CN111718887B - 一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术与植物分子生物学领域，特别涉及一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法及其应用，为便于分离不用花生组织器官的原生质体，本发明根据花生组织细胞的特定结构，提供了一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，该方法是一种适用于分离不同花生组织细胞的通用方法，能够快速、高效地制备出不同花生组织器官的原生质体细胞，所分离得到的花生原生质体，不仅获得率高，而且细胞活性好，可应用于花生体细胞的融合，花生蛋白质瞬时表达系统的开发，花生单细胞的测序以及基于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1的敲除靶点检测等花生分子生物学相关研究。

Description

一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与植物分子生物学领域，特别涉及一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法及其应用。

背景技术

植物原生质体是除去细胞壁后质膜包裹的细胞，可以在较短时间内获得大量遗传上具有同质性的细胞，并可以直接摄取外援的质粒和DNA等，因此成为植物遗传转化的良好受体材料，对基因功能研究意义重大；原生质体含有个体的全部遗传信息，并可以产生重要次生代谢产物，对其进行分离提取检测，可以为代谢物生产提供新思路；原生质体还被广泛应用于体细胞远源杂交，能够克服杂交障碍，是种质创新的有效途径。

花生(Arachis hypogaea L.)是一种常见的油料作物，属于异源四倍体豆科植物，具有典型的地上开花地下结果的特性。由于花生的生长发育阶段具有多种特殊的农艺表现，因此可作为特异材料用于研究多种生物学问题。目前，花生的分子生物学技术发展迅速，基于混池测序(Bulk-seq)技术利用其组织器官可构建大量基因的表达图谱，但是从组织水平到单个细胞水平并没有十分有效的解决办法。花生单个细胞间具有较厚的细胞壁，细胞壁的成份主要由纤维素、木质素、果胶、角质细胞等成分组成，不同器官中细胞壁的具体组分存在明显的差异。由于细胞壁难以去除，导致花生单细胞的分离存在明显的技术壁垒。

当前，分离原生质体最为有效的方式是利用由纤维素酶与果胶酶等酶组成的酶解液将细胞壁消化掉。但去除细胞壁的酶解液并没有统一的配置标准，需要根据植物种类的差异，安照不同植物细胞的渗透压进行调配，导致研究效率不高。因此，根据花生组织细胞的特定结构，开发一种能够应用于分离不同组织细胞的通用方法，将在很大程度上促进花生分子生物学的研究效率。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法。

本发明的第二个目的是提供采用上述的分离方法制备得到的花生原生质体的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供了一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，该方法包括以下步骤：

S1、将花生不同组织器官切割成细小组织，然后进行反复冻融处理；

S2、往冻融处理后的组织器官中加入酶解液，然后置于恒温振荡条件下进行酶解处理，所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、崩溃酶、阿魏酸酯酶、皂荚皂素、山梨醇、甘露醇、MES溶液和BSA；

S3、酶解后进行过滤、离心处理，收集沉淀即得原生质体。

为便于分离不用花生组织器官的原生质体，本发明根据花生组织细胞的特定结构，构建了一种适用于分离不同花生组织细胞的通用方法，该方法包括反复冻融预处理和酶解处理，其中，反复冻融有利于不同花生组织细胞壁的破碎，提高后续的酶解效率；酶解处理所用的酶解液的各成分之间搭配合理，酶解效果好，适用于不同花生组织细胞的水解，酶解液中的阿魏酸酯酶、皂荚皂素和山梨醇起到连接桥梁的作用，使酶解液的各成分得到充分的协调，从而更好的发生相互之间的协同增效效果，其中，阿魏酸酯酶可以水解半纤维素与木质素之间的阿魏酸酯键，破坏两者之间的共价键连接，从而使纤维素酶、离析酶、崩溃酶等更好的发挥水解细胞壁的效果；皂荚皂素和山梨醇一方面可以降低纤维素的表面张力，提高其亲水性，使其更易与酶结合，另一方面还可以降低溶液的表面张力，使酶分散得更均匀，更有利于与底物的结合，进而提高了酶的活力，促进细胞壁的水解；采用本发明方法分离得到的花生原生质体，不仅获得率高，而且细胞活性好，可以应用于花生分子生物学的相关研究中。

优选的，所述花生组织器官包括但不限于花生叶片、花生茎干、花生幼嫩种子与果针。

优选的，为提高酶解的效果，在所述酶解液中，纤维素酶的质量浓度为1-5％，离析酶的质量浓度为0.5-2％，崩溃酶的质量浓度为0.5-1％，阿魏酸酯酶的质量浓度为0.3-0.5％，皂荚皂素的质量浓度为0.05-0.1％，山梨醇的质量浓度为1-3％，甘露醇的质量浓度为4-5％，MES溶液的体积浓度为4-6％，BSA的质量浓度为0.05-0.2％。

更优选的，所述MES溶液的摩尔浓度为0.1-0.3mol/L。

在一些具体实施方式中，所述酶解液还包括终浓度为0.05-0.15mol/L的氯化钙溶液。

在一些具体实施方式中，所述酶解液还包括终浓度为0.005-0.015mol/L的EDTA溶液。

优选的，所述恒温振荡的温度为28℃，转速为50-70g/min，时间为2-3h。

优选的，所述细小组织小于2mm。

优选的，步骤S2是按照1:5-10的料液比(g/mL)加入酶解液。

优选的，所述反复冻融为0-4℃冷冻2h，常温解冻1h，反复冻融2-4次。

优选的，所述过滤采用40um细胞筛，所述离心的转速为300-400g/min、时间为5-10min。

本发明还提供了采用上述的分离方法制备得到的花生原生质体在花生体细胞融合中的应用。

本发明还提供了采用上述的分离方法制备得到的花生原生质体在花生蛋白质瞬时表达系统开发中的应用。

本发明还提供了采用上述的分离方法制备得到的花生原生质体在花生单细胞测序中的应用。

本发明还提供了采用上述的分离方法制备得到的花生原生质体在基于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1的花生敲除靶点检测中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，该方法是一种适用于分离不同花生组织细胞的通用方法，能够快速、高效地制备出不同花生组织器官的原生质体细胞，所分离得到的花生原生质体，不仅获得率高，而且细胞活性好，可应用于花生体细胞的融合，花生蛋白质瞬时表达系统的开发，花生单细胞的测序以及基于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1的敲除靶点检测等花生分子生物学相关研究。

附图说明

图1为花生叶片分离制备原生质体细胞过程涉及的图(A：花生叶片；B：原生质体细胞；C：显微镜观察结果)；

图2为花生茎干分离制备原生质体细胞过程涉及的图(A：花生茎干；B：酶解处理；C：原生质体细胞)；

图3为花生幼嫩种子与果针分离制备原生质体细胞过程涉及的图(A：花生果针；B：原生质体细胞；C：花生幼嫩种子)；

图4为四倍体花生植株的形成过程(A：原生质体细胞；B：融合后的原生质体细胞；C：愈伤组织；D：花生小叶组织)；

图5为花生蛋白亚细胞定位的激光共聚焦显微图(A：FAB2-GFP融合的重组质粒；B：明场的原生质体细胞；C：融合叠加后的原生质体细胞)；

图6为花生原生质体基因编辑效率的测序结果；

图7为CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1基因编辑花生植株的形成过程(A：经CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1敲除的原生质体细胞；B：愈伤组织；C：花生幼苗)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一种用于分离花生组织器官原生质体的方法

该方法具体包括以下步骤：

S1、将花生叶片切割成小于2mm的细小组织，然后反复冻融3次，其中，0℃冷冻2h，常温解冻1h；

S2、按照1:7的料液比(g/mL)往冻融处理后的组织器官中加入酶解液，然后置于恒温振荡器中，28℃下以60g/min的转速酶解2.5h，所述酶解液包括以下成分：

纤维素酶的质量浓度为3％，离析酶的质量浓度为1％，崩溃酶的质量浓度为0.8％，阿魏酸酯酶的质量浓度为0.4％，皂荚皂素的质量浓度为0.08％，山梨醇的质量浓度为2％，甘露醇的质量浓度为4.5％，0.2mol/L的MES溶液的体积浓度为5％，BSA的质量浓度为0.1％；

S3、酶解后采用40um细胞筛进行过滤，然后以350g/mim的转速离心7.5min，去除上清，收集沉淀即得原生质体。

如图1所示，经显微镜观察得知，所制备得到的原生质体细胞的获得率约为800个细胞/μL，细胞活性达到80％以上。

实施例2一种用于分离花生组织器官原生质体的方法

该方法具体包括以下步骤：

S1、将花生茎干切割成小于2mm的细小组织，然后反复冻融2次，其中，0℃冷冻2h，常温解冻1h；

S2、按照1:5的料液比(g/mL)往冻融处理后的组织器官中加入酶解液，然后置于恒温振荡器中，28℃下以50g/min的转速酶解2h，所述酶解液包括以下成分：

纤维素酶的质量浓度为1％，离析酶的质量浓度为0.5％，崩溃酶的质量浓度为0.5％，阿魏酸酯酶的质量浓度为0.3％，皂荚皂素的质量浓度为0.05％，山梨醇的质量浓度为1％，甘露醇的质量浓度为4％，0.2mol/L的MES溶液的体积浓度为4％，BSA的质量浓度为0.05％；

S3、酶解后采用40um细胞筛进行过滤，然后以300g/mim的转速离心5min，去除上清，收集沉淀即得原生质体。

如图2所示，经显微镜观察得知，所制备得到的原生质体细胞的获得率约为500个细胞/μL，细胞活性达到80％以上。

实施例3一种用于分离花生组织器官原生质体的方法

该方法具体包括以下步骤：

S1、将花生幼嫩种子与果针切割成小于2mm的细小组织，然后反复冻融4次，其中，4℃冷冻2h，常温解冻1h；

S2、按照1:10的料液比(g/mL)往冻融处理后的组织器官中加入酶解液，然后置于恒温振荡器中，28℃下以70g/min的转速酶解3h，所述酶解液包括以下成分：

纤维素酶的质量浓度为5％，离析酶的质量浓度为2％，崩溃酶的质量浓度为1％，阿魏酸酯酶的质量浓度为0.5％，皂荚皂素的质量浓度为0.1％，山梨醇的质量浓度为3％，甘露醇的质量浓度为5％，0.2mol/L的MES溶液的体积浓度为6％，BSA的质量浓度为0.2％，氯化钙溶液的体积浓度为0.01mol/L；

S3、酶解后采用40um细胞筛进行过滤，然后以400g/mim的转速离心10min，去除上清，收集沉淀即得原生质体。

如图3所示，经显微镜观察得知，所制备得到的原生质体细胞的获得率约为1000个细胞/μL，细胞活性达到80％以上。

实施例4一种用于分离花生组织器官原生质体的方法

该方法具体包括以下步骤：

S1、将花生萌发幼苗叶片切割成小于2mm的细小组织，然后反复冻融3次，其中，0℃冷冻2h，常温解冻1h；

S2、按照1:7的料液比(g/mL)往冻融处理后的组织器官中加入酶解液，然后置于恒温振荡器中，28℃下以60g/min的转速酶解2.5h，所述酶解液包括以下成分：

纤维素酶的质量浓度为3.5％，离析酶的质量浓度为1.5％，崩溃酶的质量浓度为0.9％，阿魏酸酯酶的质量浓度为0.4％，皂荚皂素的质量浓度为0.07％，山梨醇的质量浓度为2.5％，甘露醇的质量浓度为4.5％，0.2mol/L的MES溶液的体积浓度为5.5％，BSA的质量浓度为0.13％，氯化钙溶液的体积浓度为0.01mol/L，EDTA溶液的体积浓度为0.001mol/L；

S3、酶解后采用40um细胞筛进行过滤，然后以350g/mim的转速离心7.5min，去除上清，收集沉淀即得原生质体。

经显微镜观察得知，所制备得到的原生质体细胞的获得率约为1500个细胞/μL，细胞活性达到80％以上。

对比例1一种用于分离花生组织器官原生质体的方法

对比例1与实施例1相比，步骤S2的酶解液中缺少阿魏酸酯酶。

经显微镜观察得知，所制备得到的原生质体细胞的获得率约为300个细胞/μL，细胞活性小于70％。

对比例2一种用于分离花生组织器官原生质体的方法

对比例2与实施例1相比，步骤S2的酶解液中缺少皂荚皂素。

经显微镜观察得知，所制备得到的原生质体细胞的获得率约为350个细胞/μL，细胞活性小于70％。

对比例3一种用于分离花生组织器官原生质体的方法

对比例3与实施例1相比，步骤S2酶解液中的阿魏酸酯酶的质量浓度为0.1％。

经显微镜观察得知，所制备得到的原生质体细胞的获得率约为370个细胞/μL，细胞活性小于70％。

实验例1采用本发明方法制备得到的花生原生质体在花生体细胞融合中的应用

选取不同品种的二倍体野生型花生萌发幼苗的叶片，按照实施例1的方法制备得到原生质体细胞，利用PEG6000溶液，促进不同二倍体野生种原生质体细胞的融合，经无菌条件下培养后形成愈伤组织，经脱分化生根培养后形成四倍体的花生植株。如图4所示，叶片原生质体经PEG6000处理后细胞成团，成团细胞生长为愈伤组织，愈伤组织经脱分化筛选长出幼嫩的小叶组织。

实验例2采用本发明方法制备得到的花生原生质体在花生蛋白质瞬时表达系统开发中的应用

将不含终止密码子的花生硬脂酰-ACP脱饱和酶基因FAB2的全长编码序列(GenBank:FJ230310.1)克隆到载体pNA580(p35S-GFP)上，该载体含有GFP绿色荧光蛋白，克隆所用引物为：FAB2-GFP前引物(5’-GTTGTTACTAGTATGGCTCTGAGGCTGAACCCTAAC-3’)和FAB2-GFP后引物(5’-GTTGTTCCCGGGGAGTTGCACTTCCCTATCGTAAAT-3’)，得到FAB2-GFP融合的重组质粒，将质粒转化到大肠杆菌DH5α后，利用质粒DNA大量提取试剂盒(Omega)提取重组质粒，确保质粒的浓度达到10μg/μL。

选取萌发花生幼苗的茎干组织，按照实施例2的方法制备得到原生质体细胞，然后利用LH5溶液(154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl、2mM MES、pH 5.7)洗涤原生质体细胞两次；加入MG溶液(0.4M mannitol、15mM MgCl₂、4mM MES、pH 5.7)重悬原生质体细胞；随后加入110μL质量浓度为40％的PEG4000与30μg重组质粒，置于28℃的黑暗环境下处理30min；再次加入1mL LH5溶液，离心去除上清后收集细胞；之后加入500μL LHI溶液(0.5mMmannitol、4mM MES、pH 5.7、20mM KCl)，28℃下黑暗培养16h后利用激光共聚焦显微镜观察原生质体的转化情况，进而完成花生蛋白的亚细胞定位分析。如图5的激光共聚焦显微镜观察结果所示，在叶绿体上有绿色荧光产生，与明场的细胞图片叠加后，成功将花生FAB2-GFP融合蛋白定位于花生原生质体细胞的叶绿体上。

此外，还可以利用该方法开展免疫荧光染色观察，细胞核DAPI染色观察等多种基于原生质体系统的蛋白瞬时表达系统构建的分子生物学实验。

实验例3采用本发明方法制备得到的花生原生质体在花生单细胞测序中的应用

利用二倍体野生种与四倍体栽培种花生的萌发幼苗叶片，按照实施例4的方法获得高质量的原生质体细胞(细胞数目达到10-50万个，样品浓度约1500个细胞/μL，细胞活性达到80％以上)。利用单细胞测序(Single-cell RNA-seq)平台10×Genomics技术(样品依照该平台相应的操作流程进行制备)进行单个原生质体细胞的转录组测序，生物信息分析后获取花生不同组织部位单细胞的转录组表达谱。

此外，还可以利用激光显微切割、微吸管分离、流式细胞仪等对原生质体细胞进行分离，结合基因组、转录组、蛋白组、以及代谢组等技术开展花生单细胞的测序。

实验例4采用本发明方法制备得到的花生原生质体在基于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1的敲除靶点检测中的应用

根据花生二倍体野生种与四倍体栽培种的基因组信息(Peanutbase.org)，对花生脂肪酸脱饱和酶基因(Fatty acid desaturase 2)FAD2(Arahy.5913QL)设计CRISPR/Cas9的靶点序列(5’-CTGCATTCTCACCGGTGTTTGG-3’)，Cas9选择含有NGG的PAM序列；同时设计CRISPR/Cpf1的靶点序列(5’-TCTTGTCTATTAGTTCCTTATTT-3’)，Cpf1选择含有TTTN的PAM序列。

选取二倍体野生种与四倍体栽培种花生的幼嫩茎干，按照实施例2的方法制备得到原生质体细胞，然后根据实验例2中的质粒转化方法将构建好的载体利用PEG4000将其瞬时表达于花生二倍体野生种与四倍体栽培种的原生质体中，转化后的原生质体置于黑暗条件下培养16h后，对其进行DNA或RNA提取，并设计靶点检测引物：前引物(5’-ATGGGTGCTGGAGGGCGTGT-3’)和后引物(5’-TCCCTGTTAGAGTATATGGGA-3’)，利用PCR扩增方法对靶点上下游各约300bp的序列进行扩增，随后利用二代测序技术，检测扩增产物的碱基序列信息，将所得到的基因信息与未转化载体前的原生质体的基因组信息进行比对，鉴定CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1的基因编辑效率。如图6的结果所示，利用CRISPR/Cas9与CRISPR/Cpf1敲除花生原生质体细胞的FAD2基因后，敲除结果采用测序的方法鉴定缺失的碱基序列，以此检测敲除的效果。

将经过CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1编辑后的原生质体细胞，利用PEG6000进行细胞聚合，随后转入MS液体培养基，经过原生质体培养，成团细胞分化为愈伤组织，再经脱分化生成再生苗，从而得到无CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1标记的经基因编辑的花生植株。如图7所示，经过CRISPR/Cas9与CRISPR/Cpf1敲除的原生质体细胞在成团培养后，原生质体细胞分化成为愈伤组织，愈伤组织经过脱分化培养形成未生根的花生幼苗。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 广东省农业科学院作物研究所

<120> 一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法及其应用

<140> 2020105512548

<141> 2020-06-17

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 1

gttgttacta gtatggctct gaggctgaac cctaac 36

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 2

gttgttcccg gggagttgca cttccctatc gtaaat 36

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 3

ctgcattctc accggtgttt gg 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 4

tcttgtctat tagttcctta ttt 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 5

atgggtgctg gagggcgtgt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 6

tccctgttag agtatatggg a 21

Claims (5)

1.一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将不同花生组织器官切割成细小组织，然后进行反复冻融处理；S2、往冻融处理后的组织器官中加入酶解液，然后置于恒温振荡条件下进行酶解处理，所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、崩溃酶、阿魏酸酯酶、皂荚皂素、山梨醇、甘露醇、MES溶液和BSA；S3、酶解后进行过滤、离心处理，收集沉淀即得原生质体；

其中，在所述酶解液中，纤维素酶的质量浓度为1-5％，离析酶的质量浓度为0.5-2％，崩溃酶的质量浓度为0.5-1％，阿魏酸酯酶的质量浓度为0.3-0.5％，皂荚皂素的质量浓度为0.05-0.1％，山梨醇的质量浓度为1-3％，甘露醇的质量浓度为4-5％，MES溶液的体积浓度为4-6％，BSA的质量浓度为0.05-0.2％。

2.根据权利要求1所述的一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，其特征在于，所述花生组织器官包括但不限于花生叶片、花生茎干、花生幼嫩种子与果针。

3.根据权利要求1所述的一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，其特征在于，所述MES溶液的摩尔浓度为0.1-0.3mol/L。

4.根据权利要求1所述的一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，其特征在于，所述酶解液还包括终浓度为0.05-0.15mol/L的氯化钙溶液。

5.根据权利要求1所述的一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，其特征在于，所述酶解液还包括终浓度为0.005-0.015mol/L的EDTA溶液。

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