CN102978230A

CN102978230A - 一种高效基因枪转化小麦叶片单细胞瞬间表达的方法及其应用

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Publication number: CN102978230A
Application number: CN2012105070317A
Authority: CN
Inventors: 邢莉萍; 曹爱忠; 钱晨; 王秀娥; 陈佩度
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-12-03
Filing date: 2012-12-03
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2032-12-03
Also published as: CN102978230B

Abstract

本发明公开一种高效基因枪转化小麦叶片单细胞瞬间表达的方法及其应用。高效基因枪转化小麦叶片单细胞的方法，使用GFP基因作为报告基因，以小麦第一叶的离体叶片为转化受体进行基因枪转化，小麦叶片采用固体保鲜培养基固定，基因枪转化采用直径为1μm的钨粉，用量为300ug/枪，质粒DNA用量为750ng/枪，轰击距离采用可裂膜氦压为1350psi，可裂膜与受体膜距离为6mm，受体与阻挡网距离为6cm。利用该方法在感病小麦品种扬麦158的离体叶片表皮细胞中过量表达簇毛麦SGT1基因，结果表明该基因瞬间表达可降低互作细胞中白粉菌吸器指数，表明该基因对白粉病菌侵入和吸器形成有抑制作用，可增强对白粉病菌的抗性。

Description

一种高效基因枪转化小麦叶片单细胞瞬间表达的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，公开了一种高效基因枪转化小麦叶片单细胞瞬间表达的方法及其应用。

背景技术

白粉病是小麦的主要真菌病害之一，培育抗病品种是目前最经济有效的方法。常规育种周期长，转基因生物技术育种是高效培育抗病小麦抗病新品种的有效策略。但小麦基因组庞大、组织培养周期长且转基因频率太低，限制了利用稳定转化方法高通量、快速鉴定白粉病抗病候选基因及相关基因功能的研究，使得有效抗白粉病基因的发掘受阻。因此，建立快速而有效的鉴定白粉病抗病候选基因功能的技术体系显得尤为重要。

单细胞瞬间表达技术可将外源基因导入植物细胞内在一定时间内（降解之前）可获得瞬间超量表达，亦可将外源基因片段构建呈“发夹（hairpin）结构”导入植物细胞内瞬间表达后引起内源基因沉默（TIGS），同时在单细胞基础上研究瞬间表达细胞内的外源基因表达改变对病原菌侵染的影响，分析外源基因的抗病功能。对抗病基因工程的上游已经筛选和克隆出的包括抗病基因类似物、转录因子、信号传导因子及大量的抗病基因类似物片段等，利用单细胞瞬间表达技术这种高效而快速的功能验证方法，来鉴定它们的功能，可以有效地推动其在分子育种中的研究和利用。利用单细胞瞬间表达技术在大麦中鉴定白粉病抗病基因的功能已经得到了广泛的应用（Nelson A J,BushnellW R.Transient expression of anthocyanin genes inbarley epidermal cells:potential for use in evaluation ofdisease response genes.Transgenic Res，1997,6(3):233–244；Schultheiss H,DechertC.A small GTP-bindinghost proteins required for entry of powdery mildew fungus into epidermal cells ofbarley.Plant Physiol，2002,128(4):1447–1454）。

一个高效的小麦基因枪瞬间表达技术体系的包括三个要素：1、方便观察和统计的报告基因；2、高效的基因枪转化参数；3、适合的目标基因表达产物与白粉菌互作效率的统计参数。近几年，单细胞瞬间表达技术在小麦中也有初步的应用（Schweizer,Pokorny et al.ATransient Assay System for the Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat.Molecular Plant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654），但是该技术在小麦中还存在基因枪转化的效率受人为操作的主观影响而效率较低、在小麦中缺乏高效的基因枪转化参数的筛选、选用报告基因表达效率不稳定等一些问题。为了建立高效小麦单细胞瞬间表达体系，本发明紧扣上述三要素，以小麦离体叶片为受体，使用绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因，对表达效率影响较大的多个转化参数进行优化，建立了适合小麦单细胞瞬间表达的技术体系，并利于该体系对簇毛麦Sgt1基因在小麦白粉病抗病中的功能研究，为下一步该基因在小麦抗白粉病转基因育种中的利用提供依据。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，对小麦离体叶片基因枪转化方法进行了系统的研究，建立了高效的小麦单细胞瞬间表达体系。

本发明的另一目的是提供一种高频小麦叶片瞬间表达体系分析外源基因的抗白粉病功能的方法。

本发明的又一目的是提供含有抗白粉病相关基因簇毛麦SGT1基因的表达载体。

本发明的又一目的是提供该表达载体在小麦抗白粉病转基因育种中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种高效基因枪转化小麦叶片单细胞的方法，使用绿色荧光蛋白GFP基因作为报告基因，以小麦第一叶的离体叶片为转化受体进行基因枪转化，小麦叶片采用固体保鲜培养基固定，基因枪转化采用直径为1μm的钨粉，用量为300ug/枪，质粒DNA用量为750ng/枪，轰击距离采用可裂膜氦压为1350psi，可裂膜与受体膜距离为6mm，受体与阻挡网距离为6cm。

本发明所述高效基因枪转化小麦叶片单细胞的方法在白粉病抗病基因筛选和/或功能鉴定中的应用。

一种利用本发明所述的高效基因枪转化小麦叶片单细胞的方法分析外源基因的抗白粉病功能的方法，包括如下步骤：

1）采用权利要求1所述的方法将含有候选基因的质粒通过基因枪转化小麦叶片；

2）接种白粉菌，观察基因瞬间表达的叶片单细胞对白粉菌的抗性作用，以白粉菌吸器指数大小作为抗性高低的衡量标准。

利用上述的方法筛选到的含有Hv-SGT1基因的表达载体。

所述的Hv-SGT1的表达载体优选以pBI220为出发载体，将Hv-SGT1基因插入pBI220的BamHI和SacI酶切位点间所得。

本发明所述的含Hv-SGT1的表达载体在培育抗白粉病小麦品种中的应用。

有益效果：

1）基因枪转化过程中，基因枪转化效率受多个因素的综合影响，本发明运用单因素试验设计研究了离体叶片固定方法、每枪金粉用量、每枪DNA用量、可裂膜氦压等因素的影响，并且双因素试验设计综合考察了轰击距离A(可裂膜与载体膜之间的距离)和B（阻挡网与受体组织之间的距离）组合对表达效率的影响。找到了优化的基因枪轰击参数，建立了高效的转化体系。

2）本发明提供了一种高频小麦叶片瞬间表达体系分析外源基因的抗白粉病功能的方法，运用优化的基因枪转化技术体系在感病小麦品种离体叶片表皮细胞中过量表达簇毛麦SGT1基因，结果表明该基因瞬间表达使互作细胞吸器指数降低，对白粉病菌侵入和吸器形成有抑制作用，可增强对白粉病菌的抗性。本发明建立的单细胞瞬间表达体系可成功应用于白粉病抗病基因功能的鉴定。

附图说明

图1离体叶片的两种固定方式-固体培养基法（A）和载玻片法（B）

图2报告基因C1-Lc(A)、GFP(B)、GUS(C)在小麦叶片表皮细胞中的表达

图3基因枪转化参数的瞬间表达分析，A：每枪钨粉用量对瞬间表达效率的影响；B：每枪质粒DNA用量对瞬间表达效率的影响；C：可裂膜氦压对瞬间表达效率的影响；D：轰击距离A(可裂膜与载体膜之间距离)+B(阻挡网与受体组织之间距离)对瞬间表达效率的影响

图4pBI220:Hv-SGT1过量表达载体构建图谱

图5GUS基因在小麦叶片表皮细胞中的表达及目标基因与白粉菌的互作，a-d:白粉菌成功侵入表达GUS基因的表皮细胞后形成的吸器,200×;e-h:白粉菌附着孢未能侵入表达GUS和目标基因的表皮细胞,200×。geec:表达GUS基因的表皮细胞;ha:吸器;app:附着孢;co:接种孢子;hy:菌丝。

具体实施方式

实施例1高基因枪转化小麦离体叶片体系的建立

1.1材料与方法

带不同报告基因的表达载体：报告基因花青素苷合成调节基因C1-Lc的表达载体pBecks400.Red（McCormac AC,Wu HX,Bao MZ,Wang YB,Xu RJ,Elliott MC,Chen DF.Theuse of visual marker genes as cell-specific reporters of Agrobacterium-mediated T-DNAdelivery towheat(Triticum aes tivum L.)and barley(Hordeum vulgare L.).Euphytica，1998,99(1):17―25.）。绿色荧光蛋白基因GFP的表达载体psGFP（Takashi Tamura,KojiroHara,Yube Yamaguchi,Nozomu Koizumi and Hiroshi Sano.Osmotic stress tolerance oftransgenic tobacco expressing a gene encoding a membrane-located receptor-likeprotein from tobacco plants.PlantPhysiol，2003,131:454-462.）。β-1,3-葡萄糖苷酸酶基因GUS的表达载体pAHC25(Christensen A H，Quail P H,Ubiquitin promoter-basedvectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes inmonocotyledonous plants.Transgenic Research,1996,5:213-218.)。

高感白粉病小麦品种扬麦158的种子分别种在小塑料盆钵中，放置在无病原菌的光照箱中于25℃、每天12h光照培养7d。剪下一叶期小麦幼苗叶片约4cm长的端部，取5~6片叶片，背面朝上，并排贴在加了20mg/L6-BA的水琼脂固体培养基表面，用塑料插地牌制作的阻挡扣固定两端（图1A）；用双面胶贴在载玻片上，剪切口用湿润的吸水纸压住以保湿，接受基因枪轰击（图1B）。基因枪使用PDS1000/He系统，采用直径1.0μm钨粉，表达载体质粒用北京天根公司质粒小提中量试剂盒提取并用酶标仪定量，终浓度为1μg/μl。待优化的参数包括：叶片固定方式（图1）、钨粉用量、质粒DNA用量、可破裂膜的氦压、轰击距离（A-可裂膜与载体膜之间的距离；B-阻挡网与受体组织之间的距离）、真空度。钨粉的准备和质粒的包裹如下：

制备钨粉：称取30mg的钨粉于1.5ml eppendorf管中，加入1ml70%酒精，涡旋3-5min后静置15min，使钨粉完全沉淀。12000rpm离心1min后弃上清。加入1ml ddH₂O水，涡旋混匀后，离心弃上清（重复三次）。最后加入500μl50%甘油涡旋混匀，以备用。

包裹子弹：吸取16-135μl涡旋均匀的钨粉（10枪，100-800μg/枪）于1.5ml的eppendorf管中，加入220无菌水，边涡旋边向eppendorf管内滴加50μl2.5M CaCl₂，然后加入20μl0.1M亚精氨（现配先用），10μl质粒DNA(总量应为0.25-1.5μg/枪)，冰上涡旋10min。静置1min后离心2s，弃上清。加入600μl70%酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。然后加入600μl100%酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。最后加入100μl100%酒精（10μl/枪），充分涡旋，以备使用。

1.2结果与分析

1.2.1报告基因C1-Lc、GFP、GUS均能在小麦的叶片表皮细胞中表达

本研究首先采用花青素合成酶调节基因（Cl-Lc），绿色荧光蛋白基因（GFP)，β-半乳糖苷酶基因（GUS)分别作为报告基因转化小麦叶片获得瞬间表达，结果发现，虽然花青素合成酶基因和GFP基因表达载体使用的是CAMV35S启动子，而GUS使用的是Ubi启动子，但三者在小麦叶片表皮细胞中的表达效率没有显著差异，每张叶片均可获得几十甚至上百个表达细胞（图2），而且报告基因在表皮长细胞、气孔保卫细胞、气孔间短细胞等各种类型的表皮细胞中都能够正常表达。三种报告基因中，以花青素的观察最为简单，表达细胞肉眼可见红色花青素积累（图2A），但由于表达细胞颜色会逐渐加深至红褐色，在显微镜下无法看清楚表达细胞内的白粉菌的结构，而且脱色时会和叶绿素一样迅速褪去。GFP的观察可在活体进行，在荧光显微镜下使用蓝光激发，可见到呈亮绿色荧光的转化细胞（图2B），但是在表达GFP的细胞内也无法看清楚白粉菌的结构。GUS基因产物不能进行活体观察，必需经过化学染色和脱色再观察，但在将转化阳性细胞染成蓝色的同时也能特异地将白粉菌的吸器染成蓝色（图2C），易于观察和统计。综合上述特点，后续的研究在优化基因枪轰击参数的实验中采用GFP做报告基因，而在验证基因功能的实验中采用GUS做报告基因。

1.2.2叶片固定方式的选择

在基因枪轰击到实现目标基因瞬间表达，再到后续接种白粉菌研究其互作特性的过程中，离体的叶片要保持其细胞活力至少52个小时，加上要尽量减少叶片在轰击过程中的损伤，以及避免轰击时由于可裂膜破裂产生的冲力而打飞叶片影响轰击的效率，叶片的固定方式值得进行探究。本实验通过培养基和载破片两种固定方式的比较发现：小麦叶片宽且平整，表面无绒毛及较厚的蜡质层，采用含保鲜剂固体培养基固定，便于保湿透气，进而保持了叶片细胞的活性；两端用自制的阻挡扣压紧，使叶片在基因枪轰击过程中也不会被打飞掉；接种白粉菌后叶片在固体培养基上培养，既能使叶片保持活性，延缓轰击损伤造成的细胞死亡，又能保证湿度有利于白粉菌的发育。因此，采用含保鲜剂固体培养基固定离体叶片的方法的优点明显，在后续的基因功能验证实验中被一直使用。

1.2.3基因枪轰击参数对表达效率的影响

用带有报告基因GFP的质粒对影响较大的钨粉用量，质粒DNA用量，氦压，轰击距离A(可裂膜与载体膜之间的距离)和B（阻挡网与受体组织之间的距离）组合等转化参数进行优化以获得较高的瞬间表达频率。

钨粉用量在50-500μg/枪的范围内，随着浓度的增加，瞬间表达效率也随之提高，

300-500μg/枪的范围内，GFP瞬间表达频率差异不大（图3-a）。这与王华忠等（2006）报道的金粉的用量对表达效率的影响的结果一致，可见使用钨粉与金粉的差异不大，且钨粉浓度较高，不仅不利于包裹上DNA后微弹的分散，而且还可能因轰击损伤细胞数目的增加而影响表达效率的提高，故采用300μg/枪钨粉是适宜的。

钨粉用量为300μg/枪时，质粒DNA浓度在250-1500μg/枪的范围内，随着浓度的增加，GFP瞬间表达效率也随之提高，在750ng/枪，GFP表达的效率最高，超过1000ng/枪后则GFP表达细胞数明显下降（图3-b），可能因为质粒浓度高影响了钨粉颗粒的分散，从而影响轰击的效果。

在研究氦压对表达效率的影响时，钨粉用量为300μg/枪，质粒浓度为750ng/枪，采用可承受750psi、900psi、1100psi、1350psi、1550psi氦压的五种可破裂膜进行实验。结果表明，当使用1350psi的可破裂膜时，单张叶片轰击后表达GFP的细胞个数最多（图3-c），且明显高于其他参数组。

在研究轰击距离对表达效率的影响时，钨粉用量为300μg/枪，质粒浓度为750ng/枪。轰击距离A-可裂膜与载体膜之间的距离采用(3,6,9,12mm)4个梯度；B-阻挡网与受体组织之间的距离(6,9,12cm)3个梯度，共计12个组合。结果表明，轰击距离A-6mm和B-6cm的组合，单张叶片轰击后表达GFP的细胞个数最多（图3-d）。

最适的轰击参数主要是轰击损伤（细胞损伤）和轰击效率（接受金粉的细胞数）之间的平衡。综合上述影响因素，选择以下参数用于基因枪转化：钨粉用量300μg/枪；质粒DNA浓度750ng/枪，氦压1350psi；可裂膜与受体膜距离6mm；受体与阻挡网距离6cm。

实施例2簇毛麦SGT1基因Hv-SGT1过量表达载体的构建

以簇毛麦SGT1基因cDNA(SEQ ID NO.1）为模板，使用引物对SGT1ATG-BamHIF（TTGGATCCTCGACGCAGACATGG，SEQ ID NO.2）和SGT1-TGA-KpnI-R（GCGGTACCTCATTAATACTCCCAC，SEQ ID NO.3）进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和KpnI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到BamHI和KpnI双酶切后的载体pBI220（（Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker inhigher plants.EMBO J.1987,6:3901-3907.）），将Hv-SGT1置于35S启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因Hv-SGT1克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:Hv-SGT1（图4）。经测序验证，表明载体构建成功。

实施例3利用瞬间表达方法将Hv-SGT1基因转入感病小麦叶片，研究其与小麦白粉病的互作效果

3.1材料与方法

将目标基因Hv-SGT1的表达载体与GUS表达载体pAHC25（Christensen A H,Quail P H.Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/orscreenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgenic Research,1996,5:213-218.）质粒DNA混合同时包裹钨粉（目标基因载体与GUS基因载体浓度的摩尔比例为2:1），用基因枪轰击小麦叶片共转化。

叶片轰击后4h接种白粉病菌孢子。接种方法：将一塑料片卷成圆桶状置于瓷盘上，从上面均匀抖落新鲜的白粉病菌孢子，接种密度要高，至少1个表皮细胞表面落有1个孢子。瞬间表达后的处理过程为：接种后48h进行GUS染色（配方为：0.1mol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH7.0)，含10mmol/L EDTA，5mmol/L铁氰化钾和亚铁氰化钾，0.1mg/ml X-Gluc，0.1%TritonX-100，20%甲醇，）真空渗透10min,37℃染色24h，然后用70%酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6%的考马斯亮蓝对白粉菌孢子染色。然后在载玻片上滴加50%甘油作为浮载剂和保存剂，在Olympus显微镜下观察转化阳性细胞表面白粉病菌的发育情况及细胞内吸器的有无。

吸器指数定义为在一定数目的表达GUS基因并且落有白粉病孢子的阳性表皮细胞中，白粉菌成功侵入并在细胞内形成吸器的细胞所占的比例。相对吸器指数：将对照组侵入频率矫正为100%，处理组作相应矫正。每个质粒载体的轰击重复3次，每次重复轰击4个培养皿的叶片，根据3次重复的数据计算平均吸器指数并运用卡方测验进行差异显著性分析。

3.2结果与分析

感白粉病叶片只转GUS基因对照接种白粉菌后经GUS染色，可以观察到大部分GUS阳性细胞表面的孢子都能够正常萌发，长出初生芽管和附着孢芽管，附着孢芽管末端形成附着孢紧紧贴附于表皮细胞表面并向表皮细胞壁的方向形成侵入钉，进一步侵入表皮细胞并在细胞内形成吸器，由于吸器是白粉菌吸收营养继续生长并形成次级菌丝和菌落等（图5a-d）。而在共转化目的基因Hv-SGT1与GUS基因的GUS阳性细胞中，白粉菌的侵染终止在侵入钉侵入表皮细胞这一步，并不能在细胞内形成吸器，这样的细胞视为由于目标基因过量表达产物在该GUS阳性细胞中的积累抑制吸器的形成，增强了对白粉病菌的抗性的阳性细胞（图5e-h）。

目的基因Hv-SGT1与小麦白粉病的互作效果统计结果表明（表1），该基因使互作细胞吸器指数降低至25.5%，对照为单独导入GUS基因的叶片表皮细胞吸器指数为42.5%，表明该基因对白粉病菌侵入和吸器形成有抑制作用，可增强小麦对白粉病菌的抗性。

表1利用建立的瞬间表达体系研究Hv-SGT1对白粉菌吸器形成的影响

Claims

1.一种高效基因枪转化小麦叶片单细胞的方法，其特征在于：使用绿色荧光蛋白GFP基因作为报告基因，以小麦第一叶的离体叶片为转化受体进行基因枪转化，小麦叶片采用固体保鲜培养基固定，基因枪转化采用直径为1μm的钨粉，用量为300ug/枪，质粒DNA用量为750ng/枪，轰击距离采用可裂膜氦压为1350psi，可裂膜与受体膜距离为6mm，受体与阻挡网距离为6cm。

2.权利要求1所述的方法在白粉病抗病基因筛选和/或功能鉴定中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的方法分析外源基因抗白粉病功能的方法，其特征在于包括如下步骤：

4.利用权利要求3所述的方法筛选到的含有Hv-SGT1基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的Hv-SGT1的表达载体是以pBI220为出发载体，将Hv-SGT1基因插入pBI220的BamHI和SacI酶切位点间所得。

6.权利要求4或5所述的含Hv-SGT1的表达载体在培育抗白粉病小麦品种中的应用。