CN102154353A

CN102154353A - 抗小麦矮缩病毒的rna干涉载体、构建方法及其在小麦遗传转化中的应用

Info

Publication number: CN102154353A
Application number: CN2010106198944A
Authority: CN
Inventors: 王锡锋; 庞俊兰; 吴蓓蕾; 刘艳; 李莉
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明涉及“抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体、构建方法及其在小麦遗传转化中的应用”，属于基因工程技术领域。本发明中抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体骨架载体是pMCG161，在其上游的两个酶切位点AscI、AvrII间插入WDV-CP基因的正义链，在下游的两个酶切位点SpeI、SgfI间插入WDV-CP基因的反义链，通过载体上的intron形成发夹结构，这样可得到了用于基因枪转化单子叶植物的双价载体。本发明通过基因枪法将其转入小麦中，获得对小麦矮缩病毒具有抗性的转基因小麦品种。本发明为植物抗病育种提供了一种高效的育种途径和新的策略。

Description

抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体、构建方法及其在小麦遗传转化中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。本发明特别涉及一种适合单子叶植物遗传转化抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体的构建及其在小麦遗传转化中的应用。进一步涉及小麦矮缩病毒(WDV)的外壳蛋白(CP)基因表达载体及其遗传转化小麦并得到有抗性的植株。

背景技术

小麦矮缩病(wheat dwarf disease)是小麦重要病害之一。它是由小麦矮缩病毒(Wheatdwarf virus，WDV)引起。小麦矮缩病毒的传毒介体是条沙叶蝉，它以成、若虫刺吸作物茎叶，导致受害幼苗变色，生长受到抑制。20世纪80年代最先在瑞典报道了小麦矮缩病毒的发生(Kvarnheden等，2002)。近年来，该病毒已经在非洲、欧洲、亚洲、和大洋洲引起了严重的经济损失。2007年本实验室在国内首次报道了该病毒引起矮缩病的发生。随后在陕西、甘肃、河北、云南等12个省被发现。该病在陕西北部麦区已经引起严重的减产，如2007和2008年陕西韩城发病面积超过10万亩，病株率20％以上，重病田达1万亩。目前小麦矮缩病已经成为威胁我国西北、华北和西南麦区重要的病毒病。

目前农业生产上防治此类病害的主要方法：化学药剂、耕作措施和抗病育种。化学药剂容易造成人蓄中毒、农药残留和环境污染等危害；轮作换茬等耕作措施不能根除病害；综合比较来看培育抗病小麦新品种是比较有效的防治措施，但由于小麦抗病种质资源的缺乏，常规育种方法又存在周期长、定向性差、易带入不良性状等缺点，因此单靠传统育种培育抗病害的小麦新品种的方法获得抗病、高产优质的双重特性品种的难度很大。于是小麦生物技术抗病育种应运而生。

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默现象，它是指通过双链RNA介导的特异性的降解对应序列的mRNA，从而特异性地抑制相应基因的表达，是植物对外来入侵者的一种重要的防御机制

近年来，RNAi技术在研究植物病毒基因功能与致病机制和植物抗病机理中有了广泛应用，但在国内外RNAi介导的WDV抗性还未见报道。

发明内容

针对上述不足，本发明在WDV(来自陕西韩城SXHC-2样品，目前序列还未登录GenBank)上设计了WDV高保守性的外壳蛋白(CP)介导的RNAi的dsRNA前体，将WDV-CP基因连接到双向干涉载体pMCG161载体的正义链位点，而后在正义链载体的基础上将WDV-CP基因连接到双向干涉载体pMCG161载体的反义链酶切位点上，最终构建了适合禾本科植物转化的干涉载体。利用基因枪的方法进行小麦的遗传转化，借助小麦组织中RdRp的转录作用，产生WDV-CP基因的dsRNA的形式，再由Dicer酶的作用产生SiRNA，当小麦受WDV侵染时，就可产生SiRNA，从而达到利用RNAi介导对WDV的抗性的目的。但由于本发明所选择的序列为WDV的保守序列，因此所得到的转基因植株可以使入侵的致病病毒发生RNA沉默现象，且这种沉默具有普遍性，从而使植物对病毒具备普遍的抗性。期望筛选出免疫或高抗WDV的转基因小麦植株，探索利用分子生物学技术获得抗WDV的基因工程新策略，最终实现利用RNAi获得抗WDV小麦新品种的预期目标。

依据现有的WDV的保守序列设计引物，PCR扩增小麦矮缩病毒陕西韩城SXHC-2样品的cp基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO9所示。

抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体，包括骨架载体和含有正、反义链的发夹结构，其特征在于：以SEQ ID NO9所示的WDV-CP基因序列作为正、反义链。

所述骨架载体为pMCG161。

所述WDV-CP基因的正义链插入pMCG161中上游的两个酶切位点AscI、AvrII间，WDV-CP基因的反义链插入pMCG161中下游的两个酶切位点SpeI、SgfI间。

上述干涉载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)WDV-CP基因的获得

以陕西韩城SXHC-2样品的总DNA为模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2为引物对，经PCR扩增WDV-CP，得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP。

SEQ ID NO 1：5’-ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’

SEQ ID NO2：5’-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’

(2)WDV-CP正义链载体的获得

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板，以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4为引物对，经PCR扩增，得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP+，用AscI、AvrII双酶切阳性质粒和载体pMCG161，再用T4 DNA连接酶将正义链片段和载体连接，得到WDV-CP正义链载体pMCG161+WDV。

SEQ ID NO3：5’-AT GGCGCGCC ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’

SEQ ID NO4：5’-AT CCTAGG TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’

(3)WDV-CP干涉载体的获得

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板，以SEQ ID NO5和SEQ ID NO6为引物对，经PCR扩增，得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP-，用SpeI、SgfI双酶切阳性质粒和WDV-CP正义链载体，再用T4DNA连接酶将反义链片段和载体连接，得到干扰载体pMCG161+/-WDV。

SEQ ID NO5：5’-AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’

SEQ ID NO6：5’-AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’

(4)WDV-CP反义链载体的获得

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板，以SEQ ID NO5和SEQ ID NO6为引物对，经PCR扩增，得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP-，用SpeI、SgfI双酶切阳性质粒再用T4 DNA连接酶将反义链片段和载体连接，得到反义链载体pMCG161-WDV。

SEQ ID NO5：5’-AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’

SEQ ID NO6：5’-AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’

(5)另一种方法获得WDV-CP干涉载体

用SpeI、SgfI双酶切pMD18-T-WDV-CP-阳性质粒和载体pMCG161，再用T4DNA连接酶将反义链片段和载体pMCG161连接，得到WDV-CP反义链载体；再用AscI、AvrII双酶切pMD18-T-WDV-CP+阳性质粒和WDV-CP反义链载体，再用T4 DNA连接酶将正义链片段和酶切后的WDV-CP反义链载体连接，得到干扰载体pMCG161+/-WDV。

上述RNA干涉载体在遗传转化单子叶植物中的应用。

所述应用是将上述RNA干涉载体转化有关单子叶受体植物，使之对小麦矮缩病毒产生抗性。

所述转化方法为基因枪法。

所述受体植物为禾本科植物。

所述禾本科植物为小麦。

本发明根据WDV的基因组序列，设计了SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，以感染小麦矮缩病毒(WDV)的陕西韩城SXHC-2样品的总DNA为模板，扩增得到了外壳蛋白(CP)的目的片段为783bp。根据双向干涉载体pMCG161的酶切位点设计引物，在其上游的两个酶切位点AscI、AvrII间插入WDV-CP基因的正义链，在下游的两个酶切位点SpeI、SgfI间插入WDV-CP基因的反义链。通过载体上的intron(rice Waxy-a intron 1)形成发夹结构，这样可用于基因枪转化单子叶植物的干扰载体就构建成功。

本发明为植物抗病基因工程提供了一种干扰病毒基因表达载体及其构建方法与应用，为转基因技术及RNA干扰在生物抗性育种中的应用提供了新的思路。将该载体转入小麦中，成功获得了抗病毒植株，实现了利用RNAi原理获得抗WDV小麦新品种的预期目标，为RNAi介导的植物抗性育种及基因工程提供了成功的实例，弥补了RNAi介导的WDV抗性在本领域研究中的空缺。

本发明的干扰载体并不只限于对WDV进行转化和用于培育对WDV有抗性的转基因植株。利用本发明的干扰载体转化所得的抗性生物体可以是任何微生物、植物或其组织、细胞，以及由此所获得具有任何抗病活性的微生物、植物，以及该类植物后代的种子、杂交和转育后代。

附图说明

图1.PCR扩增获得WDV外壳蛋白(CP)基因的电泳图

泳道1.DL2000，5.健康小麦植株，2、3、4、6、7克隆得到WDV外壳蛋白(CP)

图2.正义链载体中正义链片段的PCR检测电泳图

泳道1.8DL2000，2阳性对照，3水，4.5.6.7.8.9正义链PCR产物

图3.反义链载体中反义链片段的PCR检测电泳图

泳道1.8DL2000，2阳性对照，3水，4.5.6反义链PCR产物

图4.正、反义链载体的正、反义片段酶切鉴定电泳图

泳道1-2正义链载体双酶切，3为DNA Marker DL2000，4-5.反义链载体双酶切，6.DNA Marker HandIII

图5.干涉载体中正、反义链片段的酶切鉴定电泳图

泳道1DNA Marker DL2000，2双酶切正义链，

图6.载体pMCG161的结构示意图；

图7.质粒载体pMCG161外源片断构建线性图；

AscI和AvrII两个酶切位点，用来插入cp基因的正义链；在它的下游含有SpeI与SgfI两个酶切位点，用来插入cp基因的反义链

图8.小麦基因枪转化小麦幼胚愈伤组织获得转基因植株的过程；

A基因枪转化前愈伤组织处理，B基因枪转化后愈伤组织恢复培养，C基因枪转化后打枪后愈伤组织出现绿芽点，D诱导生根壮苗培养，E移栽到温室花盆中的转基因小麦

图9A.T₀代转基因植株WDV-CP的PCR电泳图

泳道1.DL2000 2.阳性对照；3.阴性对照；4.水；5.6.7.8…转基因植株；5、8为阳性植株，

图9B.T₀代转基因植株intron的PCR电泳图

泳道1.DL2000 2.阳性对照；3.阴性对照；4.水；5.6.7.8…转基因植株；5、7、11为阳性植株

图9C.T₁代转基因植株的WDV-CP片段(783bp)的PCR电泳图

泳道1.DL2000 2.阳性对照；3.性对照.；5水.；4.6.7转基因阳性植株；

图10.转基因植株WDV的抗性测定对照图

1、感病的对照小麦品种扬麦158 未接种未发病

2、小偃22(抗病的对照小麦品种) 接种未发病

3、感病的对照小麦品种扬麦158 接种发病

4、5、6、7、8转基因植株接种未发病

具体实施方式

实验中使用的载体pMCG161(该载体保存在中国农业科学院植物保护研究所病毒组实验室内，可向公众发放)是专门适用于禾本科植物转化的干扰载体(图6)，它含有来源于水稻的Rice waxy-a intron 1，位于5442bp-6576bp，在它的上游含有AscI和AvrII两个酶切位点，用来构建cp基因的正义链，在它的下游含有SpeI与SgfI位点，用来构建cp基因的反义链(图7)。

实验中所用的pGEM T-easy，购自Promega生物技术公司。pMD18-T为常用载体。

陕西韩城SXHC-2样品，在申请人的论文“陕西韩城严重发生的小麦矮缩病病原鉴定与原因分析”中公开过，该材料保存在中国农业科学院植物保护研究所病毒组实验室内，可向公众发放。

实施例1，抗小麦矮缩病毒(WDV)的RNA干涉载体的构建

步骤1、依据已知的WDV的基因组序列，设计全长cp基因的引物，如下：

SEQ ID NO1：(WDV-CP) 5’-ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’

SEQ ID NO2：(WDV-CP) 5’-TACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’

以陕西韩城SXHC-2样品的总DNA为模板，经PCR扩增WDV-CP，得到PCR产物，目的片段为783bp(图1)。回收PCR产物，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，进行克隆测序鉴定，如SEQ ID NO9所示，得到cp基因的阳性克隆。

步骤2：设计带有2个酶切位点AscI、AvrI的引物

AscI

SEQ ID NO3：WDV-CP+(F)：5’-AT GGCGCGCC ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’

AvrII

SEQ ID NO4：WDV-CP+(R)：5’-AT CCTAGG TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板进行PCR扩增，得到PCR产物(图2)，回收PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP+。用AscI、AvrI，双酶切阳性质粒和载体pMCG161，再用T₄ DNA连接酶将正义链片段和载体连接，得到WDV-CP正义链载体pMCG161+W(简写pS)。正义链载体酶切检测结果(图3)

步骤3、设计带有2个酶切位点SpeI和SgfI的引物：

SgfI

SEQ ID NO5：WDV-CP-(F)：5’-AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’

SpeI

SEQ ID NO6：WDV-CP-(R)：5’-AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板进行PCR扩增，得到产物、回收与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP-。用SpeI和SgfI双酶切阳性质粒和载体pMCG161，再用T4DNA连接酶将反义链片段和载体连接，得到WDV-CP反义链载体pMCG161-W(简写pA)。反义链载体酶切检测结果(图4)

步骤4、WDV-CP正义链载体阳性质粒经SpeI、SgfI酶切，将经SpeI、SgfI酶切得到的反义链连接到WDV-CP正义链载体上，最终构建成干扰载体pMCG161+/-W(简写pSA)。干扰载体酶切检测结果见图5。

实施例2转基因植物的获得(图8)

步骤1、干扰载体及其对照载体，分别转化感受态细胞DH5α，涂板，37℃培养过夜。挑取单菌落，经过小量液体LB(3-5ml)震荡培养；中量培养(20-30ml)后；以1∶50的比例接种200ml液体LB培养z基，37℃震荡培养2-3小时；加入终浓度为170μg/ml的氯霉素，继续培养16-18小时；5000rpm10分钟离心收集菌体；采用大量质粒提取试剂盒(TIANGEN)纯化质粒。方法参见厂家说明书。获得质粒浓度达2-3mg/ml，含有90％以上的超螺旋DNA，可用于基因枪转化。

步骤2、将授粉14天左右的小麦幼穗(品种：扬麦158、科农199等)从田间采回，人工剥粒后在超净工作台中70％乙醇和10％(V/V)次氯酸钠溶液消毒，用解剖刀取小麦幼胚，幼胚直径约1-1.5mm为宜，放于SD₂培养基上，盾片向上，胚芽向下，两胚芽相互间距0.5cm左右。26℃黑暗条件下诱导愈伤组织，7-10d后将愈伤组织集中于培养皿中央，直径约2cm左右，经0.4mol/L渗透压培养基(SD₂添加0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇)处理4～6h以备基因枪轰击之用。

步骤3、将步骤2备好的小麦愈伤组织和步骤1中提取的质粒应用于基因枪的转化。轰击后的愈伤组织继续在原渗透压培养基上处理16～18h，然后转入SD₂培养基黑暗条件下(26℃)恢复培养2周。

步骤4、恢复培养后的愈伤组织移到MS+NAA(1mg/L)+KT 1mg/L+Bialaphos(PPT)3mg/L的培养基上诱导分化3周(每日10h光照，24℃)，出现绿芽分化后，转到无激素培养基(MS+Bialaphos 5mg/L)上培养1周，再转入无激素培养基(MS+Bialaphos 5mg/L)上继续培养(每日10h光照，24℃)，直到小苗生长到1～2cm时，移入MS+IAA(0.5mg/L)+Bialaphos(6mg/L)的培养基上壮苗，再生植株生长到适宜大小(苗高6～8cm，根系较好)时放入4℃冰箱中春化处理20～30天，然后移入装有灭菌土的纸营养钵中，外罩保鲜膜保湿。最后移入花盆，置于温室。通过基因枪的遗传转化，获得了四个载体的T₀代植株。

实施例3转基因小麦植株的分子检测(见图9)

本发明以SEQ ID NO3/SEQ ID NO4和Intron 1/Intron 2为引物，对以扬麦158为受体的转WDV全长cp基因的400株T₀代转基因植株进行PCR检测，结果表明，获得了四个载体的T₀代转基因小麦，pSA、pS、pA和pMCG161的阳性T₀代转基因小麦植株分别是14株、6株、4株和4株。对转基因小麦的T₀、T₁代分别进行了PCR鉴定，T₁代植株呈现出3∶1分离。

实施例7、转基因小麦植株对WDV的抗病性鉴定(见图10)

本发明采用生物学方法测定了转基因小麦植株对WDV的抗病性。方法如下：待小麦长到3叶期时，对转基因小麦进行WDV接种试验。将已在WDV毒源上饲毒5天的条沙叶蝉接种转基因小麦植株、对照小麦感病品种扬麦158和对照小麦抗病品种小偃22。每株接种带毒(WDV)条沙叶蝉10-20头，待条沙叶蝉在麦苗上取食5天后，用杀虫剂把条沙叶蝉杀死，接种25天后观察记录发病情况。抗病性功能检测结果见图10所示。感病的对照小麦品种扬麦158接种条沙叶蝉后发病，而转基因植株接种条沙叶蝉后未发病。

由于WDV于2007年在我国首次发现，因此关于它的病情级别的划分只鉴于我们实验室与西北农林科技大学所做的WDV抗病品种的调查，建议目前WDV的级别划分如下：0级：不发病；1级：中感，矮化分蘖少；2级：感病，严重矮化分蘖多。接种的四个载体的T₂代转基因小麦中，干涉载体的小麦抗病性好。干扰载体的T₂代转基因小麦的接种WDV试验表明获得了干扰载体的四个抗病性株系：pSA-1、6、7、17。

抗病性功能检测结果见图10所示。

Claims

1.抗小麦矮缩病毒的RNA干涉载体，包括骨架载体和含有正、反义链的发夹结构，其特征在于：以SEQ ID NO9所示的WDV-CP基因序列作为正、反义链。

2.根据权利要求1所述的RNA干涉载体，所述骨架载体为pMCG161。

3.根据权利要求2所述的RNA干涉载体，所述WDV-CP基因的正义链插入pMCG161中上游的两个酶切位点AscI、AvrII间，WDV-CP基因的反义链插入pMCG161中下游的两个酶切位点SpeI、SgfI间。

4.权利要求3所述的RNA干涉载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)WDV-CP基因的获得

以陕西韩城SXHC-2样品的总DNA为模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2为引物对，经PCR扩增WDV-CP得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP；

SEQ ID NO1：5’-ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’，

SEQ ID NO2：5’-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’，

(2)WDV-CP正义链载体的获得

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板，以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4为引物对，经PCR扩增得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP+，用AscI、AvrII双酶切阳性质粒和载体pMCG161，再用T4DNA连接酶将正义链片段和载体连接，得到WDV-CP正义链载体；

SEQ ID NO3：5’-AT GGCGCGCC ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’，

SEQ ID NO4：5’-AT CCTAGG TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’，

(3)WDV-CP干涉载体的获得

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板，以SEQ ID NO5和SEQ ID NO6为引物对，经PCR扩增得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP-，用SpeI、SgfI双酶切阳性质粒和WDV-CP正义链载体，再用T4DNA连接酶将反义链片段和正义链载体连接，得到干扰载体pMCG161+/-WDV；

SEQ ID NO5：5’-AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’，

SEQ ID NO6：5’-AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’。

5.权利要求4所述的构建方法的第(3)步WDV-CP干涉载体的获得用下列方法替代：

A)WDV-CP反义链载体的获得

以阳性质粒pMD18-T-WDV-CP为模板，以SEQ ID NO5和SEQ ID NO6为引物对，经PCR扩增得到PCR产物，回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性质粒pMD18-T-WDV-CP-，用SpeI、SgfI双酶切阳性质粒和载体pMCG161，再用T4DNA连接酶将反义链片段和载体连接，得到反义链载体pMCG161-WDV；

SEQ ID NO5：5’-AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’

SEQ ID NO6：5’-AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’

B)WDV-CP干涉载体的方法

用AscI、AvrII双酶切pMD18-T-WDV-CP+阳性质粒和WDV-CP反义链载体，再用T4DNA连接酶将正义链片段和酶切后的WDV-CP反义链载体连接，得到干扰载体pMCG161+/-WDV。

6.权利要求2-4任一所述RNA干涉载体在遗传转化单子叶植物中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，是将上述RNA干涉载体转化单子叶受体植物，使之对小麦矮缩病毒产生抗性。

8.根据权利要求7所述应用，所述转化方法为基因枪法。

9.根据权利要求8所述应用，所述受体植物为禾本科植物。

10.根据权利要求9所述应用，所述禾本科植物为小麦。