CN102363787A - 一种抗玉米矮花叶病RNAi载体 - Google Patents
一种抗玉米矮花叶病RNAi载体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，发明人在鉴定引起我国玉米矮花叶病的病毒种类和分析其基因组群体变异的基础上，筛选出了SCMV最保守的基因，找到了诱导RNA干扰最有效的3个片段（CI、NIb和CP）。本发明通过分子生物学技术构建了新的抗玉米矮花叶病RNAi载体（p3301-SCMVCINIb1CPRi）并转化大肠杆菌，对其进行生物保藏，其保藏编号为CGMCCNO4356。利用该载体可以培育出对我国玉米矮花叶病具有广谱、高效、持久抗性的转基因植株；通过RNAi获得的转基因植株抗病程度高，特异性强。而且转入植物的反向重复不需要完整病毒基因，避免了翻译成蛋白质可能带来的潜在风险，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种RNA干扰（RNAi）载体，特别涉及一种抗甘蔗花叶病毒引起的玉米矮花叶病的RNAi载体。
背景技术
甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），在自然界中主要通过蚜虫和种子传播，是国内外甘蔗和玉米等禾本科作物上的重要病毒。SCMV的基因组由一条正单链RNA分子组成，有一个大的开放阅读框（ORF），可表达产生一个多肽，然后经翻译切割成10个成熟蛋白。SCMV感染所致的玉米矮花叶病（Maize dwarf mosaic，MDM）在我国北方大面积发生，是玉米生产上面临的突出问题。引起我国玉米矮花叶病的SCMV大多属于MDB株系。但近年在山东、河北等地还出现了一个国内外未见报道的新株系，可以侵染我国大多数主栽玉米品种。
种植抗病品种是防治玉米矮花叶病最有效的措施。但在培育抗病品种时面临选育周期长、抗病基因匮乏及病毒变异导致的抗病性丧失等问题。利用RNA干扰技术，通过基因工程手段可以在较短时间内获得抗病毒材料。
RNA干扰（RNA interference，RNAi；也称RNA沉默，在植物中也可称为转录后基因沉默）是真核生物体内发生的、基于核酸序列同源性的一种基因表达调控机制。双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）是RNAi起始的关键因子。它首先被Dicer酶降解为3′-端具有2 nt突出的21-26 nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），后者整合入RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），并指导RISC对同源RNA进行识别和切割，最终导致RISC降解靶标mRNA。
dsRNA形成的有效途径之一是将体外构建的反向重复结构（inverted repeats，IR）转入植株。转入植物的反向重复载体在植物体内转录形成dsRNA后，启动RNAi，有效控制与转基因有同源性的入侵病毒。反向重复结构由一段间隔序列（spacer）连接两段反向互补序列构成，转录后会形成发夹状RNA（hairpin RNA，hpRNA）。hpRNA由茎（stem，是反向互补序列转录的RNA配对形成的双链）和环（loop，是由spacer转录的RNA单链结构）组成。hpRNA中的茎是诱发序列特异性基因沉默的关键部份，茎的长短影响RNA沉默的效率和稳定性，植物中50-1000 bp的dsRNA同源片段均能高效诱发转录后基因沉默，沉默效率接近100%。转化IR获得的抗病植株比例和抗病程度高于转正义或反义基因。
RNAi的效率还取决于IR的茎与入侵病毒核酸一致率的高低。转基因与入侵病毒基因组核苷酸一致率越高，则抗病效果越好。植物RNA病毒在自然界中是以准种形式存在，同一种病毒的基因组可能有一定程度的变异。在构建RNAi载体时，需要针对不同病毒找到最保守的基因，筛选最有效的片断作为靶标。
因此如何应用RNA干扰技术来获得抗玉米矮花叶病的植株，就成为了现在亟待解决的问题之一。
发明内容
基于上述的原因，发明人利用在鉴定引起我国玉米矮花叶病的病毒种类和分析其基因组群体变异以及已知SCMV的全基因序列的基础上，筛选出了SCMV最保守的基因，并在其中找到了诱导RNA干扰最有效的3个片段（CI、NIb和CP）。本发明通过分子生物学技术构建了新的抗玉米矮花叶病RNAi载体（p3301-SCMVCINIb1CPRi）。利用该载体可以培育出对我国玉米矮花叶病具有广谱、高效、持久抗性的转基因植株；通过RNAi获得的转基因植株抗病程度高，特异性强。转入植物的反向重复不需要完整病毒基因，避免了翻译成蛋白质可能带来的潜在风险，而且产生的RNA干扰高效持久并能在后代稳定遗传，对于采用RNA干扰技术来获得抗病毒植株的研究，提供了良好的参考借鉴作用。
本发明所提供的RNAi载体，发明人将其命名为p3301-SCMVCINIb1CPRi，其序列如Seq ID No:1所示。
其中发明人筛选出了SCMV最保守的基因，发现了诱导RNA干扰最有效的3个片段：CI、NIb和CP，其序列分别如Seq ID No:2、Seq ID No:3和Seq ID No:4所示，其中CI位于SCMV全序列中的4878-5430 bp，NIb位于全序列的7652-7892 bp，CP位于全序列的9008-9303 bp，具体如下表：
根据上述的三个片段，发明人通过融合PCR构建反向重复序列，通过NcoI/BstEⅡ双酶切将反向重复序列插入双元表达载体pCAMBIA3301，从而获得了能诱导对我国玉米矮花叶病广谱抗性的RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi。
由于该载体中整合了SCMV中诱导RNA干扰最有效的3个片段，将其转化玉米，可将反向重复序列整合到植物基因组内，转录后形成以我国SCMV为特异靶标的siRNA，由此可以介导对我国玉米矮花叶病的抗性。本发明中的载体可以用于培育对我国玉米矮花叶病具有广谱、高效、持久抗性的转基因玉米植株。
综上所述，本发明发现了SCMV最保守的基因中诱导RNA干扰最有效的3个片段，并基于上述片段获得了以我国SCMV为特异靶标的siRNA，这样就实现了应用RNA干扰技术来获得抗玉米矮花叶病的植株，避免了翻译成蛋白质可能带来的潜在风险，而且产生的RNA干扰高效持久并能在后代稳定遗传，对于采用RNA干扰技术来获得抗病毒植株的研究，提供了良好的参考借鉴作用。
本发明所提供的RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi，转化到大肠杆菌中(EC3301- SCMVCINIb1CPRi)，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体保藏信息如下：
保藏信息
保藏时间：2010年11月22日
保藏单位名称：中国普通微生物保藏管理中心 CGMCC
保藏编号：CGMCC NO 4356
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所
分类命名: 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。
附图说明
图1、本发明构建的反向重复片段及引物示意图；
图2、单片段的扩增，泳道1-3分别为CI、Nib和CP片段。
图3、正向片段的融合扩增，泳道1为CINIb1CP；
图4、反向片段的扩增，泳道1分别为R-CINIb1CP；
图5、RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi的双酶切鉴定的电泳图，泳道1为p3301-SCMVCINIb1CPRi质粒，泳道2为p3301-SCMVCINIb1CPRi用NcoⅠ/ BstEⅡ双酶切产物，其中箭头指示的是本发明构建的反向重复片段；
图6、RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi的PCR鉴定的电泳图，泳道1、2同为p3301-SCMVCINIb1CPRi质粒PCR扩增产物，泳道3为以pCAMBIA3301为对照进行PCR扩增。
具体实施方式
本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：
| 引物编号 | 序列（5'-3'） | Seq ID No |
| 1 | CATGCCATGGGCGGTACCTTCACAATTGGTTAACGG | Seq ID No:5 |
| 2 | CTAAGTTCCATTCTTCCATTTCCAGCGCCCTTGCAGTC | Seq ID No:6 |
| 3 | GACTGCAAGGGCGCTGGAAATGGAAGAATGGAACTTAG | Seq ID No:7 |
| 4 | CACTAAAATGATGCATTATCACCATTGGCGAACATTC | Seq ID No:8 |
| 5 | GAATGTTCGCCAATGGTGATAATGCATCATTTTAGTG | Seq ID No:9 |
| 6 | CCAAGCTTGGGTGACCTTGCGACTAACGTCGCCA | Seq ID No:10 |
| 7 | GGGTACCCTGCGCACTGATCCTTGTTC | Seq ID No:11 |
| 8 | CATGCCATGGTTGCGACTAACGTCGCCA | Seq ID No:12 |
| 9 | TTGTATTGGACTGCAAGGGCGCT | Seq ID No:13 |
| 10 | GCTTCAGCTGCATCACTAAAATGAT | Seq ID No:14 |
其中引物1-6应用于单片断扩增及融合，引物7和8应用于反向片段的扩增，引物9和10应用于检测。
实施例1：单片段的扩增
1.总RNA提取及RT-PCR反应
从田间采集明显表现矮花叶症状，且经鉴定确认为感染甘蔗花叶病毒的玉米植株，按照TransZol试剂盒（Beijing TransGen Biotech Co., Ltd）提供的方法，从玉米叶片中提取总RNA。
以植物总RNA为模板，分别以引物2、4、6为反转录引物进行反转录。反应体系如下：
| 5×反转录缓冲液(TransGen) | 4 μl |
| dNTP（10 mM） | 1 μl |
| 反转录引物（10 mM） | 1 μl |
| RNA酶抑制剂(TransGen，50 U/μl) | 0.5 μl |
| 无RNA酶的H2O | 2.5 μl |
| 感病植株总RNA | 10 μl |
| EasyScipt反转录酶(TransGen，200 U/μl) | 1 μl |
| 总体积 | 20 μl |
混匀后42℃孵育50 min，70℃孵育15 min停止反应。
以所得反转录产物为模板，使用不加尾的KOD聚合酶（TOYOBO，Japan）进行单片段的PCR扩增。
CI段PCR反应体系如下：
| 反应成分 | 加入体积 |
| 10× PCR Buffer | 2.5 μL |
| MgSO4（25 mM） | 1.5μL |
| dNTP（2.0 mM each） | 1.0 μL |
| 引物1（10μM） | 1.0 μL |
| 引物2（10μM） | 1.0 μL |
| 模板DNA | 0.5 μL |
| KOD聚合酶 | 0.3 μL |
| 加ddH2O至 | 25.0 μL |
NIb段PCR反应体系如下：
| 反应成分 | 加入体积 |
| 10× PCR Buffer | 2.5 μL |
| MgSO4（25 mM） | 1.5μL |
| dNTP（2.0 mM each） | 1.0 μL |
| 引物3（10μM） | 1.0 μL |
| 引物4（10μM） | 1.0 μL |
| 模板DNA | 0.5 μL |
| KOD聚合酶 | 0.3 μL |
| 加ddH2O至 | 25.0 μL |
CP段PCR反应体系如下：
| 反应成分 | 加入体积 |
| 10× PCR Buffer | 2.5 μL |
| MgSO4（25 mM） | 1.5μL |
| dNTP（2.0 mM each） | 1.0 μL |
| 引物5（10μM） | 1.0 μL |
| 引物6（10μM） | 1.0 μL |
| 模板DNA | 0.5 μL |
| KOD聚合酶 | 0.3 μL |
| 加ddH2O至 | 25.0 μL |
PCR程序如下：
| 1 | 94℃ 3 min |
| 2 |   |
| 3 | 55℃（↓0.2℃/cycle） 50 s |
| 4 | 72℃ 40 s |
| 5 | 72℃ 10 min |
2、PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
3、切胶，使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit（TransGen Biotech，China）分别回收大小为550 bp（CI段）、240 bp（NIb段）和300 bp（CP段）的片段。使用超微量分光光度计ScanDrop250（Analytikjena，Germany）测定回收产物的核酸浓度。
实施例2：正向片段的扩增
1、采用实施例1中所获得的CI段回收产物、NIb段回收产物和CP段回收产物，并使其加入量相等（50-125 ng/50 μL体系），进行不加引物的后延伸。
PCR体系如下：
| 反应成分 | 加入体积 |
| 10× PCR Buffer | 5.0 μL |
| MgSO4（25 mM） | 3.0 μL |
| dNTP（2.0 mM each） | 2.0 μL |
| CI段回收产物 | 9.0 μL（约90 ng） |
| NIb段回收产物 | 9.0 μL（约90 ng） |
| CP段回收产物 | 9.0 μL（约90 ng） |
| KOD聚合酶 | 0.5 μL |
| 加ddH2O至 | 50.0 μL |
延伸程序如下：
| 1 | 94 ℃ 3 min |
| 2 |   |
| 3 | 55 ℃ 20 s |
| 4 | 72 ℃ 1 min |
| 5 | 72 ℃ 10 min |
2、上步延伸产物取15μL为模板，使用加尾的Taq聚合酶（TaKaRa，Japan），加入引物1、6进行融合PCR扩增。
PCR体系如下：
| 反应成分 | 加入体积 |
| 10× PCR Buffer | 5.0 μL |
| MgSO4（25 mM） | 3.0 μL |
| dNTP（2.5 mM each） | 2.0 μL |
| 引物1（10 μM） | 2.0 μL |
| 引物6（10 μM） | 2.0 μL |
| 模板 | 15.0 μL |
| Taq聚合酶 | 0.5 μL |
| 加ddH2O至 | 50.0 μL |
扩增程序如下：
| 1 | 94 ℃ 3 min |
| 2 |   |
| 3 | 61 ℃ 50 s |
| 4 | 72 ℃ 1 min |
| 5 | 72 ℃ 10 min |
3、琼脂糖凝胶电泳回收，将融合好的约1100 bp正向片段命名为CINIb1CP。
4、取回收的融合片段CINIb1CP，连接pMD19-T simple载体（4℃，8h）。
连接体系如下：
| CINIb1CP | 7.7 μL |
| 10× Ligase buffer | 1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
| pMD19-T simple | 0.3 μL |
5、连接产物通过热激法转化DH5α感受态细胞。
6、挑取单斑摇菌，碱裂解法抽提质粒。
7、NcoI/BstEⅡ（NEB）双酶切2小时进行筛选，正确的克隆（命名为pMD19-T simple- CINIb1CP）可切出一条1100bp左右的带。
酶切体系如下：
| 质粒 | 8.0 μL |
| 10×E Buffer 3 | 2.0 μL |
| BSA（10 mg/ml） | 0.2 μL |
| BstEⅡ | 0.5 μL |
| NcoI | 0.5 μL |
| 加ddH2O至 | 20 μL |
实施例3：反向片段的扩增
以实施例2所获得的CINIb1CP：约1100 bp正向片段为模板，扩增反向片段R-CINIb1CP（约900bp；比CINIb1CP少loop部分）。
PCR体系如下：
| 反应成分 | 加入体积 |
| 10× PCR Buffer | 5 μL |
| MgSO4（25 mM） | 3 μL |
| dNTP（2.5 mM each） | 2.0 μL |
| 引物7（10μM） | 2.0 μL |
| 引物8（10μM） | 2.0 μL |
| 模板（CINIb1CP回收产物） | 1.0 μL |
| Taq聚合酶 | 0.5 μL |
| 加ddH2O至 | 50.0 μL |
PCR程序如下：
| 1 | 94 ℃ 3 min |
| 2 |   |
| 3 | 60 ℃ 50 s |
| 4 | 72 ℃ 1 min |
| 5 | 72 ℃ 10 min |
2、琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约900bp的片段（R-CINIb1CP）。
实施例4：反向重复片段的构建
1、实施例2中获得的pMD19-T simple- CINIb1CP质粒与实施例3中 R- CINIb1CP片段用NcoI/KpnI双酶切。
酶切体系如下：
2、2小时后，从pMD19-T simple-CINIb1CP的酶切体系中回收约为4100 bp的带，从R-CINIb1CP的的酶切体系中回收约为900 bp的带，测定两者的浓度。
3、回收产物进行连接（使pMD19-T simple-CINIb1CP与R- CINIb1CP量的比例在1:3-1:10之间）。连接体系如下：
| R-CINIb1CP | 6 μL |
| pMD19-T simple-CINIb1CP | 2 μL |
| 10× T4 Ligase buffer | 1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
4、热激法转化DH5α，挑单斑摇菌。
5、碱裂解法提取质粒，NcoI/BstEⅡ双酶切筛选，正确的克隆应切出有一条2000 bp的带，质粒命名为pMD19-T simple-CINIb1CPRi。
酶切体系如下：
| 质粒 | 8.0 μL |
| 10× NE Buffer 3 | 2.0 μL |
| BSA（10 mg/ml） | 0.2 μL |
| NcoI | 0.5 μL |
| BstEⅡ | 0.5 μL |
| 加ddH2O至 | 20 μL |
实施例5：反向重复载体的构建
1、将上述获得的pMD19-T simple-CINIb1CPRi与市场上直接购得的pCAMBIA3301用NcoI/BstEⅡ双酶切。酶切体系如下：
2、电泳回收，pMD19-T simple-CINIb1CPRi回收2000 bp左右的带，pCAMBIA3301回收10 kb左右的带。测定回收产物的核酸浓度。
3、将pCAMBIA3301与CINIb1CPRi连接（1:3-1:10）。
连接体系如下：
| CINIb1CPRi | 6 μL |
| pCAMBIA3301 | 2 μL |
| 10× Ligase Buffer | 1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
4、转化DH5α，挑单斑摇菌，抽提质粒。
5、NcoI/BstEⅡ双酶切鉴定筛选，酶切体系如下：
| 质粒 | 8.0 μL |
| 10×NE Buffer 3 | 2.0 μL |
| BSA（10 mg/ml） | 0.2 μL |
| BstEⅡ | 0.5 μL |
| NcoI | 0.5 μL |
| 加ddH2O至 | 20 μL |
正确的克隆可切到有一条1980 bp的带，也就是目标载体，其序列如Seq ID No:1所示。将此最终构建好的载体命名为p3301-SCMVCINIb1CPRi。
6、可以通过设计的检测引物9、10对p3301-SCMVCINIb1CPRi进行PCR检测，应扩增出250 bp的片段。
PCR体系如下：
| 反应成分 | 加入体积 |
| 10× PCR Buffer | 2.5 μL |
| MgSO4（25 mM） | 1.5 μL |
| dNTP（2.5 mM each） | 1.0 μL |
| 引物9（10 μM） | 1.0 μL |
| 引物10（10 μM） | 1.0 μL |
| p3301-SCMVCINIb1CPRi | 0.5 μL |
| Taq聚合酶 | 0.3 μL |
| 加ddH2O至 | 25.0 μL |
PCR程序如下：
| 1 | 94 ℃ 3 min |
| 2 |   |
| 3 | 54 ℃ 30 s |
| 4 | 72 ℃ 30 s |
| 5 | 72 ℃ 10 min |
Claims (3)
1.一种抗玉米矮花叶病RNAi载体，其基因序列如Seq ID No:1所示。
2.一种将权利要求1所述RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi转化到大肠杆菌中获得的大肠杆菌，其保藏编号为CGMCC NO 4356。
3.如权利要求1所述的抗玉米矮花叶病RNAi载体，在转化玉米或水稻或小麦或其他禾本科作物上的应用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011103261175A CN102363787A (zh) | 2011-10-25 | 2011-10-25 | 一种抗玉米矮花叶病RNAi载体 |
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| CN2011103261175A CN102363787A (zh) | 2011-10-25 | 2011-10-25 | 一种抗玉米矮花叶病RNAi载体 |
Publications (1)
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|---|---|
| CN102363787A true CN102363787A (zh) | 2012-02-29 |
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| CN2011103261175A Pending CN102363787A (zh) | 2011-10-25 | 2011-10-25 | 一种抗玉米矮花叶病RNAi载体 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120229 |