CN104846007B - 利用人工合成mv5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV5序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育和抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。本发明获得的植物表达载体采用了RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种摆脱了对抗源基因的依赖，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病育种周期。本发明已获得的转基因植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。
Description
技术领域 本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用人工合成MV5 序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，属于生物技术领域。
背景技术 甘蔗(Saccharum officinarum)是最重要的糖料作物，蔗糖占我国食糖总产的90％以上。甘蔗花叶病是甘蔗上发生最普遍、危害最严重的一类病毒病害，它主要破坏甘蔗叶片的叶绿体，严重制约其光合作用，从而使甘蔗的生长受到限制，造成产量降低5％-19％、节间变短、品质变劣和品种退化。该病病原复杂，可由多种病毒引起，主要为甘蔗花叶病毒 (Sugarcane Mosaic Virus,ScMV)和高粱花叶病毒(Sorghum Mosaic Virus,SrMV)，属马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，为单链正义RNA病毒，基因组结构简单，编码10个成熟蛋白，分别为P1、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。且该病的侵染病毒极易分化，不同地区的分离物或株系均存在差异。在1997年已报道至少存在7个株系，包括属于ScMV的株系ScMV-A,B,D,E和属于SrMV的株系SrMV-H,I,M，这些不同株系的病毒均可引起甘蔗花叶病的发生。因此，仅以单一株系的花叶病毒的单一基因为靶标的转基因改良显然无法应对蔗区病原株系多样化、复杂化以及优势株系的变化。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种转录后基因表达沉默机制，构建可转录为双链RNA(dsRNA)的植物表达载体转化植物，可实现植物目标基因的可遗传的基因沉默，用于基因功能鉴定和创造分子育种新材料。而且，引发RNAi的片段并不需要完整的基因序列，还可以是多个病毒的不同基因片段的嵌合体，因此，RNAi针对的靶标基因也可以是多个不同病毒的基因片段。为此，我们采用RNAi技术，将收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，并从多序列比对结果中分别选出两条100％同源的序列区段，采用人工合成的方式串联在一起，作为RNAi干扰片段，构建反向重复序列，得到一个RNAi载体。通过基因枪轰击法遗传转化甘蔗，以获得具有沉默病毒基因表达效果的转基因甘蔗。
专利号为ZL20071009226.8的发明专利“利用SrMV-P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法”，介绍了一种利用SrMV-P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P1基因的克隆、抗花叶病甘蔗转P1基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P1基因材料的培育以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。
发明内容 本发明的目的是提供一种利用人工合成序列MV5培育抗花叶病甘蔗品种的方法。针对现有蔗区甘蔗花叶病严重的问题，人工合成可同时沉默甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的新型核酸序列，构建RNAi载体，通过基因枪轰击法进行遗传转化，获得对花叶病高抗的转基因甘蔗。
本发明的目的是通过以下方法实现的。
本发明的利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV5序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于：
(1)MV5序列的人工合成：
从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV5序列，同时在正义链5′端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5′端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：
GATCTAGACT CGAGGCATCT CCAACATTCA GACAGATAAT GCACCACTTT AGTGATGCAGCTGAAGCGTA CATAGAGCGT AGATTTAGGC GCAATGTACA ATATCTCAGC TACGCATCAA ATATCAAGTTTAGTGCAGAA AAGTCGAGAT GTTCGGTCTG GACGGAAATG TCGGCGAGAC TCAGGAGAAT ACAGAGAGACACACAGCTGG TTAACCGTGA GAAAAAGCGT AGATTTAGGC GCTGTATACA ATATATCAGC TACGCATCTAATATCAGGTA CCATCGATAG
所述从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，指分别将收集到的ScMV各个病毒株系的核酸序列和SrMV各个病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从中分别各选取 2条长度大于40bp，且100％同源的序列区段串联在一起，共262bp，为目标RNAi干扰序列。
(2)RNAi干扰载体构建：
(a)目的片段Ⅰ的获得：利用限制性内切酶Kpn I和Xho I将目的片段A进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅰ；目的片段Ⅰ的序列为序列表中SEQID NO:2所示的核苷酸序列；
(b)目的片段Ⅱ的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅱ，目的片段Ⅱ的序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
(c)中间载体B的获得：将回收的目的片段Ⅰ和目的片段Ⅱ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B；所述中间载体B是指将目的片段Ⅰ插入到pHANNIBAL载体后获得的载体；
(d)目的片段Ⅲ的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶Cla I和XbaI 进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅲ；目的片段Ⅲ的序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
(e)目的片段Ⅳ的获得：将目的片段A用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅳ；目的片段Ⅳ的序列为序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
(f)中间载体C的获得：将回收的目的片段Ⅲ和目的片段Ⅳ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C；所述中间载体C是指将目的片段Ⅳ插入到中间载体B后获得的载体；
(g)目的片段Ⅴ的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅴ；目的片段Ⅴ的序列为序列表中 SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
(h)目的片段Ⅵ的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅵ；目的片段Ⅵ的序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
(i)抗甘蔗花叶RNAi干扰载体pG0229i-MV5的获得：将回收的目的片段Ⅴ和目的片段Ⅵ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi干扰载体pG0229i-MV5；
(3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体 pG0229i-MV5质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL ，基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。
所述pHANNIBAL载体、pGreenII0229载体、大肠杆菌DH5α，均由商业购买获得。
利用本发明的人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，在人工接种条件下，分别接种了属于ScMV株系的ScMV-A,D和属于SrMV株系的SrMV-I,M共4个株系，对照发病率分别达到了84.6％、85.7％、87.5％和86.9％，而转基因甘蔗均无发病，说明转入人工合成的MV5基因后提高了甘蔗抗多种花叶病毒的能力。采用本发明的方法筛选获得的转基因植株，都具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高的特点。
本发明的优点和有益效果：
1.本发明获得的植物表达载体采用了RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种摆脱了对抗源基因的依赖。
2.本发明人工合成的核酸序列包含2段与ScMV各病毒株系核酸序列100％同源和2段与SrMV各病毒株系核酸序列100％同源的序列区段，作为RNAi序列，获得的转基因植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。
3.本发明获得的RNAi干扰载体用于转基因甘蔗，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病育种周期。
附图说明 图1为构建完成的pG0229i-MV5质粒图谱。
具体实施方式 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例一：构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体
构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体的方法，包括以下步骤：
1、MV5序列的人工合成：
将收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从中分别选取2条长度大于40bp且100％同源的序列区段，然后将选取出来的4条序列区段采用人工合成的方式串联在一起，共262bp，即为目标RNAi干扰序列；同时在拟人工合成序列的正义链5′端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5′端加入Cla I和Kpn I酶切位点，人工合成获得目的片段A；所述目的片段A是指在目标RNAi干扰序列的正义链 5′端和反义链5′端加入酶切位点后的核苷酸序列；人工合成后，目的片段A的序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2、RNAi干扰载体构建：
利用限制性内切酶Kpn I和Xho I将步骤1中获得的目的片段A进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅰ，同时将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅱ，将回收的目的片段Ⅰ和目的片段Ⅱ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B；提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶Xba I和Cla I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅲ，同时将步骤1中获得的目的片段A也用限制性内切酶Xba I和Cla I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅳ，然后将回收的目的片段Ⅲ和目的片段Ⅳ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C；提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅴ，同时将植物表达载体 pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅵ，将回收的目的片段Ⅴ和目的片段Ⅵ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得RNAi干扰载体 pG0229i-MV5；所述琼脂糖凝胶电泳，参照《分子克隆》工具书中琼脂糖凝胶电泳的方法；所述将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，转化方法参照《分子克隆》工具书中用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌的方法；所述提取质粒DNA的方法，参照质粒提取试剂盒说明书；所述酶切方法，参照限制性内切酶的说明书；所述回收方法，参照胶回收试剂盒说明书；所述用T4-DNA连接酶进行连接方法，参照T4-DNA连接酶操作说明书；构建完成的 pG0229i-MV5质粒图谱如图1所示。
实施例二：一种抗花叶病转基因甘蔗的培育
一种抗花叶病转基因甘蔗的培育，包括以下步骤：
1、材料准备：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229i-MV5质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL ；受体甘蔗品种为ROC22；
2、基因枪轰击法遗传转化甘蔗：
受体材料的预处理：在甘蔗植株顶端部分，取白色心叶的肥厚带中生长点以上10cm内的幼嫩心叶，用体积浓度为75％的乙醇消毒后，并将其切成厚度不大于3mm的圆片，接种至MS+3.0mg/L 2.4-D+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的诱导培养上诱导培养7d，在基因枪轰击前4h转至MS+2mg/L 2,4-D+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇+30g/L蔗糖+6 g/L琼脂粉pH 5.8的渗透培养基中，进行预处理；
基因枪轰击转化：按照Bio-Rad公司的PDS-1000/He型基因枪操作说明书制备微弹，调整轰击距离6cm、气压1,100psi，轰击预处理的材料，将轰击后的材料分散开，继续在渗透培养基上处理20h；
转化后材料培养和再生植株的获得：将基因枪轰击转化后的材料转至MS+2.0mg/L2.4-D+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的恢复培养基，恢复培养6d；然后将恢复培养后的材料移至MS+2.0mg/L 2.4-D+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+4mg/L PPT pH 5.8的继代筛选培养基中，在28℃黑暗条件下筛选培养2-3代，15d/代；然后将材料转至MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+4mg/L PPT pH 5.8的分化筛选培养基中，在28℃下，每天给予12h～14h 2000Lx的光照，筛选培养2-3代，15d/代，直至长出幼苗；待幼苗长高至3-4cm时，将其转至1/2MS+0.2mg/L 6-BA+3mg/L NAA+60g/L蔗糖+6g/L 琼脂粉pH 5.8的生根培养基中，在28℃下，每天给予12h～14h 2000Lx的光照，直至幼苗生根；
3、分子检测：将生根后的幼苗移栽至小花盆中(草木灰：沙子：耕作土＝1:1:1)，待幼苗成活后，分别提取DNA，进行PCR检测，共获得46株阳性转基因植株；
4、抗病转基因甘蔗抗病性鉴定
参照专利号为20071009226.8的发明专利“利用SrMV-P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法”中接种鉴定方法。
结果：在人工接种条件下，分别接种了属于ScMV株系的ScMV-A,D和属于SrMV株系的SrMV-I,M共4个株系，对照发病率分别达到了84.6％、85.7％、87.5％和86.9％，而转基因甘蔗均无发病，说明转入人工合成的MV5基因后提高了甘蔗抗多种花叶病毒的能力。
抗甘蔗花叶病的植物表达载体是基于RNAi原理构建获得的，该技术可以使抗病毒育种摆脱了对抗源基因的依赖，同时人工合成的核酸序列包含多段与病原核酸序列100％同源的序列区段，作为RNAi干扰序列，获得的转基因植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点，同时用于转基因甘蔗，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病育种周期。
Claims (2)
1.一种利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV5序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于：
(1)MV5序列的人工合成：
从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV5序列，同时在正义链5′端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5′端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：
GATCTAGACT CGAGGCATCT CCAACATTCA GACAGATAAT GCACCACTTT AGTGATGCAG
CTGAAGCGTA CATAGAGCGT AGATTTAGGC GCAATGTACA ATATCTCAGC TACGCATCAA
ATATCAAGTT TAGTGCAGAA AAGTCGAGAT GTTCGGTCTG GACGGAAATG TCGGCGAGAC
TCAGGAGAAT ACAGAGAGAC ACACAGCTGG TTAACCGTGA GAAAAAGCGT AGATTTAGGC
GCTGTATACA ATATATCAGC TACGCATCTA ATATCAGGTA CCATCGATAG；
(2)RNAi干扰载体构建：
(a)目的片段Ⅰ的获得：利用限制性内切酶Kpn I和Xho I将目的片段A进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅰ；目的片段Ⅰ的序列为序列表中SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；
(b)目的片段Ⅱ的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅱ，目的片段Ⅱ的序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
(c)中间载体B的获得：将回收的目的片段Ⅰ和目的片段Ⅱ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B；所述中间载体B是指将目的片段Ⅰ插入到pHANNIBAL载体后获得的载体；
(d)目的片段Ⅲ的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅲ；目的片段Ⅲ的序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
(e)目的片段Ⅳ的获得：将目的片段A用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅳ；目的片段Ⅳ的序列为序列表中SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；
(f)中间载体C的获得：将回收的目的片段Ⅲ和目的片段Ⅳ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C；所述中间载体C是指将目的片段Ⅳ插入到中间载体B后获得的载体；
(g)目的片段Ⅴ的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅴ；目的片段Ⅴ的序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
(h)目的片段Ⅵ的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅵ；目的片段Ⅵ的序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
(i)抗甘蔗花叶RNAi干扰载体pG0229i-MV5的获得：将回收的目的片段Ⅴ和目的片段Ⅵ用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi干扰载体pG0229i-MV5；
(3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229i-MV5质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL ，基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，其特征在于所述从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，即将收集到的ScMV各个病毒株系的核酸序列和SrMV各个病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从中分别各选取2条长度大于40bp，且100％同源的序列区段串联在一起，共262bp。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180309 Termination date: 20190302 |