120

ccgacgactt gtctcaagac gcactattag ataagaatgc aatagcaata gtaaaagacc    180

tgcagaaatt gaatggtctg gacgacgatt atgacaatga ctcgggctcg ggtcctcata    240

acgtcggcag aagaaagact attcacaatt tggagaaggc gagacagaag aagaggaata    300

taggcacact ggatgtggcc ttcaagaaga gattcttcaa tatgaacgcc aacgatggac    360

caggtacacc agttctaaat cgtaagatga cgttgagaag ggaaacgcta aaggctttag    420

agacgagaag gaattcagtg atggcggaaa gaagaaaatc ccagatgcaa acacttggtg    480

ccaataatga atatggagtg acaggaatgc tcaataataa cttaggtgtc gggccgcggc    540

acaggacatc taatgccaac atatcagtga aagatgtttt cggcgagcca aacggaggtc    600

aagtcaaccg aggctacgaa accaccatag gcgac                               635

附录3：L4440载体DNA核苷酸序列

SEQ ID NO2：

<210>2

<211>2790

<212>DNA

<213>未知

<400>2

aacctggctt atcgaaatta atacgactca ctatagggag accggcagat ctgatatcat     60

cgatgaattc gagctccacc gcggtggcgg ccgctctaga actagtggat ccaccggttc    120

catggctagc cacgtgacgc gtggatcccc cgggctgcag gaattcgata tcaagcttat    180

cgataccgtc gacctcgagg gggggcccgg tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt    240

acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc    300

aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc    360

gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgggac gcgccctgta    420

gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca    480

gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct    540

ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc    600

acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat    660

agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc    720

aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc    780

cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta    840

acaaaatatt aacgcttaca atttaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc    900

tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg    960

ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc   1020

ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt   1080

gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct   1140

caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac   1200

ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact   1260

cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa   1320

gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga   1380

taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt   1440

tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga   1500

agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg   1560

caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat   1620

ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat   1680

tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc   1740

agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga   1800

tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc   1860

agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag   1920

gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc   1980

gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt   2040

tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt   2100

gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat   2160

accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc   2220

accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa   2280

gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg   2340

ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag   2400

atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag   2460

gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa   2520

cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt   2580

gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg   2640

gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc   2700

tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac   2760

cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc                                    2790

Claims (8)

1、一种饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，通过dsRNA触发的基因沉默来抑制特定基因mRNA在昆虫的发育过程中的表达，其特征在于：主要包括以下步骤：

(1)选定特定功能的dsRNA片段：该特定功能的基因为昆虫几丁质合成酶基因SeCHS-A，选定特定功能的dsRNA片段为SeCHS-A基因上一段特异性的基因片段SeA3，该基因片段SeA3的基因序列为如附录SEQ ID NO1所示；

(2)取昆虫总RNA，通过RT-PCR得到cDNA；

(3)通过PCR技术扩增出目的基因片断SeA3：根据选用昆虫几丁质合成酶基因SeCHS-A，设计一对基因特异引物——SeCHSA3_F和SeCHSA3_R，以上一步得到的cDNA作为模板，通过PCR技术扩增出目的基因片段SeA3片段，其中，正向引物SeCHSA3_F的基因序列为5′-TCGCCATGGTTGTATTCTTCTTCGCCTTG-3′，反向引物SeCHSA3_R的基因序列为5′-GACAAGCTTGTCGCCTATGGTGGTTTCGT-3′；

(4)构建含有选定的dsRNA片段的重组表达载体：选用载体L4440为构建重组表达载体的空载体，将此基因片段SeA3用T4 DNA连接酶插入载体L4440中，构建重组表达载体L4440-SeA3，转化入宿主菌——大肠杆菌DH5α中；

(5)重组表达载体向受体菌的转化：再将重组表达载体L4440-SeA3转化入dsRNA表达受体菌——大肠杆菌HT115(DE3)中；

(6)通过基因诱导使受体菌重组表达载体L4440-SeA3的表达选定的dsRNA片段：在一定的温度、转速和时间下诱导转化入受体菌HT115(DE3)中的重组表达载体L4440-SeA3表达相应昆虫基因片段的dsRNA；

(7)对表达了dsRNA的受体菌进行纯化、富集：将前一步获得的已经表达了dsRNA的受体菌即大肠杆菌HT115(DE3)进行纯化、富集；

(8)将富集的表达了dsRNA的受体菌加入饲料并喂养昆虫幼虫：将富集表达了dsRNA的大肠杆菌HT115(DE3)用适当的无菌水稀释，按照一定的比例均匀加入昆虫人工饲料中，饲喂适当龄期的昆虫幼虫，饲料每天更换；

(9)采用RT-PCR检测昆虫幼虫的SeCHS-A基因的表达：饲喂特定的时间后，取昆虫幼虫做RT-PCR检测，检测其SeCHS-A基因的表达情况；并持续饲养为取材检测的幼虫，记录幼虫经RNAi后的表现型；

(10)检测昆虫幼虫的SeCHS-A基因的表达情况。

2、根据权利要求1所述饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，其特征是：所述的dsRNA在大肠杆菌细胞内表达，所述昆虫为用人工饲料在实验室内饲养的鳞翅目昆虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫或斜纹夜蛾Spodoptera litura。

3、根据权利要求1所述饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，其特征是：所述的表达dsRNA的载体L4440含有两个反向的T7启动子。

4、根据权利要求1所述饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，其特征是：所述表达的dsRNA的片段大小为200bp到1000bp之间的任一碱基数目。

5、根据权利要求1所述饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，其特征是：其中基因诱导的所述温度为25℃-40℃之间任一温度，所述转速为150rpm-300rpm之间任一转速，所述时间为2小时-24小时之间任一时间长度。

6、根据权利要求1所述饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，其特征是：所述饲喂昆虫幼虫的适当龄期为幼虫发育一龄到五龄之间的任一龄期。

7、根据权利要求1所述饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，其特征是：所述饲喂特定的时间为连续饲喂幼虫后1～15天的任一时间。

8、根据权利要求1所述饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法，其特征是：所述饲喂昆虫幼虫的方法是直接自然喂养。

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