CN105821051B - 利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法 - Google Patents

利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法，包括RNAi载体构建、遗传转化、转基因甘蔗植株的筛选鉴定及对花叶病的抗性鉴定。本发明采用融合PCR技术，克隆了SCMV的P3N‑PIPO的编码序列，以pGBKT7‑SCMV‑P3NPIPO为诱饵从甘蔗的酵母文库中筛选到了与P3N‑PIPO互作的甘蔗基因ScPCaP。以ScPCaP作为RNAi干扰靶序列，经遗传转化后获得了对SCMV，SrMV和SCSMV均有抗性的转基因甘蔗植株，并具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久的特点，有效缩短了甘蔗抗花叶病育种周期。采用本发明的利用RNAi阻断病毒胞间移动的方法培育抗花叶病转基因甘蔗，在转基因生物安全上，优于转入病毒序列的转基因甘蔗。

Description

利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法
技术领域 本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法，属于生物技术领域。
背景技术 甘蔗(Saccharum officinum L.)是我国乃至全世界最重要的糖料作物和能源作物，甘蔗糖占我国食糖总量的92％，占世界食糖总量的74％，甘蔗乙醇占世界生物质燃料乙醇的60％。甘蔗花叶病是严重危害甘蔗生产的病毒性病害之一，在全世界各大蔗区普遍发生，在上个世纪20年代，几乎摧毁了阿根廷、巴西和美国的甘蔗产业，至今仍然对全世界的甘蔗产业构成潜在的威胁。甘蔗花叶病在我国蔗区普遍发生，华南各地区尤其是广西、云南旱地蔗区发病率达30％以上，产量损失3～50％。
甘蔗花叶病的病原主要有3种，即甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic Virus,SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcanestreak mosaic virus,SCSMV)，均属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)。其中，SCMV和SrMV属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。SCSMV于1978年在美国首次发现并报道，1998年确定其属于Potyviridae，2012年国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy ofViruses,ICTV)将其立为该科新属，即禾病毒属(Poacevirus)。病毒株系繁多。这三种病毒均为单链正义RNA病毒，基因组结构简单，长度约为10Kb，编码一个多聚蛋白，经酶解后形成10个成熟蛋白，从N端到C端依次为：第一蛋白(P1)、辅助成分-蛋白酶(helper componentproteinase，HC-pro)、第三蛋白(P3)、第一个6K蛋白(6K1)、柱状内含体蛋白(cylindricalinclusion protein,CI)、第二个6K蛋白(6K2)、病毒的末端结合蛋白(Viral ProteinGenome-linked，VPg)、核内含体a蛋白(Nuclear Inclusion a protein,NIa)、核内含体b蛋白(Nuclear Inclusion b protein,NIb)和外壳蛋白(Coat Protein,CP)。另外，在P3基因内部，在G2A7保守结构域发生移码，编码一个新的蛋白，为P3N-PIPO。
甘蔗花叶病主要由蚜虫以非持续性方式传播，通过常规手段难以防治。控制花叶病最有效的方法是使用抗性品种。通过传统的杂交方式选育抗花叶病品种难度很大，需要消耗大量的人力物力，因为缺少有效选择标记，很难获得高产高糖等优良农艺性状与抗花叶病性状聚合的基因型。针对传统杂交育种的缺陷，国内外学者开展了转基因抗花叶病育种研究，将病毒CP基因片段转入甘蔗，获得了一些抗性转基因材料，但这些材料仅抗CP基因来源病毒株系，对同种病毒不同株系或其他种类病毒抗性不足或没有抗性，因此不具有广谱性。这种由病毒基因介导的抗性的本质是RNA干扰(RNAi)。RNAi严格依赖核酸序列相似性，而病毒株系繁多，且变异很快，因此这种转病毒基因获得转基因材料很难获得对多种病毒或株系的广谱抗性。另外，将外源核酸片段尤其是导入病毒的核酸片段导入甘蔗，使转基因植株面临复杂的环境安全问题。
植物病毒作为一种细胞内专性寄生物，必须借助寄主的某些特异因子，才能在寄主体内完成复制、翻译、胞间移动等生命活动，建立系统性侵染。病毒对寄主的侵染是长期协同进化的结果，寄主对病毒的响应机制相同，即寄主中参与病毒建立系统性侵染的基因可以被一类或几类病毒同时利用，敲除或沉默这类寄主基因，可以获得对病毒的广谱抗性，比如敲除翻译起始因子基因获得对多种病毒的抗性已经在拟南芥、西红柿等植物上实现。植物病毒从侵染的细胞通过胞间连丝(plasmodesmata,PD)移动到相邻的健康细胞，是病毒完成系统性侵染的关键环节。因为病毒粒子太大难以自主通过胞间连丝，为此病毒通过编码移动蛋白(movement proteins,MP)介导病毒的胞间移动过程。已有文献研究表明，P3N-PIPO在马铃薯Y病毒科病毒中普遍存在，并在病毒胞间移动的过程中执行了移动蛋白的功能。敲除甘蔗中参与SCMV、SrMV和SCSMV胞间移动的基因，可以获得对3种病毒具有广谱抗性的转基因甘蔗。
发明内容 本发明的目的是提供一种利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法。采用RNAi技术，以甘蔗的ScPCaP基因的非保守区作为RNAi干扰片段，构建反向重复序列，得到一个RNAi载体。通过基因枪轰击法转化甘蔗，获得对SCMV、SrMV和SCSMV具有广谱抗性的转基因甘蔗。
本发明的目的是通过以下方法实现的。
一种与SCMV、SrMV和SCSMV的P3N-PIPO均互作的甘蔗基因ScPCaP，其特征在于所述基因的核苷酸序列如下：
ATGGACATCTGGAAGTCCAAGGTGCTGCCCAAGATCAAGCTCGTCTTCGTCAAGAGCGGCGGCAAGAAGGCCGCCGCTGCCGCCGAGCTCGTCAAGTCCTTCGACGAGTCCAAGGAGGGGATCAATGGCGAGTTCCAGGAGAAGAAGGCGGATCTCCAGCCCAAGGTCGTCGAGATCTATGAGTCTGCCCCAGCACCACTCAAGGTCCTGATCAAGGAGAGGAGCAAGGTGTCCGGGATCAAGAAGAACTCCGCCGCAATCACCAAGTTCTTCGAGGAGCTCACCAAGATCGAATTCCCTGGAGCCAAGCAAGTGAGCGACGGCATCTCCAAGGTCGGCCCGGCCCTGCTGTCCGGCCCCATCTTCGCCACCTTCGAGAAGGTCTCCACGCTGCTCCCTGTCGCCGCCGAGGAGGCGACGACCAAGGAGGCACCGGCCGCCGCTAAGGAGGAAGCCGCCGTTGAGGAGAAGAAAGAGGAAGCCGCCGTCGAGAAGAAGGAAGAAGCGGAGGAGGAGAAGAAAGAAGGGACCTCTGCACCGGCTGATGAGACCGCCGCCGCCGCCGAGACTGCTCCTCCTGCTGATGCAGCTGCTGCAGAGCCCACGGCGGAGGCGGCGCCGGCCGAGGCAATGCCGGAAGCCAAGGCTGCACCAGCCGAGGCGGAGCCGGCCAAGGCCGAGGAGGAGACACCCAAGGCCTAG。
所述SCMV的P3N-PIPO的核酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；SrMV的P3N-PIPO的核酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；SCSMV的P3N-PIPO的核酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；ScPCaP基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；ScPCaP的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
一种针对ScPCaP基因的3′端靶位区段设计的一对特异性引物ScPCaP-F和ScPCaP-R，其特征在于所述引物的序列如下：
ScPCaP-F：5′-TCTAGACTCGAGGGAGCCAAGCAAGTGAGCGAC-3′；
ScPCaP-R：5′-AAGCTTGGTACCCCTTGGCTTCCGGCATTGC-3′。
一种利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法包括RNAi载体构建、遗传转化、转基因甘蔗植株的筛选鉴定及对花叶病的抗性鉴定，其特征在于：
(1)RNAi载体构建：
A、以ScPCaP基因的3′端为靶位区段设计的一对特异性引物ScPCaP-F和ScPCaP-R，在上游引物ScPCaP-F上引入Xba I和Xho I酶切位点，在下游引物ScPCaP-R上引入Hind Ⅲ和Kpn I酶切位点，通过PCR反应，获得5′端带有Xba I和Xho I酶切位点，3′带有Hind Ⅲ和Kpn I酶切位点的PCR产物，将PCR产物连接到pMD19-T载体中，获得含有ScPCaP基因的载体pMD19-T-PCaP；所述上游引物ScPCaP-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；下游引物ScPCaP-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
B、用Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切pMD19-T-PCaP载体回收正向片段S1；用Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切pHANNIBAL载体，用T4 DNA连接酶将正向片段S1连接到pHANNIBAL载体上，得到重组质粒pS1；用Xba Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pMD19-T-PCaP，并回收反向互补片段S2；用Xba Ⅰ和HindⅢ双酶切载体pS1，用T4 DNA连接酶将反向互补片段S2连接到重组质粒pS1上，得到以pHANNIBAL载体上的内含子intron作为间隔区、具有发卡结构反向重复序列的中间载体pS1S2，然后用Not Ⅰ单酶切中间载体pS1S2，并回收S1-intron-S2片段；用Not Ⅰ单酶切pGreenII0229载体，将S1-intron-S2片段用T4 DNA连接酶连接到pGreenII0229载体上，得到RNAi干扰载体pG0229-PCaP；所述PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶检测，目的片断的回收和纯化按照OMIGA柱式胶回收试剂盒说明书进行；回收的PCR产物连接到pMD19-T载体转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取含有阳性克隆的菌落，PCR检测后进行测序验证；所述正向片段S1的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，反向互补片段S2的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
(2)遗传转化、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229-PCaP质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL，基因枪轰击法转化甘蔗，筛选鉴定转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。
所述pHANNIBAL载体、pGreenII0229载体、大肠杆菌DH5α，内切酶均由商业购买获得。
对利用本发明的RNAi载体转化甘蔗获得抗花叶病甘蔗材料进行人工接种，接种的病毒为SCMV的SCMV-A，D株系，SrMV的SrMV-H共3个株系和SCSMV的JP1(云南分离物)、JP1(云南分离物)。对照侵染率分别达到了93.3％、90.0％和86.7％，而38株转基因甘蔗均无发病，但是其中有6株转基因甘蔗的接种叶的上位叶上PCR检测出了CP基因。说明沉默与胞间移动蛋白互作的甘蔗ScPCaP基因，阻断病毒的胞间移动，使转基因甘蔗获得了对病毒的广谱抗性。采用本发明的方法筛选、鉴定获得的32株转基因植株，都具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高的特点。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明获得的植物表达载体采用了RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种避开了病毒株系复杂的问题，使转基因甘蔗的培育摆脱了对抗源基因的依赖。
2.本发明选择与三种甘蔗花叶病病原胞间移动蛋白互作的甘蔗因子基因作为RNAi序列获得的转基因植株，具有对三种花叶病病毒的广谱抗性、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。
3.本发明获得的RNAi干扰载体用于转基因甘蔗，对其他农艺性状优良但不抗花叶病的甘蔗品种进行遗传改良，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病育种周期。
4、本发明沉默的是甘蔗内源基因，因此，在转基因生物安全上，优于转入病毒序列的转基因甘蔗。
附图说明 图1为pG0229-PCaP质粒图谱。
具体实施方式 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例一：构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体
构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体的方法，包括以下步骤：
1、ScPCaP基因的克隆及其功能验证：
利用融合PCR技术，分别以SCMV、SrMV和SCSMV的P3基因为模板，克隆了这三个病毒的P3N-PIPO的编码序列，即SCMV-P3N-PIPO、SrMV-P3N-PIPO和SCSMV-P3N-PIPO。SCMV-P3N-PIPO的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，SrMV-P3N-PIPO的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，SCSMV-P3N-PIPO的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；利用亚细胞定位技术，明确这三个病毒的P3N-PIPO均定位于胞间连丝，佐证了其参与病毒胞间移动的功能；将SCMV-P3N-PIPO的编码序列构建到载体pGBKT7中，获得诱饵载体pGBKT7-SCMV-P3N-PIPO，作为诱饵，利用酵母双杂交技术，筛选甘蔗酵母文库，获得了1个与SCMV-P3N-PIPO互作的甘蔗基因ScPCaP。ScPCaP基因全长702bp，编码233个氨基酸，ScPCaP蛋白N端保守且具有DREPP保守结构。ScPCaP基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术，证明ScPCaP与SCMV-P3N-PIPO、SrMV-P3N-PIPO、SCSMV-P3N-PIPO均发生互作，说明ScPCaP是参与这三种病毒胞间移动的寄主因子。
2、以ScPCaP为靶基因构建RNAi载体：
利用GenBank中的RNAi载体设计库对ScPCaP基因的3′端靶位区段进行筛选，避开该基因的DREPP的结构域，选择了ScPCaP基因的301-627片段作为RNAi的佳靶位区段。设计一对引入酶切位点的特异性引物ScPCaP-F(上游引物)和ScPCaP-R(下游引物)，对靶位区段进行改造，使其易于定向连接到中间载体pHANNIBAL。在上游引物ScPCaP-F的5′端引入XbaI和Xho I酶切位点，下游引物ScPCaP-R的5′端引入Hind Ⅲ和Kpn I酶切位点。ScPCaP-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，ScPCaP-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。使用该对引物，对ScPCaP基因进行扩增，PCR反应体系为25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs 2.0μL，上游引物(10μmol/L)1.0μL，下游引物(10μmol/L)1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.125μL，ddH2O 17.375μL，模板(cDNA)1.0μL，总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；然后运行35个循环，94℃30s，60℃30s，72℃1min；最后72℃10min。电泳检测PCR产物并使用OMIGA柱式胶回收试剂盒对目的片段进行回收和纯化。
将回收的目的片段连接到pMD19-T载体中，阳性克隆经质粒PCR检测后进行测序验证，获得克隆有RNAi靶位区段的载体pMD19-T-PCaP。用Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切载体pMD19-T-PCaP回收正向片段S1，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；同时用Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切pHANNIBAL载体，用T4-DNA连接酶将正向片段S1连接到pHANNIBAL载体上，得到重组质粒pS1。将pS1转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取含有阳性克隆的菌落，经PCR检测后测序验证。提取pS1质粒DNA，用Xba Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切载体pMD19-T-PCaP，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收反向互补片段S2，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:9所示的核苷酸序列；用Xba Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切载体pS1，用T4-DNA连接酶将反向互补片段S2连接到重组质粒pS1上，得到以pHANNIBAL载体内含子(intron)作为间隔区、具有发卡结构反向重复序列的中间载体pS1S2。将中间载体pS1S2转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取含有阳性克隆的菌落，PCR检测后测序验证。提取pS1S2质粒DNA，用Not Ⅰ单酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收S1-intron-S2片段，同时用Not Ⅰ单酶切pGreenII0229载体，将S1-intron-S2片段用T4-DNA连接酶连接到pGreenII0229载体上，得到RNAi干扰载体pG0229-PCaP。
所述琼脂糖凝胶电泳，参照《分子克隆实验指南》(第二版)第六章第一节中琼脂糖凝胶电泳的方法；所述将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，转化方法参照《分子克隆实验指南》(第二版)第一章第五节中用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌的方法；所述含有阳性克隆的菌落的挑取，参照《分子克隆实验指南》(第二版)第一章第六节中含重组质粒的细菌菌落的鉴定方法；所述提取质粒DNA的方法，参照质粒提取试剂盒说明书；所述酶切方法，参照限制性内切酶的说明书；所述回收方法，参照胶回收试剂盒说明书；所述用T4-DNA连接酶进行连接方法，参照T4-DNA连接酶操作说明书；构建完成的pG0229-PCaP质粒图谱如图1所示。
实施例二：一种对花叶病具有广谱抗性的转基因甘蔗培育
一种对花叶病具有广谱抗性的转基因甘蔗培育，包括以下步骤：
1、材料准备：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229-PCaP质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL；受体甘蔗品种为ROC22；
2、基因枪轰击法遗传转化甘蔗：
受体材料的预处理：在甘蔗植株顶端部分，取白色心叶的肥厚带中生长点以上10cm内的幼嫩心叶，用体积浓度为75％的乙醇消毒后，并将其切成厚度不大于3mm的圆片，接种至MS+3.0mg/L 2.4-D+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的诱导培养上诱导培养7d，在基因枪轰击前4h转至MS+2mg/L 2,4-D+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的渗透培养基中，进行预处理；
基因枪轰击转化：按照Bio-Rad公司的PDS-1000/He型基因枪操作说明书制备微弹，调整轰击距离6cm、气压1,100psi，轰击预处理的材料，将轰击后的材料分散开，继续在渗透培养基上处理20h；
转化后材料培养和再生植株的获得：将基因枪轰击转化后的材料转至MS+2.0mg/L2.4-D+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的恢复培养基，恢复培养6d；然后将恢复培养后的材料移至MS+2.0mg/L 2.4-D+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+4mg/L PPT pH 5.8的继代筛选培养基中，在28℃黑暗条件下筛选培养2-3代，15d/代；然后将材料转至MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+4mg/L PPT pH 5.8的分化筛选培养基中，在28℃下，每天给予12～14h 2000Lx的光照，筛选培养2-3代，15d/代，直至长出幼苗；待幼苗长高至3-4cm时，将其转至1/2MS+0.2mg/L 6-BA+3mg/L NAA+60g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的生根培养基中，在28℃下，每天给予12～14h 2000Lx的光照，直至幼苗生根；
3、分子检测：将生根后的幼苗移栽至小花盆中(草木灰∶沙子∶耕作土＝1∶1∶1)，待幼苗成活后，分别剪取叶片提取RNA，反转录成cDNA，利用定量PCR技术检测ScPCaP基因的表达情况。共获得47株ScPCaP基因完全沉默的转基因植株，其中，38株转基因甘蔗植株在株高、叶姿、茎径等农艺性状方面与受体材料相比没有明显差异；
4、抗病转基因甘蔗抗病性鉴定
参照专利号为ZL200710009226.8的发明专利“利用SrMV-P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法”中接种鉴定方法。依次对转基因甘蔗植株接种属于SCMV的A株系和D株系，属于SrMV的H株系，属于SCSMV的JP1株系和JP2株系，共6个株系的病毒。同时，针对SCMV、SrMV和SCSMV的CP基因的保守区分别设计特异引物，采用PCR技术，对接种叶片的上位叶进行PCR检测，明确病毒是否建立系统性侵染。
结果：以受体材料ROC22为对照，在人工接种条件下，对38株转基因甘蔗进行攻毒试验，均未发病。在接种SCMV-A、D株系时，38株转基因甘蔗植株中有2株的接种叶的上位叶检测出SCMV的CP基因扩增产物；30株对照中，28株表现出典型的花叶病症状，2株未显症植株的接种叶的上位叶均未检测出SCMV的CP基因扩增产物，则共有28株对照被侵染，侵染率为93.3％。在接种SrMV-H株系时，38株转基因甘蔗植株种有3株接种叶的上位叶上检测出SCMV的CP基因扩增产物；30株对照中，25株表现出典型的花叶病症状，在5株未显症的甘蔗中，有2株甘蔗的接种叶的上位叶检测出SCMV的CP基因扩增产物，则共有27株对照被侵染，侵染率为90.0％。在接种SCSMV-JP1、JP2株系时，38株转基因甘蔗植株中有1株接种叶的上位叶检测出SCMV的CP基因扩增产物；30株对照中，26株表现出典型的花叶病症状，在4株未显症植株的接种叶的上位叶检未测出SCMV的CP基因扩增产物，则共有26株对照被侵染，侵染率为86.7％。病毒接种实验结果详见表1。在38株转基因甘蔗中，有32株生长正常且对3种病毒表现出抗性，说明沉默ScPCaP基因后提高了转基因甘蔗抗多种花叶病毒的能力。
表1.转基因甘蔗病毒接种鉴定结果
抗甘蔗花叶病的植物表达载体是基于RNAi原理构建获得的，本发明的方法可以使抗病毒育种摆脱了对抗源基因的依赖，以与3种花叶病毒互作的甘蔗内源基因作为RNAi干扰序列所获得的转基因植株，具有对三种病毒的广谱抗性。同时，因为沉默的是甘蔗内源基因，在转基因生物安全上，优于转入病毒序列的转基因甘蔗。

Claims (1)

1.一种利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法，包括RNAi载体构建、遗传转化、转基因甘蔗植株的筛选鉴定及对花叶病的抗性鉴定，其特征在于：
(1)RNAi载体构建：
A、以ScPCaP基因的3′端为靶位区段，设计的一对特异性引物ScPCaP-F和ScPCaP-R，上游引物ScPCaP-F含有Xba I和Xho I酶切位点，下游引物ScPCaP-R含有HindⅢ和Kpn I酶切位点，通过PCR反应，获得5′端带有Xba I和Xho I酶切位点，3′带有HindⅢ和Kpn I酶切位点的PCR产物，将PCR产物连接到pMD19-T载体中，获得含有ScPCaP基因的载体pMD19-T-PCaP；所述ScPCaP基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；上游引物ScPCaP-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；下游引物ScPCaP-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
B、用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切载体pMD19-T-PCaP回收正向片段S1，S1的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切pHANNIBAL载体，用T4DNA连接酶将正向片段S1连接到pHANNIBAL载体上，得到重组质粒pS1；用XbaⅠ和HindⅢ双酶切载体pMD19-T-PCaP，并回收反向互补片段S2，S2的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；用XbaⅠ和HindⅢ双酶切载体pS1，用T4DNA连接酶将反向互补片段S2连接到重组质粒pS1上，得到以pHANNIBAL载体内含子intron作为间隔区、具有发卡结构反向重复序列的中间载体pS1S2，然后用NotⅠ单酶切中间载体pS1S2，并回收S1-intron-S2片段；用NotⅠ单酶切pGREEN载体，将S1-intron-S2片段用T4DNA连接酶连接到pGREEN载体上，得到RNAi干扰载体pG0229-PCaP；
(2)遗传转化、转基因甘蔗植株的筛选鉴定及对花叶病的抗性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229-PCaP质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL，基因枪轰击法转化甘蔗，筛选鉴定阳性转基因植株，并接种SCMV、SrMV、SCSMV对转基因甘蔗植株进行抗性鉴定。
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