CN108384800A

CN108384800A - 转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定及应用

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Publication number: CN108384800A
Application number: CN201810082121.3A
Authority: CN
Inventors: 毛洪玉; 延昕; 刘迪; 祝朋芳; 熊超明; 毕蒙蒙
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2018-08-10
Anticipated expiration: 2038-01-29
Also published as: CN108384800B

Abstract

本发明属于植物基因工程及分子植物育种领域，提供包括有CmWRKY15‑1基因的重组载体、转化细胞、转CmWRKY15‑1基因切花菊的培育、鉴定方法及应用。转CmWRKY15‑1基因切花菊的培育方法包括如下步骤：（1）菊花CmWRKY15‑1基因的克隆（2）植物表达载体PBI121‑CmWRKY15‑1的构建（3）农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花。对转化植株进行PCR、定量RT‑PCR检测证实CmWRKY15‑1基因已整合到转基因植株基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行抗病性检测，转基因植株抗白色锈病能力明显提高，为选育抗病新品种菊花提供切实可行的方法。

Description

转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程及分子植物育种领域，涉及一种通过转CmWRKY15-1基因提高菊花抗白色锈病能力的方法，具体涉及转CmWRKY15-1基因的重组载体、转化细胞、转CmWRKY15-1基因的切花菊的培育鉴定及应用。

背景技术

菊花（Chrysanthemum morifolium）是我国十大名花之一，种类丰富，被广泛的应用于园林绿化及切花生产中。不同品种菊花的性状差异较大，很多观赏性强、经济价值高的菊花不能够兼具良好的抗逆性及抗病性。分子植物育种的诞生，为快速高效的选育出具有优良性状的菊花提供了新方法，其可通过转基因技术手段，将特定的基因整合到植株的基因组中，从而改变植物的生物学特性，获得具有特定性状的转基因植株。

WRKY转录因子是植物十大转录因子家族之一，最初由Ishiguro等人在甘薯中发现（1994），后来相继有学者研究发现WRKY转录因子参与到植物的抗生物胁迫及非生物胁迫响应中，增强植物自身的抗病能力及抗逆性。目前已发现在拟南芥、烟草、水稻等植物中过表达WRKY基因能够增强植物的耐盐性、耐旱性和耐寒性等抗逆能力。另一方面，WRKY转录因子能够通过直接调控抗病基因的表达或参与激素介导的信号转导途径从而改变植物的抗病能力。在拟南芥中，WRKY基因能够增强其对野火病菌、灰霉病菌、青枯病菌、枯萎病菌等病原菌的抗性（Deslandes et al.，2002；Xu et al.，2006；Le Roux et al.，2015；Karim etal.，2015）。在水稻中，过量表达WRKY基因能够显著提高水稻对稻瘟病和白叶枯病的抵抗力（Encinas-Villarejo et al.，2009；Jing et al.，2009）。此外，WRKY基因还能够抗番茄叶卷曲病（Mandal et al.，2015）、葡萄霜霉病（Merz et al.，2015）、白粉病（乔恒波，2016）、柑橘溃疡病（周鹏飞等，2017）等多种植物病害。在菊花中，关于WRKY基因功能的研究尚不多见。DgWRKY5和CmWRKY1基因能够增强菊花的耐盐性和耐旱性（田效琴，2016；范青青，2016）。在菊花中过表达CmWRKY48基因和CmWRKY15基因，增强了菊花对蚜虫的防御机制和对黑斑病的敏感性（Li et al.，2015；范青青，2016）。

菊花白色锈病是菊花重要病害之一，其传播范围广、危害性大，一旦发病将使植株叶片干枯下卷甚至变黑，引起大规模植株死亡（Whipps et al.，1993）。目前，关于WRKY基因增强菊花抗白色锈病的能力的相关研究尚未见报道。

针对目前实际生产中菊花抗白色锈病能力较弱，且尚未有相关研究提供WRKY基因增强菊花抗白色锈病能力的理论依据，本发明提出一种转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定方法及应用。

参考文献：

1.Ishiguro S, Nakamura K. 1994. Characterization of a cDNA encoding anovel DNA-binding protein, SPF1, that recognizes SP8 sequences in the 5’upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweetpotato[J]. Mol. Gen Genet, 244(6): 563-571.

2.Deslandes L, Olivier J, Theulieres F, et al. 2002. Resistance toralstonia solanacearum in arabidopsis thaliana is conferred by the recessiveRRS1-R gene，a member of a novel family of resistance genes[J]. Proceedings ofthe National Academy of Sciences, 99(4): 2404-2409.

3.Xu X, Chen C, Fan B, et al. 2006. Physical and functional interactionbetween pathogen-induced Arabidopsis WRKY18, WRKY40, and WRKY60 transcriptionfactors[J]. The Plant Cell, 18(5): 1310-1326.

4. Le Roux C, Huet G, Jauneau A, et al. 2015. A receptor pair with anintegrated decoy converts pathogen disabling of transcription factors toimmunity[J]. Cell, 161(5): 1074-1088.

5. Karim A, Jiang YZ, Guo L, et al. 2015. Isolation and characterizationof a subgroup IIa WRKY transcription factor PtrWRKY40 from Populustrichocarpa[J] .Tree Physiology, 35(10): 1129-1139.

6.Encinas-Villarejo S, Maldonado AM, Amil-Ruiz F, et al. 2009, Evidencefor a positive regulatory role of strawberry (Fragaria × ananassa) Fa WRKY1and Arabidopsis At WRKY proteins in resistance[J]. Journal of ExperimentalBotany, 60(11): 3043-3065.

7. Jing SJ, Zhou X, Song Y, et al. 2009. Heterologous expression ofOsWRKY23 gene enhances pathogen defense and dark-induced leaf senescence inArabidopsis [J].Plant Growth Regulation, 58(2): 181-190.

8. Mandal A. Sarkar D, Kundu P, et al. 2015. Mechanism of regulatin oftomato TRN1 gene expression in late infection with tomato leaf curl New Delhivirus[J]. Plant Science, 241: 221-237.

9.Merz PR, Moser T, Höll J, et al. 2015. (Vitis The transcription factorVvWRKY33 is involved in the regulation of grapevine defense against theoomycete pathogen vinifera) Plasmopara viticola[J]. Physiologia Plantarum,153(3): 365-380.

10. 乔恒波. 2016. 中国野生毛葡萄转录因子WRKY3基因克隆与功能研究[D].西北农林科技大学.

11.周鹏飞, 贾瑞瑞, 陈善春, 等. 2017.柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析[J]. 园艺学报, 44 (3): 452-462.

12. 田效琴. 2016. 菊花DgWRKY5及DgWRKY4基因的克隆和功能鉴定[D].四川农业大学.

13. Li P, Song A , Gao C, et al. 2015. The over-expression of achrysanthemum WRKY transcription factor enhances aphid resistanc[J]. PlantPhysiology & Biochemistry, 95: 26-34.

14.范青青. 2016. 菊花CmWRKY1和CmWRKY15基因功能初步分析[D]. 南京农业大学.

15. Whipps JM. 1993. A review of white rust (Puccinia horiana Henn.)disease on chrysanthemum and the potential for its biological control withVerticillium lecanii (zimm.) Viégas. Annals of Applied Biology, 122(1): 173-187。

发明内容

为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定方法及抗病应用，采用农杆菌介导法将菊花的内源基因CmWRKY15-1导入菊花中提高其抗病能力，为选育抗白色锈病新品种菊花提供切实可行的方法，为选育菊花抗病新品种提供理论依据，为后续研究奠定基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

利用根癌农杆菌介导法，将CmWRKY15-1基因导入切花菊，并经过卡那霉素筛选抗性植株；经过卡那霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测验证内源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录，对转基因植株后代进行抗白色锈病分析，最终获得抗白色锈病能力提高的转基因菊花植株。

本发明的技术要点为：

1.本发明提供一种重组载体，该重组载体包括序列如SEQ ID NO.1所示CmWRKY15-1基因，通过DNA连接酶将CmWRKY15-1基因连接到载体。

2.本发明还提供包括有上述1提供重组载体的转化细胞。

3.本发明还提供一种转CmWRKY15-1基因切花菊的培育方法，该方法以白色锈病高抗品种‘双粉匙’为材料获得抗病基因CmWRKY15-1，通过酶切连接与植物表达载体PBI121质粒进行重组连接，通过农杆菌介导法将CmWRKY15-1基因导入菊花。

4.本发明提供一种转CmWRKY15-1基因菊花的培育方法，该方法包括如下步骤：

（1）菊花CmWRKY15-1基因的克隆

以白色锈病高抗品种‘双粉匙’叶片为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据序列信息设计特异性引物：

上游引物CmWRKY15-1-F：序列如SEQ ID NO.2所示；

下游引物CmWRKY15-1-R：序列如SEQ ID NO.3所示，获得CmWRKY15-1基因序列；

结合PCR扩增目的基因的全长序列，设计引物：

上游引物CmWRKY15-1-2F：序列如序列如SEQ ID NO.4所示；

下游引物CmWRKY15-1-2R：序列如SEQ ID NO.5所示；在CmWRKY15-1基因的上游和下游分别引入Xba I和Sac I酶切位点，获得PCR产物；

（2）植物表达载体PBI121-CmWRKY15-1的构建

将步骤（1）获得的PCR产物连接到pTOPO-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒pTOPO-CmWRKY15-1。用限制性内切酶Xba I和Sac I分别对提取的质粒及PBI121载体进行双酶切，PCR电泳检测回收酶切产物，然后用T4连接酶连接过夜，连接产物转化DH5α大肠杆菌，提取阳性质粒进行双酶切验证。

（3）农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花

将步骤（2）制备的阳性质粒PBI121-CmWRKY15-1，加入感受态EHA105中，获得阳性克隆农杆菌，通过叶盘法转化菊花，将CmWRKY15-1基因转入菊花中，获得转CmWRKY15-1基因切花菊。

5.上述1提供的重组载体在培育抗白色锈病菊花上的应用。

6.上述2提供的转化细胞在培育抗白色锈病菊花上的应用。

7.上述3或4提供的转CmWRKY15-1基因切花菊的培育方法在抗白色锈病转基因菊花株系培育上的应用。

8.通过上述3或4提供的培育方法获得切花菊在抗白色锈病上的应用。

9.转CmWRKY15-1基因切花菊的鉴定方法，该鉴定方法将转CmWRKY15-1基因初步获得抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系。

具体步骤如下：

（1）PCR检测

提取生根筛选得到的卡那霉素抗性待检测植株基因组DNA，将筛选基因NPTⅡ作为检测目标，根据NPTⅡ基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为676bp，引物序列为：

上游引物PBI121-NPTⅡ-F：序列如SEQ ID NO.6所示，

下游引物PBI121-NPTⅡ-R：序列如SEQ ID NO.7所示；

分别以卡那霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以PBI121-NPTⅡ-F和PBI121-NPTⅡ-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

（2）荧光定量RT-PCR检测

提取抗卡那霉素植株叶片及野生型植株叶片总RNA，反转录合成cDNA第一链，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以野生型植株的表达为基准值，计算各转基因植株的相对表达情况；特异引物扩增出的片段长为131bp为阳性结果，引物序列：

上游引物CmWRKY15-1-RT-F：序列如SEQ ID NO.8所示，

下游引物CmWRKY15-1-RT-R：序列如SEQ ID NO.9所示；

以Actin扩增的基因片段为内参，片段长度为188bp阳性结果，引物序列：

上游引物Actin-F：序列如SEQ ID NO.10所示，

下游引物Actin-R：序列如SEQ ID NO.11所示；

由PCR、荧光定量RT-PCR检测呈阳性，确定获得转基因菊花株系。

本发明的有益效果：

1.本发明采用转基因技术，将CmWRKY15-1基因整合到菊花基因组中，获得的抗白色锈病菊花稳定表达抗性，从根本上提高菊花抗病能力，减少化学污染，对环境无危害。通过转化内源CmWRKY15-1基因并正常转录表达，在接种白色锈病病原菌后诱导下游基因表达从而提高菊花抗白色锈病的能力，为选育菊花抗病新品种提供理论依据，为后续研究奠定基础。

2.本发明提供的方法选育了转基因菊花材料，通过接菌试验分析结果发现，与野生型植株相比，转入CmWRKY15-1基因的植株抗白色锈病能力得到很大提高：在接菌1h后，转基因植株中CmWRKY15-1基因表达量显著高于野生型植株，明显提高了菊花抗病能力。

3.本发明通过PBI121引入卡那霉素抗性基因，利于后期通过卡那霉素筛选和PCR检测筛选转基因植株，并通过荧光定量RT-PCR检测可以定量检测抗病表达水平。

附图说明：

图1为PBI121-CmWRKY15-1植物载体图；

图2为植物表达载体构建过程的琼脂糖凝胶电泳图；

图2其中：M1:Maker 2000，M2:Maker Ⅲ，1：CmWRKY15-1，2.双酶切验证电泳图，3.菌液PCR；

图3为转CmWRKY15-1基因菊花的转化和再生过程；

图3中：转化叶盘分化出抗性芽1，抗性芽生根筛选2，抗性芽生根3，抗性芽长成抗性苗4；

图4为转CmWRKY15-1基因菊花特异引物检测电泳图；

图4中：M：DL2000Marker，阳：阳性质粒，WT：野生型植株，1~8：转CmWRKY15-1抗性株系；

图5为转基因及野生型植株中CmWRKY15-1基因的相对表达水平；

图5中：WT：野生型植株，W15-1-n：转CmWRKY15-1的株系；

图6为接菌处理后野生型及转基因植株中CmWRKY15-1基因的相对表达水平。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的说明，下列实时例中未注明具体条件的试验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

（1）菊花CmWRKY15-1的克隆

以白色锈病高抗品种‘双粉匙’（品种权号为CNA20080514.2）为材料，取叶片100mg，参照天根RNA提取试剂盒说明说的操作方法提取叶片的总RNA，采用Prime Script™ II 1stStrand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行反转录获得cDNA，根据转录组测序所得该基因序列信息，利用Primer 5.0软件设计特异性引物扩增CmWRKY15-1。

上游引物CmWRKY15-1-F：序列如SEQ ID NO.2所示：atggtggctg catcacat

下游引物CmWRKY15-1-R：序列如SEQ ID NO.3所示： ggaagaatca gtgctaatac attaa

以‘双粉匙’叶片的cDNA为模板，进行PCR反应，20ul反应体系：2×PCR Mix 10.0ul，CmWRKY15-1-F、CmWRKY15-1-R引物各1.0ul，cDNA模板2ul，ddH₂O6ul；反应程序：94℃预变性5min，94℃解链30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，反应35个循环，72℃延伸10min；PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2中1所示，片段大小为810bp，PCR产物用艾德莱公司凝胶回收试剂盒进行回收，即获得CmWRKY15-1基因序列，序列测定为SEQ ID NO.1：

atggtggctg catcacatgc cttagacctc aatcttaacc tcttccacat aactgatgat

gatacaccag ttgtggacgt tcattccagt tctgatgagg aggacagcga atgctcgttt

gcaaaagagc aggacaatga tcatatggtt ggggatttaa gtcggataag taaagaaaac

aagaagctaa aggaaatgct tacagtttta ttggacaatt ataccactct ccaaactcaa

gtgaagaaaa taattaaaga caaagaagta tccgagtcga gcccaaagaa acgaaaattt

gatgaaacgg ttcaacaaag cttgtggaaa aggctgaatg aagaaatacc aaagtccggt

attcaaagag tttacgtacc aacagatccg tccgataaaa gcttgatagt gaaggatgga

tatgaatgga gaaaatatgg gcaaaaggtt actagagata acccatctcc tagggcttac

tataagtgct ctttcgctcc aacatgccca gtcaaaaaga aggttcaaag aagtgtcgat

gatgcaggta ttgtagttgc aacctatgaa ggagagcata accacaaaag caggaaggaa

gaggtaacat atgctctagc taatgaatgt gatatttcaa ctagtgaaag aaggttcgac

tctcctaagg ttatgccaat ttgtgacgag gttttggttg aacaaatggc tacttattta

atcaaagact ctaaatttac ggaagaactt gctgctgcaa tgtattccaa gactttagaa

gctagtaatt ttttattcaa agtatgttaa

（2）植物表达载体的构建

根据CmWRKY15-1基因全长序列设计引物：上游引物CmWRKY15-1-2F:序列如SEQ IDNO.4所示：catttggaga gaacacgggg gactctagaa tggtggctgc atcac，下游引物CmWRKY15-1-2R:序列如SEQ ID NO.5所示：gtttgaacga tcggggaaat tcgagctctt aacatacttt gaata，以‘双粉匙’叶片cDNA作为模板，进行PCR反应：20ul反应体系：2×PCR Mix 10.0ul，CmWRKY15-1-2F、CmWRKY15-1-2R引物各1.0ul，cDNA模板2ul，ddH₂O6ul；反应程序：94℃预变性5min，94℃解链30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，反应35个循环，72℃延伸10min，在目的基因两端分别引入酶切位点Xba I和Sac I，PCR产物用艾德莱公司凝胶回收试剂盒进行回收，回收产物与pTOPO-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒pTOPO-T-CmWRKY15-1；

植物表达载体构建的过程如图1所示，具体实施措施如下：

用限制性内切酶Xba I 和Sac I分别对质粒PBI121和pTOPO-T-CmWRKY15-1进行双酶切，双酶切体系（50ul）：1×M Buffer 5ul，Xba I 2ul，Sac I 2ul，质粒或pTOPO-T-CmWRKY15-1 10ul，ddH₂O 31ul；37℃，过夜。双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，如图2所示，分别获得了线性载体和CmWRKY15-1目的片段，酶切产物用凝胶回收试剂盒进行回收。用T4DNA连接酶连接两个回收产物，连接反应体系（20ul）：ddH₂O 9ul ，10×T₄DNA LigaseBuffer 2ul，CmWRKY15片段4ul，PBI121载体片段4ul，T₄DNA Ligase1ul，16℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，提取质粒进行双酶切验证，PCR电泳检测结果如图2所示。植物表达载体构建成功，通过PBI121引入卡那霉素抗性基因。

（3）农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花

取1ugPBI121-CmWRKY15-1载体质粒加入100ul的EHA105感受态细胞混匀，依次于冰上静置10min、液氮5min、37℃5min、冰浴5min。加入700ul无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3小时。5000rpm离心1min收菌，留取100ul左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含抗生素（50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素）的LB固体培养基上，倒置防于28℃培养箱培养2-3d，挑去单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化菊花。

用YEP液体培养基培养阳性克隆农杆菌EHA105，即包含CmWRKY15-1基因的植物表达载体的EHA105；以切花菊‘神马’叶片为外植体，采用根癌农杆菌介导法将‘双粉匙’中克隆得到的CmWRKY15-1基因导入菊花。取‘神马’组培苗顶端叶盘（0.5cm×0.5cm）为转化受体，在预培养培养基中培养3d，然后浸入制备好的农杆菌菌液中侵染7min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养基上暗培养3d，然后转入延迟培养基中延迟培养3d，最后转入筛选培养基进行继代培养。如图3所示，在筛选培养7d后，转化的叶盘长出抗性芽，待抗性芽长至2-3cm时转入生根筛选培养基上进行生根筛选，初步获得抗性植株。

菊花组织培养基以MS培养基为基础，PH5.8，100KPa，121℃灭菌20min；

预培养培养基：MS+0.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA；

共培养培养基：MS+0.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA；

延迟培养基：MS+0.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+200mg/LTim；

筛选培养基：MS+0.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+ 200mg/LTim+20mg/LKan；生根培养基：MS+20mg/LKan。

（4）转CmWRKY15-1基因抗性植株进行分子检测

a. PCR检测

取生根筛选得到的卡那霉素抗性植株嫩叶及未转化植株嫩叶，提取基因组DNA，将NPTⅡ基因作为检测目标，根据NPTⅡ基因两段合成扩增反应引物，扩增出的片段长为676bp，引物序列为：

上游引物PBI121-NPTⅡ-F：序列如SEQ ID NO.6所示：gctatgactg ggcacaacag；

下游引物PBI121-NPTⅡ-R：序列如SEQ ID NO.7所示：ataccgtaaa gcacgaggaa；

分别以卡那霉素抗性植株和野生型植株DNA为模板，以PBI121-NPTⅡ-F和PBI121-NPTⅡ-R为引物，进行PCR检测。扩增体系为：2×PCR Mix 10.0ul，PBI121-NPTⅡ-F、PBI121-NPTⅡ-R引物各1.0ul，cDNA模板2ul，ddH₂O6ul；反应程序：94℃预变性3min，94℃解链30s，57℃退火40s，72℃延伸1min，反应35个循环，72℃延伸10min；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析（如图4）。

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。图4中可以看到，转基因植株均可扩增出片段大小为676bp的条带，与阳性对照扩增得到的特异条带相同，而野生型植株没有扩增出该条带。

b. 荧光定量RT-PCR检测

提取卡那霉素抗性植株叶片及野生型植株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量RT-PCR对CmWRKY15-1基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒说明书建立扩增体系，扩增条件为。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以野生型植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型植株基因相对表达情况。

特异引物扩增出的片段长为131bp为阳性结果，引物序列：

上游引物CmWRKY15-1-RT-F：序列如SEQ ID NO.8所示：tagggcttac tataagtgctctttcg；

下游引物CmWRKY15-1-RT-R：序列如SEQ ID NO.9所示：cttccttcct gcttttgtgg tt；

上游引物Actin-F：序列如SEQ ID NO.10所示：tccgttgccc tgaggttct，

下游引物Actin-R：序列如SEQ ID NO.11所示：gatttccttg ctcatcctgt ca；

根据荧光定量RT-PCR检测结果，与野生型相比，转CmWRKY15-1的植

株基因表达量有所提高。W15-1-2、W15-1-4株系表达量明显较高。证实内源基因已经转入菊花基因组DNA中并表达，如图5。

由PCR、荧光定量RT-PCR检测呈阳性，获得转基因植株。

（5）转基因植株后代的抗病性分析

选取生长健壮的野生型菊花（WT）和转基因菊花的扦插苗作为接菌处理材料，用手指涂抹法将白色锈病病原菌接种到第二到第五枚叶片上，分别于接菌0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、72h取叶片，于液氮中速冻，-80℃保存备用。参照上述步骤（2）中荧光定量检测方法，分析接菌之后野生型植株及转基因植株CmWRKY15-1基因相对表达量变化情况。

人工接种白色锈病病原菌，试验表明转基因菊花对白色锈病有明显的抗性。如图6所示，在接种病原菌后，野生型植株中CmWRKY15-1基因表达量于接种4h时有所提高，而转基因植株中CmWRKY15-1基因表达量于接种1-4h内明显升高，且在2h时达到最高，与对照植株相比，差异及其显著。由此可见，转基因植株具有显著的抗病性。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定及应用

<130> 18-0087

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 810

<212> DNA

<213> 菊花(Chrysanthemum morifolium)

<400> 1

atggtggctg catcacatgc cttagacctc aatcttaacc tcttccacat aactgatgat 60

gatacaccag ttgtggacgt tcattccagt tctgatgagg aggacagcga atgctcgttt 120

gcaaaagagc aggacaatga tcatatggtt ggggatttaa gtcggataag taaagaaaac 180

aagaagctaa aggaaatgct tacagtttta ttggacaatt ataccactct ccaaactcaa 240

gtgaagaaaa taattaaaga caaagaagta tccgagtcga gcccaaagaa acgaaaattt 300

gatgaaacgg ttcaacaaag cttgtggaaa aggctgaatg aagaaatacc aaagtccggt 360

attcaaagag tttacgtacc aacagatccg tccgataaaa gcttgatagt gaaggatgga 420

tatgaatgga gaaaatatgg gcaaaaggtt actagagata acccatctcc tagggcttac 480

tataagtgct ctttcgctcc aacatgccca gtcaaaaaga aggttcaaag aagtgtcgat 540

gatgcaggta ttgtagttgc aacctatgaa ggagagcata accacaaaag caggaaggaa 600

gaggtaacat atgctctagc taatgaatgt gatatttcaa ctagtgaaag aaggttcgac 660

tctcctaagg ttatgccaat ttgtgacgag gttttggttg aacaaatggc tacttattta 720

atcaaagact ctaaatttac ggaagaactt gctgctgcaa tgtattccaa gactttagaa 780

gctagtaatt ttttattcaa agtatgttaa 810

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtggctg catcacat 18

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaagaatca gtgctaatac attaa 25

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catttggaga gaacacgggg gactctagaa tggtggctgc atcac 45

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtttgaacga tcggggaaat tcgagctctt aacatacttt gaata 45

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctatgactg ggcacaacag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ataccgtaaa gcacgaggaa 20

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tagggcttac tataagtgct ctttcg 26

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttccttcct gcttttgtgg tt 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccgttgccc tgaggttct 19

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gatttccttg ctcatcctgt ca 22

Claims

1.一种重组载体，其特征在于：该重组载体包括序列如SEQ ID NO.1所示CmWRKY15-1基因，通过DNA连接酶将CmWRKY15-1基因连接到载体。

2.包括有权利要求1所述的转化细胞。

3.一种转CmWRKY15-1基因切花菊的培育方法，其特征在于：该方法以菊花白色锈病高抗品种‘双粉匙’为材料获得抗病基因CmWRKY15-1，通过酶切连接与植物表达载体PBI121质粒进行重组连接，通过农杆菌介导法将CmWRKY15-1基因导入菊花。

4.一种转CmWRKY15-1基因切花菊的培育方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

（1）菊花CmWRKY15-1基因的克隆

以抗病品种‘双粉匙’叶片为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据转录组测序所得到的序列信息设计特异引物：

上游引物CmWRKY15-1-F：序列如SEQ ID NO.2所示

下游引物CmWRKY15-1-R：序列如SEQ ID NO.3所示；获得CmWRKY15-1基因序列；

结合PCR扩增目的基因的全长序列，设计引物：

上游引物CmWRKY15-1-2F：序列如SEQ ID NO.4所示

下游引物CmWRKY15-1-2R：序列如SEQ ID NO.5所示；在CmWRKY15-1基因的上游和下游分别引入Xba I和Sac I酶切位点获得PCR产物；

（2）植物表达载体PBI121-CmWRKY15-1的构建

将步骤（1）获得的PCR产物连接到pTOPO-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；

用限制性内切酶Xba I和Sac I分别对提取的质粒及PBI121载体进行双酶切，PCR电泳检测回收酶切产物，然后用T4连接酶连接过夜，连接产物转化DH5α大肠杆菌，提取阳性质粒进行双酶切验证；

（3）农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花

将步骤（2）制备的阳性质粒PBI121-CmWRKY15-1转化农杆菌感受态EHA105，获得阳性克隆农杆菌，通过叶盘法转化菊花，将CmWRKY15-1基因转入菊花中，获得转CmWRKY15-1基因切花菊。

5.权利要求1所述的重组载体在培育抗白色锈病菊花上的应用。

6.权利要求2所述的转化细胞在培育抗白色锈病菊花上的应用。

7.权利要求3或4所述的转CmWRKY15-1基因切花菊的培育方法在抗白色锈病转基因菊花株系培育上的应用。

8.通过权利要求3或4所述的培育方法获得切花菊在抗白色锈病上的应用。

9.转CmWRKY15-1基因切花菊的鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法将转CmWRKY15-1基因初步获得的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系；

具体包括如下步骤：

（1）PCR检测

上游引物PBI121-NPTⅡ-F：序列如SEQ ID NO.6所示，

下游引物PBI121-NPTⅡ-R：序列如SEQ ID NO.7所示；

分别以卡那霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以PBI121-NPTⅡ-F和PBI121-NPTⅡ-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；

（2）荧光定量RT-PCR检测

提取抗卡那霉素植株叶片及野生型植株叶片总RNA，反转录合成cDNA第一链，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以野生型植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物

扩增出的片段长度为131bp阳性结果，引物序列：

上游引物CmWRKY15-1-RT-F：序列如SEQ ID NO.8所示，

下游引物CmWRKY15-1-RT-R：序列如SEQ ID NO.9所示；

上游引物Actin-F：序列如SEQ ID NO.10所示，

下游引物Actin-R：序列如SEQ ID NO.11所示；