CN110951763B

CN110951763B - 一种马铃薯y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用

Info

Publication number: CN110951763B
Application number: CN201911166008.4A
Authority: CN
Inventors: 庹德财; 沈文涛; 周鹏; 言普; 赵光远; 黎小瑛
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110951763A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种以番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)为病毒载体的马铃薯Y病毒属病毒基因沉默系统。该系统是将目的基因插入到番木瓜畸形花叶病毒PLDMV的NIb与外壳蛋白CP之间，并在目的基因与CP之间引入NIa‑Pro酶切位点。利用Gibson拼接或In‑Fusion克隆等体外拼接方法将目的基因片段无缝克隆插入到NIb与CP之间构建成含有植物目的基因的重组病毒沉默载体。该重组病毒沉默载体通过农杆菌注射接种植物，诱导沉默植物的目的基因后观察植物的表型变化。本发明为利用PLDMV沉默载体进行番木瓜的基因功能研究提供了强有力的工具，具有重大的科学意义和应用前景。

Description

一种马铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，主要涉及一种马铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)最早用于描述植物受病毒感染后的病症恢复现象(van Kammen,1997)。由于植物体内中存在一种抵御外源核酸入侵的防御系统，正常情况下保护植物免受病毒的侵染，但植物的这种防御机制可被病毒RNA激活，属于转录后基因沉默现象。近年来，VIGS已特指通过携带一段寄主植物目的基因cDNA片段的重组病毒来引发植物内源基因沉默的反向遗传学技术(Burch-Smith etal.,2004)。VIGS系统通过在病毒载体中插入目的基因片段，当携带目的基因的病毒载体侵染寄主植物后，会完全沉默寄主植物的目的基因或出现表达水平下降，使其目标基因功能丧失或异常，导致相应表型或生理指标发生变化，从而实现对该基因功能的快速鉴定(Senthil-Kumar&Mysore,2011)。与传统遗传转化的方法相比，VIGS技术是一种免去大规模突变体筛选，不依赖于成熟的遗传转化体系，能够在当代完成目的基因功能验证，具有操作简单、快速、低成本、高通量等优点，因而成为功能基因组学研究领域最具吸引力的技术手段之一(Becker&Lange,2010)。目前，VIGS沉默系统不仅在拟南芥、本生烟等模式植物上成功应用，在水稻、玉米、小麦、番茄、苹果、葡萄、柑橘等作物上的应用也有报道，但在番木瓜上还未见可用的VIGS载体相关报道。随着研究的深入和技术的不断发展，VIGS已广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等相关基因的功能鉴定，在植物性状改良及植物保护等方面也展现出良好的应用前景。

到目前为止，已经有RNA病毒，DNA病毒以及一些病毒卫星分子被成功改造成VIGS载体。RNA病毒是最早建立VIGS体系采用的病毒，也是目前应用最多的VIGS载体病毒种类。1995年，Kumagai等基于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒的代表种—烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)完成了首个VIGS载体的构建。1998年，Ruiz等构建了马铃薯X病毒属(Potexvirus)病毒的代表种—马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)的VIGS载体。随后，基于烟草脆裂病毒属(Tobravirus)病毒的代表种—烟草脆裂病毒(Tobacco rattlevirus,TRV)的VIGS载体构建成功(Ratcliff et al.,2001)，因其具有病症弱、沉默效率高、持续时间长及能够侵染分生组织等优点，在模式植物本生烟、拟南芥以及马铃薯、番茄、棉花、辣椒、矮牵牛等多种植物上得到应用，是目前应用最为广泛的VIGS载体(Huang et al.,2012)。但每个VIGS载体受病毒寄主范围限制，对于不同的植物通常需要构建不同的病毒VIGS载体。马铃薯Y病毒属(Potyvirus)包含175种病毒，是植物RNA病毒中最大的一个属，也是在全球范围内给农业生产造成经济损失和危害最为严重的一个属，但马铃薯Y病属病毒用于VIGS载体改造的研究尚无报道。因此，利用马铃薯Y病属病毒开发其VIGS沉默系统将对植物功能基因组研究具有重要意义。

番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的病毒，近年来已成为一种新的威胁我国番木瓜种植业的主要病毒病害。因此，利用PLDMV构建其VIGS沉默系统为番木瓜的基因功能研究提供了强有力的工具。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种马铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用，本发明构建的VIGS载体效果显著，沉默作用明显。

本发明提供了马铃薯Y病毒属病毒在诱导基因沉默中的应用。

在本发明中，所述马铃薯Y病毒属病毒为PLDMV。

基因沉默在生物中普遍存在，其作用表现在抵御病毒、转座子等外来核酸的入侵，识别并抑制外源基因表达，维持生物基因组稳定性等。VIGS作为基因沉默的特殊形式，是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒或携带cDNA的病毒载体侵染植物后，在复制与表达过程中通常会形成双链RNA(Double stranded RNA，dsRNA)形式的中间体。dsRNA作为基因沉默关键激发子，首先在细胞中被类似RNaseⅢ家族特异性核酸内切酶Dicer类似物(如DCL4)切割成21～24nt的小分子干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)。siRNAs在植物细胞内被依赖RNA的RNA聚合酶1(RNA-dependent RNApolymerase 1，RDR1)、RDR2或RDR6进一步扩增，并以单链形式与Agronaute1(AGO1)蛋白等结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC特异地与细胞质中的同源RNA互作，导致同源RNA降解，从而发生转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional gene silencing，PTGS)；RISC特异地与细胞核内同源DNA相互作用导致其被甲基化等修饰，从而发生转录水平的基因沉默(Transcriptional gene silencing，TGS)。

本发明中，所述基因沉默的目标生物为番木瓜。

利用PLDMV病毒侵染番木瓜的特性，构建的这种针对番木瓜基因的沉默载体能够有效沉默番木瓜的基因。对于其他PLDMV易感的植物，本发明所述的沉默载体也能够实现良好的沉默作用。

本发明还提供了一种基因沉默载体，其以pGreenII-35S为骨架，含有PLDMV基因组全长cDNA和基因沉默片段。

本发明中所述基因沉默片段位于PLDMV基因组的NIb编码区和CP编码区之间(图2)。

本发明中，所述基因沉默片段为在目的基因中添加、缺失或替换一个或多个核苷酸，且能够导致目的基因沉默的核酸片段。

所述基因沉默载体的构建方法，其包括：PCR扩增基因沉默片段，插入至构建的pGreenII-35S-PLDMV载体中。

本发明中，所述目的基因为CaPDS基因，所述基因沉默片段的为如SEQ ID NO:1所示的野生型CaPDS基因序列中的4～105bp、4～303bp、4～504bp、4～600bp、601～1200bp或1201～1749bp。该基因片段为野生型番木瓜八氢番茄红素脱氢酶基因(CaPDS)的部分片段，以该基因片段连接入沉默载体中，能够有效沉默目标物的PDS基因。相对于其它截短的PDS基因序列，插入102bp的沉默载体pG35S-PLDMV-CaPDS102的沉默效果稍弱，而插入其他长度和位置的CaPDS基因序列的沉默载体的沉默效果差异不明显，皆显示较高的沉默效率。这说明本发明提供的载体和方法具有良好的沉默效果。

本发明还提供了CaPDS基因沉默载体，其以pGreenII-35S为骨架，含有PLDMV基因组全长cDNA和所述的CaPDS基因片段；所述PDS基因片段位于PLDMV基因组的NIb编码区和CP编码区之间(图2)。

本发明还提供了携带本发明所述基因沉默载体的宿主。

所述宿主为农杆菌，具体的，本发明提供了携带所述基因沉默载体的农杆菌。

所述基因为CaPDS，则携带所述基因沉默载体(CaPDS基因沉默载体)的农杆菌的构建方法：

以质粒pGreenII-35S-PLDMV为模板，分别用引物对pldmv4991F/pldmv9068R、pldmv9045F/pldmv5020R扩增，获得片段I和片段II；

以质粒pMD-CaPDS为模板，以引物对pld-CaPDSF/pld-CaPDSR进行扩增，获得片段III。

将片段I、II和III在体外完成Gibson拼接，将拼接产物直接电击转化农杆菌感受态细胞，获得所述含重组病毒沉默载体的农杆菌。

本发明中，携带沉默载体的农杆菌为根癌农杆菌。

具体的，所述根瘤农杆菌为农杆菌GV3101(pSoup)。

所述基因沉默载体或所述的宿主在沉默番木瓜基因中的应用。

本发明还提供了一种诱导植物基因沉默的方法，其以本发明所述的农杆菌侵染植株。本发明中，所述植株为番木瓜。

所述侵染的农杆菌以接种缓冲液重悬，所述接种缓冲液含有：10mM MgCl₂,10mMMES pH 5.6,150μM acetosyringone。

所述重悬至OD值为0.6，然后室温黑暗静置3h。

所述番木瓜植株的高度为20～30cm，浸染的部位是第三、四片叶片的下表皮。

所述侵染后，番木瓜植株放置于25℃、16/8h昼夜、80％相对湿度培养。

在本发明中，所述方法为番木瓜的PDS基因沉默方法，其以所述的CaPDS基因沉默载体的农杆菌侵染番木瓜植株。侵染后30天，番木瓜新生嫩叶(非接种叶片)出现光漂白现象。该现象证明CaPDS基因被沉默。

本发明提供了CaPDS基因的片段，并提供了CaPDS基因的沉默载体，其有益效果至少包括：

1.本发明在实现了番木瓜CaPDS基因沉默体系的构建，获得了具有植物PDS基因沉默的沉默体系。

2.本发明使用特异引物来扩增植物CaPDS基因，并利用番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)成功构建PDS基因沉默载体。

3.通过转化农杆菌对植株进行侵染，20-30日后RNA进行检测发现，利用番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)构建的沉默体系成功侵染植株。

4.本发明构建的沉默载体侵染植株30天后，植株便开始出现了漂白症状，白化现象沿叶脉向四周蔓延，植株的CaPDS基因表达水平下降，叶绿素被漂白。可见其效果显著，沉默作用明显。

本发明不仅丰富了VIGS载体的种类，而且为开展番木瓜的功能基因组研究提供有效的技术手段。

附图说明：

图1示番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)的基因组结构和PLDMV的侵染性克隆(pG35S-PLDMV)及沉默番木瓜PDS基因(CaPDS)的沉默载体(pG35S-PLDMV-CaPDS)的构建示意图；

图2是本发明实施例1所构建的pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体结构示意图(全长序列如SEQ ID NO:12所示)；

图3是本发明实施例1对构建的沉默载体pG35S-PLDMV-CaPDS阳性克隆进行PCR产物测序鉴定时的大片段扩增示意图；

图4是本发明实施例1将沉默载体侵染番木瓜植株后出现的表型形状，其中A为健康植株对照；B为接种pG35S-PLDMV的对照组，出现叶片畸形、皱缩、花叶症状；C为接种pG35S-PLDMV-CaPDS的实验组，顶端叶片出现白化症状；

图5是本发明实施例1对照植株(pG35S-PLDMV)与沉默CaPDS基因的番木瓜植株(pG35S-PLDMV-CaPDS)在侵染第30天后的CaPDS相对表达量qRT-PCR检测结果图；

图6示本发明实施例2构建不同番木瓜CaPDS基因片段长度和位置的沉默载体示意图及侵染番木瓜植株后的沉默效果图，其中A为构建不同番木瓜CaPDS基因片段长度和位置的沉默载体示意图；B为接种pG35S-PLDMV的对照组(WT)和接种5种不同CaPDS沉默载体(pG35S-PLDMV-CaPDS102、CaPDS300、CaPDS597、CaPDS600、CaPDS549)的番木瓜植株沉默效果图，顶端叶片出现不同程度的白化；

图7示本发明实施例对照植株(pG35S-PLDMV-WT)与5种沉默不同CaPDS基因片段的番木瓜植株(pG35S-PLDMV-CaPDS102、CaPDS300、CaPDS597、CaPDS600、CaPDS549)在侵染第30天后的CaPDS相对表达量的qRT-PCR检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种马铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：下面结合实例对本发明作进一步阐述，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未特别指明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。实施例未详述的方案和配方，请参见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社。

实施例1：沉默番木瓜PDS基因(CaPDS)的番木瓜畸形花叶病毒诱导的基因沉默载体(pG35S-PLDMV-CaPDS)的构建和应用方法

实验试剂:引物由Invitrogen公司合成；高速高保真DNA聚合酶(PrimerSTAR MaxDNA Polymerase)及反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time))荧光定量RT-PCR试剂盒(TB Green Premix DimerEraser(PerfectReal Time))购自Takara公司；TRIZOL Reagent购自Invitrogen；2×Rapid Taq MasterMix和胶回收试剂盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit)购自南京诺唯赞生物科技有限公司，Gibson Assembly Master Mix购自NEB公司，农杆菌菌株GV3101(pSoup)感受态细胞由本实验室自制保存，其余所需试剂均可通过商业途径购买得到。

本发明构建pG35S-PLDMV-CaPDS基因沉默载体及应用，包括以下步骤：

(1)引物设计：本发明中PLDMV诱导的基因沉默载体的构建策略是采用Gibson拼接或In-Fusion克隆等体外连接的无缝克隆方法，分为具有15-20bp重叠区的病毒基因组、载体及沉默靶基因片段等多个DNA片段设计PCR扩增引物。本实施例基于本实验室前期构建获得的PLDMV全长cDNA侵染性克隆质粒pG35S-PLDMV(见Tuo D.C.,Fu L.L.,Shen W.T.,etal.,Generation of stable infectious clones of plant viruses by usingRhizobium radiobacter for both cloning and inoculation.Virology,2017,510:99-103.)和前期克隆的番木瓜八氢番茄红素脱氢酶基因(Carica papaya phytoenedesaturase,CaPDS)质粒pMD-CaPDS利用Vector NTI软件设计引物，引物具体序列见引物表；

表1：用于pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体构建及鉴定的引物

(2)pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体构建的片段扩增：以质粒pG35S-PLDMV为模板，分别用引物对pldmv4991F/pldmv9068R、pldmv9045F/pldmv5020R，采用高速高保真的PrimeSTAR Max DNAPolymerase进行扩增，经普通琼脂糖凝胶电泳检测和胶回收，获得大小分别为4078bp和9361bp的PCR产物回收片段I和II；以质粒pMD-CaPDS为模板，采用高速高保真的PrimeSTAR Max DNA Polymerase以引物对pld-CaPDSF/pld-CaPDSR进行扩增，经普通琼脂糖凝胶电泳检测和胶回收，获得大小为551bp的PCR产物回收片段III(含有野生型CaPDS片段的4～504bp和引物接头片段)。

(3)pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体的构建与阳性克隆筛选鉴定：将PCR产物回收片段I、II和III在体外完成Gibson拼接反应，取5-10μl连接产物直接电击转化农杆菌GV3101(pSoup)感受态细胞，涂布于含卡那霉素和利福平抗性的LB平板，放置于28℃条件下培养2-3天，挑取单克隆至2ml离心管用200μl含卡那霉素和利福平抗性的LB液体培养基摇菌3-5h，然后用2×Rapid Taq Master Mix和引物对pld-CaPDSF/pld-CaPDSR进行菌液PCR检测，对菌液PCR检测为阳性的克隆用50ml离心管扩大培养，用5ml含卡那霉素和利福平抗性的LB液体培养基过夜摇菌后抽提质粒，以抽提得到的质粒为模板用高速高保真酶PrimeSTAR MaxDNA Polymerase分别用引物对pGreen35S-F/pldmv5614R和pldmv5441F/pGreen35S-R将病毒基因组分为两个重叠的大片段F5和F3进行PCR扩增鉴定(图3)，PCR产物F5和F3经普通琼脂糖凝胶电泳检测和胶回收后进行测序鉴定。

(4)pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体农杆菌注射接种番木瓜植株：将测序鉴定正确的农杆菌阳性克隆pG35S-PLDMV-CaPDS和本实验室前期构建保存的不含外源插入基因的PLDMV全长cDNA侵染性克隆pG35S-PLDMV(对照组)分别接种到2ml含50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平的LB液体培养基中，置于28℃摇床上，220rpm/min振荡培养过夜12-16h；然后将菌液分别按1:100稀释转接到新的10ml含10mM MES，20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)，50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平的LB液体培养基中，置于28℃摇床上，220rpm/min振荡培养至OD₆₀₀约为1.0；然后室温下6000g，离心15min，去上清，收集各菌体。然后用注射接种缓冲液(10mM MgCl₂,10mM MES pH 5.6,150μM acetosyringone)重悬菌体，并调其OD₆₀₀为0.6左右，室温黑暗静置3h后注射接种番木瓜植株；使用去针头的1ml注射器，注射接种20-30cm长势一致的番木瓜苗的第三、四片叶(叶片长约1cm为第一片叶)的下表皮，然后将接种后的番木瓜植株放置于25℃、16h/8h昼夜周期、80％相对湿度的植物光照培养箱中生长；定期观察和记录各植株的生长情况和表型变化。

(5)pG35S-PLDMV-CaPDS沉默载体接种番木瓜后的表型观察：接种30天后，注射接种pG35S-PLDMV-CaPDS的番木瓜新生嫩叶(非接种叶片)出现光漂白现象；而注射接种pG35S-PLDMV的对照组番木瓜新生嫩叶仅有明显的病症出现，未见光漂白现象(图4)。

(6)qRT-PCR对CaPDS基因沉默效果分析：接种30天后，分别收取上述表型叶片，通过qRT-PCR检测沉默CaPDS的番木瓜植株(pG35S-PLDMV-CaPDS)和对照植株(pG35S-PLDMV)体内的CaPDS基因的mRNA表达水平。具体qRT-PCR检测方法如下：

a、Trizol法分别提取沉默CaPDS的番木瓜植株(pG35S-PLDMV-CaPDS)和对照植株(pG35S-PLDMV)的叶片总RNA；

b、分别取1μg提取的总RNA用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行反转录反应合成cDNA；

c、以获得的cDNA为模板，用引物CapdsF/CapdsR采用TB Green PremixDimerEraser(Perfect Real Time)试剂盒进行Real Time PCR反应，具体反应体系和反应条件参照试剂盒说明书，同时以番木瓜的actin基因为内参基因，内参基因引物为actinF/actinR。

qRT-PCR检测结果如图5所示：与对照植株(pG35S-PLDMV)相比，沉默CaPDS的番木瓜植株(pG35S-PLDMV-CaPDS)体内的PDS表达量均下调了83％左右。上述结果表明，PLDMV介导的VIGS载体成功沉默了番木瓜的CaPDS基因，可用于番木瓜基因的沉默。

实施例2不同番木瓜CaPDS基因片段长度和区域的沉默效果

采用与实施例1相同的方法，在pG35S-PLDMV载体中的相应位置分别插入来自番木瓜CaPDS基因的不同长度和区域的片段(图6)，插入的片段分别为CaPDS基因的4～105bp、4～303bp、4～600bp、601～1200bp、1201～1749bp，构建获得的沉默载体依次为pG35S-PLDMV-CaPDS102、pG35S-PLDMV-CaPDS300、pG35S-PLDMV-CaPDS597、pG35S-PLDMV-CaPDS600、pG35S-PLDMV-CaPDS549。结果表明，以PLDMV病毒作为基因沉默载体，不论插入的片段长短或区域怎样选择，都能够取得良好的沉默效果，顶端叶片均出现不同程度的白化。对以携带不同载体的农杆菌侵染后的番木瓜植株中的CaPDS相对表达量进行检测，结果如图7，相对于野生型番木瓜，CaPDS基因的表达显著降低。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种马铃薯Y病毒属病毒诱导的基因沉默系统及其应用

<130> MP1912907

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1752

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactttat gcgggagtgt ttctgcggcg agcttcggct gccaaagcaa cagaatagct 60

attggaaact ttcattctgc cgcctcgaaa tgtggttatc gagacactct ggatcaaaac 120

aacatactag catttagggt tagtgaatcc attggagacg gcctgagaat tcccgaagca 180

cgagctgtta agattaggtc caggaacggt gcccgccctt cgcaggtagt ttgtgtagat 240

tacccgagac cagagcttga taatacttta aatttcttgg aagcagcgca cttgtcttca 300

tcctttcgga cttctccccg tccatcgaga ccattgaaga tcgtaattgc tggcgcaggt 360

ttggctggtt tatcgactgc aaaatatttg gcagatgcag gtcacaagcc tttgttgctg 420

gaagcaagag atgttctagg tggaaaggtg gctgcatgga aagatgatga tggagactgg 480

tatgagacag gcttacatat attctttggg gcctatccaa atatgcagaa cttgtttgga 540

gaacttggta tcaatgatcg gttgcagtgg aaggagcact caatgatgtt tgcaatgcca 600

aacaagcctg gggaattcag ccgatttgac ttccttgaag aattgccggc acctttaaac 660

ggaatttggg caattttaaa aaataatgaa atgctgactt ggcctgagaa agtgaagttt 720

gcgattgggc ttctgcctgc aatggtcggt ggacaggagt atgttgaggc tcaagatggt 780

ttaagtgttc aaaagtggat gagaaagcag ggcatacctg accgggtgac taatgaggtg 840

tttgtcgcta tgtcaaaggc actaaacttc attaacccag atgaactgtc aatgcaatgt 900

atactgattg ctttgaaccg atttcttcag gagaagcatg gttctaagat ggcattctta 960

gatggtaacc ctccagaaag actctgtatg ccaattgttg atcatatcct gtcactaggt 1020

ggtgaagtga aacttaattc tcggatacag acaattgagc tcaacaatga tggaactgtg 1080

aagagcttta tactaaatag tggggatgtg attgaaggag atgcttatgt atttgccact 1140

ccagttgata tcttgaagct tcttctgcct gaaagctgga aagagatcct atacttcaag 1200

agattggaga aattagttgg cgtccctgtt attaatgttc acatatggtt tgacaggaaa 1260

ctaaagaaca catatgacca cctactcttc agcagaagtc ccctcctgag tgtatatgct 1320

gatatgtctg taacatgtaa ggaatattac aacccaaatc aatccatgct ggagttagtt 1380

tttgcccctg ctgaagaatg gatttcacgc agtgattcag aaattattgg tgctacaatg 1440

aaggaacttg cgaaactttt tcctgatgaa attgcagcgg accaaggcaa agcaaaaata 1500

ttgaaatacc atgttgttaa aataccaagg tctgtctaca aaactgtccc aggttgtgaa 1560

ccttgccgcc cggtacagag atcttctata gagggttttt acttagctgg tgattatact 1620

aaacaaaagt atttggcttc aatggaagga gctgttctct cagggaagct ttgtgcacag 1680

gctattgtac aggattatga gtttcttatt gcttcagcgc aaagaaggct ggcacaggca 1740

agcattcatt ga 1752

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaagatgtt tctcaccagt ccgctacttt atgcgggagt gtttctgcg 49

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagcggactg gtgagaaaca tcttcgaata tatgtaagcc tgtctcatac cag 53

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caccatgaaa attggttcga ccgatat 27

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actatatcgg tcgaaccaat tttcatgg 28

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaagatgttt ctcaccagtc cgctc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcggactgg tgagaaacat cttca 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgttccaacc acgtcttcaa agca 24

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgctcaacac atgagcgaaa ccctat 26

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atatcatgat ggcagcatgc ac 22

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcttcacgcg gtaaatcaag atgaat 26

<210> 12

<211> 13910

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agcccgctcg acggcgggct gttggatggg gatcgcctga atcgccccat catccagcca 60

gaaagtgagg gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt 120

gaacttttgc tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt 180

caactcagca aaagttcgat ttattcaaca aagccacgtt gtgtctcaaa atctctgatg 240

ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa 300

cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct caaggccgcg 360

attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg 420

gcaatcaggt gcgacaatct accgattgta tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct 480

gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg 540

gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc 600

atggttactc accactgcga tcccagggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc 660

tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat 720

tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc 780

acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc 840

tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa acttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt 900

cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg 960

tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa 1020

ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga 1080

taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt tctaatcact 1140

agaccaatgt tacacatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag 1200

gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc 1260

gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt 1320

tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt 1380

gccggatcaa gagctaccaa ctcttcttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat 1440

accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc 1500

accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa 1560

gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg 1620

ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag 1680

atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag 1740

gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa 1800

cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt 1860

gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg 1920

gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgagatct caaacaaaca catacagcga 1980

cttagtttac ccgccaatat atcctgtcaa ggatcgtacc cctactccaa aaatgtcaaa 2040

gatacagtct cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt aatttcggga 2100

aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag 2160

gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcat tcaagatgcc 2220

tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 2280

gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg acatctccac tgacgtaagg 2340

gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt 2400

catttggaga ggaaaaatat aaaaactcaa caaaacttat gcaaaacaat ttcaatacat 2460

acactaaact cctgaattgt gcaattcaaa tctttgcatt aactcaatat tttcagcttt 2520

tgaaacaaac aacgcttaca gacaacatgt cgatcgttat tggtgatttt tctattccac 2580

tcacctgcag aactgagcag attgaatgtg ttcgtcttgt tcctggaaca agagttgaag 2640

aagtgaagac cattaaaaag gtcttaaaaa cacactacca agaagtaact cttggttgta 2700

ctgatagatg cgcgggcctg agcgcataca caaaaacctc ccttaagaga gcaattaagg 2760

aaaaggattt aactgcatct ggcagctgta tctactgtgg gcttagagca caaattggag 2820

agggtaggaa aagggtagaa ttagtaccca tttcagtcat ggaggatgtt gaaactgtgg 2880

aacaagtact tgttccatgt atggtagagg agaaatatta taaggaagtt tcgaatttcc 2940

ataaggctac gctcatcgac agaccaaagc taactatagc cccagtttta atggcacgac 3000

ctgcccaagt gccgaaacct gctgttttta atggaatacg aaaagttcat gaggagatgg 3060

agtcccaaac ctctgaaaac aaggtcttag aagaggaaac tcaatgcgtt ggtgatgcag 3120

cgcttcgcca cttagatgaa gtttatgagt gtagaaaacg agcgcaggta ggcattgacc 3180

gcatacaagc cagacatgca aggcatagaa ctgaggctag acagcaggtt aacgaggagc 3240

aatcggaagc actagcagcg ttcgaatcct tctttaatca aactcacaga gaggatagat 3300

atgaagggaa aatcttaacc attcgaaatg ggatcacagg ctggtttgaa ccaaataggc 3360

gtgatattaa gaacgcagct aggcgaagaa agagagccag caagaaagcc ttgtctgttg 3420

cgcgtgaaaa tgacgtcatg cggatcgaaa ctcataaaac taacgtcaaa gagggaataa 3480

aagatgtgga ggaagtaact gacacgtcta catttaagaa gcagcacaat gagagaaaga 3540

gagtgctgag agaaaatgtg cctcttggaa tggtgcgcat taatgaactt gtccgatgtg 3600

ttacaaaatt atgccgaaaa gactcaaagg agcttgagtt tatcggaaag agaggaagtc 3660

ttcaagttca atgtactaaa aattgtggtt cacgagtgat actaagacac ttgcgtgggg 3720

aacttagaag aaaagattgt tattgggatc gtgtcattga gaatttcttc gaaattgcag 3780

ctgcaaagct ccagaataag aatctcaata acaatgaatc tgtgaggaga gggcacagtg 3840

gacatatcat tcaatacgat aagttcaaag gtttaagcgg acggcatttt ggaagttaca 3900

tcattgttag gggtgatatg gatggcagaa tcattgacgc tcgttcaaag atcacacaca 3960

acgttatgat caatatgacc cactacagtg atgcaggttt aagtttttgg aaaggtttcg 4020

accgtcaatt tattgacact cgagaaaaac ctaagaacgc ccatgagtgc aaagccacta 4080

taaatgttga ggagtgtggc gaaatggcag ccattgtaaa ccaactccta tttccaatgt 4140

ggaaaataac atgcactcaa tgtggagaat tgcttgaaat gttgtcgcaa gaggaggaac 4200

ttgagtcttt caggcgcaaa aggaatcaat tggcaagtaa attgtccagt cttcatatca 4260

aattccctta tgtggatcat tttcttaatc gatatgaaaa tagtctggac cggatgaaca 4320

caaacttcga tgcgcataaa caaattgcac aaattattgg cggtcgcaaa gagattcctt 4380

tttcaaattt agagcgtctg aatgaattgc taattaagtc ggataagctt gttagcaagg 4440

atttctatga aatgtctcaa tgccttttag agctaacacg ctggcataaa aacaggagcg 4500

attcattcaa gaagggagag attcatcatt tccgaaataa gatgtcaggc aaagcacaat 4560

ttaattttgc attgatgtgt gacaaccagc ttgacaaaaa tggtaacttc gtgtggggtg 4620

aaagaggtta tcatgcgaag aggtttttct caaacttctt tgagaaagtt gattcaactg 4680

acggttataa gaaacacata acgcgagtca acccaaatgg cacacgacaa acagctatag 4740

gaaaactgat tttatcgacg gatccatcta cactgcgaca acagatgaaa ggcaacccag 4800

tcacaagagt tccagttggc aaatactgta caagcaaaag agatgattgt tacgtctatc 4860

cagcatgctg tgttactatg gaagatggta cgccattgtt ttcagatatc aagatgccaa 4920

ctaagaatca tttagtcatt gggaattcag gagatccaaa gtatgtggat gtaccgagca 4980

actcaagtga catgattgta gccaaggaag gttattgtta tctcaacatt ttcttggcaa 5040

tgttgctgaa tgtgaatgag agtgaatcaa aatcattcac aaagaaggtt agagatataa 5100

ttgtgccgcg tctcggtcag tggccaagct taattgatgt tgcaaccgaa tgttacttcc 5160

tatcagcttt tcaccctgaa acgaaaaatg ctgagctacc tcgaatcctg gtggatcata 5220

cgtcaaaatg tatgcatgtg atcgattcat atggttcgct agatactcaa tttcatgttc 5280

taaaggcaaa tactgtaagt cagctcatta aattcgcaga tgatgacttg gattcggaga 5340

tgaaacatta tttagtaggt ggagacctcc atagtaagca agtgcctcag tgttccataa 5400

aattactttg tagatgtata tataggccta aattgatgag gcaatgcatt gaggaagaac 5460

cttttttatt aattttagcg tgtatctcac caggtgtctt attagcttta tataatagtc 5520

agcatttaga attagcttta aagtactgga tgagtaagca acaatctgtc gctgctttat 5580

ttgcaatgat ccatggatta gccgcaaaag tgacagttgc tcaaacattg aatgagcaga 5640

ggttaatact tgagcacgga gcgcgcaatt tgatttcagt catggaagcc atacacatga 5700

caaaccattc ataccaaccc gcgcttcttc agctacaggt catggcaaat cgtagagaca 5760

tgaattccgc tcttgatctc gctggattca gcatattaca atctgaagat agtatgtatt 5820

ggatggaaaa aagctatctc atggaattag aggattcgtg gaacgactta aagtggttgg 5880

aaaaattacg agaaatgtgg cgattgtcaa agtactcaat atctgggata agtcaacttt 5940

caatgaaagg cgctaccgat ttaggcggtc gatattcagt atctgcaaag cagtttatga 6000

catcagtgat gaaacctgtc aagaaatctt gtgtaaaagc aagagatact tgtaaggaag 6060

taatcatcaa tacaacatct tggacatttc gggcaacatt ctctttgtgt aagtggtgct 6120

tgcctgattg tttgaagttt ataaacatgc ttatagttat aagtttgatt ctcagcattt 6180

ggcattcagc taattccata tcattcgatt atgcacaaat gaagagagaa aagcaggtaa 6240

atgtcgagaa aattctgatg aataatttag tggcccttta taaggaacag ataaagatta 6300

atccagatct gacaaaggaa gaatttaagg aatacattgc aagaagtaga cctgagctga 6360

tcacattagt taacaaggaa ttgcaagaag aagttgatca ccaagctaag cggaaaggtg 6420

aacaaaattt ggagaaaatt atagcatttg ttgctttagt tatgatgatc tttgactcgg 6480

agaaaagtga ttgcgtatat aagacactga acaaattgcg aaatctcgta gccacatgtg 6540

atgaacctgt cgcacatcaa agcttggacg acattcaaga cattttgact gacaaagaaa 6600

caaccattga tttcgactta gattgtgagg ggagcaaagt tacagagttc aaggagatga 6660

actttgccgc atggtgggaa aaacaactac aatatgatag agtggtaccc cattacagga 6720

caactgggaa atttattgaa ttcactcgtg aaagctgtgc tagcgtgagt aacacaatat 6780

ctcacgcccc tgagaaagaa tggatagtcc gtggtggtgt cggatcagga aaatctactg 6840

gtctaccatt tgcgttatct agtaaaggtg cagttcttat gctcgaacca acgagaccat 6900

tggcagagaa tgtctcacga cagttgagac aacatccctt ctatgcaaac cccacattga 6960

gaatgcgagg aatgtcaact tttggatcca gtaatatatg tataatgact agtggatttg 7020

ccttcagtta ttttgcaaat aaccctttaa aattaagtga ttttgaattt gtgataatag 7080

acgagtgtca cgtcctagat agcaacgcta tggcatttgt gtgtcttctc aaagagcaca 7140

actatgatgg caaattattg aaagtgtcag ccacaccaca gggtcgtgaa tgtgaattcc 7200

acacacagca tccagtttcc attcatatag aggaacaact tagtttccaa gctttttgcg 7260

aagctcaagg aactgagtct gcacgagatg taatcaataa gggggataac attttagtgt 7320

atgtcgcaag ttacaatgag gttgatcagc tctcaaaaat gctcggagac aaaggctatt 7380

tagtgactaa agtcgatggg cgcaccatga aaattggttc gaccgatata gttactaaag 7440

ggagtagcca gaagaaacat ttcattgtag caaccaacat aatcgagaat ggagtcactc 7500

tggatgtgga tgttgttgtg gactttggtt tgaaagttac tgctgaaatt gattacgata 7560

atcgatgcgt taactacaca aagaccagca tttcatatgg agaacgcata caaagattgg 7620

gcagggttgg tagacacaag aaagggcatg caatgagaat tggaactaca attaaaggat 7680

taattgagat tcctagtctc gtagcgacac aggctgcatt ccaatgcttc acatatggat 7740

tgcctgtaat gacacaagga gtttcagtta acagtttatc taattgcaca gttcgacagg 7800

ccagagttat gtcccgtttt gaattgccgc cttacttcat ggcttcactt gtatatcatg 7860

atggcagcat gcacccggag attcacaagc atttaactcc ttacaaacta gatgaatctg 7920

aaattcaact tagtgccatg gcttttaact ttactgtaac atctgtttgg ctagattgta 7980

aattttatga tagtatagga attcatcttg atttaccgcg tgaagctaaa attccattcc 8040

actgtagaga atttccagat atgaaatacc gacgtttgtg ggaagatatt ctcaaaatca 8100

agaacacaaa ttgttttggt agaatgagtg ttgtcagcgc aacgaaagta gcatatacac 8160

ttaagacaga cattcattca atcggaaaaa ctctcggata tattgacgcc ctcttgcaag 8220

aagaatatag aaagcagcat catttcaaag caatgacaag caacgcatgt agtgggaaca 8280

ctttttcaat gctaagcata gcaaatgcaa tacggaacca ctatgctaag gattacactg 8340

ctggtaatat tcagaaattg caggcagcaa agaatcaaat cctggaattt gtcaatttaa 8400

atattgatcc ttcagcaaaa tgcggatttc aagagttcgg agctttggaa ctagtcaccc 8460

atcagagcag gcaagaagtc tcaaaattcc taaatttaag aggcaagtgg aataagtcac 8520

taattacacg tgatatctta gtcctgttag gtgtcactat tggtggtttc tggatgatat 8580

gggataaatt caaatcaaat attgaagatg tccatcacga aggaaagaga aaggatcaaa 8640

agcttaaatt tcgagatgct cgcgataaga aaatgggtag agaagtatat ggagacgatg 8700

gtactattga acattacttt ggatcagcat acgtcaagag aggtgcagtt aagggtcata 8760

agagaggaat gggcgaaaaa tcaagacgtt tcgttagtat gtatggagtt aatttagaag 8820

attttgcttt tattagatac atagatccca taactggagc aacgcgcgat gagagtcctc 8880

taacggatgt ggaattggtg caagctcatt ttggagaaat cagagacaaa atgctaaacg 8940

agggcctcat cgataagcaa cacattataa ataaaccagg tttgacagct tatttagtta 9000

aggatggagt taagtccatc atgaaagtag acttgcaacc acacaatcct ctgctcgtat 9060

gcaaaaacaa agcgacaata gcagggtttc ctgagaagga gtttgttttg cgacaaacgg 9120

ataaagcata tgaagtaagc agagaggaac taccagaacg gaatgaagat gtttcttttg 9180

aaggagcttc aagtgtgaag ggattgcgcg attacaatgg tgtagctagc gctatttgcc 9240

aactcacaaa caactcgaat ggtcggtcca ccacgactta tggggttggc tatggctcat 9300

acatcatagt taataggcac ttgtttaaag agaataatgg gaatttattg atcaaatcaa 9360

cgcatggaaa tttcaatatc aggaactcca aacaaattaa agttgttgga gtggaggata 9420

gggacattgc cattcttcaa atgcctaaag acttcccacc ctttgcacag aggctacgat 9480

ttagaaatcc aatagtaggt gaatcaattt gtcttgttgg aaatacgttc caagaaaagt 9540

acaatgcaag catcgtttct gagacaagca aaacattccc acgagttgaa ggtagctttt 9600

ggaaacattg gattaataca acggaaggac attgtgggtt gcctctagtt agcgtcactg 9660

acggatttat tgtaggaata catagtttaa tgagtcataa gtacgatcat aattacttct 9720

cgaacttcga cgacgcgttt gaaggcgatt atattgacaa gttgaaggaa ctgaaatggg 9780

agcagaattg gacttacaat gttaatactg ttagttgggg taacatgaaa cttcaggata 9840

gtgctccatg caaagaattc aaaacaacta aattgattag cgacttatgc acggaacctg 9900

tgtgcgctca gagtagcaat caagttagat ggttatataa ccggcttgaa ggaaatttga 9960

aagcagttgc aactattccc aacaactttg ttacaaagca cattgtgaaa gggcgatgta 10020

aattgtttga attgtatctg caaactcata gtgaagcgaa tgagttcttt aaaccgctga 10080

tgggttccta tggtaagagt ggtctcaaca aggaagcata cattaaggac ttatttaagt 10140

actcctcaga aataccaatt ggggaggtca acaccgagag attcgaagat gcggttgggc 10200

aggtcatcga gattatgatg caatggaact ttagggaatg caagtatatc accgattgtg 10260

accagatctt tgaatcattg aacatgaaag cggcagttgg tgctttgtac agtggtaaga 10320

aaaaggcgta cttcgaaaat tccacatttg atgatcgaaa tcatttgcta cagcttagtt 10380

gtctccgatt attcaagggt gatttgggaa tttggaatgg gagtcttaaa gctgaattaa 10440

gaccaatcga aaaggttgaa gcaaacaaaa cgcgaacatt cacagcagct ccaattgaaa 10500

ctttacttgg aggaaaggtt tgcgtcgatg acttcaacaa tcaattttat gatcttaata 10560

tgaaatgccc atggacagtc gggatgacta aattttattg tggatggaat gatctcctaa 10620

gtaaactccc tgatggttgg atatactgtg atgctgacgg atcacgattt gacagttctc 10680

taacaccgta cttgctgaat gcagtgctcg gaattaggga gtttttcatg gaagattggg 10740

acataggcgt gcagatgctt cgaaatttgt acactgaaat aatttacacc cccattgcaa 10800

cacctgatgg aacagtcgtc aaaaagtttc gaggaaataa tagtggtcaa ccatcaacag 10860

tcgtagataa cacattaatg gtctgtattt gtgtgcaata tagtttaatt atgaatagtg 10920

tagagtttaa gaatcaggat gatgtctgca gatacttcgt taacggcgat gatttattgc 10980

ttgcgattaa tccaaaattt atacatatcc tagattcttt taaagtccat ttcgctaatt 11040

taggtttaga ctacgacttc tctcatcgaa cagaggacaa aggagagctt tggtttatgt 11100

cccacaaagg aattaggtta aatgacatgt atatcccaaa gctggagcca gagagaattg 11160

tctcaatact tgagtgggat agaagtgtaa agccagaaca cagattagaa gcgatttgcg 11220

cttcaatgat tgaagcatgg ggttacccta agttaactca cgaaattcgg aaattttatg 11280

cttgggttct ggaacaagca ccatacaatc atcttgcttc tgaggggaag gcaccataca 11340

tttcggaaac agcgctcaaa agattgtaca catgcgagga aggaagtgcc gatgaaatca 11400

tatcatacct agaaatgtgt gcaaacgatt ttaacgagga tgaatatttc aatgatgaag 11460

atgtttctca ccagtccgct actttatgcg ggagtgtttc tgcggcgagc ttcggctgcc 11520

aaagcaacag aatagctatt ggaaactttc attctgccgc ctcgaaatgt ggttatcgag 11580

acactctgga tcaaaacaac atactagcat ttagggttag tgaatccatt ggagacggcc 11640

tgagaattcc cgaagcacga gctgttaaga ttaggtccag gaacggtgcc cgcccttcgc 11700

aggtagtttg tgtagattac ccgagaccag agcttgataa tactttaaat ttcttggaag 11760

cagcgcactt gtcttcatcc tttcggactt ctccccgtcc atcgagacca ttgaagatcg 11820

taattgctgg cgcaggtttg gctggtttat cgactgcaaa atatttggca gatgcaggtc 11880

acaagccttt gttgctggaa gcaagagatg ttctaggtgg aaaggtggct gcatggaaag 11940

atgatgatgg agactggtat gagacaggct tacatatatt cgaagatgtt tctcaccagt 12000

ccgctcttga tgctggcaaa tccacagtag aaaacaagaa agatgatgaa gagaagaaga 12060

ataaagaaga aaagcaggaa aataaaaaca aaaataaaga agtcgagaag aaacatgaga 12120

aaacttcgag tagcacatct ggtgctattg tttcaaacaa tgaaaaagac aaggatgtcg 12180

acgttggatc aagcggatct ttcattatac cacgaattaa atcgatatcc aataaactta 12240

caatgccaaa agtaaaaggg aaaggaattt taaatttgga gttcctttta caatacacac 12300

cagatcaagt ggacatttca aacactaggg caagtatttc acagtttaat acatggtaca 12360

atgctgtgaa ggaatcctat ggtgtatctg atgaagaaat gggaataatt ttgaatggat 12420

taatggtttg gtgtattgag aatggaacat ctccaaatat taatggcatg tggtttatga 12480

tgcaagggga agaacaaatc gaataccccc ttcaaccaat agtggaaaac gcaaagccca 12540

ctttgcgtca gattatggcc cactttagca atgttgctga agcatacatt gaaaagagaa 12600

attatgagaa gccatatatg ccgaggtacg gtattcaacg gaacctcacc gacatgagtt 12660

tggcgcgata tgcttttgat ttctatgaaa tgacatcaag gacgccatct cgggcccggg 12720

aagcccacat ccagatgaaa gcagcagcat tacgagatgc aaataataag atgtttggac 12780

tggatggaaa agtcggaaat gcgactgaga acacggagcg ccacaccaca gatgatgtta 12840

atcataacac tcatgcattc actggcgctc gatattatta gatatttatc taagcatggt 12900

tttatctagt atcttttaaa tcgcattagc tttactttct agcacgcgtt agcgaggttt 12960

tacctcctat tatctatgtg tcagtgaggg tagcccttgt gtgatatctt agaaagtatt 13020

gtcccaagct gcagtggctg gttgttcata gcatgagtgg ctcatggaac ttcagactaa 13080

gcaaggaggg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tcggtacgct gaaatcacca 13140

gtctctctct acaaatctat ctctctctat tttctccata aataatgtgt gagtagtttc 13200

ccgataaggg aaattagggt tcttataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac 13260

ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa 13320

ccaaaatcca gtactaaaat ccagatcgat aacgttacac cacaatatat cctgccaaga 13380

tctaattccg gggatcggaa atccagaagc ccgagaggtt gccgcctttc gggctttttc 13440

tttttcaaaa aaaaaaattt ataaaacgat ctgttgcggc cggccgccgg gttgtgggca 13500

aaggcgctcg acggtgggca accgcttgcg gttgtccacg ggcggagccg gtgcgcgtag 13560

cgcattgtcc acaagccaag ggcgaccaat aattgatata tatattcata attgaaaagc 13620

taattgaaca tactacttgc tgtaactact tgccggagcg aggggtgttt gcaagctgtt 13680

gatctgaaag ggctattagc gttctcacgt gcctttttga ttagcgattt cacgtgacct 13740

tattagcgat ttcacgtact ccgattagcg atttcacgta ccctgattag cgatttcacg 13800

tggatagttt ttggagcggg ccggaaagcc ccgtgaatca aggctttgcg gggcattagc 13860

ggtttcacgt ggataactac cctctatcca caggcttccg gggataaaaa 13910

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttgcttcagc gcaaagaagg 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acaagatcca gaagaagctc aca 23

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgccatcct ccgtcttgac cttgc 25

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

attccaatga gtgatggctg gaagag 26

Claims

1.马铃薯Y病毒属病毒PLDMV在构建基因沉默的载体中的应用，所述载体以pGreenII-35S为骨架，含有PLDMV基因组DNA和基因沉默片段；所述基因沉默片段位于PLDMV基因组DNA的NIb编码区和CP编码区之间。

2.一种基因沉默载体，其以pGreenII-35S为骨架，含有PLDMV基因组DNA和基因沉默片段；所述基因沉默片段位于PLDMV基因组DNA的NIb编码区和CP编码区之间。

3.根据权利要求2所述的基因沉默载体，其特征在于，所述目的基因为CaPDS基因，所述基因沉默片段为如SEQ ID NO:1所示的野生型CaPDS序列中的4～105bp、4～303bp、4～504bp、4～600bp、601～1200bp或1201～1749bp。

4.携带权利要求2或3所述基因沉默载体的农杆菌。

5.一种诱导植物基因沉默的方法，其特征在于，以权利要求4所述的农杆菌侵染番木瓜。