CN118497263B

CN118497263B - CPuORF18基因在负调控植物低温耐受性中的应用

Info

Publication number: CN118497263B
Application number: CN202410949285.7A
Authority: CN
Inventors: 宁昕; 李志远; 徐秀美; 吕丹丹; 陈立超; 孙扬; 石艳云; 王珂; 张立新
Original assignee: Sanya Research Institute Of Henan University; Henan University
Current assignee: Sanya Research Institute Of Henan University; Henan University
Priority date: 2024-07-16
Filing date: 2024-07-16
Publication date: 2024-09-13
Anticipated expiration: 2044-07-16
Also published as: CN118497263A

Abstract

本发明提供了CPuORF18(Conserved peptide uORF‑containing transcript18)基因在负调控植物低温耐受性中的应用，所述CPuORF18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述调控表现在敲除CPuORF18基因的植物对低温的耐受性增加，所以本发明提供了一种新的提高植物低温耐受性的方法，通过该方法使植物能够在低于其原本生长适应的温度范围内存活和生长，为植物的分子育种和遗传改造提供了一种新的基因资源。

Description

CPuORF18基因在负调控植物低温耐受性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CPuORF18基因在负调控植物低温耐受性中的应用。

背景技术

水稻 (Oryza sativa L.) 是世界主要的粮食作物之一，在水稻的生长发育过程中需要适应多种外界环境的变化，而温度是最主要的环境因素之一。其中苗期低温造成的冷害会严重影响水稻的生长发育，使水稻的营养和生殖生长受到抑制，严重时会导致水稻叶片枯黄、烂秧甚至是死亡。目前低温冷害是影响水稻产量的最主要因素，研究水稻低温的耐受性对指导生产有重要的意义。

上游开放阅读框 (uorf) 通常只存在于20-50%的真核生物中，其中编码保守肽的uORFs (CPuORFs) 更少，且其功能研究的还比较少。目前已证明CPuORF家族编码着多种不同类型的转录因子包括bZIP (HG1)、bHLH (HG2和HG15)、MADS(HG4)、HD-ZIP (HG14)、AP2/ERF (HG21)和HSF激活因子(HG18)。而通过比较水稻和拟南芥的全长cDNA，在植物中也鉴定出26种不同的CPuORF。其中有研究发现CPuORF可以控制信号分子调节的下游ORF的翻译，CPuORF肽作为“肽开关”结合小分子，从而减弱原核生物的转录和翻译，并根据小分子的浓度调节真核生物的剪接。此外CPuORF还被报道参与植物蛋白质周转，影响部分蛋白翻译。但目前并未有研究表明CPuORF18基因与植物对低温的耐受性有关联。

发明内容

本发明的目的是提供CPuORF18基因在负调控植物低温耐受性中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：

基于水稻专用数据库国家水稻数据中心 (https://www.ricedata.cn/) 公布的水稻全基因组测序，获得水稻CPuORF18基因 (即LOC_Os04g38520.1) 的核苷酸序列信息。CPuORF18基因编码框核苷酸序列长度为1896 bp，由631个氨基酸组成，其序列可以通过水稻专用数据库国家水稻数据中心查询获得。

本发明还构建一系列植物表达和敲除载体，含有上述基因的表达载体、基因编辑载体或转基因植物系以及含有所述载体的宿主细胞在提高植物低温耐受性方面的功能也落入本发明的保护范围之内。

本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述CPuORF18基因，还包括与CPuORF18基因具有较高同源性 (如同源性高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％) 的同源基因在低温耐受性方面的功能。

本发明根据CPuORF18的CDS基因序列构建了含EC1.2p启动子的pHEC401基因编辑载体，并通过农杆菌侵染创制出CPuORF18敲除突变株系。观察CPuORF18突变体 (CPuORF18敲除突变株系) 在苗期低温胁迫中的表型并分析其生物学功能，为作物抗逆分子育种提供基因资源。

本发明公开的CPuORF18基因在植物耐低温胁迫中的生物学功能，具体表现在：在低温胁迫条件下，CPuORF18敲除突变株系对低温冷害的耐受性显著高于野生型。上述应用通过低温处理实验得出结论。

根据其功能，可以通过转基因的方式来获得耐低温的植株，具体地，可以通过敲除CPuORF18基因，得到转基因植物，该植株对低温的耐受性高于目的植物。

具体地，可通过所述基因编辑载体导入所述目的植物。所述方法中，所述基因编辑载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，包括如下步骤（1）或（2）：

（1）通过减少目的植物中CPuORF18蛋白的活性，获得低温耐受性强于目的植物的植株；

（2）通过降低目的植物中CPuORF18基因的表达，获得低温耐受性强于目的植物的植株；

“降低目的植物中CPuORF18基因的表达”的实现方式可为如下（1）或（2）或（3）：

（1）在目的植物中敲除CPuORF18基因；

（2）插入T-DNA序列使基因无法表达；

（3）本领域内的其它常见方法。

其中，本发明所述目的植物是水稻。

目的基因，也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：水稻，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。

本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根（包括块茎）、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

本发明的优点：

本发明通过植物基因组克隆获得水稻CPuORF18基因，构建了pHEC401基因编辑载体，通过农杆菌侵染创制出CPuORF18基因敲除突变株系cpuorf18，分析了CPuORF18基因敲除突变株系cpuorf18在苗期低温胁迫中的生物学功能，结果表明，在低温胁迫下，CPuORF18基因敲除突变株系对低温冷害的耐受性显著高于野生型，揭示了CPuORF18基因调控植物低温耐受性的机制，为作物抗逆分子育种提供新的基因资源。

附图说明

图1为CPuORF18基因敲除突变体的鉴定；其中，图1中的A为CPuORF18基因在突变体中的突变位点示意图；图1中的B为CRISPR-Cas9靶点附近的核酸序列以及基因测序峰图，该测序以中花11号作为实验对照。

图2为CPuORF18-GFP融合蛋白的荧光定位结果。

图3为CPuORF18-FLAG蛋白在细胞中的分布情况。

图4为CPuORF18相关遗传材料经低温 (4℃) 处理96 h后恢复生长两周的表型图。

图5为CPuORF18相关遗传材料经低温 (4℃) 处理96 h后存活率统计图。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

在介绍具体实施例前，为便于本领域技术人员详细了解本申请的相关研发情况，以下结合附图对本发明的原理、部分实验材料、检测方法等情况进行说明：

1. 植物材料总RNA的提取及反转录

取0.2 g的植物材料，在液氮中迅速研磨成灰白色粉末进行实验。在粉末中加入600 µL Buffer EL，振荡1 min待粉末完全混匀后，立即离心5 min(12000 rpm)，转移上清至吸附柱III中离心1 min (12000 rpm)，将上清转入新管并加入300 µL无水乙醇调节上柱环境，充分混匀后将混合物分批加入吸附柱V中，离心30 s (12000 rpm)，弃滤液。随后在吸附柱V中分步加入RWA和RWB并离心除杂 (RWB要洗杂两遍)。洗杂后换新的收集管空柱离心2min (12000 rpm)，室温晾干后加水洗脱 (高速离心2 min)。洗脱后总RNA置于冰上暂存或液氮速冻后置于-80℃保存。

将提取得到的总RNA用Nanodrop测量浓度后，按照5 µg总RNA的量进行RNA模板变性，设置PCR程序 (65℃加热5 min，12℃降温5 min)，运行程序结束并且降温后取出变性产物，冰浴2 min。冰浴后加入gDNA wiper Mix混匀，置于42℃孵育2 min。在取出的混液中依次加入RT Mix、HiScriptIII Enzyme Mix、Oligo (dT)20VN以及RNase-free ddH₂O。将上述液体用移液枪吹打混匀后，设置PCR程序 (25℃加热5 min，37℃加热45 min，85℃处理5s)，取出后的cDNA产物可用于后续实验，或在-80℃保存。

2. 载体构建

基因编辑载体的构建流程：

首先登录官方网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，在CRISPR-PLANT网站中评估脱靶情况，筛选目的基因中Class0.0类型的靶 DNA 位点，以降低Cas9蛋白在剪切过程中的错配率。然后设计带靶点的引物，以稀释后的10pCBC-DT1T2为模板进行PCR扩增 (表1)，以便将基因组中识别位点前长度为20 nt的DNA片段通过PCR扩增克隆到向导RNA中。扩增引物的浓度控制在10-20 ng/µL；-F0/-R0需稀释20倍；PCR完成后，将PCR产物加入1% (w/v)琼脂糖凝胶的上样孔中进行电泳，前沿迁移到凝胶的2/3处停止电泳，切取含单一目的DNA片段的凝胶，放入离心管中。向离心管中加入1倍体积的溶胶液V1 (将凝胶称重，其体积视为1 μL/mg)，将离心管放入65℃水浴锅中进行加热。加热期间上下颠倒离心管数次至凝胶完全溶解，随后立即进行冰浴至溶液完全冷却至室温。将冷却后的溶胶液转移至吸附柱中，室温静置3 min 以使溶液与吸附柱充分结合，随后4000 rpm离心30-60 s。将过滤后的液体重新转移至吸附柱中，重复过滤2-3次。按照上述步骤将溶胶液全部转移上柱后，向吸附柱中加入漂洗液W2 (含无水乙醇) 700 μL，12000rpm室温离心30-60 s，弃去漂洗废液。重复漂洗一次后，将吸附柱置于烘箱直至乙醇完全挥发，加入40-50 μL超纯水洗脱 (高速离心2 min)。洗脱后回收产物置于冰上暂存。然后按照表2的酶切-连接体系进行酶切连接。将切连接后的产物用热激转化法转化至大肠杆菌T1中，并将转化产物涂至加有抗生素的LB平板上，在37℃条件下倒置培养12 h。挑取单菌落进行PCR验证，并将条带大小正确的菌液送至上海生工生物公司进行测序以检测构建情况。所构建的目的基因为CPuORF18基因，其ORF长1896 bp，编码631个氨基酸，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

表1 PCR扩增步骤

表2 酶切-连接体系

3. 遗传材料创制

以水稻野生型中花11号为出发植株。将构建出的基因编辑载体导入农杆菌中，通过农杆菌侵染水稻的愈伤组织，并通过抗性筛选获得CPuORF18基因敲除突变株(cpuorf18)。提取中花11号和cpuorf18突变体的RNA并反转录为cDNA，以此为模板利用特异性引物对CPuORF18基因进行PCR扩增，将PCR产物送至上海生工生物公司进行测序，结果表明，在cpuorf18突变体中CPuORF18基因的外显子上缺失了37个碱基，这导致该基因发生了移码突变 (图1中的A、图1中的B)。

4. CPuORF18蛋白的亚细胞定位

首先制备水稻原生质体：选取培养瓶中黑暗培育14±2天，生长状态良好的水稻黄化苗。取幼茎用刀片将其切成1±0.5 mm的细段，转移至盛有酶解液 (Cellulase RS, 1.5%(w/v); Macerozyme R10, 0.7% (w/v); D-Mannitol, 0.4 M; CaCl₂, 20 mM; MES-KOH(pH 5.7), 20 mM; BSA, 0.1% (w/v); KCl, 20 mM) 的平皿中，并将平皿避光置于30℃恒温摇床上 (60±20 rpm)，消化6±2 h。在消化完全的细胞悬浮液中缓慢加入与酶解液等体积的W5缓冲液，轻晃平皿混匀液体终止消化。并将混合的细胞悬液用300目细胞筛过滤至预冷的圆底离心管中 (缓慢研磨)，4℃离心2 min (转速200 g)，弃上清后沿管壁加入5 mLW5缓冲液。轻旋离心管使管底原生质体沉淀重悬，置于冰上自然沉降30min。吸除上清后完成水稻原生质体制备。

其次水稻原生质体转化 (全程避光)：在制备好的水稻原生质体中沿管壁加入转化所需的MMG缓冲液 (MgCl₂, 15 mM; D-Mannitol, 0.4 M; MES-KOH (pH 5.7), 4 mM)，轻旋离心管至原生质体重新悬浮于缓冲液中。与此同时将待转化的pCambia1300-35S-CPuORF18-GFP质粒、pCambia1300-35S-H2B-RFP质粒、pCambia1300-35S-SOT5-GFP质粒和pCambia1300-35S-GLK1-GFP质粒分装进2 mL圆底离心管中 (质粒总量10-20 µg, 体积不超过20 µL)，在转化时加入相应体积的原生质体细胞悬液并拨匀，随后加入提前配制的PEG转化液 (D-Mannitol, 0.2 M; CaCl₂, 100 mM; PEG4000, 40% (w/v)) 拨匀并置于室温反应15 min。转化反应完成时加入4倍体积的W5缓冲液 (CaCl₂, 125 mM; NaCl, 154 mM;KCl, 5 mM; MES-KOH (pH 5.7), 2 mM) 终止反应，室温离心2 min (转速100 g)，去除上清后加入W5缓冲液1 mL，在离心管中重悬原生质体。后将离心管平躺于平皿中，在28℃条件下，培养12±4 h。次日取出过夜培养的样品，自然沉降并去除700µL上清，以剩余缓冲液重悬原生质体。取少量原生质体悬液置于快速超分辨激光共聚焦显微镜下成像观察并拍摄图片。结果如图2所示：本实验以叶绿体的自发荧光信号和SOT5融合绿色荧光蛋白的绿色荧光信号作为叶绿体定位的对照。以GLK1融合绿色荧光蛋白的绿色荧光信号和H2B融合红色荧光蛋白的红色荧光信号作为细胞核定位的对照。观察CPuORF18蛋白的定位情况。在水稻叶片细胞中CPuORF18-GFP融合蛋白的绿色荧光信号与定位细胞核的H2B-RFP红色荧光信号完全重合。且通过GLK1对照组可以观察到这种定位信号与GLK1的细胞核定位信号一致，这种信号分布说明CPuORF18-GFP的融合蛋白定位于细胞核 (图2)。

5. 水稻组分分离实验

细胞核的分离实验：选取培育21天生长状况良好的植物材料1-2 g，在液氮中迅速研磨成粉末进行实验。向粉末中投入NIB缓冲液10 mL (Hepes/NaOH (pH 7.4) 50 mM;NaCl 25 mM; 5%Sucrose (w/v); 30%Glycerin (w/v);0.25%Triton X-100 (v/v); 0.1%β-巯基乙醇 (v/v); 0.1%PPIC (v /v))。过滤后低温孵育15 min，将孵育好的溶液离心20min (转速3000g)。弃去上清后，向沉淀中加入Wash缓冲液10 mL(Hepes/NaOH (pH 7.4) 50mM; MgCl₂20 mM; NaCl 100 mM; 40%Sucrose (w/v); 40%Glycerin 0.25%Triton X-100(v/v); 0.1%β-巯基乙醇 (v/v); 0.1%PPIC(v /v))，重悬细胞核粗提物。再次离心，并重复洗涤一次，所得沉淀即为分出的细胞核。

向上述分离得到的细胞核样品中加入100 μL全蛋白提取液 (125 mM Tris-HCl,pH 8.8; 50 mM Na₂S₂O₅; 1% (w/v) SDS; 10% (w/v) Glycerol)，充分涡旋振荡 (15min)，然后室温离心 (12,000 g，10 min)，吸取上清至新的1.5 mL 离心管中并进行Westernblot。其结果如图3所示，即CPuORF18-FLAG的融合蛋白定位于细胞核。

6. 水稻低温处理验证CPuORF18基因在低温耐受性中的功能

本发明使用非冷驯化方式对培养14天的水稻幼苗进行了低温处理。具体处理方法如下：首先对CPuORF18相关遗传材料的种子进行侵泡催芽 (30℃，避光环境)，约2日后将萌发一致的水稻种子转移至水稻专用水培盒中，用水在人工气候箱中育秧。2-3天后将水更换为国际水稻所使用的专用营养液培养14天 (该过程中生长的光周期为16/8，即光照16 h，黑暗8 h)，温度为光照时28℃/黑暗时20℃，光照强度为200 μmol.m^-2.s^-1，湿度为60%)。14天后将材料转移到4℃培养箱中处理96 h (该过程中生长的光周期为16/8，即光照16 h，黑暗8 h，温度为4℃，光照强度为200 μmol.m^-2.s^-1，湿度为60%)，然后转移回正常条件下进行恢复，在恢复过程中观察表型并统计存活率 (图4和图5)。以上所有实验均设置3个生物学重复，并计算其平均值及误差。实验结果显示，CPuORF18基因敲除后的水稻幼苗在低温处理后的存活率大大升高，在低温处理后其存活率显著高于野生型 (中花11号)。存活率统计结果显示，野生型 (中花11号) 的幼苗经过低温处理后存活率约为10%，即约90%的叶片出现萎蔫甚至整株死亡。而CPuORF18基因敲除突变体的水稻幼苗在低温处理后存活率高达60%。

以上结果表明，在水稻幼苗中敲除CPuORF18基因可提高水稻幼苗对低温的耐受能力。即，CPuORF18基因是个负调控基因，在实际育种过程中，可以通过降低CPuORF18基因表达的方式来提高植物的低温耐受性，为作物抗低温分子育种提供基因资源。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.CPuORF18基因在负调控植物对低温耐受性中的应用，其特征在于，所述CPuORF18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述负调控表现在降低CPuORF18基因表达的植物对低温的耐受性提高，所述植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述低温耐受性为萌发后生长14天的苗期植物对低温的耐受性，所述低温处理的温度范围为0℃~4℃。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，降低CPuORF18基因表达的方式为敲除CPuORF18基因。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，敲除CPuORF18基因的方式是通过构建CPuORF18Crispr-cas9基因编辑载体，获得CPuORF18基因敲除突变株系，所述突变株系的低温耐受性高于野生型。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，以野生型水稻为出发植株，将构建出的基因编辑载体导入农杆菌中，通过农杆菌侵染水稻愈伤组织，并将获得的愈伤组织继续诱导以获得再生苗，通过抗性筛选得到CPuORF18基因敲除突变株系。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CPuORF18基因为水稻来源的CPuORF18基因。

7.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为以下（1）或（2）：

（1）通过减少目的植物中CPuORF18蛋白的活性，获得耐低温性能强于目的植物的植株；

（2）通过降低目的植物中CPuORF18基因的表达，获得耐低温性能强于目的植物的植株；

所述CPuORF18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CPuORF18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述目的植物为水稻。

8.根据权利要求7所述的植物育种方法，其特征在于，降低目的植物中CPuORF18基因的表达的方法为敲除CPuORF18基因。