KR100869565B1

KR100869565B1 - 기능획득 돌연변이의 신속 생산 방법

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Publication number: KR100869565B1
Application number: KR1020020032312A
Authority: KR
Inventors: 정화지; 인동수; 최동욱; 최필선; 유장렬; 이수영; 고석민
Original assignee: 유진텍주식회사
Priority date: 2002-06-10
Filing date: 2002-06-10
Publication date: 2008-11-21
Also published as: KR20030095418A

Abstract

본 발명은 식물체를 기타의 변이 유발요인이 제거된 활성표지법에 의해 돌연변이를 유도함으로써 식물체 전체 genome의 기능획득 돌연변이 라이브러리를 용이하게 얻을 수 있어 2차 대사산물을 대량 생산하는 돌연변이를 얻을 수 있을 뿐 아니라 효과적으로 새로운 식물 유전자를 발견하고 그 기능을 구명할 수 있는 새로운 방법에 관한 것이다.

본 발명은, (A) 야생형 A. rhizogenes를 식물체 조직에 감염시켜 모상근 세포계(line)를 획득하는 단계; (B) activation tagging vector가 도입된 A. tumefaciens로 상기 식물체 모상근 세포계를 형질전환시켜 activation tagging된 모상근을 선별하는 단계를 포함하는 기능획득 돌연변이 식물 모상근의 신속한 획득방법 및 이에 의해 획득된 식물체 전체 genome 돌연변이 라이브러리를 제공한다.

활성표지법, activation tagging, 돌연변이, 기능획득, 식물, 모상근, 인삼

Description

기능획득 돌연변이의 신속 생산 방법{Rapid Production of transgenic hairy roots using the activation tagging system}

도 1은 본 발명의 실시예에서 제조된 activation tagging vector의 구조도.

최근 특정 유전자의 기능을 알아보기 위해서 특정 유전자의 기능을 없앤 기능손실 돌연변이체(loss-of-function mutant)를 이용한 유전학적, 분자생물학적 방법이 널리 사용되고 있다. 기능손실 돌연변이체의 제조방법으로는 상동 재조합(homologous recombination)을 이용한 knock-out 방법, EMS(ethyl methanesulfonate)와 같은 화학물질을 이용하거나, 감마선 조사와 같은 물리적인 방법, 혹은 T-DNA 표지(T-DNA tagging)와 같은 생물학적인 방법 등이 알려져 있다.

그러나 이러한 기능손실 돌연변이체를 제조하여 특정 유전자의 기능을 연구하는 것은 여러 가지 장점에도 불구하고 기능손실 돌연변이체를 이용하여 해당 유전자의 기능을 알아내기 어려운 경우가 있다.

예를 들면 첫째, 기능 손실 돌연변이체의 표현형은 돌연변이체의 자가수분을 통해 얻어진 후대세대에서만 관찰이 가능하므로 인삼과 같이 유전적으로 변이체를 제조하기가 어려운 식물체의 경우이다.

둘째, 어떤 유전자의 기능이 다른 유전자의 기능과 중복되는 경우이다. 즉, 그 유전자이외에도 유사한 역할을 하는 유전자가 존재(functional redundancy)하여 한 유전자의 기능상실만으로는 돌연변이체가 형질을 보이지 않는 경우가 이에 해당된다.

셋째, 배발생 초기에 발현하여 만약 그 유전자의 기능이 손실되었을 때 생물체의 발생이 전혀 이루어지지 않게 되는 유전자들의 경우이다. 이러한 경우 해당 유전자의 기능 손실 돌연변이체 제조를 시도하면 그 생물은 초기 배발달이 이루어지지 않게 되므로 해당 유전자의 돌연변이체를 전혀 얻을 수 없게 된다. 따라서 기능손실을 야기하는 일반적인 선별방법으로는 이러한 유전자를 분리하기란 매우 어렵다.

이러한 이유로, 기존의 기능손실 돌연변이체 선별 방법은 그 장점에도 불구하고 제한적으로 사용될 수 밖에 없다. 이러한 기능 손실 돌연변이체 선별방법의 대안으로서 활성표지 선발법 (Activation tagging system)이 확립되어 애기장대에 널리 활용되고 있다(Weigel et al., 2000). 이 활성 표지 선별 방법은 Cauliflower 모자익 바이러스의 35S 프로모터 enhancer 서열이 비교적 멀리 떨어져 있는 상태에서도 주변의 유전자의 전사를 활성화(transcription activation) 시킬 수 있다는 점을 이용하여 기능 획득 돌연변이체(gain-of-function mutant)를 얻는 방법이다.

구체적으로 살펴보면, 상기 enhancer 서열을 함유하는 activation tagging vector를 제작하여 이를 Agrobacterium tumefaciens에 도입한다. 이어서 상기 A. tumefaciens를 식물체에 도입시켜 형질진환시킨 후 이로부터 캘러스를 유도하고, 캘러스를 재분화조건에서 배양하여 형질전환된 식물 개체를 얻는 것이다. 그 후 기능획득 발현 형질(표현형질)을 보이는 식물체를 선별하고 게놈 DNA를 회수하여 전사 활성화된 유전자를 클로닝하는 것이다.

이렇듯 활성표지 선별법을 통해 보다 효율적으로 식물체로부터 새로운 유전자를 발견하고 분석하는 것이 가능하게 되었다.

그러나, 이제까지의 활성표지 선별법은 신규 유전자의 발견 및 분석에 매우 유리한 방법이지만, ① 식물체 조직을 형질전환시킨 후 이로부터 캘러스를 유도하고, 캘러스로부터 재분화 개체를 획득해야 하기 때문에 장기간을 요하며, ② 모든 재분화 개체를 독립적으로 길러야 하기 때문에 넓은 작업장이 필요할 분 아니라, ③ 시각적으로 나타나지 않는 표현형, 예를들면, 특정 물질의 생산유무 또는 생산량의 증감 유무 등과 같은 표현형에 대한 유전자에 대한 연구에는 적합하지 않다는 단점이 있다.

인삼(Panax ginseng)은 고대로부터 우리나라와 중국, 일본에서 널리 이용된 매우 유용한 약용식물 중의 하나이다. 인삼뿌리의 활성물질은 항암, 항스트레스, antiaging, 면역강화 증진에 효능이 있는 것으로 알려져 있으며 최근 들어 음료, 강장제, 비누, 화장품 등의 형태로 생산보급되고 있다.

인삼 재배는 4∼6년의 오랜 시간과 고가의 노동력이 요구되므로 식물세포배양기술을 이용하여 인삼 사포닌을 비롯한 다양한 유효성분을 대량으로 생산하는 연구가 꾸준히 이루어지고 있다(Wu and Zhong, 1999). 그러나 일반 식물세포 혹은 조직배양의 경우 지속적인 호르몬의 공급이 필요하며 오랜 계대배양을 거치는 동안 유전적으로 불안정하며 그 결과 유효성분 생산량이 감소하는 단점이 있다.

이러한 단점을 보완하는 대체 배양기술로서 식물의 모상근 증후를 일으키는 Agrobacterium rhizogenes를 이용하여 이차 대사산물을 대량 생산하는 시스템이 알려져 있다(Giri and Narasu, 2000; Shanks and Morgan, 1999).

모상근은 일반 뿌리보다 생장속도가 빠르며, 유전적으로 안정하고, 호르몬이 없는 배지에서도 성장이 가능하다. 또한 모상근은 식물체 뿌리조직의 모든 특성을 보유하고 있는 돌연변이 조직으로서 체세포변이 없이 식물체로의 재분화가 용이하며, 줄기 재분화에 영향을 주는 항생제의 사용없이 형질전환체 선택이 가능하다는 장점을 지니고 있다.

이러한 모상근의 장점을 이용하여 여러 식물체로부터 진세노사이드, 인돌알카로이드, 탄닌, 사포닌, 플라보노이드 등의 유용 이차대사 산물의 대량생산을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(Geerlings et al., 1999; Jouhikainen et al., 1999).

그러나 A. rhizogenes로 유도된 모상근의 많은 장점에도 불구하고 종래 모상근 유도를 통한 유용한 이차대사 산물의 생산연구는 단순히 특정 식물체의 뿌리(예를들면 인삼)에서 생산되는 대사 산물을 관리하고 조작하기 편리한 "뿌리대용"의 모상근에서 생산하는 것일 뿐 더 이상의 부가적인 효과를 얻지는 못하고 있다.

이에 본 발명자들은 종래 기술의 단점을 해결한, 활성표지 선별법과 모상근 유도법을 결합시켜 모상근을 이용한 효율적인 이차대사산물 대량생산 돌연변이체를 획득하는 방법 및 이 방법에 의한 식물체 전체 genome 돌연변이 라이브러리를 개발하여 대한민국 특허출원 제10-2002-28182호로 출원한 바 있다.

상기 출원발명에 의해 식물의 이차대사 산물을 효율적으로 생산할 수 있는 시스템을 확립히고, 얻어진 기능획득 돌연변이체로부터 유전자를 분리하고 분석하는데 시간을 획기적으로 단축시켜 식물의 신규 유전자 발견 그 이용에 매우 유용하게 된다.

그러나 상기 출원발명에 의하면, 발현된 표현형의 변이가 식물체 유전자 조작 과정에서 유발된 우발적 돌연변이인지, activation tagging system에 의해 유도된 유전자 돌연변이에 기인한 것인지, A. rhizogenes의 oncogene 상의 오옥신(auxine)관련 유전자의 변이 때문인지, 또는 추후 선별과정에서의 환경변화에 기인한 것인지 분명치 않은 단점이 있다. 따라서 각 표현형의 변이체 마다 변이의 원인을 밝혀야 하는 추가적인 조작과정이 필수적으로 요구되는 것이다.

이에 본 발명은, 전술한 표현형 변이의 원인을 명확히 파악할 수 있는 식물 돌연변이체 신속획득방법을 제공하고자 한다.

즉 본 발명은, 활성표지 선별법과 모상근 유도법을 결합시켜 식물체 모상근으로부터 돌연변이체를 획득하는 과정에서 activation tagging 이외의 원인에 의한 모든 변이유발 요소(background effect 또는 background noise)를 제거한 식물 돌연변이체 신속획득방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 보다 신속하고 경제적으로 활성표지 선별법에 의한 기능활성 돌연변이체를 획득할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 전술한 방법을 이용한 식물체 전체 genome 돌연변이 라이브러리를 제공하는 것을 목적으로 한다.

(I) 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, (A) 야생형(wild type) A. rhizogenes를 식물체 조직에 감염시켜 모상근을 유도하고, 유도된 모상근 중 어느 하나를 분리하여 모상근 세포계(line)를 획득하는 단계; (B) enhancer 및 선별 마커를 포함하는 activation tagging vector를 제작하고, 상기 activation tagging vector를 A. tumefaciens에 도입하는 단계; (C) 상기 activation tagging vector가 도입된 A. tumefaciens로 상기 식물체 모상근 세포계를 형질전환시키고, 선별배지에서 배양하여 activation tagging된 모상근 라이브러리를 획득하는 단계;를 포함하는 기능획득 돌연변이 식물 모상근의 신속한 획득방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 상기 단계들에 (D) 상기 모상근 세포계와 상기 activation tagging된 모상근을 동일한 조건에서 배양하여 양자의 표현형(phenotype) 차이를 분석하는 단계가 추가될 수도 있다.

본 발명에서 상기 대상 식물체는 A. rhizogenes의 감염에 의해 모상근이 유도될 수 있는 어떠한 식물체라도 가능하다. 예컨대, 유용한 약용물질을 생산하는 인삼을 대상으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 enhancer 및 선별마커는 activation tagging system에 적합한 종래의 어떤 것, 장차 개발될 어떤 것이라도 사용할 수 있다. 본 발명에서는 예시적으로 pCAMBIA vector에 Cauliflower 모자익 바이러스의 35S 프로모터 enhancer인 CaMV 35S enhencer를 삽입시킨 플라스미드 pKH1를 제작하여 activation tagging vector로 사용한다.

상기 (C) 단계는 종래 알려진 방법에 따라, A. tumefaciens와 대상 식물체의 적절한 조직을 공동배양(coculture)하여 진행할 수 있다.

상기 (A) 단계에서는 activation tagging vector가 없는 야생형 A. rhizogenes를 식물체 조직에 도입하여 모상근을 유도하고, 그 중 하나를 선택하는 것이다. 이 과정을 통해 모상근 마다 있을 수 있는 A. rhizogenes의 oncogene 상의 오옥신(auxine)관련 유전자의 변이에 의한 변이요인(background effect 또는 background noise)을 제거할 수 있게 된다. 모상근 세포계는, 형성된 모상근을 분리하고 수 회 계대배양하여 형태적, 생리적 안정성이 유지되는 모상근 중에서 선발하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 형태적, 생리적 안정성이 유지되면서 생장속도가 가장 빠른 모상근을 선택하는 것이 좋다. 후속되는 과정의 소요시간을 줄일 수 있기 때문이다.

이렇게 선택된 모상근 세포계는 액체배지에서 급속으로 배양하여 형질전환용 stock으로 사용하게 된다.

상기 (C) 단계를 거쳐 얻어진 기능획득 돌연변이 모상근은 오로지 activation tagging vector의 enhancer의 작용에 기인한 것임을 추정할 수 있다. (C) 단계에서 획득된 식물체 모상근은 전체 genome 기능획득 돌연변이 라이브러리에 해당하므로 해당 식물체의 유전자 발견과 그 기능 구명에 유용하게 활용할 수 있게 된다. 상기 전체 게놈 돌연변이 라이브러리의 각각 구성 세포계(모상근 line)를 재분화시켜 발현된 표현형에 따라 관련 유전자를 연구할 수 있게 됨으로써 식물 기능유전체학에 획기적인 연구도구로 활용할 수 있게 된다.

(II) 또한 전술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, (A) 야생형(wild type) A. rhizogenes를 식물체 조직에 감염시켜 모상근을 유도하고, 유도된 모상근 중 어느 하나를 분리하여 모상근 세포계를 획득하는 단계; (B) enhancer 및 선별마커를 포함하는 activation tagging vector를 제작하고, 상기 activation tagging vector를 A. tumefaciens에 도입하는 단계; (C) 상기 Activation Tagging vector와 동일하면서 enhancer 부분만이 없는 control vector를 제작하고, 상기 control vector를 A. tumefaciens에 도입하여 control A. tumefaciens를 획득하는 단계; (D) 상기 control A. tumefaciens로 상기 식물체 모상근 세포계를 형질전환시키고, 선별배지에서 배양하여 형질전환된 모상근 표준세포계를 획득하는 단계; (E) 상기 activation tagging vector가 도입된 A. tumefaciens로 상기 식물체 모상근 표준세포계를 형질전환시키고, 선별배지에서 배양하여 activation tagging된 모상근 라이브러리를 획득하는 단계;를 포함하는 기능획득 돌연변이 식물 모상근의 신속획득방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 상기 단계들 이후에 (F) 상기 모상근 표준세포계와 상기 activation tagging된 모상근을 동일한 조건에서 배양하여 양자의 표현형(phenotype) 차이를 분석하는 단계가 추가될 수 있다.

여기서 (A) 단계, (B) 단계 및 (F) 단계는 각각 전술한 (I)의 (A) 단계, (B) 단계 및 (D) 단계와 동일하다. (E) 단계는 모상근 세포계 대신에 모상근 표준세포계를 형질전환시킨다는 점을 제외하고는 전술한 (I)의 (C) 단계와 동일하다.

여기서 (C) 단계 및 (D) 단계는, 추후 선별과정에서의 환경변화에 기인한 변이를 제거하기 위한 단계이다. (C) 단계에서는 예를들면, 카나마이신 저항성 유전 자 등과 같이 추후 선별에 이용될 특정 마커(marker) 등은 존재하지만 enhancer가 없는 control vector(empty vector)를 제작하고, 이를 A. tumefaciens에 도입하여 control A. tumefaciens를 얻는다. 이어서 (D) 단계에서는 상기 control A. tumefaciens로 (A) 단계에서 얻어진 식물체 모상근 세포계를 형질전환시키고, 선별배지에서 배양하여 형질전환된 모상근 표준세포계를 획득하는 것이다. 선별배지 즉, 항생제 함유 배지에서 형질전환된 모상근 표준세포계를 선별하고 이를 증식시켜 activation tagging system의 적용대상으로 활용하는 것이다.

이렇게 선별·증식된 모상근 표준세포계는 A. rhizogenes의 oncogene 상의 오옥신(auxine)관련 유전자의 변이, 또는 추후 선별과정에서의 환경변화에 기인한 변이 등 activation tagging 이외의 원인에 의한 변이유발 요소가 제거된 세포계인 것이다.

따라서, 상기 (E) 단계를 거쳐 얻어진 기능획득 돌연변이 모상근은 오로지 activation tagging vector의 enhancer의 작용에 기인한 것임을 추정할 수 있다. (E) 단계에서 획득된 식물체 모상근은 전체 genome 기능획득 돌연변이 라이브러리에 해당하므로 해당 식물체의 유전자 발견과 그 기능 구명에 유용하게 활용할 수 있게 된다. 상기 전체 게놈 돌연변이 라이브러리의 각각 구성 세포계(모상근 line)를 재분화시켜 발현된 표현형에 따라 관련 유전자를 연구할 수 있게 됨으로써 식물 기능유전체학에 획기적인 연구도구로 활용할 수 있게 된다.

위 (I) 또는 (II)에서 획득된 형질전환체를 각각 모상근 세포계 또는 모상근 표준세포계와 동일한 조건(액체 또는 고체배지, 배양조건)에서 일전기간 배양한 후 배양액 또는 모상근 추출액을 비교분석하거나, 형태적 특성을 비교분석함으로써 activation tagging system에 의해 유전자 기능이 활성화된 돌연변이체를 분리할 수 있고, 나아가 이로부터 해당 유전자를 분리하고 그 기능을 구명할 수 있게 되는 것이다. 이는, 모든 변이유발요소가 제거된 상태이기 때문에 형질전환된 돌연변이체와 모상근 세포계 또는 모상근 표준세포계와의 표현형질 차이는 곧 activation tagging에 기인한 것이기 때문이다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 예시적으로 설명한다. 하기 실시예에서 사용되는 각종의 유전자, 벡터, 식물체 등은 본 발명을 설명하기 위한 예일 뿐 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위가 한정되는 것이 아님은 당업자에게 있어서 자명한 것이다.

실시예 1 : 모상근 세포계의 제조(인삼 조직에 야생형 A, rhizogenes 의 도입)

(1) 인삼 조직의 준비

재료로 사용한 인삼(천풍(KG101))종자는 한국인삼연초연구원의 위탁 채종 포장인 대천의 인삼재배 농가로부터 분양 받았다. 천풍(KG101)은 인삼연초연구원이 품종화시킨 Open pollinated type으로 매우 균일한 생육특성과 많은 뇌두를 내는 대형종 인삼이다.

분양 받은 종자는 층적처리를 통해 개갑을 유도하여 실험재료로 사용하였다. 개갑된 인삼종자는 종피를 제거한 뒤, 30 초간 70% (v/v) ethanol로 세척 후, 15분간 0.4% 상용락스 용액에 침지 후 멸균증류수로 3회 세척하였다. 살균된 인삼종자는 접합자배를 1/2MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에서 무균발아시키고 모상근을 유도에 효율적인 조직으로 확인된 자엽, 하배축, 잎, 엽병 등을 재료로 이용하였다. 한편, 또 다른 재료로서, 4년근 성체인삼의 잎, 엽병, 줄기 등은 0,4% 상용 락스에 10∼15분 간 침지하여 살균하였다. 살균된 조직은 멸균 증류수로 3회 세척 후 약 0.5∼1 cm3 로 절단하여 A. rhzogenes와 공동 배양을 위한 재료로 사용하였다.

(2) 모상근의 유도 및 모상근 세포계의 분리

전기 (1)에서 준비한 인삼 조직과 야생형 A. rhzogenes 균주를 공동배양하여 균주가 인삼 조직에 도입되도록 유도하였다. 야생형 A. rhzogenes 균주는 균주는 생명공학연구원 부설유전자원센터(KCTC)로부터 분양 받은 A. rhzogenes R1000 (A4, CIP104786)를 이용하였다(기탁 번호 : KCTC2742).

현탁배양한 상기 A. rhizogenes 배양액을 1/25비율로 1/2 농도의 MS액체배지로 희석하여 공동배양액을 조성하고 약 30분간 상기 인삼 조직을 침지하였다. 이어서 상기 침지된 인삼 조직을 1/2salt의 MS고체배지에서 2일간 공동배양하였다.

공동배양 된 인삼조직을 800mg/L cefotaxime이 첨가된 1/2MS 액체배지로 세 척 후 3주일 간격으로 400mg/L cefotaxime이 첨가된 1/2MS 선택배지(1/2MSC400Km 100)에서 계대배양하면서 모상근을 유도하였다.

공동배양 후 약 2주 후부터 인삼 조직으로부터 모상근의 발달이 관찰되었고, 1∼2달 후에 생장속도가 빠르고 형태적, 생리적 안정성이 유지되는 모상근 1개를 분리하여 400mg/L cefotaxime과 50mg/l의 Km이 첨가된 1/2MS 배지에 증식/계대배양하였다. 선별된 모상근 세포계를 100mg/L cefotaxime 이 첨가된 SH 배지를 이용하여 1달 간격으로 계대배양하면서 필요에 따라 사용하였다.

이렇게 제조된 모상근 세포계는 A. rhzogenes 균주 자체에 의한 변이 유발요소가 제거된 상태이다.

실시예 2 : activation tagging vector의 제작 및 A. tumefaciens 의 형질전환

(1) activation tagging vector의 제작

A. tumefaciens 균주에 도입되어 복제 전사될 수 있으며, 추후 식물체 세포에 도입되어 돌연변이를 유발할 수 있는 activation tagging vector(도 1)를 제작하였다.

Activation tagging vector pSKI015(Weigel et. al., 2000)의 enhancer부분을 BamHI과 PstI 제한효소 및 하기와 같은 서열을 가지는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하여 pCR2.1 TOPO vector내로 cloning을 하였다.

5'―TCTAGAACTAGTGGATCCCCAACATG－3' (서열 1)

5―CTGCAGAATATATCCTGTCAAACACTG―3' (서열 2)

cloning된 vector를 TOP10 cell내로 도입시켜 플라스미드를 증폭시킨 후 BamHI과 PstI 제한효소를 처리하였다. agarose gel상에서 전기영동하여 vector로부터 enhancer fragment를 분리시키고 QIAquick gel extraction kit를 이용하여 1413 bp 크기의 fragment를 정제 회수하였다.

pCAMBIA2300 vector에 BamHI 과 PstI 제한효소를 처리한 후 enhancer fragment와 함께 16℃에서 약 14∼16시간 ligation반응을 시켰다. igation 반응물을 DH10B competent cell로 도입하여 Kanamycin이 함유된 LB 선별배지에서 증폭시키므로써 pKH1을 제조하였다.

Activation tagging vector pSKI015는 활성표지법에 의한 돌연변이를 연구하는 많은 연구그룹이 보유하고 있는, 입수가 매우 용이한 vector이며, 이 vector로부터 enhancer의 분리 및 pKH1의 제작은 본 발명이 속하는 기술분야의 보통 수준의 연구원이라면 용이하게 수행할 수 있는 것이다. 이에 본 발명자들은 pKH1의 기탁을 생략하였다.

(2) A. tumefaciens 의 형질전환

상기 (1)에서 제작된 activation tagging vector pKH1을, 기능획득 모상근 유도를 위해 control A. tumefaciens에 도입하였다. 본 실시예에서는 A. tumefaciens strain 4404 균주는 Clonetech (Palo Alto, USA)으로부터 구입하여 사용하였으나, 형질전환을 목표로하는 식물체의 종류에 따라 다른 종류의 disarmed A. tumefaciens strain도 가능하다.

A. tumefaciens를 3ml의 YEP 액체배지(Bacto-peptone 10g/L, Bacto-yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L)에 접종하여 28℃, 180rpm으로 진탕배양하여 이용하였다.

Competent cell를 만들기 위해 15∼24 시간 배양한 A. tumefaciens을 새로운 50 ml YEP 배지에 2 ml 접종하여 배양한 후 OD600=0.6∼1.0 이 되었을 때 수확하여 0.15M NaCl에 재 분주하여 얼음에 10분간 방치하였다. 박테리아는 다시 원심분리하여 수확한 후 1ml 20mM CaCl2에 분주하고 100 ㎕ 씩 나누어 액체질소에 얼린 후 ―70℃ deep freezer에 보관하여 c-cell로 사용하였다.

제작된 vector를 박테리아에 도입시키기 위해 100 ㎕의 A. tumefaciens 보관액에 약 1 ㎍의 DNA을 섞고 액체질소에서 약 2분간 얼린 후 37℃에서 5분간 녹이는 과정을 2회 반복하고 얼음에 30분간 방치하였다.

상기 tube에 약 1 ml의 YEP배지를 넣고 약 2시간 배양후 박테리아만 수확하여 Kanamycin (100mg/l)이 들어있는 선별배지에 도말하여 vector가 도입된 A. tumefaciens를 선별하였다.

실시예 3 : Control vector를 A. tumefaciens 에 도입

A. tumefaciens 균주에 도입되어 복제 전사될 수 있으며, activation tagging vector에서 enhancer 부분이 없는 control vector를 A. tumefaciens 균주에 도입하였다.

Control vector로는 상기 activation tagging vector인 플라스미드 pK1에서 enhancer 부분만이 없는 플라스미드 pCAMBIA2300를 사용하였다.

플라스미드 pCAMBIA2300는 식물체 돌연변이를 연구하는 많은 연구그룹이 보유하고 있는, 입수가 매우 용이한 vector이기 때문에 그 기탁을 생략하였다.

Control vector를 A. tumefaciens에 도입하는 과정에서 사용된 균주 및 방법은 전기 실시예 2의 (2)에 기재된 바와 같았다.

실시예 4 : 모상근 표준세포계의 제조

실시예 1에서 준비된 인삼 모상근 세포계와 실시예 3에 의한 control vector로 형질전환된 A. tumefaciens 균주를 공동배양하여 균주가 인삼 모상근 세포계에 도입되도록 유도하였다.

현탁 배양한 상기 control vector로 형질전환된 A. tumefaciens를 배양액을 1/25비율로 1/2 농도의 MS액체배지로 희석하여 공동배양액을 조성하고 약 30분간 상기 인삼 모상근 세포계를 침지하였다. 이어서 상기 침지된 인삼 모상근 세포계를 1/2salt의 MS고체배지에서 2일간 공동배양하였다.

공동배양 된 인삼 모상근 세포계를 800mg/L cefotaxime이 첨가된 1/2MS 액체배지로 세척 후 3주일 간격으로 400mg/L cefotaxime과 100mg/L Kanamycin이 첨가된 1/2MS 선택배지(1/2MSC400Km 100)에서 계대배양하면서 돌연변이 모상근 라이브러리를 유도하였으며, 이를 "모상근 표준세포계" 로명명하였다.

유도된 돌연변이 모상근 라이브러리를 100mg/L cefotaxime과 100mg/L Kanamycin이 첨가된 SH 배지를 이용하여 1달 간격으로 계대배양하면서 필요에 따라 사용하였다.

이렇게 제조된 모상근 표준세포계는 A. tumefaciens 균주 자체에 의한 변이 유발요소 및 추후 선별과정의 환경변화에 의한 변이 유발요소가 제거된 상태이다.

실시예 5 : 모상근 세포계로부터 돌연변이 모상근 라이브러리(1)의 유도

실시예 1에서 준비된 인삼 모상근 세포계와 실시예 2에 의한 activation tagging vector로 형질전환된 A. tumefaciens 균주를 공동배양하여 균주가 인삼 모상근 세포계에 도입되도록 유도하였다.

도입과정은 전기 실시예 4에 기재된 방법과 동일하게 수행하였다.

유도된 돌연변이 모상근 라이브러리(1)를 100mg/L cefotaxime과 100mg/L Kanamycin이 첨가된 SH 배지를 이용하여 1달 간격으로 계대배양하면서 필요에 따라 사용하였다.

실시예 6 : 모상근 표준세포계로부터 돌연변이 모상근 라이브러리(2)의 유도

실시예 4에서 준비된 인삼 모상근 표준세포계와 실시예 2에 의한 activation tagging vector로 형질전환된 A. tumefaciens 균주를 공동배양하여 균주가 인삼 모상근 표준세포계에 도입되도록 유도하였다.

유도된 돌연변이 모상근 라이브러리(2)를 100mg/L cefotaxime과 100mg/L Kanamycin이 첨가된 SH 배지를 이용하여 1달 간격으로 계대배양하면서 필요에 따라 사용하였다.

실시예 7 : 표현형의 비교분석

(1) 실시예 5에 의한 돌연변이 라이브러리(1)와 실시예 1에 의한 모상근 세포계의 비교

(2) 실시예 6에 의한 돌연변이 라이브러리(2)와 실시예 4에 의한 모상근 표준세포계의 비교

본 발명에 의한 활성표지 선별법 및 모상근 유도법의 조합법에 의하면 짧은 시간동안에 전체 식물 genome의 돌연변이 라이브러리를 용이하게 얻을 수 있게 된다.

따라서 이를 활용하여 식물의 이차대사 산물을 효율적으로 생산할 수 있는 시스템을 확립할 수 있게 되며, 얻어진 기능획득 돌연변이체로부터 유전자를 분리하고 분석하는데 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있기 때문에 향후 식물의 신규 유전자 발견 그 이용에 대한 유용성이 매우 높을 것으로 생각된다.

즉, 본 발명에 의하여 ① 상기 활성표지(돌연변이) 모상근 라이브러리를 이 용한다면 식물체의 이차대사 산물을 대량생산할 수 있는 시스템을 확립할 수 있게 되며, ② 상기 활성표지(돌연변이) 모상근 라이브러리에서 tagging된 관련 유전자를 분리하여 분석함으로써 새로운 유전자의 발견 및 특성분석이 가능하게 된다.

<110> Eugentech <120> Rapid Production of transgenic hairy roots using the activation tagging system <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 tctagaacta gtggatcccc aacatg 26 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctgcagaata tatcctgtca aacactg 27

Claims

(A) 야생형(wild type) 리조게네스(A. rhizogenes)를 식물체 조직에 감염시켜 모상근을 유도하고, 유도된 모상근 중 어느 하나를 분리하여 모상근 세포계를 획득하는 단계;

(B) 증강제(enhancer) 및 선별마커를 포함하는 활성표지 벡터(activation tagging vector)를 제작하고, 상기 활성표지 벡터(activation tagging vector)를 투메팩션스(A. tumefaciens)에 도입하는 단계;

(C) 상기 활성표지 벡터(activation tagging vector)가 도입된 투메팩션스(A. tumefaciens)로 상기 식물체 모상근 세포계를 형질전환시키고, 선별배지에서 배양하여 기능획득 돌연변이 모상근 라이브러리를 획득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능획득 돌연변이 식물 모상근의 신속획득방법.
제 1 항에 있어서

상기 (A) 단계에서 모상근 세포계는, 형성된 모상근을 분리하고 수 회 계대배양하여 형태적, 생리적 안정성이 유지되는 모상근 중에서 선발되는 것을 특징으로 하는 기능획득 돌연변이 식물 모상근의 신속획득방법.
제 1 항에 있어서

(D) 상기 모상근 세포계와 상기 기능획득 돌연변이 모상근을 동일한 조건에서 배양하여 양자의 표현형(phenotype) 차이를 분석하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 기능획득 돌연변이 식물 모상근의 신속획득방법.
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(A) 야생형(wild type) 리조게네스(A. rhizogenes)를 식물체 조직에 감염시켜 모상근을 유도하고, 유도된 모상근 중 어느 하나를 분리하여 모상근 세포계를 획득하는 단계;

(B) 증강제(enhancer) 및 선별마커를 포함하는 활성표지 벡터(activation tagging vector)를 제작하고, 상기 활성표지 벡터(activation tagging vector)를 투메팩션스(A. tumefaciens)에 도입하는 단계;

(C) 상기 활성표지 벡터(Activation Tagging vector)와 동일하면서 증강제(enhancer) 부분만이 없는 대조 벡터(control vector)를 제작하고, 상기 대조 벡터(control vector)를 투메팩션스(A. tumefaciens)에 도입하여 대조(control) 투메팩션스(A. tumefaciens)를 획득하는 단계;

(D) 상기 대조(control) 투메팩션스(A. tumefaciens)로 상기 식물체 모상근 세포계를 형질전환시키고, 선별배지에서 배양하여 형질전환된 모상근 표준세포계를 획득하는 단계;

(E) 상기 활성표지 벡터(activation tagging vector)가 도입된 투메팩션스(A. tumefaciens)로 상기 식물체 모상근 표준세포계를 형질전환시키고, 선별배지에서 배양하여 기능획득 돌연변이 모상근 라이브러리를 획득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능획득 돌연변이 식물 모상근의 신속획득방법.
제 5 항에 있어서

상기 (A) 단계에서 모상근 세포계는, 형성된 모상근을 분리하고 수 회 계대배양하여 형태적, 생리적 안정성이 유지되는 모상근 중에서 선발되는 것을 특징으로 하는 기능획득 돌연변이 식물 모상근의 신속획득방법.
제 5 항에 있어서

(F) 상기 모상근 표준세포계와 상기 기능획득 돌연변이 모상근을 동일한 조건에서 배양하여 양자의 표현형(phenotype) 차이를 분석하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 기능획득 돌연변이 식물 모상근의 신속획득방법.
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