CN114107305B - 一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用；所述的增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的有益效果是：本发明的所提供的增强子，可以在低温诱导的情况下特异启动增强目标基因的表达，同时在不寒冷的时候不会启动这个基因，不消耗植物多余的能量。采用增强子调控基因表达的模式能够避免组成型启动子非特异性启动基因表达，产生大量蛋白质或代谢产物对植物生长状况的影响。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用。
背景技术
在农业生产中，寒冷对于植物的生长繁殖有较大影响。利用基因工程将外源抗寒基因导入植物细胞或植物体来提高植物的抗寒能力是一种有效手段。目前植物基因工程中基本是运用组成型启动子来驱动目的基因的表达，但组成型启动子在所有组织中都启动基因表达，不表现时空特异性及条件诱导性，在非胁迫环境下同样会产生大量蛋白质或代谢产物在植物体内积累，造成植物能量不必要的消耗，可能会打破了植物原有的代谢平衡，因而阻碍了植物的正常生长，导致作物减产，甚至导致死亡。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种低温诱导型增强子，为在基因工程中低温诱导特异表达关键基因提供功能元件。
本发明的提供一种低温诱导型增强子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的植物低温诱导型的增强子，能够用更为有效的调控元件代替组成型启动子增强目的基因的表达。在生产中，可以进行更加精准的分子育种，例如提高植物的抗寒性等，使植物遇到寒冷时的特异性提高相应蛋白表达显著提高，能够应对胁迫环境；再比如利用低温特异诱导一些物质的积累等等。利用低温诱导型增强子代替常规基因工程中的组成型顺式调控元件，可以使植物再其他条件下不表达外源基因，不消耗植物多余的能量。
本发明采用如下方法得到所述增强子：通过分析拟南芥的常温与冷处理的叶片RNA-seq数据，发现FMO GS-OX4 （AT1G62570）冷处理后基因表达上调150倍，对此基因的开放染色质进行分析，发现在此基因内含子区域存在一个低温诱导的开放染色质区域；具体步骤包括有：
RNA-seq数据的获得：对拟南芥叶片进行冷诱导，所述的冷诱导为在4℃下处理24小时，分别提取拟南芥常温和冷诱导叶片的mRNA，经过二代测序获得RNA-seq数据，通过生信方法分析发现经过冷处理之后的拟南芥的FMO GS-OX4 （AT1G62570）基因表达上调。
取样：同一生长期的常温下的拟南芥叶片和4℃处理24小时的拟南芥叶片；
由北京诺禾致源科技股份有限公司进行mRNA的提取、建库以及二代测序；
通过生信方法处理数据对比冷处理前后基因表达情况的变化；
利用实验室已有的常温和冷诱导的拟南芥叶片的 DNase-seq 数据，Nase-seq 数据为两个生物学重复，进行全基因组DNaseI超敏感位点（DNase I Hypersensitive Sites）的鉴定，发现在基因内部第二个内含子的位置（chr1:23169889:23170650）有一个位点，在常温下不开放在冷诱导下开放。
进一步的，本发明提供一种含有所述增强子的载体。
进一步的，本发明提供一种含有所述增强子的重组质粒。
进一步的，本发明提供一种所述增强子在植物低温诱导下增加基因表达中的应用。
进一步的，本发明提供一种特异性提高低温下目标基因表达的方法，包括利用基因工程手段，在植物中利用1所述的增强子实现基因的低温诱导表达，所述表达的方式包括以下方式中的一种或多种组合：
（1）通过在植物中导入所述的增强子；
（2）通过在植物中导入所述的载体；
（3）通过在植物中导入所述的重组质粒。
进一步的，将所述的增强子和载体连接后，转化大肠杆菌，筛选获得构建成功载体的大肠杆菌，并提取大肠杆菌的质粒，转化农杆菌，将农杆菌打入烟草叶片组织中。
进一步的，将所述的增强子和载体连接后，转化大肠杆菌，筛选获得构建成功载体的大肠杆菌，并提取大肠杆菌的质粒，转化农杆菌，进行农杆菌介导的拟南芥遗传转化，筛选转基因纯合植物。
进一步的，本发明提供一种利用所述低温诱导增强子，特异提高植物低温下目标基因的表达的，及其在植物育种中的应用。
本发明具有以下优点：本发明的所提供的增强子，可以在低温诱导的情况下特异启动一些目的基因，如特异性提高低温下的某些有效成分的积累，或提高耐寒性，同时在不寒冷的时候不会启动这些目的基因，不消耗植物多余的能量。采用诱导型增强子调控基因表达的模式能够避免组成型启动子非特异性启动基因表达，产生大量蛋白质或代谢产物对植物生长状况的影响。
附图说明
图1 为常温与冷诱导条件下的11个基因表达量的比较结果。
图中RT为常温；Clod为冷诱导。
图2 为常温和冷诱导的拟南芥叶片的 DNase-seq 数据，FMO GS-OX4基因区在常温与寒冷情况下染色质开放程度视化图。
图3为烟草瞬时转化载体的示意图；
图中，miniPro::LUC 为阴性对照；35sEn-miniPro::LUC为阳性对照；Non-DHS::miniPro::LUC为非DHS对照；C1R-miniPro::LUC为阳性对照；DHS::miniPro::LUC为增强子验证载体；
LUC为空载对照。
图4为常温下包括有增强子的烟草瞬时转化结果图；
图中：1为mini增强子阴性对照；2为35s增强子正向阳性对照；3及5为非DHS对照4为C1R增强子反向阳性对照；6、7、8为增强子验证载体；9为空载体对照。
图5为拟南芥稳定转化载体的示意图；
图中，miniPro::GUS为阴性对照；35sEn-miniPro::GUS为阳性对照；DHS::miniPro::GUS为增强子验证载体。
图6 为低温梯度时间诱导植株后GUS蛋白含量及染色情况图；
图中，A为mini载体；B为35S载体；C为目标序列载体。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例1：构建载体瞬时表达（luc）证明目标位点具有功能
（1）目标片段获取
以拟南芥DNA为模板扩增目标片段，PCR 反应程序如下：95℃5min 、95℃30min、x45min、72℃ y 、72℃10min 、12℃∞PCR反应体系如下：10×Buffer 2 μL、MgCl2 1.6 μL、dNTP 1.6 μL、Ex Taq 酶 0.1 μL、正向引物 1 μL、反向引物 1 μL、模板 1 μL、ddH2O补齐至20μL。x—退火温度，根据引物 Tm 值设定；y—延伸时间，根据扩增片段长度设定。PCR扩增获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若符合目标大小则切下目的片段胶块，按照琼脂糖凝胶试剂盒步骤回收目标片段，置于-20℃保存备用。
（2）线性载体的制备
根据载体上带有的酶切位点选用合适的核酸内切酶进行切割，获得线性载体，具体反应体系如下：10×Buffer 2μL、核酸内切酶1 1μL、核酸内切酶2 1μL、质粒1μg、ddH2O补齐至20μL。反应温度为37℃，酶切时间为16h；酶切完成后65℃水浴20min 终止反应，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性载体，置于-20℃保存备用
（3）载体连接
将获得的目标片段与线性载体按照一定比例混合，加入T4连接酶进行连接反应，室温过夜，连接反应体系如下：5×Buffer 2μL、T4连接酶1μL、线性载体3μL、目标片段1μL、ddH2O补齐至10μL反应温度为室温，过夜连接，置于-20℃保存备用。
（4）大肠杆菌转化及菌落PCR验证
将储存于-80℃的大肠杆菌感受态细胞取出，置于冰上融化，每管分装25μL感受态细胞，加入1-2μL按照（3）获得的产物，混匀，冰浴 30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入250μL纯LB培养基，37℃，200rpm，震荡培养1h，吸取菌液（10-100μL）涂布在含有相应抗生素的LB培养基上，37℃，过夜培养。挑取单菌落，进行菌落 PCR 验证，其反应体系如下：2×PCR mix10μL、正向引物1μL、反向引物1μL、模板1μL 、ddH2O补齐至20μL ，PCR反应程序按照目标片段获取的反应程序设定，扩增完成后，进行琼脂糖凝胶电泳观察结果；将菌落PCR验证正确的菌落挑至含有相应抗生素的的液体LB培养基中，37℃、200rpm过夜培养，扩繁菌体后送去公司进行测序进一步验证；测序验证正确的菌液按照美国OMEGA生物试剂公司质粒提取试剂盒步骤提取质粒；
本实施例中，通过转化大肠杆菌可以从载体的连接体系中筛选构建成功的载体，由构建成功的载体才具有的抵抗某种抗生素的能力，因此可以通过相应的抗生素培养基来筛选构建成功的载体，然后对能够在抗性培养基上生长的大肠杆菌菌落进行PCR检测目标片段是否在该菌落中，排除菌落的假阳性。之后比对公司返回的测序结果确定构建的载体无误，提取质粒并保存以备使用。
（5）农杆菌转化
将储存于-80℃的农杆菌感受态细胞取出，置于冰上融化，每管分装50μL感受态细胞，加入1-2μL由（4）步骤构建的质粒，混匀，冰浴5分钟，置于液氮中处理5分钟，28℃水浴5分钟，冰浴5分钟，加入700μLLB液体培养基，于控温摇床中28℃，200rpm震荡培养2-3h，6000rpm、1min收集菌液，吸取10-100μL菌液涂布在含有相应抗生素的LB培养基上，28℃培养 2d，挑取单菌落进行菌落 PCR 验证。将菌落PCR验证正确的菌落至含有相应抗生素的的液体LB培养基中，28℃、200rpm过夜培养。菌液与甘油1：1体积置于-80℃保存备用。
（6）烟草瞬时转化
a、吸取含有重组质粒的农杆菌 GV3101 菌液于含有 25ml LB 液体培养基，培养基中含有相应抗生素的锥形瓶中，28℃，200rpm 培养过夜，直至 OD600 达到 0.5；
b、吸取菌液，5000×g 离心 10min，去除上清液，然后将沉淀重新悬浮于农杆菌渗滤缓冲液中，使得 OD600 达到 0.5 ；
c、在室温下放置2h后，用1mL一次性无菌注射器将含有农杆菌的渗滤缓冲液注射进烟草叶片中；
d、将注射后的烟草置于培养室中培养48h后，涂抹荧光素钠溶液，在Tanon- 5200仪器的化学发光模式下检测荧光信号强度。
农杆菌渗滤缓冲液：10mM MgCl2；200µM 乙酰丁香酮；ddH2O。
以拟南芥基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目标片段整合到含有 Luciferase（LUC）报告基因的表达载体中，根据图三构建增强子验证载体；
增强子验证载体：利用微小型启动子（miniPro）自身不能单独启动基因表达，只能在增强子存在下才能启动基因表达的特性，将目标片段序列整合到带有微小型启动子和LUC报告基因的表达载体（DHS::miniPro::LUC）中（图三6、7、8）进行验证；
将已知 35S增强子的正向序列（图三2）和C1R增强子（图三4）分别装入带有微小型启动子和LUC基因的表达载体（35sEn-miniPro::LUC、C1R-miniPro::LUC），作为阳性对照；
将只含有微小型启动子和 LUC 基因的载体（miniPro::LUC）（图三1）以及含有非DHS的片段、微小型启动子和 LUC 基因的载体（图四3、5）作为阴性对照；
分析图4实验结果，1号和9号无荧光信号说明该增强子验证载体体系只能在增强子存在下才能启动基因表达的特性无误；2号信号最强，35S是已知的超强增强子，能够充分启动报告基因的表达，证明该增强子验证体系与具有增强子功能序列相连后能够发挥功能，为阳性对照；4号荧光较弱，C1R是拟南芥中已知的增强子，通过设计这一阳性对照载体可以保证实验过程中的检测体系无误，即同等实验条件下若目标序列具有增强子功能能够被检测到，弥补了35S载体由于超强增强功能而无法确定是否会由于实验条件的原因导致本应该具有增强子功能的序列因为自身增强功能较弱而受实验操作的影响；3和5号作为阴性对照无荧光，证明该验证载体不会由于连接序列的物理原因引起报告基因的表达，只能由于该序列的增强功能，促使报告基因的表达；6、7、8为目标序列载体，检测到荧光信号证明目标序列具有增强子的功能。
实施例2：构建GUS 稳定转化载体，进行农杆菌介导的拟南芥稳定转化，筛纯合子，通过低温处理和常温对照，证明本发明提供的增强子是一个具有低温诱导性的增强子。
（1）目标片段获取
以拟南芥DNA为模板扩增目标片段，PCR 反应程序如下：95℃5min 、95℃30min、x45min、72℃ y 、72℃10min 、12℃∞PCR反应体系如下：10×Buffer 2 μL、MgCl2 1.6 μL、dNTP 1.6 μL、Ex Taq 酶 0.1 μL、正向引物 1 μL、反向引物 1 μL、模板 1 μL、ddH2O补齐至20μL。x—退火温度，根据引物 Tm 值设定；y—延伸时间，根据扩增片段长度设定。PCR扩增获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若符合目标大小则切下目的片段胶块，按照琼脂糖凝胶试剂盒步骤回收目标片段，置于-20℃保存备用。
（2）线性载体的制备
根据载体上带有的酶切位点选用合适的核酸内切酶进行切割，获得线性载体，具体反应体系如下：10×Buffer 2μL、核酸内切酶1 1μL、核酸内切酶2 1μL、质粒1μg、ddH2O补齐至20μL。反应温度为37℃，酶切时间为16h；酶切完成后65℃水浴20min 终止反应，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性载体，置于-20℃保存备用。
（3）载体连接
将获得的目标片段与线性载体按照一定比例混合，加入T4连接酶进行连接反应，室温过夜，连接反应体系如下：5×Buffer 2μL、T4连接酶1μL、线性载体3μL、目标片段1μL、ddH2O补齐至10μL反应温度为室温，过夜连接，连接完成后置于-20℃保存备用。
（4）大肠杆菌转化及菌落PCR验证
将储存于-80℃的大肠杆菌感受态细胞取出，置于冰上融化，每管分装25μL感受态细胞，加入1-2μL按照（3）获得的产物，混匀，冰浴 30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入250μL纯LB培养基，37℃，200rpm，震荡培养1h，吸取菌液（10-100μL）涂布在含有相应抗生素的LB培养基上，37℃，过夜培养。挑取单菌落，进行菌落 PCR 验证，其反应体系如下：2×PCR mix10μL、正向引物1μL、反向引物1μL、模板1μL 、ddH2O补齐至20μL ，PCR反应程序按照目标片段获取的反应程序设定，扩增完成后，进行琼脂糖凝胶电泳观察结果；将菌落PCR验证正确的菌落挑至含有相应抗生素的的液体LB培养基中，37℃、200rpm过夜培养，扩繁菌体后送去公司进行测序进一步验证。测序验证正确的菌液按照美国OMEGA生物试剂公司质粒提取试剂盒步骤提取质粒。
（5）农杆菌转化
将储存于-80℃的农杆菌感受态细胞取出，置于冰上融化，每管分装50μL感受态细胞，加入1-2μL由（4）步骤获得的质粒，混匀，冰浴5分钟，置于液氮中处理5分钟，28℃水浴5分钟，冰浴5分钟，加入700μLLB液体培养基，于控温摇床中28℃，200rpm震荡培养2-3h，6000rpm、1min收集菌液，吸取10-100μL菌液涂布在含有相应抗生素的LB培养基上，28℃培养 2d，挑取单菌落进行菌落 PCR 验证。将菌落PCR验证正确的菌落至含有相应抗生素的的液体LB培养基中，28℃、200rpm过夜培养。菌液与甘油1：1体积置于-80℃保存备用。
（6）农杆菌介导的拟南芥遗传转化
a、吸取含有重组质粒的农杆菌 GV3101 菌液于含有相应抗生素 25ml LB 液体培养基中，28℃，200rpm 培养过夜，使菌活化；
b、吸取菌液于 2mL 离心管中，4000rpm 离心 4min，去除上清液，然后加入拟南芥侵染缓冲液，重新悬浮；
c、将含有农杆菌的拟南芥侵染缓冲液滴在拟南芥所有花蕾上，将植株置于培养室中培养；
d、重复上述abc步骤 3 次；
e、收获拟南芥种子（T0 代），将其撒在含有卡那霉素的 MS 培养基上进行转基因阳性植株的筛选；筛选完成后，将阳性植株移栽到土壤中培养，收取种子（T1 代），再次进行阳性植株的筛选，直至筛选出转基因纯合植株 ；
f、将筛选的转基因阳性植株放置于4℃和常温的培养箱中设置低温处理时间梯度0h,5h,10h,24h,48h培养，拟南芥小苗避光浸泡于 GUS 染色缓冲液中，37℃避光培养过夜，植株GUS结果图见图6；
g、去除缓冲液，加入 80%酒精脱色，不定期更换酒精，直至脱色完全；完全脱色后观察 GUS 信号强弱以及组织分布；
GUS信号强弱说明导入的序列的基因表达量的多少，间接说明增强子的活性高低，即信号强说明增强子活性高，信号弱说明增强子活性弱，因此通过低温处理之后信号加强可以说明该增强子可以受到低温诱导；通过组织分布观察可以知道该序列的表达是否有空间特异性。
拟南芥侵染缓冲液（30mL）：蔗糖 2g；MES 0.012g；silwet L-77 15µl（pH5.7）。
GUS 染色缓冲液：100mM（pH7.0）磷酸钠缓冲液；1mM K4Fe(CN)6（亚铁氰化钾）；0.1% N-laurylsarcosine（十二烷基肌氨酸纳）；10mM Na2EDTA；1mM K3Fe(CN)6（铁氰化钾）；0.5mg/mL X-Gluc；0.1% Triton X-100。
通过烟草瞬时转化结果证实了目标序列具有增强子的功能，由于烟草瞬时转化实验无法诱导低温且无法证实组织特异性，于是构建了GUS载体在拟南芥中稳定转化来验证。以拟南芥基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目标片段；根据目标以及表达载体序列信息设计引物，将候选 DHS 片段整合到含有 GUS 报告基因的表达载体中，构建功能验证载体。将候选 DHS 装入带有微小型启动子和 GUS 报告基因的表达载体（DHS::miniPro::GUS）中进行验证（见图5 中的DHS::miniPro::GUS）；同时将已知 35S 增强子装入带有微小型启动子和GUS基因的表达载体作为阳性对照（见图5中的 35sEn-miniPro::GUS ）；将只含有微小型启动子及GUS基因的载体作为阴性对照（见图5中miniPro::GUS)。将构建好的载体转入农杆菌，侵染拟南芥花序进行拟南芥稳定转化，正常光周期培养，收侵染后拟南芥植株的种子（T0 代），以加有相应抗性的MS 培养基进行转基因阳性植株筛选，对筛选出来的阳性植株99进行低温梯度时间处理后GUS染色，根据图6所示，通过GUS信号发现BK1-2在植物的根茎叶等部位都可以表达，说明其表达不存在组织特异性，GUS颜色加深说明随着冷处理时间的增强BK1-2的表达量逐渐增高。通过检测蛋白表达量的变化与GUS信号变化一致。作为阳性对照的35S载体和阴性对照的mini载体证明该报告体系的正常无误，说明目标序列是一个植物低温诱导型的增强子这一实验结果真实可信。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>朱博
<120>一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用
<160> 1
<210> 1
<211> 896
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GAGGCAAACACACAGCCACAGTTATCGAGTTCCTGATCCATTCAAAGATGAGGTATTTTCATAATCTACGATACTTTTTTAATACTAAAATTGACTTTATTATTGACAGCTATAATCTTTCACTACATTAACCTAACGTACGGACCAAGTCTCAATTTTATAGAAAACAAAACGATGATACAACACGTAACTTTTACTCATTTTATTAAATCAACATTTTAGACTTTTAAGTTAATTAAAATATAGTTAACGTTGGGATACGTGTTGAGAGAAGAAACGTATACATCTATGAAAAAAAATTAATGAAAGATGAGTTAATGATGGTGACGAAATTCTTGTTAGTTGTTACGCTTTCTAGTTTATGTTCTCTTTTCTTTATTCGATTCCTAATGCTTTTTTTCAGTGAATAAAAAACTCCATTTCATTGTGGACCGCAGAAAATAATATCTCAAAATTTGATATAGTATAAACTATGTCGGTATAGTCAGATCTTCTAGAGAGTTGTGGTATCCACAAACAAAGAATACAATCGCAGATTCGCAAAACACTTTTCATTAAATAGTAATTAATAATCACATATAGTACTCTTTAAAATGTATAAAAGTCACTTTTGGTTTAACCCATGTGGGAGGGATTAAATGGAATAGATTAATTTGCTTTGATACATCTTTAACTGGATAATAATAAACCAAACGTTGACTAAACCATACATTAATTTGCAGGTGGGGGTAGTAATCGGGAATTTTGCGAGTGGAGCCGATA
Claims (8)
1.一种低温诱导型增强子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有权利要求1所述增强子的载体。
3.一种含有权利要求1所述增强子的重组质粒。
4.权利要求1所述增强子在植物低温诱导下增加基因表达中的应用；所述的植物包括有烟草和拟南芥。
5.一种特异性提高低温下目标基因表达的方法，其特征在于：包括利用基因工程手段，在植物中利用权利要求1所述的增强子实现基因的低温诱导表达，所述表达的方式包括以下方式中的一种或多种组合：
（1）通过在植物中导入权利要求1所述的增强子；
（2）通过在植物中导入权利要求2所述的载体；
（3）通过在植物中导入含有权利要求3所述的重组质粒；
所述的植物包括有烟草和拟南芥。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将权利要求1的增强子和载体连接后，转化大肠杆菌，筛选获得构建成功载体的大肠杆菌，并提取大肠杆菌的质粒，转化农杆菌，将农杆菌打入烟草叶片组织中。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将权利要求1的增强子和载体连接后，转化大肠杆菌，筛选获得构建成功载体的大肠杆菌，并提取大肠杆菌的质粒，转化农杆菌，进行农杆菌介导的拟南芥遗传转化，筛选转基因纯合植物。
8.权利要求5所述的方法获得的转基因植物在植物育种中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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