CN107099535B - 一种受低温、高盐、干旱或aba诱导的启动子hlp4 - Google Patents

Abstract

本发明公开了拟南芥的一个受低温、高盐、干旱或ABA诱导的启动子HLP4，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其是通过PCR技术从拟南芥基因组中克隆获得。本发明还公开了所述启动子HLP4在植物抗逆基因研究或抗逆基因工程育种中的应用，是利用启动子HLP4构建报告基因GUS的植物表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物；实验证实转基因植物在低温、高盐、干旱以及ABA处理下，报告基因GUS的表达活性比对照显著提高，表明启动子HLP4是一个受逆境强烈诱导的启动子，预示启动子HLP4在植物的抗逆基因研究和作物抗逆育种中有着巨大应用潜力。

Description

一种受低温、高盐、干旱或ABA诱导的启动子HLP4

技术领域

本发明属于植物生物工程育种和分子生物学技术领域，涉及一种植物的启动子，具体说，涉及拟南芥的一个受低温、高盐、高渗或ABA诱导的启动子HLP4及其应用。

背景技术

植物在生长发育过程中经常会遭受诸如高温、低温、盐碱、干旱、水涝等恶劣环境的影响，给作物造成大幅减产。传统育种技术通过杂交筛选虽然也可以获得抗逆品种，但存在育种效率低、随机、盲目、不确定性的问题。随着分子生物学的迅速发展，转基因技术已为作物新品种的培育提供了新思路和新方法，具有方便快捷、目标定向、周期短等种种优势。目前在国内外商业化种植的转基因抗虫棉、抗虫玉米、抗除草剂大豆、抗病番木瓜等就是新一代育种技术的成功案例。这种技术依赖于发掘并克隆植物重要的抗逆功能基因和调控元件，进而进行作物的分子设计与遗传改良，以提高作物对不良环境的适应性，已经成为保证粮食安全的有效措施。

在利用抗逆基因进行作物的抗逆育种时，选择什么样的启动子来调控抗逆基因表达，将直接关系到抗逆基因功能的发挥和育种的有效性。目前，在作物遗传改良中能够被广泛使用的启动子非常有限，在单子叶植物主要使用来自玉米泛素(ubiquitin)基因的启动子和水稻肌动蛋白(actin)基因启动子，在双子叶植物主要使用来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(Ye et al.2012)。这些启动子都属于组成型启动子，也就是说在这些启动子的调控下，目标基因每时每刻都在表达。这种类型的启动子对于抗逆育种将会带来很多问题，例如，在比较好的环境条件下，作物根本不需要抗逆基因的表达。如果抗逆基因持续的高效表达，合成了大量不需要的抗逆蛋白，这些蛋白的贮藏运输不仅成为一种负担，而且还消耗了大量的能量和代谢资源，对植物的正常生长反而造成了不利影响。换一个思路，如果我们能够将抗逆基因置于诱导型启动子的调控之下，只有当高温、低温、盐碱、干旱、水涝等恶劣环境来临时，启动子才被激活，使抗逆基因适时地表达，而不是时时地表达，这不仅保证了植物在遭遇逆境时具有很好的抗逆性，还保证了植物在非逆境条件下极大地节约细胞代谢资源，减轻细胞负担，促进作物生长和提高产量。

然而，目前能应用于作物遗传改良的诱导型启动子非常少，对于新的逆境诱导型启动子的发现、克隆、功能分析和利用已成为当前一个重要的创新研究方向。将功能明确的逆境诱导的启动子成功应用到转基因作物的抗逆育种中将是未来遗传育种的重要方向。目前已有的研究了解到，植物在抵抗干旱、缺氧、高盐和低温等环境胁迫时普遍存在着脱落酸(ABA)的生理学效应。ABA能够整合各种胁迫信号，控制下游相关基因响应，植物必须不断调整ABA水平，以应对变化莫测生理和环境条件。在ABA依赖的信号途径中，当植物受到逆境胁迫后，胁迫信号将激活ABA合成酶，使植物体内迅速产生大量的ABA，接着ABA受体将胁迫信号传递到第二信号系统，即Ca²⁺/IP3/CAPK，引起相应的磷酸化和去磷酸化反应，激活该途径的转录因子，继而结合到效应基因的启动子上，启动效应基因表达，引起相关代谢途径的改变以适应环境的变化(Urao et al.1993)。因此，在克隆鉴定逆境诱导型启动子时，无论是对逆境直接响应的启动子，还是受ABA诱导的启动子，都将在抗逆遗传育种中得到重要应用。

申请人在相关研究中从拟南芥克隆到一个受低温、高盐、干旱或ABA多种逆境因素诱导的启动子，命名为启动子HLP4。该启动子的功能揭示它在抗逆育种上的应用将具有重要价值。迄今为止，未见该启动子克隆和应用的相关报道。

发明内容

针对目前的技术现状，本发明的目的是提供一种来源于拟南芥基因组的受低温、高盐、干旱或ABA诱导的启动子及其应用。

本发明所述的拟南芥的一个受低温、高盐、干旱或ABA诱导的启动子，命名为启动子HLP4。其特征在于：该启动子的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。

(2)与序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。

(3)对上述(1)或(2)所示DNA序列进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有相同启动子功能的DNA。

进一步优选的实施方式是：所述启动子命名为启动子HLP4，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。

上述启动子HLP4可以利用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物序列，通过PCR技术从拟南芥基因组DNA中克隆获得。

鉴于本领域专业人员很容易通过定向优化或者点突变等方法对本发明专利中所述的启动子序列进行修饰或突变，那些经过人工修饰改造后具有与本发明所提供的启动子碱基序列同源性≧60％且仍具有启动子活性的核苷酸序列均为本发明中所述启动子序列衍生物，等同于本发明所述序列，属于本专利的保护范畴。

含有上述启动子的载体、转基因组织或细胞系、重组菌株和转基因植株等均属于本发明的保护范围。

本发明所述拟南芥的一个受低温、高盐、干旱或ABA诱导的启动子HLP4在植物抗逆基因研究或抗逆基因工程育种中的应用。

其中，所述应用的方法是：所述启动子HLP4为低温、高盐、干旱或ABA诱导型启动子，将其作为启动子分别与功能基因融合构建植物表达载体，并转入植物中，以实现在转基因植物体内的诱导型高表达。

其中，所述植物优选是农作物、经济林木、牧草或草坪草；所述植物体是指在植株器官、组织、细胞或整株水平。

进一步的，所述农作物优选是棉花、大豆、烟草、油菜、白菜、甘蓝、芥菜、玉米、小麦或水稻。

本发明利用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物序列，通过PCR技术从拟南芥基因组DNA中克隆启动子HLP4，然后利用该启动子构建报告基因GUS的植物表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。试验检测表明：本发明的启动子HLP4能够明显增强报告基因在低温、高盐、干旱以及ABA处理条件下的表达水平(见附图)。

本发明的突出效果是：在当前抗逆育种中缺少理想的诱导型启动子的背景下，本发明为植物基因功能研究和基因工程育种提供了植物来源的诱导型强启动子，并可以将其广泛用于培育抗逆的植物品种，实现了明显增强抗逆基因在低温、高盐、干旱以及ABA处理条件下的表达水平的目的，在农作物基因工程育种中具有重要的应用价值和很好的开发前景。

附图说明

图1.HLP4启动子PCR扩增产物的电泳图，其中：M为分子量Marker，泳道1-5为启动子DNA。

图2.HLP4启动子与GUS报告基因连接示意图。用HLP4启动子替换pBI121载体中的CaMV35S启动子，即得到HLP4启动子连接GUS报告基因的植物表达载体。

图3.HLP4-GUS转基因拟南芥在4℃(代表低温)、NaCl(代表高盐)、Mannitol(代表渗透胁迫或干旱)和ABA处理前后叶片中GUS酶活的染色对比图。表明HLP4是一个低温、高盐、干旱、ABA强烈诱导的启动子。

图4.HLP4-GUS转基因拟南芥在4℃、NaCl、Mannitol和ABA处理前后叶片中GUS酶活性的定量测定。再次证明HLP4是一个低温、高盐、干旱、ABA强烈诱导的启动子。

具体实施方式

下述将通过具体实施例子对本发明作进一步的说明，但本发明并不仅限于以下具体实施例子。下面实施例子中所描述的方法内容若无特殊说明，均为常规实验方法。

实施例1拟南芥HLP4启动子的获得

为了得到逆境诱导型启动子，本发明人从拟南芥基因组克隆了100多个基因的启动子，逐一对这些启动子活性进行大规模筛选。发现HLP4启动子具有很强的受逆境诱导的活性。下面叙述它的具体克隆过程。

1)首先根据拟南芥TAIR数据库，选定HLP4基因的翻译起始密码子ATG上游约1.6kb的调控序列作为HLP4启动子序列。

2)依据上述序列，利用PRIMER5.0软件设计PCR扩增引物如下。

HLP4-F：5'AAGCTTGTTACACAACGTCATCAGATGAGTC 3'；

HLP4-R:5'GGATCCGTCTAAAATCTATATGATGCCGCGG 3'。

上游引物5'末端添加HindIII酶切位点，下游引物5'末端添加BamHI酶切位点，便于后续的启动子克隆。

3)采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA，具体参见《分子克隆实验指南Ⅲ》，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系如下所示：

PCR反应体系：10mM Tris·Cl，1.5mM MgCl₂，50mM KCl，200μM dNTP each，0.8μM引物，0.8U高保真DNA polymerase，1μL DNA模板，无菌水补足25μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min 30s，循环35次；72℃延伸5min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

4)电泳结束后，利用天根公司生产的DNA片段回收试剂盒(TIANGEN BIOTECH CO,LTD)回收目的条带，凝胶回收具体步骤参见其说明书。回收的目的条带通过T-A连接直接连入中间载体pMD-T18。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。向转化的大肠杆菌管中加入约1ml LB培养基37℃200rpm振荡培养1小时，4000rpm离心5min收菌，涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素LB固体平板上过夜培养，挑单克隆在含有50mg/L氨苄青霉素的液体LB培养基中振荡培养6-8小时后提取质粒DNA，经PCR鉴定插入片段的大小，然后送华大科技股份有限公司进行测序确认，以确保启动子的正确性。

实施例2拟南芥HLP4启动子的植物表达载体构建和农杆菌转化

目的是获得HLP4启动子驱动葡萄糖苷酸酶报告基因(GUS)表达的载体，同时获得含有该载体的农杆菌，为后续的转化拟南芥做准备。

1)将HLP4启动子从pMD-T18中间载体上用HindIII和BamHI两种限制性内切酶切出，pBI121植物表达载体也用同样的两种酶切开(内切酶购自Takara公司，具体酶切的条件和程序参见其说明书)。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后使用天根公司的凝胶回收试剂盒回收(参考说明书)。

2)将获得的酶切后的启动子片段与载体进行连接(使用Takara公司的T4DNA连接酶，连接体系参照公司说明书)。连接反应体系轻轻混匀，置于16℃恒温水浴锅过夜连接，随后将连接产物直接用于转化大肠杆菌。

3)大肠杆菌的转化。融化固体LB培养基，待冷却到50℃左右时加入Kan抗生素至50mg/L，混匀后倒平板；-80℃冰箱中取出约50μL感受态大肠杆菌置于冰上，加入连接产物后轻轻混匀；冰浴30分钟，同时42℃热激90s，随后迅速冰浴2min；向管中加入800μL液体LB培养基(不含抗生素)混匀后放入摇床，37℃，200rpm，1h复苏；复苏结束后，5000rpm，离心3min，将上清吸至剩余约100μL左右，轻轻将菌悬浮；将其涂布于上述准备好的平板上，倒置平板，放入培养箱中37℃过夜培养；挑单克隆摇菌，提取质粒进行酶切鉴定和测序，确认大肠杆菌中含有构建正确的HLP4-GUS表达载体。

4)农杆菌的转化。农杆菌GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故需要将构建的HLP4-GUS表达载体转入农杆菌。取80μl农杆菌液接种到含50μg/ml利福平(Rif)的LB培养基中，28℃培养一夜；取1ml菌液，加至50ml含50μg/ml Rif的LB培养基中，28℃震荡培养，至OD₆₀₀＝0.5；菌液冰浴30min，4℃，4500rpm，离心10min，收集菌体；将菌液重新悬于预冷的10ml 0.15mol/L的CaCl₂中，4℃，4500rpm，离心10min，收集菌体；将菌液重新悬于冰浴的1ml 20mmol/L的CaCl₂溶液中，用1.5ml的EP管进行分装，液氮速冻1min，储存于-70℃作为农杆菌感受态备用；从上述大肠杆菌中提取HLP4-GUS表达载体,取100μl农杆菌感受态细胞在冰上化开，把表达载体10μl加入其中，轻轻混合均匀，冰上放置30分钟；液氮速冻1min，迅速移至37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；加入LB培养基(未添加抗生素)1ml，28℃培养3h；7000rpm，离心1min，收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的LB平板上，28℃倒置暗培养3天。挑取农杆菌单菌落，用添加了50μg/ml Kan的LB培养基扩增培养，从农杆菌中提取质粒，进行后续PCR验证，以确定HLP4-GUS表达载体转入了农杆菌GV3101。

实施例3HLP4启动子转化拟南芥验证其受低温、高盐、干旱和ABA强烈诱导

目的是将HLP4启动子-GUS表达载体转入拟南芥，获得转基因植物，用于验证HLP4启动子是否能够被逆境环境条件诱导。

1)利用浸花法(一种公开的通用方法)，使含有植物表达载体的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之后，收集T1代种子并在筛选培养基(MS培养基附加30mg/L卡那霉素)上进行筛选，将能够正常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养，分别收获其T2代种子再进行下一轮的卡那霉素筛选，挑选出绿苗：白苗为3：1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子(T3代)。对每一单株的种子部分用于卡那霉素平皿筛选，直到选出在筛选培养基上为全绿的株系，即为纯合转基因株系。

2)为了分析HLP4启动子对逆境胁迫的响应情况，对HLP4-GUS转基因拟南芥进行了多种多样的胁迫处理。具体做法是：将在MS固体培养基中培养两周的HLP4-GUS转基因幼苗，用镊子小心夹取部分幼苗，移植到MS液体培养基中进行胁迫处理。胁迫处理条件设置为仅用MS液体培养基在4℃处理(代表低温)以及MS液体培养基中分别添加150mM NaCl(代表高盐)、250mM Mannitol(代表高渗或干旱)、100μM ABA在常温(22℃)下处理，对照组仅用MS液体培养基在常温下处理。在处理3h、6h、12h、24h后，分别取材进行GUS染色。

3)GUS染色的具体做法是：将植物材料放入离心管中，倒入冰预冷的90％丙酮没过植物材料，插到冰上放置30min。用现配的GUS染色缓冲液(公知的配方)清洗材料，置于冰上20分钟，倒掉缓冲液再加入新的缓冲液重复洗一次，再倒掉染色缓冲液。倒入配好的染色液(染色缓冲液中加入终浓度为2mM的X-Gluc)，保证植物材料完全没入其中。根据染色情况在37℃温箱中染色6-12h。75％乙醇清洗材料，去除染色液，倒入无水乙醇浸泡材料直至完全脱色。实体解剖显微镜下观察并拍照。

4)GUS酶活性的荧光定量分析：基本上参照文献进行(Jefferson RA,Kavanagh TAand Bevan MW.Gus Fusions-Beta-Glucuronidase as a Sensitive and Versatile GeneFusion Marker in Higher-Plants.EMBO J.1987，6,3901–3907)。

相关试剂的配制：

反应缓冲液：0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.0)50mL，10％十二烷基肌氨酸钠1mL，0.5MEDTA(pH＝8.0)2mL，10％Trition 100 1mL，β-巯基乙醇100μL，水补至100mL。

10mM 4-MUG母液的配制：5mg 4-MUG加到1.42mL反应缓冲液中。

1mM 4-MUG检测液的配制：450μL反应缓冲液+50μL 10mM/L 4-MUG母液。

反应终止液(0.2mol/L NaCO3)：NaCO₃ 10.6g，水定容至500mL。

标准曲线的制定：

用反应终止液将1mM的4-MU母液稀释成10nM，100nM，500nM，1μM，2μM，4μM的浓度梯度，利用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm，扫描时间10s，狭缝宽度5nm，电压550V的条件下测定各浓度溶液的荧光值，并绘制标准曲线。

GUS酶活测定：

用打孔器取适量叶片，加1mL 4℃预冷的反应缓冲液快速磨碎，转入1.5ml离心管中置于冰上约10min，期间不断颠倒混匀；12500rpm，4℃，离心10min；取100μL上清加入到37℃预热的1mL检测液中迅速混匀，即刻取出80μL加入到720μL反应终止液中终止反应，并将该管的酶活值作为酶促反应空白对照。剩余上清液用于蛋白含量的测定；分别在10min、20min、30min、40min、60min时取出80μL上述检测液加入到720μL终止液中，并迅速混匀；利用荧光分光光度计测定上述终止液的荧光值，测定条件同上。

样品蛋白定量：

取叶片提取液30μl，采用Bradford法测定蛋白含量(Bradford MM,A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein–dye binding.Ann.Biochem.,1976，72:248–254.)。

GUS酶活力的计算：

以酶反应时间对4-MU含量作图，直线部分的斜率即为酶反应初始阶段的速度。酶活力单位定义为：每分钟水解4-MUG生成1nmol 4-MU的酶量为一个活力单位。根据定义求出各样品的酶活力。GUS基因表达的酶活性以每毫克蛋白的酶活力表示，将样品酶活力除以上述测得的样品蛋自含量。

上述GUS染色和GUS酶活性测定结果表明，HLP4启动子是一个受低温、高盐、干旱以及ABA强烈诱导的启动子。由附图3和附图4可见，HLP4启动子在逆境条件下，能够提高目标基因的表达600倍以上，尤其在低温条件下，甚至将目标基因的表达提高到1200倍以上，在作物抗冷、抗盐、抗旱等抗逆育种上显示出巨大的应用潜力。

序列表

<110>山东大学

<120>拟南芥的一个受低温、高盐、干旱或ABA诱导的启动子HLP4

<141>2017-6-20

<160>3

<210>1

<211> 1602

<212>DNA

<213>拟南芥

<221>启动子HLP4的核苷酸序列

<222>（1）…（ 1602）

<400>1

gttacacaac gtcatcagat gagtcaatga aacagtgaga ctttgtgtga gtttgtccaa 60

tagctacgga gaagtaattc tctcccttga attcaacgat ggtctatgat accttcttgg 120

gggagtcact acctgaagaa ggaggcgact tagttttctt gatcaactcg ggctcgaaaa 180

agttgtaaac gtcttcgtcc tgagacatat atatcacaac tatgccaatt agatatatag 240

aggttcctct atcaccaaaa atatttctct tgctaattgt gtcccactgt tgcagaggtt 300

aaaatgaaga atgtactagt aaatatttac cttttgcatt cggttccagc tacttaactc 360

actgattgca gtaatatcca aattttggtg caactccttc atccctccaa atggttgcat 420

aaaagccact atgaattcat tacgtagtgc tttcctatgt aaagaatgct ccatttggtt 480

agcttggtat ctcatgaggt tcttagatgg cagcataaat aattgctgta gcgtcgacac 540

taaaacatat atattctcat aactagccaa tatacttttg aggctatggg aaatcgctta 600

cccatggata aggctatatg tgggaaatag gagaaattgt tggttctagt ccaacaatta 660

aaacctgaga cacactactt ggaaataaag aggcctgtga gattaggcat ctcactacac 720

attactctag tagatctttt gggaaatgga aactggttgg atatcagaga tgaagtttgt 780

gacaaaagaa cttggtacgc cacaaatcat tctcggtacg gccacttgtt caatcgatta 840

gtacttgttt tacgagtcaa tttctgcttc ttacaaatta ctgtgttaat gggctactta 900

gcaattgaga ctaaaggctt tgtaaacatt attttcatgt ggtataatag aacggaatct 960

tattaaatat tggtaggtga ccaattgctg taactcgcag cataaatgaa caatgcctta 1020

atttatttat tttttgttaa attcaagtta gatttcgttt tatttttaaa ggaaagaaaa 1080

ggatgaaact ttacaaaaag gtgatttcgg tctatcgtct tttttatgat gacgggtaga 1140

tatttgtgaa gagagagtag taaaagatga cagttgtttt tactttttag ttggattttg 1200

tcaaagataa atgaatgccg accatctaaa tcaatggtaa cggaccaatc gacgtgtcca 1260

cgcaaggaca accaagaatt ttgatttaac gctggactgg gtcataacaa aaatacatgt 1320

caccatcgta ttaaagtgaa aggtgacgag taataaatct tttttttttg gggaaaggac 1380

gagtaacaat caagaacgta aaagcaatga aaaaaaagaa gtaatcaagt agtaaaatga 1440

ccttaatctt aatggtcctc caagttacac atgcacttac caaagtactt aaacaaatag 1500

taaataactt ttgagacagc accgacgaag tgacattggc cgactaatat actcacgtgt 1560

agatattttc ataccaaccg cggcatcata tagattttag ac 1602

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<221> HLP4-F

<222>（1）…（31）

<400>2

aagcttgtta cacaacgtca tcagatgagt c 31

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<221> HLP4-R

<222>（1）…（31）

<400>3

ggatccgtct aaaatctata tgatgccgcg g 31

Claims (2)

1.拟南芥的一个受低温、高盐、干旱或ABA诱导的启动子，命名为启动子HLP4，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。

2.权利要求1所述拟南芥的一个受低温、高盐、干旱或ABA诱导的启动子在抗逆基因工程育种中的应用，其中，所述应用的方法是：所述启动子HLP4为低温、高盐、干旱或ABA诱导型启动子，将其作为启动子分别与功能基因融合构建植物表达载体，并转入植物中，以实现在转基因植物体内的诱导型高表达；

其特征在于：

所述植物是拟南芥。