CN113234753A - 玉米微丝解聚因子adf7转基因植株的培育、鉴定及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子植物育种及基因工程领域，提供包括有玉米ADF7基因(ZmADF7)的重组载体、转化细胞、转ZmADF7基因拟南芥的培育方法、鉴定及应用。转ADF7基因拟南芥的培育方法包括如下步骤：(1)玉米ZmADF7基因的克隆；(2)植物表达载体PCAMBIA1300‑221‑ZmADF7的构建(3)农杆菌GV3101花序浸染法转化拟南芥。对转化植株进行PCR、定量RT‑PCR检测证实玉米ZmADF7基因已整合到转基因拟南芥植株基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行检测，转基因植株的抗旱性明显提高，为玉米ZmADF7基因进一步相关研究提供切实可行的方法。

Description

玉米微丝解聚因子ADF7转基因植株的培育、鉴定及应用
技术领域
本发明属于分子植物育种及基因工程领域，涉及一种通过将玉米ZmADF7基因转入拟南芥以此来进一步研究该基因相关功能的方法，具体涉及转玉米ZmADF7基因的重组载体、转化细胞、转ZmADF7基因的拟南芥的培育鉴定及应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)，禾本科一年生草本植物，原产于中美洲和南美洲，具有较高的营养价值，是世界重要的粮食作物。在我国，玉米也是养殖业的主要饲料来源，是轻工业，医疗卫生等产业的重要原料，已经成为我国第一大粮食作物(Wu et al.，2020)，因此，利用基因工程挖掘和克隆玉米抵抗逆境的关键基因，并且证明其抗逆的作用机制具有重要的科学和实际意义。分子植物育种技术及转基因技术手段的发展，为快速高效的选育出具有优良性状的作物品种法提供了可行的方法，其可将特定的外源基因整合到植株的基因组中，从而改变植物的生物学特性，进而获得具有特定性状的转基因植株。
微丝是细胞内一个重要细胞器，起到支撑细胞形态的作用，为细胞骨架的主要成分(Yuan et al.，2016)。微丝通过微丝结合蛋白的调控，在细胞内发挥生理作用。ADF家族是一种解聚和剪切微丝的微丝结合蛋白，可以调控微丝的组织结构和动态。在自然界，已知的植物ADFs家族成员的数目要多于在动物中的数目。植物ADF基因主要存在玉米、水稻、葡萄、大白菜等各类植物中。ADF基因在不同的植物中表现出较为一致的解聚和剪切微丝的功能(Xu et al.，2009)，并且在植物中的生长发育和抵抗逆境中发挥极其重要的作用(Nanet al.，2017；Qian et al.，2016)。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)为十字花科拟南芥属草本植物。高7cm-40cm，在我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、等多省区均有分布(Qin et al.，2009：Meng et al.，2019)。拟南芥作为现代生物科学理想的模式生物，其植株矮小、生长周期短、结子多、生长力顽强，是非常好的遗传学研究实验材料(Qin et al.，2009：Meng et al.，2019)。目前已经证明：拟南芥中ADF7具有ADF家族的典型功能，相比于ATP-G-actin，ADF7更易与ADP-G-actin结合，并具有剪切微丝的功能(Ye et al.，2010)。ADF7在花粉发育过程中起重要作用，它在花粉管杆状区与微丝共定位，且改变微丝的剪切频率和解聚速度(Zheng et al.，2013)。本实验前期发现拟南芥ADF7基因在提高植物抗逆性发挥重要作用(数据尚未发表)。本研究将利用基因工程方法，克隆玉米ZmADF7基因，并且构建载体，转入拟南芥中，可在短时间内获得转基因植株，为该基因功能的研究提供更加便利的条件，很大程度上节约试验时间、空间成本。
目前玉米是我国第一大粮食作物，研究其抗逆基因功能有重要的科学和实践意义。ADF家族在植物抗逆性发挥具有重要作用，然而玉米中ADF家族尚未有任何研究。
针对研究玉米抗逆性的分子机制有重要科学和实际意义，并且目前尚无有相关研究玉米ADF家族提高植物抗逆性的理论依据，本发明提出一种ZmADF7转基因植株培育、鉴定方法及应用。
参考文献：
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发明内容
为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种转玉米ZmADF7基因的培育、鉴定方法及抗旱性应用，采用农杆菌介导法将玉米的内源基因ZmADF7导入拟南芥中提高其抗病能力，为改善拟南芥品种提供切实可行的方法，也为其他作物的品种改良提供一定理论依据，为后续研究奠定基础。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
利用农杆菌花序浸染法，将玉米ZmADF7基因导入拟南芥，并经过卡那霉素筛选抗性植株；经过卡那霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测验证内源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录，对转基因植株后代进行抗性分析，最终获得抗性能力提高的转基因拟南芥植株。
本发明的技术要点为：
1.本发明提供一种重组载体，该重组载体包括序列如SEQ ID NO.1所示ADF7基因，通过DNA连接酶将ZmADF7基因连接到载体。
2.本发明还提供包括有上述1提供重组载体的转化细胞。
3.本发明还提供一种转ZmADF7基因拟南芥的培育方法，该方法以玉米为材料获得目的基因ZmADF7，通过酶切连接与植物表达载体PCAMBIA1300-221质粒进行重组连接，通过农杆菌介导法将ZmADF7基因导入拟南芥。
4.本发明提供一种转ZmADF7基因拟南芥的培育方法，该方法包括如下步骤：
(1)ZmADF7基因的克隆
以玉米为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据序列信息设计特异性引物：
上游引物ADF7-F：序列如SEQ ID NO.2所示；
下游引物ADF7-R：序列如SEQ ID NO.3所示，获得ZmADF7基因序列；
结合PCR扩增目的基因的全长序列，设计引物：
上游引物ADF7-2F：序列如序列如SEQ ID NO.4所示；
下游引物ADF7-2R：序列如SEQ ID NO.5所示；在ZmADF7基因的上游和下游分别引入Xba I和BamH I酶切位点，获得PCR产物；
(2)植物表达载体PCAMBIA1300-221-ZmADF7的构建
将步骤(1)获得的PCR产物连接到pTOPO-T载体上，转化DH5 α感受态细胞，提取阳性质粒；用限制性内切酶Xba I和BamH I分别对提取的质粒及pCAMBIA1300-221载体进行双酶切，PCR电泳检测回收酶切产物，然后用T4连接酶连接过夜，连接产物转化DH5 α大肠杆菌，提取阳性质粒进行双酶切验证；
(3)农杆菌GV3101介导遗传转化法转化拟南芥
将步骤(2)制备的阳性质粒pCAMBIA1300-221-T-ZmADF7转化农杆菌感受态GV3101，获得阳性克隆农杆菌，通过浸染法转化拟南芥，将ADF7基因转入拟南芥中，获得转基因植株。
5.上述1提供的重组载体在培育抗旱性拟南芥上的应用。
6.上述2提供的转化细胞在培育抗旱性拟南芥上的应用。
7.上述3或4提供的转ZmADF7基因拟南芥的培育方法在抗旱性转基因拟南芥株系培育上的应用。
8.通过上述3或4提供的培育方法获得抗旱性拟南芥的应用。
9.转ZmADF7基因拟南芥的鉴定方法，该鉴定方法将转ADF7基因初步获得抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因拟南芥株系。
具体步骤如下：
(1)PCR检测
提取生根筛选得到的卡那霉素抗性待检测植株基因组DNA，将筛选基因NPT II作为检测目标，根据NPT II基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为661bp，引物序列为：
上游引物PCAMBIA1300-221-NPT II-F：序列如SEQ ID NO.6所示，
下游引物PCAMBIA1300-221-NPT II-R：序列如SEQ ID NO.7所示；
分别以卡那霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以PCAMBIA1300-221-NPT II-F和PCAMBIA1300-221-NPT II-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。
(2)荧光定量RT-PCR检测
提取抗卡那霉素植株叶片及野生型植株叶片总RNA，反转录合成cDNA第一链，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以野生型植株的表达为基准值，计算各转基因植株的相对表达情况；特异引物扩增出的片段长为100bp为阳性结果，引物序列：
上游引物ADF7-RT-F：序列如SEQ ID NO.8所示，
下游引物ADF7-RT-R：序列如SEQ ID NO.9所示；
以18S扩增的基因片段为内参，引物序列：
上游引物18S-F：序列如SEQ ID NO.10所示，
下游引物18S-R：序列如SEQ ID NO.11所示；
由PCR、荧光定量RT-PCR检测呈阳性，确定获得转基因拟南芥株系。
本发明的有益效果：
1.本发明采用转基因技术，将玉米ZmADF7基因整合到拟南芥基因组中，从根本上提高植物的抗逆能力。通过转化外源ZmADF7基因并正常转录表达，在干旱胁迫环境下筛选出抗性植株，为玉米ZmADF7基因的相关功能的研究提供理论依据，为后续发展奠定基础。
2.本实验提供的方法选育了转基因拟南芥材料，通过后续的实验分析，结果发现，与对照组相比，转入ADF7基因的植株耐旱能力得到了很大提高，在不同浓度甘露醇处理下转基因植株中ZmADF7基因表达量显著高于对照组，明显提高了拟南芥的耐旱能力。
3.本发明通过PCAMBIA1300-221引入卡那霉素抗性基因，利于后期通过卡那霉素筛选和PCR检测筛选转基因植株，并通过荧光定量RT-PCR检测可以定量检测抗病表达水平。
附图说明：
图1为PCAMBIA1300-221植物载体图；
图2为植物表达载体构建过程的琼脂糖凝胶电泳图；
图2其中：M：DL2000Marker，1：ZmADF7，2.双酶切验证电泳图，3.菌液PCR；
图3为农杆菌浸染拟南芥过程；
图3中：1、2：农杆菌侵染拟南芥，3：浸染后为提高浸染效率将拟南芥水平放置，4：浸染后黑暗处理24小时；
图4为转ADF7基因拟南芥特异引物检测电泳图；
图4中：M：DL2000Marker，阳：阳性质粒，WT：野生型植株，ZmADF7-1-6：转ADF7抗性株系(ZmADF7-1，ZmADF7-2，ZmADF7-4，ZmADF7-5为转入成功的阳性苗)；
图5为转基因及野生型植株中ZmADF7基因的相对表达水平；
图5中：WT：野生型植株，ZmADF7-1-6：转ZmADF7的株系(ZmADF7-1，ZmADF7-2，ZmADF7-4，ZmADF7-5表达明显升高)；
图6为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度甘露醇培养基中培养七天生长状态。
图6中：1：拟南芥野生型和ZmADF7转基因植株在1/2MS培养基生长七天，2：拟南芥野生型和ZmADF7转基因植株在1/MS+250nM甘露醇培养基生长七天，3：拟南芥野生型和ZmADF7转基因植株在1/2MS+350mM甘露醇培养基生长七天(ZmADF7-1和ZmADF7-5转基因苗明显提高了抗旱性)。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步的说明，下列实时例中未注明具体条件的试验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1
(1)玉米ZmADF7的克隆
以为玉米材料，取叶片100mg，参照天根RNA提取试剂盒说明书的操作方法提取叶片的总RNA，采用Prime ScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行反转录获得cDNA，根据转录组测序所得该基因序列信息，利用SnapGene软件设计特异性引物扩增ZmADF7。
上游引物ADF7-F：序列如SEQ ID NO.2所示：GATCGGGTCTAGCTGTAT
下游引物ADF7-R：序列如SEQ ID NO.3所示：TGGAAGTCCTTCACGCA
以玉米叶片的cDNA为模板，进行PCR反应，25ul反应体系；Mix×12.5ul，cDNA模板1ul，ADF7-F、ADF7-R引物各1ul，ddH2O 9.5ul；
反应程序：95℃预变性5min，95℃解链30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸10min。
PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，片段大小为420bp，PCR产物用艾德莱公司凝胶回收试剂盒进行回收，即获得ADF7基因序列，序列测定为
(2)植物表达载体的构建
根据ADF7基因全长序列设计引物：上游引物ADF7-2F：序列如SEQ ID NO.4所示：
TCTAGAGATCGGGTCTAGCTGTAT，下游引物ADF7-2R：序列如SEQ ID NO.5所示：GGATCCTGGAAGTCCTTCACGCA，以玉米叶片cDNA为模板进行PCR反应：25ul反应体系；Mix×12.5ul，cDNA模板1ul，ADF7-2F、ADF7-2R引物各1ul，ddH2O 9.5ul。反应程序：95℃预变性5min，95℃解链30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，反应35个循环，72℃延伸10min，在目的基因两端分别引入酶切位点Xba I和BamH I，PCR产物用艾德莱公司凝胶回收试剂盒进行回收，回收产物与pTOPO-T载体连接，转化D H 5α感受态细胞，提取阳性质粒pTOPO-T-Zm4DF7；
植物表达载体构建的过程如图1所示，具体实施措施如下：
用限制性内切酶Xba I和BamH I分别对质粒pCAMBIAL1300-221和pTOPO-T-ZmADF7进行双酶切，双酶切体系(50ul)：1×M Buffer 5ul，Xba I 2ul，BamH I 2ul，质粒或pTOPO-T-ADF7 10ul，ddH2O 31ul；37℃，过夜。将双酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，如图所示，分别获得了线性载体和ADF7目的片段，用凝胶回收试剂盒将酶切产物进行回收，T4DNA连接酶过夜链接，链接反应体系(20ul)：ddH2O 9ul，10×T4DNA Ligase Buffer 2ul，ADF7片段4ul，T4DNA Ligase 1ul，16℃，过夜)。连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒进行双酶切验证，PCR电泳检测结果如图，表明植物表达载体构建成功，通过pCAMBIAL1300-221引入ADF7基因。
(3)农杆菌GV3101浸染法转化拟南芥
取50uL GV3101农杆菌感受态在冰上融化后加入5uLpCAMBIB1300-221-ADF7连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min，42℃热激90s后，冰上放置2min，加入500uL，37℃预热的LB培养基，37℃振荡1h，取50uL涂在含抗生素的固体培养基上，将培养基倒置于37℃培养箱中经过大约16h左右培养过夜，菌落PCR，待培养基上长出单菌落，可进行菌落PCR鉴定，选取阳性菌落进行克隆后保存，用于浸染拟南芥。
将包含ADF7基因的植物表达载体GV3101 100uL，加入20mL到含有Kana+Rif的液体LB中，经过28℃摇菌过夜；取生长状态良好的拟南芥，采用浸染法将玉米中克隆得到的ADF7基因导入拟南芥中。将菌液6000r/min离心2min，倒掉上清液，收集菌体，用蔗糖和silwet-77配浸染液，将拟南芥植株上的角果全部减掉，只留下花苞，后取700μL浸染液将菌悬浮，用移液器吸取浸染液滴在花序上，将浸染过的苗放平，黑暗放置24-36h后扶正，浇水。
被浸染拟南芥成熟后收取的种子为T1代，用加入抗生素的1/2MS培养基进行筛选培养，并用表达载体上另一个抗性基因筛选。浸染成功的植株能在培养基上正常生长，有真叶和正常的根长，将生长状态正常的植株移到土里，单株收种子，即T2代种子。T2代植株在抗性培养基上筛选，符合正常生长与不正常生长比例为3∶1条件的，将生长正常的植株移到土里，单株收种子，即为T3代种子。将T3代种子在抗性培养基上筛选，全部正常生长的为纯合植株，即初步获得了纯合的抗性植株。
(4)转ADF7基因抗性植株进行分子检测
a.PCR检测
取生根筛选得到的卡那霉素抗性植株嫩叶及未转化植株嫩叶，提取基因组DNA，将ADF7基因作为检测目标，根据ADF7基因两段合成扩增反应引物，扩增出的片段长为420bp，引物序列为：
上游引物PCAMBIA1300-221-ADF7-F：序列如SEQ ID NO.6所示：atgtcgaactcggcgtcg
下游引物PCAMBIA1300-221-ADF7-R：序列如SEQ ID NO.7所示：tcagagggctcgcgactt
分别以卡那霉素抗性植株和野生型植株DNA为模板，以PCAMBIA1300-221-ADF7-F和PCAMBIA1300-221-ADF7-R为引物，进行PCR检测。扩增体系为：2×PCR Mix 10.0ul，PCAMBIA1300-221-ADF7-F、PCAMBIA1300-221-ADF7-R引物各1.0ul，cDNA模板2ul，ddH2O6ul；反应程序：94℃预变性3min，94℃解链30s，57℃退火40s，72℃延伸1min，反应35个循环，72℃延伸10min；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(如图4)。
扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。图4中可以看到，转基因植株均可扩增出片段大小为661bp的条带，与阳性对照扩增得到的特异条带相同，而野生型植株没有扩增出该条带。
b.荧光定量RT-PCR检测
取卡那霉素抗性植株叶片及野生型植株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量RT-PCR对CmWRKY15-1基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒说明书建立扩增体系，扩增条件为。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以野生型植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型植株基因相对表达情况。
特异引物扩增出的片段长为100bp为阳性结果，引物序列：
上游引物ADF7-RT-F：序列如SEQ ID NO.8所示：GGTGAGTACATCCGATCTGTTTC
下游引物ADF71-RT-R：序列如SEQ ID NO.9所示：CAGACAGAACCAACCACGTATC以18S扩增的基因片段为内参，引物序列：
上游引物18S-F：序列如SEQ ID NO.10所示：AAAAGATGACGGTCAAGACCTCGTCC，
下游引物18S-R：序列如SEQ ID NO.11所示：ACAGGTATCGACAATGATCCTTCCG；
根据荧光定量RT-PCR检测结果，与野生型相比，转ADF7的植株基因表达量有所提高。转基因株系表达量明显较高。证实内源基因已经转入拟南芥基因组DNA中并表达，如图5。
由PCR、荧光定量RT-PCR检测呈阳性，获得转基因植株。
(5)转基因植株后代的抗旱性分析
选取生长健壮的野生型拟南芥和转基因拟南芥的进行干旱处理相比，差异及其显著。由此可见，转基因植株具有显著的耐旱性。
Figure RE-ISB0000193592400000011
Figure RE-ISB0000193592400000021

Claims (9)

1.一种重组载体，其特征在于：该重组载体包括序列如SEQ ID N0.1所示ZmADF7基因，通过DNA连接酶将ZmADF7基因连接到载体。
2.包括有权利要求1所述的转化细胞。
3.一种转ZmADF7基因拟南芥的培育方法，其特征在于：该方法以玉米为材料获得目的基因ZmADF7，通过酶切连接与植物表达载体PCAMBIA1300-221质粒进行重组连接，通过农杆菌浸染法将ZmADF7基因导入拟南芥。
4.一种转ZmADF7基因拟南芥的培育方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)玉米ZmADF7基因的克隆
以玉米叶片为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据转录组测序所得到的序列信息设计特异引物：
上游引物ADF7-F：序列如SEQ ID NO.2所示
下游引物ADF7-R：序列如SEQ ID NO.3所示；获得ADF7基因序列；
结合PCR扩增目的基因的全长序列，设计引物：
上游引物ADF7-2F：序列如SEQ ID NO.4所示
下游引物ADF7-2R：序列如SEQ ID NO.5所示；在ZmADF7基因的上游和下游分别引入XbaI和BamH I酶切位点获得PCR产物；
(2)植物表达载体PCAMBIA1300-221-ZmADF7的构建
将步骤(1)获得的PCR产物连接到pTOPO-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；
用限制性内切酶Xba I和BamH I分别对提取的质粒及PCAMBIA1300-221载体进行双酶切，PCR电泳检测回收酶切产物，然后用T4连接酶连接过夜，连接产物转化DH5α大肠杆菌，提取阳性质粒进行双酶切验证；
(3)农杆菌GV3101浸染法转化拟南芥
将步骤(2)制备的阳性质粒PCAMBIA1300-221-ZmADF7转化农杆菌感受态GV3101，获得阳性克隆农杆菌，通过浸染法转化拟南芥，将ZmADF7基因转入拟南芥中，获得转基因拟南芥。
5.权利要求1所述的重组载体在培育转基因拟南芥的应用。
6.权利要求2所述的转化细胞在培育拟南芥的应用。
7.权利要求3或4所述的转ZmADF7基因拟南芥的培育方法在抗逆转基因拟南芥株系培育上的应用。
8.通过权利要求3或4所述的培育方法获得转基因拟南芥的应用。
9.转ADF7基因拟南芥的鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法将转ZmADF7基因初步获得的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因拟南芥株系；
具体包括如下步骤：
(1)PCR检测
提取生根筛选得到的卡那霉素抗性待检测植株基因组DNA，将筛选基因NPT II作为检测目标，根据NPT II基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为661bp，引物序列为：
上游引物PCAMBIA1300-221-NPT II-F：序列如SEQ ID NO.6所示，
下游引物PCAMBIA1300-221-NPT II-R：序列如SEQ ID NO.7所示；
分别以卡那霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以PCAMBIA1300-221-NPT II-F和
PCAMBIA1300-221-NPT II-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；
(2)荧光定量RT-PCR检测
提取抗卡那霉素植株叶片及野生型植株叶片总RNA，反转录合成cDNA第一链，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以野生型植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物
扩增出的片段长度为98bp阳性结果，引物序列：
上游引物ADF7-RT-F：序列如SEQ ID NO.8所示，
下游引物ADF7-RT-R：序列如SEQ ID NO.9所示；
以18s扩增的基因片段为内参，引物序列：
上游引物18S-F：序列如SEQ ID NO.10所示，
下游引物18S-R：序列如SEQ ID NO.11所示；
由PCR、荧光定量RT-PCR检测呈阳性，确定获得转基因拟南芥株系。
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