CN105695471A - 根特异性表达AhOda启动子及其应用 - Google Patents

根特异性表达AhOda启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及根特异性表达AhOda启动子及其应用，属于生物技术领域。根特异性表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所示。本发明克隆花生根特异启动子，并通过截短实验确定启动子核心区域，验证各启动子的功能，为我国花生生物技术应用与发展奠定基础；为获得双价抗蛴螬花生品种提供高效、稳定、特异表达的启动子提供重要分子基础。

Description

根特异性表达AhOda启动子及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及根特异启动子，其克隆、功能验证其应用。
背景技术
栽培花生(ArachishypogaeaL.)属于豆科作物，是世界重要的油料作物和经济作物，2015年，我国花生产量达1670万吨，居世界首位。花生的产量受到一些生物和非生物胁迫的影响，尤其是地下害虫、真菌、细菌等。近年来花生田地下害虫发生猖獗，严重影响了花生的产量和品质，造成花生大面积减产。
地下害虫是指生活史中某一阶段危害植物近土表主茎、根、种子的杂食性害虫，造成植物根系受损，影响植物吸收水分和无机盐，导致植物生长迟缓，甚至死亡。地下害虫的种类很多，主要有蛴螬、蝼蛄、金针虫等。其中蛴螬是危害我国主要的地下害虫，也是重要的世界性害虫，在印度、日本、美国等国都曾造成作物的减产，危害玉米、花生、甘薯、大豆、李子等。
蛴螬是鞘翅目金龟子科(Scarabaeoidae)幼虫的总称，以植食性蛴螬危害最为广泛。一般造成的花生减产为1～2成，严重地块达5成以上，甚至颗粒无收。山东新泰市农业局数据显示，2008～2011年期间花生荚果平均受害率分别为15％、25％、28％、35％，呈逐年增加趋势，个别地块因蛴螬危害几乎绝产，造成重大的经济损失。2008年，贵州高尔夫球场蛴螬暴发成灾，草坪草失绿、萎蔫、根系坏死，导致草坪草大片枯死。
目前，主要用物理防治、化学防治和生物防治三种手段防治地下害虫蛴螬。物理防治主要是根据成虫的趋光性，用黑光灯诱杀成虫，但对幼虫没有什么效果。进行化学防治时，使用呋喃丹、乐斯本、辛硫林、噻虫胺化学药剂进行的防治，虽然毒杀蛴螬的效果很好，但同时也存在一定的弊端。首先，化学药剂严重的污染环境；其次，有些杀虫剂是高残留的，直接危害到人类的健康，尤其是施用的农民，更有致残甚至致死的情况。
用于生物防治的主要有线虫、病原真菌、病原细菌等。虽然对这些生物的防治有较长的研究历史，但并没有广泛的应用。究其原因，一方面有些生物本身具有致病性，导致花生染病；另一方面，如线虫的批量生产、储藏温度、储藏时间等都会对防治效果产生影响，病原真菌及细菌中的大部分容易受到环境的影响等。为实现蛴螬的绿色防控，急需开辟新的防治途径。随着生物技术的发展，应用分子手段培育抗虫害花生新品种，已成为目前新的防治途径。
以生物防治、抗性作物品种及通过轮作控制害虫生长环境为基础的综合害虫防治，已经在世界范围广泛应用，这主要归功于抗性作物品种的发展，而生物技术在培育抗性品种方面起到了重要的作用。抗虫基因主要有三大类，植物源杀虫基因(豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因，植物次生代谢物等)；动物源杀虫基因(几丁质酶基因，蜘蛛毒素基因等)；微生物源杀虫基因(苏云金芽胞杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白基因，胆固醇氧化酶基因等)。国内外对抗虫害转基因花生的研究起步较晚，目前应用的抗虫基因也主要集中在微生物源杀虫基因。
目前，组织特异性启动子被广泛应用于基因工程。通过基因工程手段将组织特异表达的启动子与抗病基因相连，使抗病基因在特定部位定时、高效表达，达到防治病虫害的目的，为农民提供更多的生态安全和安全管理策略的机会。
植物根系是重要的地下器官，可吸收水分、无机盐等以供植物正常生长所需；植物根部的一些抗逆性基因表达的抗性蛋白等，会减缓一些生物及非生物胁迫对植物的影响，使地上部分免受重金属、干旱、致病菌等的危害。现有技术中已克隆到一些对蛴螬高毒力的cry8类基因，而蛴螬主要啃食花生的地下部分，所以寻找在整个花生生长季都高效表达的根特异启动子，驱动cry8类基因在花生根中高效、特异表达，达到防治蛴螬的作用，不仅可以实现了蛴螬的绿色防控，而且为改良花生品质、培育抗地下害虫花生新品种提供重要分子基础。
崔珊珊(崔姗姗,乔亚科,李桂兰,等.黑芥子酶基因pyk10根特异启动子在番茄中的验证[J].生物技术通报,2012(11):73-77.)等用pky10-GUS融合的植物表达载体转化番茄后进行GUS染色后发现，pyk10启动子驱动GUS基因在根部特异表达。Vanghan(VaughanSP,JamesDJ,LindseyK,etal.CharacterizationofFaRB7,anearroot-specificgenefromstrawberry(Fragaria×ananassaDuch.)andpromoteractivityanalysisinhomologousandheterologoushosts.JExpBot[J].JournalofExperimentalBotany,2006,57(14):3901-3910.)等发现草莓FaRB7启动子为根特异启动子，为作物基因工程提供了一个有价值的根特异性启动子。Cu(CuR,ZhaoL,ZhangY,etal.Isolationofamaizebeta-gulcosidasegenePormoter[J].PlantCellReports,2006,25:1157-1168.)等克隆了玉米的Zmglu1启动子，之后发现，该启动子驱动GUS基因在玉米根中的表达量最高。目前已克隆获得很多根特异启动子，其来源包括烟草、水稻、玉米、拟南芥、番茄、大豆等，但是花生根特异启动子报道比较罕见。
发明内容
本发明基于转录组测序构建了基因数字表达谱的分析结果克隆花生根部特异表达的启动子，可使目的基因在根部特定表达，在使用方面无后顾之忧。
本发明克隆花生根特异启动子，并通过截短实验确定启动子核心区域，验证各启动子的功能，为我国花生生物技术应用与发展奠定基础；为获得双价抗蛴螬花生品种提供高效、稳定、特异表达的启动子提供重要分子基础。
根特异性表达启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3所示。
一种表达载体，含有上述特异表达启动子。
上述的表述载体在转基因植物中的应用。
所述的应用，该表达载体中插入有抗虫基因，将该表达载体转入植物中，使其根中表达该抗虫基因，以防治地下害虫。
上述根特异性表达启动子在转基因植物中的应用。
所述的应用，为将含有上述根特异性表达启动子和抗虫基因的表达载体转入植物中，使其在种子或根尖表达该抗虫基因，以防治地下害虫。
本发明克隆了一个花生赤霉素氧化酶(Gibberellin20oxidase)基因上游2111bp的启动子序列，将初步命名为AhOda启动子。含有15个ROOTMOTIFTAPOX1元件，1个与OSE1ROOTNODULE元件，2个OSE2ROOTNODULE元件，三者都是与根特异表达相关的顺式作用元件；构建了3个5'端系列缺失的植物表达载体，并转化烟草，对抗性苗进行GUS染色，结果显示，转pAhOda1805、pAhOda518载体的烟草根部均被染成蓝色，而叶片无蓝色斑点，证明AhOda启动子为根特异表达载体启动子，其最小核心区518bp的启动子片段仍能指导报告基因在根部的特异表达。三个启动子的核苷酸序列见SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3所示。
通过基因工程手段将本发明的根特异表达的启动子与抗病/抗虫基因相连，使抗病/抗虫基因在根部定时、高效表达，达到防治病虫害的目的，为农民提供更多的生态安全和安全管理策略的机会。通过上述报告基因转入及在根部的特异表达结果说明，可以构建含有本发明的根特异表达启动子的表达载体，再插入对地下害虫高毒力的杀虫基因，转入植株，使该杀虫基因在根部特异表达，以防治地下害虫，特别是对蛴螬有高毒力cry8类基因，采用转基因技术，转入花生植株，使其在根部表达，防治蛴螬。
附图说明
图1contig288638上游序列的PCR扩增结果
图2AhOda启动子的生物信息学分析
图3AhOda根特异启动子各截短示意图
图4AhOda基因5'-racePCR结果
M:DL2000Marker；1：AhOda5'-RACE的PCR结果
图5根特异启动子植物表达载体构建流程图
图6植物表达载体pAhOda1805(左图)、pAhOda1168(中)、pAhOda518(右图)的载体构建图
1：各截短PCR片段；2：负对照；3：相应的植物载体的双酶切(HindIII+BamHI)；4：p2300GUSplus(HindIII+BamHI)；5：相应的复制型载体的双酶切(HindIII+BamHI)；M1:DM2000；M2:DM15000
图7pAhOda1805(1-2)、pAhOda1168(3-4)、pAhOda518(5-6)转化农杆菌LBA4404PCR鉴定结果M：DL2000Marker；CK：相应负对照；1、2：pAhOda1805转化农杆菌的PCR扩增结果；3、4：pAhOda1168转化农杆菌的PCR扩增结果；5、6：pAhOda518转化农杆菌的PCR扩增结果
图8转pAhOda1805烟草的GUS染色结果
图9转pAhOda518烟草的GUS染色结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
1、实验材料
1、1植物材料
栽培花生(ArachishypogaeaL.)品种白沙1016号，由山东省花生研究所提供。
烟草(Nicotianabenthamiana)，由本实验室保存。
1、2菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒见表1。下述菌株与质粒均可以对公众发放。
表1菌株与质粒
1、3数据库与生物软件
1、3、1数据库
NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
1、3、2生物软件
DNAMAN6.0：序列比对分析软件
Primer5.0：引物设计软件
1、4试剂
1、4、1RNA提取、反转录和荧光定量PCR试剂
提取RNA用的TotalRNAExtractor购自上海生物工程公司，其他RNase-freeddH2O、枪头等RNasefree产品购自AXYGEN公司，DNAseⅠ购自TIANGEN公司。反转录和荧光定量PCR试剂盒购自北京天根公司FastQuantcDNA第一链合成试剂盒和SYBRGreen荧光定量试剂盒。
1、4、2酶及其他生化试剂
2×TaqMix、PrimerStar高保真聚合酶购自TaKaRa公司；pMD-19TVector购自TaKaRa公司；DNAMarker分子量标准购自Promega公司；GUS染液购自北京冰达公司；其他试剂均为国产分析纯产品。DNA胶回收、PCR产物纯化、质粒小量提取试剂盒均购自Axygen公司。
1、4、3DNA分子量
DL15000：15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp
DL5000：5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp
DL2000：2000、1000、750、500、250、100bp
DL500：500、400、300、200、150、100、50bp
1、4、4其他试剂
TE缓冲液：100mmol/LTrisCl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)；
乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)溶液：用DMSO配制成500μmol/mL母液。
1、5培养基、抗生素与激素
1、5、1培养基
液体LB培养基：胰蛋白胨1.0％，酵母膏0.5％，氯化钠1.0％，121℃灭菌21min。
固体LB培养基：胰蛋白胨1.0％，酵母膏0.5％，氯化钠1.0％，琼脂粉1.3％，121℃灭菌21min。
基本培养基：MS无机盐+3％蔗糖+0.7％琼脂粉，121℃灭菌21min。
共培养培养基：基本培养基+50μmol/L乙酰丁香酮；
芽诱导培养基：20mg/L6-BA+50mg/L卡那霉素+500mg/L羧苄青霉素；
伸长培养基：20mg/L6-BA+50mg/L卡那霉素+500mg/L羧苄青霉素；
生根培养基：0.5mg/LNAA+50mg/L卡那霉素+500mg/L羧苄青霉素。
1、5、2抗生素
氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)储存母液100mg/mL，使用浓度100mg/L；卡那霉素(Kanamycin，Km)储存母液100mg/mL，使用浓度100mg/L；硫酸链霉素(Streptomycin，Sm)储存母液100mg/mL，使用浓度100mg/L；羧苄青霉素(Carbenicillin，Cb)储存母液500mg/mL，使用浓度500mg/L。所有抗生素反复冻融3次灭菌，-20℃保存。
1、5、3激素
6-BA(6-Benzylaminopurine)：称取0.5g6-BA，加300μL2mol/LNaOH，完全溶解后定容到10mL，母液为50mg/L，反复冻融3次灭菌，-20℃保存；
TDZ(Thidiazuron)：称取0.05gTDZ，加100μL2mol/LNaOH，完全溶解后定容到10mL，母液为5mg/L，反复冻融3次灭菌，-20℃保存；
NAA(Naphthylacetic)：称取0.1g6-BA，加100μL2mol/LNaOH，完全溶解后定容到10mL，母液为10mg/L，反复冻融3次灭菌，-20℃保存。
2研究方法
2.1植物材料的准备
花生根、茎、叶取自2周龄的组培苗，幼胚子叶为收集果针入土后25-55d不同大小的花生荚果，剥皮后混合。所有植物材料取样后于液氮中迅速冷冻，在-80℃冰箱保存。
干旱处理：当花生生长至15d左右时，选择健壮且长势一致的幼苗，用15％PEG6000溶液模拟干旱处理，分别取处理0、2、4、6和8h的幼苗根，-80℃保存，用于总RNA提取和荧光定量PCR分析。试验设3次重复。
黄曲霉处理：花生剥去种皮后种植于温室中，3周后接种黄曲霉孢子。用无菌水收集PDA培养基上2～3d的黄曲霉菌孢子，调整孢子浓度为6×108/ml，喷于花生的根部，分别取未处理及处理后1、3、5和7d的幼苗根，于-80℃保存，用于荧光定量PCR分析。试验设3次重复。
2.2花生根、茎、叶RNA的提取和纯化
2.2.1TRIzol法提取RNA
用TRIzol试剂提取花生根、茎、叶、幼胚总RNA，具体步骤如下：
1.取适量组织于加入液氮的研钵中，迅速研磨至粉末状。
2.转移至1.5ml离心管中，加入1mlTRIzol试剂，剧烈震荡30s，室温静置5min。
3.加200μl氯仿，剧烈振荡30s，冰上放置8min。
4.4℃，12000rpm离心10min，取上清约400μl。
5.加400μl异丙醇，充分混匀，室温放置10min。
6.4℃，12000rpm离心10min，弃上清。
7.加入700μl的75％乙醇，洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心1min。
8.加入700μl的无水乙醇，洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心3min，弃上清。
9.室温晾干，加入适量RNase-freeddH2O溶解。
2.2.2RNA的纯化
用TaKaRa公司的DNaseⅠ及RNaseInhibitor去除DNA，纯化体系为：
用TIANGEN公司的RNA纯化试剂盒，操作步骤如下：加0.5倍体积的无水乙醇混均，转让吸附住CR3，后续过程参见TIANGEN公司RNApreppure系列说明书进行，直至洗脱RNA分子。
2.2.3RNA纯度的检测
电泳检测总RNA的完整性，取1μl总RNA为模板，以actF/R为引物，并用花生基因组DNA为阳性对照，检测有无DNA污染。actF/R为引物如下，扩增产物384bp：
actF：5′-ATGAAGGAGAAGCTAGCTTA-3′；
actR：5′-AACACTGTACTTCCTCTCTG-3′。
2.3real-timePCR分析AhOda基因的表达特性
2.3.1cDNA的合成
1.配制DNA去除的混合液：
TotalRNA2μL
5×gDNABuffer2μL
加DEPC水至10μL
2.简短离心，42℃孵育3min，冰上急冷；
3.按照如下体系配制反应体系混合液：
4.将反应体系混合液加入到DNA去除的混合液中，充分混匀。
5.42℃孵育15min，95℃保温3min后冰上冷却，-20℃保存。
2.3.2real-timePCR
1.标准曲线的建立
AhOda、内参基因actin的质粒梯度的稀释，稀释梯度分别为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，取1μL为模板，进行real-timePCR反应。反应条件为95℃15min；95℃10s，60℃30s，搜集荧光信号，40个循环。
2.real-timePCR分析
以花生根、茎、叶、幼胚cDNA为模板，表3各对引物进行分析。反应条件为95℃15min；95℃10s，60℃30s，搜集荧光信号，40个循环。采用相对定量法进行数据分析，以actin为内参基因，采用进行计算。
表2引物名称及序列
2.4CTAB法提取花生基因组
花生基因组DNA的提取采用改良的CTAB法，将提取基因组放于-20℃储存备用，参照Doyle等的方法稍作改进。
1.取适量花生叶，在液氮中充分研磨，转移到1.5mL离心管中，迅速加入600μL65℃的CTAB提取缓冲液(含0.5％的β-巯基乙醇)，颠倒混匀，65℃水浴10min，期间轻柔颠倒混匀两次。
2.加入250μL5M的KAc，置于冰上30min，12000rpm离心10min。
3.取上清，加0.6倍体积的异丙醇，轻柔混匀，室温放置10min。
4.12000rpm离心10min，弃上清，75％乙醇洗涤，室温放置10min，30μL无菌水溶解。
5.电泳检测，-20℃保存备用。用HindⅢ、BamHⅠ，SacⅠ、EcoRⅠ等几种酶分别对基因组进行处理，混合回收，-20℃保存备用。
2.5根特异启动子的克隆
2.5.1引物设计
设计引物见序列表3。
表3引物名称及序列
2.5.2启动子的扩增
以2.5酶切混合后基因组为模板，进行扩增。
电泳检测目的带大小正确后，切胶回收，连接pMD-19TVector，送测序。
1.PCR产物胶回收
1)在长波紫外灯下切取目的DNA片段，置于1.5mLEp管中，计算凝胶重量，以1mg＝1μL进行计算；
2)加入3倍凝胶体积的ED-A溶液，于75℃的水浴锅中融化。
3)待凝胶块完全融化后加入0.5倍ED-A溶液体积的ED-B溶液。
4)混匀后转入回收柱，12000rpm离心1min。
5)去除残液，加入500μLW1，12000rpm离心1min。
6)去除残液，加入700μLW2，12000rpm离心1min。
7)空离1次，12000rpm离心1min。
8)向回收柱中加入30μL超纯水，静置1min。
9)12000rpm离心1min，备用。
10)琼脂糖凝胶电泳检测。
11)将回收片段与TaKaRa公司的pMD-T19连接。连接体系为：5μL2×SolutionⅠ，0.5μLpMD-19T载体，4.5μL回收产物，总体积10μL，混匀后4℃6h。
TG1感受态细胞的制备(CaCl2法)
1)挑取E.coliTG1单菌落于5mL液体LB培养基中，37℃过夜培养；
2)按1％接种量接种于100mLLB液体培养基中，37℃，220rpm培养约2hr(OD600＝0.5-0.6)；
3)4℃，5000rpm离心10min；
4)弃上清，加入40mL预冷的0.1mol/LCaCl2悬浮细胞，冰上放置30min；
5)4℃，5000rpm离心10min，收集细胞；
6)弃上清，用2mL预冷的0.1mol/LCaCl2，2mL甘油，重悬细胞，混匀后每管加300μL，于-70℃保存。
TG1的转化
1)-70℃冰箱取出TG1感受态细胞，立即放于于冰上；
2)将10μL连接产物加入其中，冰上放置45min；
3)42℃热击90s，迅速取出，冰上放置1min；
4)加600μL无抗性的LB液体培养基，于37℃培养箱中复苏45min；
5)涂于含相应抗性的LB固体培养基上，于37℃培养箱中培养10～12h，至有单菌落长出。
2.鉴定阳性转化子
1)挑单菌落，置于600μL含相应抗生素的液体LB培养基中，37℃，220rpm培4h，菌液用于PCR鉴定的模板。
2)PCR鉴定体系及条件如下：
3)将PCR阳性克隆的菌液送测序。
2.6AhOda基因上游启动子的生物信息学分析
采用生物信息学方法，用下列两个软件对这三个基因的上游启动子序列进行预测和分析：PLACESignalScanprogram(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和Plantcare数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.html)。
2.7根特异启动子植物表达载体的构建
1.根特异启动子不同长度缺失片段的获得
根据生物信息学分析结果，针对启动子序列中各根特异元件所在位置，有目的的设计截短引物，在上下游引物的5'端分别加上HindIII和BamHI酶切位点。引物序列如下，小写部分为所加酶切位点：
表4引物名称及序列
PCR扩增体系及条件如下：
PCR产物纯化加A尾，再次纯化后连T载体，转化TG1，阳性转化子鉴定方法同2.1.4，将阳性克隆送交测序。
2.质粒提取
1)将测序鉴定正确的菌株转接至5mL含相应抗生素的LB培养液中，37℃，220rpm，振荡培养约5h；
2)12000rpm，离心1min，收集菌体，弃上清；重复一次。
3)向菌体中加入250μL已加RNaseA的BuffterS1，重悬细菌沉淀。
4)加250μLBuffterS2，上下颠倒5次，使菌体充分裂解，静置3min。
5)加350μLBuffterS3，温和并充分地上下翻转6-8次，静置3min，12000rpm离心10min。
6)向制备管加入离心后上清，12000rpm离心1min，弃滤液。
7)加500μLBuffterW1，12000rpm离心1min，弃滤液。
8)加700μLBuffterW2，12000rpm离心1min，弃滤液，重复一次。
9)将制备管置回2mL离心管中，12000rpm离心1min。
10)将制备管放入1.5mL离心管，加入60μL超纯水，室温静置1min，12000rpm离心1min。
3.载体与目的片段的酶切
酶切体系：
37℃酶切2h，电泳检测。
4.目的片段回收同2.6.2
5.将回收的目的基因与载体大片段连接，反应体系如下：
p2300GUSplus0.5μL
目的片段4.5μL
SolutionⅠ5μL
混匀后4℃过夜连接。
6.对大肠杆菌TG1进行转化、PCR鉴定、质粒提取方法同上。
7.将构建好的植物表达载体酶切鉴定，体系如下：
2.7植物表达载体转化农杆菌
1.根癌农杆菌感受态细胞的制备
1)将农杆菌划线培养于含Sm抗性的固体LB平板上，在30℃培养箱中培养约40h至有单菌落长出。
2)挑取单菌落，接种于5mL含有100mg/LSmr的液体LB培养基中，30℃，220rpm培养40h。
3)将1mL菌液接种至50mL含Smr的液体LB培养基中，28℃、220rpm培养5-6h，至OD600＝0.8；
4)4℃，4500rpm离心10min，收集菌体；
5)加20mL预冷的无菌水洗涤菌体，4500rpm离心10min，收集菌体，重复2次。
6)加2mL预冷的无菌水，2mL50％甘油重悬菌体，轻柔混匀，200μL/管，-70℃存储备用。
2.电击转化重组质粒到LBA4404感受态细胞
1)取3μL重组质粒分别加入到100μL感受态细胞中，轻柔混均，置于冰上约15min；
2)将菌液转移至0.2cm预冷的电击杯中，转化条件为：2000V、25μF、200Ω；
3)将600μL液体LB加入电击杯中，轻柔混匀，移至的1.5mLEp管中，28℃，8h；
4)将菌体涂于含相应抗体的固体LB培养基上；
5)28℃温箱培养40h，至有单菌落长出。
2.8烟草的遗传转化
1.烟草的培养
1)将烟草种子用1mL80％的乙醇浸泡2min。
2)倒掉乙醇，加入1mL5％的NaClO溶液，轻摇浸泡5min。
3)倒掉NaClO溶液，用移液器尽量去除剩余液体，用无菌水冲洗2遍。
4)播种于MS基础培养基上，28℃，光照培养。
2.农杆菌的活化
从-70℃冰箱中取出含有pAhOda1805、pAhOda1168和pAhOda518载体的农杆菌，菌株活化过程同2.4.1。
3.农杆菌对烟草的侵染
1)将烟草叶片剪成直径1cm的叶盘，与农杆菌28℃，220rpm侵染20min。
2)用无菌水冲洗3次，将叶盘置于50μmol/L乙酰丁香酮的共培养培养基上暗培养2天；
3)将共培养后的叶盘转到选择分化培养基(MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+500mg/LCb+50mg/LKm)上，置于28℃温室中光照培养，每三十天更换一次培养基；
4)待叶盘分化出的小芽长至1cm左右，切下小芽并转移到选择生根培养基中(MS+0.2mg/LNAA+300mg/LCb+50mg/LKm)继续培养，每15～20天更换一次培养基。
2.9GUS组织化学染色及显微观察
1.将转化植物组织放入24孔板中，加入GUS染色液；
2.37℃培养箱中避光温育12h；
3.将染色组织于FAA固定液中固定2h，在无水乙醇中脱色1天(去除叶绿素)；
在SZX16型荧光体视显微镜及vhx-2000型超景深三维显微系统下观察GUS染色结果。
3结果与分析
3.1根特异启动子的克隆
拟克隆contig288638上游序列，根据本实验室转录组测序结果及Blast结果，设计引物(见表3)，以酶切花生基因组为模板的PCR扩增，得到如图1片段。与PMD-19T连接，送测序。
将288638的测序结果分别在NCBI中进行相似性比对，结果显示：Contig288638序列与蔓花生2-酮戊二酸依赖性酶(Arachisduranensis2-oxoglutarate-dependentdioxygenaseAOP3-like，GenbankNo：XM_016113712.1)的相似度为99％，功能注释结果为Arachisduranensis2-oxoglutarate-dependentdioxygenaseAOP3-like(LOC107492663),transcriptvariantX2,mRNA，我们将其初步命名为AhOda基因。
表5基因的功能注释及命名
3.2AhOda根特异表达基因及启动子的生物信息学分析
利用Plantcare在线数据库对AhOda启动子顺式作用元件进行分析(图2)，此段序列含有15个与根特异表达相关的ROOTMOTIFTAPOX1，1个与根特异表达相关元件OSE1ROOTNODULE，2个与根特异表达相关元件OSE2ROOTNODULE。除此以外，还发现9个GATA-motif、3个ACGT-motif、8个诱导物应答元件W-box((T)TGAC(C))，2个与干旱诱导相关MBY类调控元件，。为了验证AhOda启动子功能及确定该启动子的最小活性区，根据AhOda启动子区根特异相关元件的位置和数目预测，设计了三个截短的启动子片段(图3)。
根据AhOda基因所测得的上游的contig序列，在NCBI上进行比对，预测该基因的ATG位置，在ATG下游150bp左右处设计引物，使用SMARTerTMRACE试剂盒，将纯化的花生根部的RNA反转录为5'cDNA，根据使用说明书，应用降落PCR扩增，得到如下片段(图4)。胶回收后，连接pMD-19T，送测序，测序序列和接头引物与启动子序列比对，确定AhOda基因转录起始位点位于ATG上游的32bp处。
起始密码子ATG用带*号斜体字表示；用灰色背景表示15个与根特异表达相关ROOTMOTIFTAPOX1；用蓝色背景表示1个与根特异表达相关元件OSE2ROOTNODULE；用黄色背景表示2个与根特异表达相关元件OSE2ROOTNODULE；其他元件均用下划线表示且进行标注。
3.3AhOda根特异启动子植物表达载体的构建及转化农杆菌
以p2300GUSplus为基础载体，用根特异启动子的各个截短替换p2300GUSplus上的CaMV35S启动子，构建相应的植物表达载体，流程图见图5，构建过程如下：
以AhOda上游序列的PCR产物为模板，分别用引物对AhOda1805f/AhOdar、AhOda1168f/AhOdar、AhOda518f/AhOdar扩增AhOda上游1805bp、1168bp和518bp的启动子片段(图6，相对应的泳道都是泳道1)，将PCR产物连接pMD-19T，送测序，结果与已验证的序列完全一致。
将获得的pMD-AhOda1805、pMD-AhOda1168、pMD-AhOda518(泳道5)及基础载体p2300GUSplus(泳道4)用BamHI和HindШ双酶切，将目的片段与酶切后大片段连接，获得植物表达载体pAhOda1805、pAhOda1168和pAhOda518，用BamHI和HindШ分别对3个载体(泳道3)进行消化，分别获得1286bp、1073bp和404bp的条带，且条带大小与PCR产物一致(图6)，测序证明植物表达载体pAhOda1805、pAhOda1168和pAhOda518正确。将pAhOda1805、pAhOda1168和pAhOda518转化农杆菌LBA4404，PCR扩增分别获得1805bp、1168bp和518bp的启动子片段(图7)。其序列如如SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3所示。
3.4AhOda根部特异表达启动子在烟草中的功能验证
取相应转化植株进行GUS组织化学分析，发现转pAhOda1805、pAhOda518的植物表达载体的烟草根部均被染成蓝色(图8、9)，而在叶片中观察不到蓝色。证明AhOda启动子为根部特异表达启动子，最短的518bp的AhOda启动子(含有1个ROOTMOTIFTAPOX1元件、1个OSE1ROOTNODULE元件和1个OSE2ROOTNODULE元件)仍然具有指导基因在烟草根部特异表达的功能。

Claims (6)

1.根特异性表达启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3所示。
2.一种表达载体，含有权利要求1所述的特异表达启动子。
3.权利要求2所述的表述载体在转基因植物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，该表达载体中插入有抗虫基因，将该表达载体转入植物中，使其根中表达该抗虫基因，以防治地下害虫。
5.权利要求1所述的根特异性表达启动子在转基因植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，为将含有权利要求1所述的根特异性表达启动子和抗虫基因的表达载体转入植物中，使其在种子或根尖表达该抗虫基因，以防治地下害虫。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944816A (zh) * 2020-08-27 2020-11-17 山东省花生研究所 一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P及其克隆和应用
CN116334127A (zh) * 2023-03-29 2023-06-27 青岛农业大学 花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102911941A (zh) * 2012-11-02 2013-02-06 中国农业科学院植物保护研究所 根特异性启动子及其应用
CN103966220A (zh) * 2014-05-27 2014-08-06 中国农业科学院植物保护研究所 人工合成的根特异启动子及其应用
CN103966221A (zh) * 2014-05-27 2014-08-06 中国农业科学院植物保护研究所 种子及根尖特异表达启动子的克隆及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102911941A (zh) * 2012-11-02 2013-02-06 中国农业科学院植物保护研究所 根特异性启动子及其应用
CN103966220A (zh) * 2014-05-27 2014-08-06 中国农业科学院植物保护研究所 人工合成的根特异启动子及其应用
CN103966221A (zh) * 2014-05-27 2014-08-06 中国农业科学院植物保护研究所 种子及根尖特异表达启动子的克隆及应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944816A (zh) * 2020-08-27 2020-11-17 山东省花生研究所 一种花生种子贮藏蛋白基因Arachin6的启动子Arachin6P及其克隆和应用
CN116334127A (zh) * 2023-03-29 2023-06-27 青岛农业大学 花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆方法及应用
CN116334127B (zh) * 2023-03-29 2024-01-26 青岛农业大学 花生籽仁可溶性糖含量调控基因AhSS1的克隆方法及应用

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