CN113604500B - 一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆构建及其应用 - Google Patents

一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体及其构建方法和鉴定方法，所述甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体命名为土壤杆菌Agrobacterium sp.，于2021年5月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.22647。本发明将SCSMV全长cDNA序列分为A、B和C 3个重叠片段和pGreenII‑35S载体D片段进行扩增，通过Gibson技术进行拼接重组转化农杆菌，首次获得具备侵染活性的SCSMV全长cDNA侵染性克隆载体，将加大推动SCSMV与寄主的互作机制及致病机理的研究，为开发新的SCSMV科学防控技术提供理论依据。

Description

一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆构建及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆构建及其应用。
背景技术
病毒侵染性克隆是病毒反向遗传学研究的基础和前提。对于植物RNA病毒来说，侵染性克隆是具有完整生物活性的cDNA或者从cDNA克隆获得的具有侵染力的体外转录RNA产物。雀麦花叶病毒是第一个被成功构建出侵染性克隆的植物RNA病毒，随后大量的RNA病毒的侵染性克隆被成功构建，植物RNA病毒的研究获得了快速发展。
获得植物RNA病毒侵染性克隆，可以对cDNA克隆进行点突变，缺失突变或插入突变，可以研究病毒的基因编码策略，研究其编码的基因功能，研究基因组上非编码序列对病毒基因组RNA复制和转录的调控等。植物RNA病毒cDNA克隆可以作为基因表达载体，开发植物生物反应器。cDNA克隆还可以用于病毒诱导的基因沉默研究(VIGS)，VIGS目前被广泛应用于植物基因功能研究，对植物反向遗传学研究具有很大的帮助。
甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)自1978年首次在美国引自巴基斯坦的甘蔗种质中检测到，在全球范围内迅速传播，目前已在印度、泰国、印度尼西亚等国家广泛发生，对当地甘蔗产业造成严重影响。SCSMV侵染导致甘蔗叶色失绿，叶片出现黄绿相间不规则的嵌纹、条斑或斑驳，甘蔗茎径变小，每丛茎数减少，从而使得蔗茎产量下降，进而影响蔗糖产量(图1)。据估计，当SCSMV发生率超过50％时，可导致蔗糖产量减少20％左右。
然而由于缺乏效果显著的化学药品进行防控，目前甘蔗生产上主要是通过栽培脱毒健康种苗对甘蔗病毒病进行防控。而脱毒种苗种植于大田之后，很容易重新感染病毒病而失去防控效果。因此通过构建SCSMV全长cDNA侵染性克隆对SCSMV与甘蔗之间的互作机制及致病机理进行深入的研究，有可能为开发新的SCSMV科学防控技术提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，是提供一种甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)全长cDNA侵染性克隆载体及其构建方法和接种鉴定方法。
本发明的第一个方面是提供一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体，命名为土壤杆菌Agrobacterium sp.，于2021年5月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.22647。
本发明的第二个方面是提供一种如本发明第一个方面所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)从感染单一甘蔗条纹花叶病毒的蔗植株叶片中提取植物总RNA；
(2)利用提取的植物总RNA获得甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA序列：
(3)以获得的序列为基础，并结合表达载体pGreenII-35S序列，分别设计甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA序列的A片段、B片段和C片段三个重叠片段以及pGreenII-35S载体D片段的4对引物，分别对A片段、B片段、C片段和D片段进行扩增，其中，A片段的序列为SEQ IDNO.1所述序列的第2388bp至第5583bp，B片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第5564bp至第8982bp，C片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第8755bp至第12226bp，D片段的序列如SEQ ID NO.18所示，A片段的引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，B片段的引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，C片段的引物对的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，D片段的引物对的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
(4)将扩增获得的A片段、B片段、C片段和D片段经Gibson技术拼接重组后直接转化GV3101(pSoup)农杆菌感受态，挑单克隆进行测序鉴定，测序鉴定正确的克隆载体即为成功构建的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体。
优选地，步骤(2)具体为：
根据已有的SCSMV全长参考序列设计PCR扩增引物，将SCSMV全长基因组分为片段1、片段2、片段3三个重叠大片段分别进行克隆测定，并且通过5'RACE和3'RACE技术，对5'端和3'端的序列进行测序确认，测序结果经拼接，获得完整的SCSMV全长cDNA序列信息。
其中，片段1的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第2413bp至第5650bp，片段2的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第5495bp至第9063bp，片段3的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第8755bp至第12193bp，片段1的引物对的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，片段2的引物对的序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，片段3的引物对的序列如SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15所示。
本发明的第三个方面是提供一种如本发明第一个方面所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体的鉴定方法，将所述克隆载体进行活化培养后，接种至无毒甘蔗单芽茎节，将单芽茎节种植，长出小苗后剪取幼嫩叶片组织提取总RNA，用甘蔗条纹花叶病毒的特异检测引物F:ACAAGGAACGCAGCCACCT和R:ACTAAGCGGTCAGGCAAC进行RT-PCR检测，与经鉴定确认感染SCSMV病毒的阳性植株检测结果一致，说明获得了具备侵染活性的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体。
本发明的第四个方面是提供一种引物对，其为如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对，在构建本发明第一个方面甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体时，用于扩增A片段。
本发明的第五个方面是提供一种引物对，其为如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对，在构建本发明第一个方面甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体时，用于扩增B片段。
本发明的第六个方面是提供一种引物对，其为如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物对，在构建本发明第一个方面甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体时，用于扩增C片段。
本发明的第七个方面是提供一种引物对，其为如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物对，在构建本发明第一个方面甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体时，用于扩增D片段。
本发明的第八个方面是提供一种引物对，其组成为：F:ACAAGGAACGCAGCCACCT和R:ACTAAGCGGTCAGGCAAC。
本发明的第九个方面是提供如本发明第四个方面所述的引物对、和/或本发明第五个方面所述的引物对、和/或本发明第六个方面所述的引物对、和/或本发明第七个方面所述的引物对在构建本发明第一个方面所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体中的应用
本发明的第十个方面是提供如本发明第八个方面所述的引物对在鉴定本发明第一个方面所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明首先对甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)进行分段扩增测序，并且通过5'RACE和3'RACE技术对5'端和3'端的序列进行确认，获得准确完整的SCSMV全长cDNA序列信息。
2、本发明将SCSMV全长cDNA序列分为A、B和C 3个重叠片段和pGreenII-35S载体D片段进行扩增，通过Gibson技术进行拼接重组，重组产物直接转化农杆菌后再次进行测序验证，保证了cDNA侵染性克隆载体的保真性，提高获得具备侵染活性的cDNA侵染性克隆载体的成功率。
3、本发明将含有SCSMV侵染性克隆载体在YEP固体平板培养基及MR液体培养基上进行一系列活化处理，提高了农杆菌菌株的侵染活性，成功的进行了SCSMV侵染性克隆载体的接种鉴定，证明本研究所获得的侵染性克隆载体具备侵染活性。
4、本发明获得的具备侵染活性的SCSMV侵染性克隆载体将加大推动SCSMV与寄主的互作机制及致病机理的研究，为开发新的SCSMV科学防控技术提供理论依据。
附图说明
图1为甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)引起的甘蔗花叶病症状。
图2为SCSMV全基因组测序策略。
图3为SCSMV侵染性克隆构建策略示意图。
图4为甘蔗接种本发明SCSMV侵染性克隆载体后RT-PCR检测结果，1-10：接种本发明SCSMV侵染性克隆植株；CK-：未接种本发明SCSMV侵染性克隆的无毒植株；CK+:经鉴定确认感染SCSMV病毒的阳性植株；M：DNA marker.。
图5为甘蔗接种本发明SCSMV侵染性克隆载体后的感病植株(左)以及甘蔗未接种本发明SCSMV侵染性克隆的健康植株(右)。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
1、感染单一SCSMV株系甘蔗植株的获得及鉴定
采集花叶病症状明显的甘蔗植株叶片，提取叶片总RNA，通过甘蔗花叶病毒(SCMV)、高粱花叶病毒(SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)的特异性检测引物进行检测鉴定，筛选出只感染SCSMV的甘蔗植株。并对只感染SCSMV的甘蔗植株进行CP基因克隆，挑取多个单克隆送样测序，确保无不同SCSMV株系混合感染的情况，获得感染单一SCSMV株系甘蔗植株，并种植于防虫网内，作为构建甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆的病原材料。
2、提取感染SCSMV甘蔗植株总RNA(Trizol提取法)
首先在无酶离心管加入1ml的Trizol试剂。用液氮迅速研磨感染单一SCSMV甘蔗叶片样品，取50-100mg粉末加入管中。加入200ul氯仿并上下颠倒混匀，室温放置5min至分层。于4℃离心机中，调12000转离心15min。吸400-500ul上清至新无酶离心管中，加入等体积预冷异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置5-10min。于4℃离心机中，调12000转离心10min。弃上清，用1ml 75％乙醇(DEPC水配置)洗涤沉淀一次，再无水乙醇洗涤沉淀一次。至于室温超净台吹干5-10min后加入50ul左右RNase free H2O溶解(65°预热)。取2ul溶解物进行凝胶电泳检测，得到感染单一SCSMV甘蔗植株总RNA。
3、利用提取的总RNA测定SCSMV全长cDNA序列
参照用反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,Thermo,K1622)的使用说明，利用试剂盒中的Random引物，将步骤2中所获得的RNA反转录成cDNA。根据NCBI上已有的SCSMV全长参考序列设计SCSMV全基因组测序策略(图2)，并设计PCR扩增引物(表1)，利用诺唯赞公司的拓扑克隆试剂盒(5min TA/Blunt-Zero Cloning Kit，VazymeBiotech Co.,Ltd，C601-02)将SCSMV全长基因组分为3个重叠大片段分别进行克隆测定，其中，片段1的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第2413bp至第5650bp，片段2的序列为SEQ IDNO.1所述序列的第5495bp至第9063bp，片段3的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第8755bp至第12193bp。通过TaKaRa RACE试剂盒(SMART 5’RACE&3’RACE，TaKaRa，634858)进行5'RACE和3'RACE测定，对SCSMV的5'端和3'端序列进行确认。所有测序结果经序列拼接后，获得完整的SCSMV全长cDNA序列信息(SEQ ID NO.1)。
表1：SCSMV全长cDNA测序重叠片段扩增引物
Figure BDA0003185468060000051
Figure BDA0003185468060000061
4、SCSMV全长cDNA侵染性克隆构建
根据测序获得的SCSMV全长cDNA序列以及pGreenII-35S载体序列设计SCSMV全长cDNA侵染性克隆构建策略(图3)，并重新设计重叠片段扩增引物(表2)，利用诺唯赞公司的拓扑克隆试剂盒(5min TA/Blunt-Zero Cloning Kit，Vazyme Biotech Co.,Ltd，C601-02)将SCSMV全长cDNA序列分为A、B和C 3个重叠片段和pGreenII-35S载体D片段进行扩增，其中，A片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第2388bp至第5583bp，B片段的序列为SEQ IDNO.1所述序列的第5564bp至第8982bp、C片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第8755bp至第12226bp，D片段的序列如SEQ ID NO.18所示。采用NEB公司的Gibson克隆试剂盒(GibsonAssembly Cloning Kit，NEB，E5510S)将扩增获得的A、B、C和D重叠片段经Gibson技术拼接重组后直接转化GV3101(pSoup)农杆菌感受态。挑单克隆进行测序鉴定，测序鉴定正确的克隆即为成功构建的SCSMV全长cDNA侵染性克隆，命名为：土壤杆菌Agrobacterium sp.，于2021年5月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.22647，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所。
表2侵染性克隆构建重叠片段扩增引物
Figure BDA0003185468060000062
5、含SCSMV侵染性克隆农杆菌菌株活化
含SCSMV侵染性克隆农杆菌菌株在YEP固体平板培养基上划线，牙签挑取单克隆与400ul的液体YEP培养基中震荡培养1h。通过菌液PCR对单克隆进行鉴定。将400ul菌液均匀涂布于YEP固体平板培养基上(含100mM的乙酰丁香酮)，培养4天。刮取YEP固体平板培养基上的适量菌体，悬浮于400ul的液体YEP培养基中，再次均匀涂布于YEP固体平板培养基上(含100mM的乙酰丁香酮)，培养过夜后刮取YEP固体平板培养基上的所有菌体，悬浮于MR培养基中(1/5MS大量元素+MS氨基酸+30g蔗糖+30g葡萄糖+100mM乙酰丁香酮)，低速震荡培养两小时即为活化后的农杆菌菌液。
6、SCSMV侵染性克隆侵染活性接种鉴定
砍取无毒甘蔗单芽茎节，每节芽前芽后保留2-3cm左右的茎秆组织，保持茎节横切面的平整。竖起单芽茎节于台面上，用移液器吸取步骤3中的农杆菌菌液，均匀滴在茎节横截面上，并通过抽真空，使菌液迅速渗透于茎秆细胞组织中。用塑料保鲜袋包住接种过菌液的茎节使其保持湿润状态，过夜培养。将接种过菌液的单芽茎节种植与花盆中(花盆及泥土需进行杀虫处理)，并用防虫网进行保护种植。接种三个月后，单芽茎节长出小苗。剪取幼嫩叶片组织提取总RNA，用SCSMV的特异检测引物(F:ACAAGGAACGCAGCCACCT；R:ACTAAGCGGTCAGGCAAC；938bp)进行RT-PCR检测，检测结果如图4所示，10株受接种的甘蔗植株有两株检测结果为阳性，且相对于RT-PCR检测阴性的植株，阳性植株叶片组织具有明显的花叶病症状(图5)，说明本研究获得了具备侵染活性的SCSMV侵染性克隆。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
                         序列表
<110>  中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120>  一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆构建及其应用
<160>  18
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  13013
<212>  DNA
<213>  Artificial
<400>  1
agcccgctcg acggcgggct gttggatggg gatcgcctga atcgccccat catccagcca       60
gaaagtgagg gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt      120
gaacttttgc tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt      180
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cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct caaggccgcg      360
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cgatcccagg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata      1500
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cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt      1620
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atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cattcaagat gcctctgccg acagtggtcc      3060
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ttcaaagcaa gtggattgat gtgacatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca      3180
ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg agagg     3235

Claims (8)

1.一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体，其特征在于，命名为土壤杆菌Agrobacterium sp.，于2021年5月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No. 22647。
2.一种如权利要求1所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从感染单一甘蔗条纹花叶病毒的蔗植株叶片中提取植物总RNA；
（2）利用提取的植物总RNA获得甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA序列：
（3）以获得的序列为基础，并结合表达载体pGreenII-35S序列，分别设计甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA序列的A片段、B片段和C片段三个重叠片段以及pGreenII-35S载体D片段的4对引物，对A片段、B片段、C片段和D片段进行扩增，其中，A片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第2388bp至第5583bp，B片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第5564bp至第8982bp，C片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第8755bp至第12226bp，D片段的序列如SEQ IDNO.18所示，A片段的引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，B片段的引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，C片段的引物对的序列如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示，D片段的引物对的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
（4）将扩增获得的A片段、B片段、C片段和D片段经Gibson技术拼接重组后直接转化具有辅助质粒pSoup的GV3101农杆菌感受态，挑单克隆进行测序鉴定，测序鉴定正确的克隆载体即为成功构建的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）具体为：
根据已有的SCSMV全长参考序列设计PCR扩增引物，将SCSMV全长基因组分为片段1、片段2、片段3三个重叠大片段分别进行克隆测定，并且通过5' RACE和3' RACE技术，对5'端和3'端的序列进行测序确认，测序结果经拼接，获得完整的SCSMV全长cDNA序列信息，
其中，片段1的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第2413bp至第5650bp，片段2的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第5495bp至第9063bp，片段3的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第8755bp至第12193bp，片段1的引物对的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，片段2的引物对的序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，片段3的引物对的序列如SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15所示。
4.一种如权利要求1所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体的鉴定方法，其特征在于，将所述克隆载体进行活化培养后，接种至无毒甘蔗单芽茎节，将单芽茎节种植，长出小苗后剪取幼嫩叶片组织提取总RNA，用甘蔗条纹花叶病毒的特异检测引物F:ACAAGGAACGCAGCCACCT和R: ACTAAGCGGTCAGGCAAC进行RT-PCR检测，与经鉴定确认感染SCSMV病毒的阳性植株检测结果一致，说明获得了具备侵染活性的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，活化培养所用培养基为YEP固体平板培养基及MR液体培养基。
6.一种引物对，其特征在于，所述的引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对，或者其为如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对，或者其为如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物对，或者其为如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物对。
7.如权利要求6所述的引物对在构建权利要求1所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体中的应用。
8.一种引物对在鉴定权利要求1所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体中的应用，所述引物对组成为：F: ACAAGGAACGCAGCCACCT和R: ACTAAGCGGTCAGGCAAC。
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