CN104212787A - 一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用 - Google Patents

一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104212787A
CN104212787A CN201410441707.6A CN201410441707A CN104212787A CN 104212787 A CN104212787 A CN 104212787A CN 201410441707 A CN201410441707 A CN 201410441707A CN 104212787 A CN104212787 A CN 104212787A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhizome
leu
beta
gly
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410441707.6A
Other languages
English (en)
Inventor
黄璐琦
陈平
张绍鹏
杨涛
朱闻君
宋佳
孙巧
伍翀
郑用琏
邓琛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201410441707.6A priority Critical patent/CN104212787A/zh
Publication of CN104212787A publication Critical patent/CN104212787A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99039—Beta-amyrin synthase (5.4.99.39)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用，利用正向引物P1:5'ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3'；反向引物P2:5'TTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'，以竹节参cDNA文库为模板扩增，可获得竹节参β-香树素合酶基因，其序列为SEQIDNO.1所示。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，提高竹节参中齐墩果烷型皂苷的含量。

Description

一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及竹节参中β-香树素合酶(β-amyrin synthase)基因的克隆和应用，
背景技术
竹节参(Panax japonicus C.A.Mey)属于五加科人参属(Panax L.)植物是传统的名贵中药材之一，具有较高的药用价值，如增强人体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳以及保护心肌等作用，其主要有效成分为皂苷类化合物，其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主，同时含有少量达玛烷型四环三萜类皂苷。
竹节参是中国药典收载品种，具有广阔的应用前景和可观的经济价值,目前中国竹节参的野生资源近于濒危，人工栽培药材生长周期长，造成目前市场供不应求的现状。通过研究竹节参中活性成分三萜皂苷生物合成的途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调控，进一步实现三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。
β-香树素合酶(β-amyrin synthase，βAS)基因在三萜类皂苷的生物合成途径中起着重要的作用。βAS催化2，3-氧化角鲨烯生成β-香树素，β-香树素再经一系列生化反应生成齐墩果烷型皂苷。βAS被公认为是控制2，3-氧化角鲨烯流向齐墩果烷型皂苷合成途径的关键酶。
本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行竹节参全株的转录组测序及De novo拼接。分析找到竹节参中编码β-香树素合酶的候选基因并进行体外克隆表达，验证其功能，为竹节参齐墩果烷型皂苷化合物的生物合成提供理论基础。
在本发明被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的竹节参β-香树素合酶基因及其氨基酸序列，此基因编码的酶在竹节参中齐墩果烷型皂苷化合物的生物合成的过程中有重要的作用，本研究认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来调控竹节参中齐墩果烷型皂苷化合物生物合成的关键点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。该基因编码的酶是直接催化2，3-氧化角鲨烯行成β-香树素，而β-香树素为齐墩果烷型皂苷的前体，进而为人参属植物中齐墩果烷型皂苷含量的积累提供技术手段。
本发明的第二个目的是提供一种竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明的最后一个目的在于提供一种竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因在提高竹节参中齐墩果烷型皂苷含量的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，提高竹节参中齐墩果烷型皂苷的含量。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因(以下称为PJβAS基因)，其制备方法如下：
利用正向引物P1:5'ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3'；反向引物P2:5'TTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'，以竹节参cDNA文库为模板扩增，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，54℃退火1min，72℃延伸90s，40个循环后，72℃延伸10min。
最终获得了PJβAS基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。
一种竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因在提高竹节参中齐墩果烷型皂苷含量的应用，其应用过程如下：
将竹节参β-香树素合酶蛋白质(SEQ ID NO.2所示)对应的PJβAS基因(优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参，可获得高齐墩果烷型皂苷含量的的转基因植株。
本发明的所要保护的内容还包括：
编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
含有本发明的竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因全序列或其ORF序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围，包括但不限于pBI121，pCAMBIA1301。
含有本发明的竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因全序列或其ORF序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。包括但不限于烟草细胞大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、竹节参细胞或竹节参发根细胞。
本发明的竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因全序列或其ORF序列的转化获得转基因生物体，包括但不限于烟草、酵母、拟南芥、竹节参发根。
本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
利用本发明的竹节参β-香树素合酶(PJβAS)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与竹节参β-香树素合酶(PJβAS)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明所提供的竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因是首次从竹节参植物中克隆制备所得，利用本发明的技术可以对竹节参等含有同类化合物的药用植物进行基因工程改造，通过转基因来提高植物体内的齐墩果烷型皂苷化合物的含量。竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因可参与竹节参齐墩果烷型皂苷化合物的生物合成，因此本专利为竹节参齐墩果烷型皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。
本发明利用转基因技术得到了高含量齐墩果烷型皂苷类化合物的植株，为人参属植物中齐墩果烷型皂苷类活性成分的工业化生产提供了技术支撑。
附图说明
图1为竹节参总RNA电泳图。
图2为PJβAS功能域预测分析。
图3为PJβAS系统进化树。
图4为表达载体pYES2-PJβAS构建示意图。
图5为酶活力检测示意图。
具体实施方式
本发明所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明，均购自生物技术公司。
实施例1：
竹节参转录组测序及数据分析
1、样品采集
竹节参植株来源于湖北恩施，分别取根茎、叶、花、果实置液氮中速冻后，在-80℃冰箱中冷冻保存备用。
2、竹节参总RNA的分离和检测
对-80℃保存的各类样本于液氮中充分研磨，然后采用优化的Trizol法对样本进行总RNA的提取，全过程保证在低温条件下进行，加入一定浓度的PVP溶液(聚乙烯吡咯烷酮)，并适当加大β-巯基乙醇的浓度，离心去除PVP和β-巯基乙醇后，采用高浓度NaAc溶液析出RNA，DNase去除残留DNA完成RNA的纯化。用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性(图1),用Nanodrop2000核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度，RNA样本置于-80℃冰箱备用。
3、转录组测序(RNA-Seq)
用oligo(dT)的磁珠从总RNA中富集mRNA，接加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加poly(A)并连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小，PCR扩增构建测序文库，利用第二代Solexa HiSeq2000进行RNA测序，及De novo拼接。
4、候选基因初步筛选
通过GO注释，Blast比对分析以及MEGA5.0构建系统发育树(图3)等软件分析初步筛选到竹节参中编码β-香树素合酶的候选基因。
实施例2：
竹节参β-香树素合酶基因的克隆
利用正向引物P1:5'ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3'；反向引物P2:5'TTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'，以竹节参根茎cDNA文库为模板扩增，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，54℃退火1min，72℃延伸90s，40个循环后，72℃延伸10min克隆候选基因全长序列，链接到克隆载体pMD18-T上并转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α中，步骤如下：
a)从-80℃超低温冰箱中取100μL感受态细胞悬液，解冻后置于冰上；
b)加入5μL连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min；
c)42℃热激90s，迅速置冰上5min；
d)向EP管中加入1mL LB液体培养基(不含抗生素)，37℃200rpm45min；
e)摇菌后取100μL菌液涂布于含抗生素的平板上，37℃培养箱过夜；
f)挑取单菌落于4mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜选取阳性克隆送样测序。
至此获得了竹节参β-香树素合酶基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。
实施例3：
PJβAS基因的生物信息学分析
本发明涉及的竹节参β-香树素合酶(PJβAS)基因全长为2292bp，其序列为SEQ IDNO.1所示，其中开放读码框位于1～2292bp，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2所示。将拼接分析好的β-香树素合酶全长序列在NCBI数据库中进行Blast。该基因具有典型的ISOPREN_C2_like superfamily结构域，如图2。
实施例4：
PJβAS基因功能的研究
1、表达载体的构建
依据竹节参PJβAS基因全长序列(SEQ ID NO.1)的ORF，设计扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点KpnI和XhoI，利用正向引物P1：5'GGTACCATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA反向引物P2：5'CTCGAGTTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'进行PCR反应，进行琼脂糖凝胶电泳，30min后照相，观察胶图，扩增片段为2304bp，TA克隆，提取质粒。以KpnI和XhoI酶切扩增产物2h，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用KpnI和XhoI酶在37℃下酶切pYES2载体2h，进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用试剂盒回收大小约5856bp的片段。
二者经连接酶在16℃连接过夜。转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。PCR检测阳性菌斑，提取阳性克隆质粒，进行限制性内切酶酶切电泳鉴定，保存且有正确目标的重组质粒pYES2-PJβAS用于表达转化。该表达载体命名为pYES2-PJβAS(图4)。
2、蛋白的诱导表达
以pYES2-PJβAS质粒转化突变酵母宿主菌GIL77，在缺少尿嘧啶的完全合成培养基SC-U(20ug/ml麦角固醇，13ug/ml血红素，5mg/mlTween80)上30℃震荡培养2d，收集细胞在不含葡萄糖的SC-U培养基(20ug/ml麦角固醇，13ug/ml血红素，5mg/mlTween80，2％半乳糖)上30℃培养10h.收集细胞悬浮于0.1M，pH7.0的磷酸钾溶液中添加3％葡萄糖和血红素30℃培养24h。回收菌体，分离微粒体，纯化蛋白。
3、酶促反应鉴定
对表达纯化的β-香树素合酶进行酶活力的检测，加入2ug的纯化表达蛋白到反应体系0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)，2，3-环氧角鲨烯，1mM的DDT，1mg/ml的βAS，0.05％的Triton X-100。2，3-环氧角鲨烯作为反应底物，底物浓度越高产生的β-香树素含量越高。反应总体系在37℃下预孵20min。在100℃下加热3min终止反应，用氯仿提取反应产物。检测β-香树素的含量。如图5所示当添加的底物2，3-环氧角鲨烯浓度越高时产生的β-香树素含量越高，反应速率随着β-香树素合酶的减少而逐渐减少。
实施例5：PJβAS在竹节参中进行真核表达及转基因竹节参发根中总皂苷含量的测定
转基因用的受体材料采自湖北恩施。
含目的基因(竹节参β-香素树合酶基因)的表达载体的构建：根据竹节参β-香素树合酶基因的全长cDNA序列(SEQ ID NO.1)，在扩增编码区的正反方向引物上引入限制性内切酶位点(视选用的载体而定)，以便构建植物表达载体。
具体步骤如下：
以实施例2中获得的含有PJβAS基因编码区的pMD18-T Vector的质粒为模版，在上述构建的正向引物前引入BamH I酶切位点，在反向引物前引入Sac I酶切位点，正向引物P1：5'GGATCCATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3'；反向引物P2：5'GAGCTCT TAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'进行PCR扩增后，TA克隆，提取质粒。以BamH I和Sac I酶切扩增产物4h，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BamH I和Sac I酶在37℃下酶切pBI121载体4h，在16℃下利用T4连接酶连接产物过夜在保证阅读框正确的前提下将竹节参PJβAS基因的编码区克隆到植物表达载体pBI121上。将酶切鉴定好的表达载体pBI121PJβAS转入农杆菌中，遗传转化竹节参。
利用发根农杆菌介导的竹节参遗传转化技术，所需的材料和操作步骤如下：
1)发根农杆菌A4，使用前自冰箱中取出，用YEB培养基传代2次，菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28℃培养过夜。
2)取竹节参细嫩腋芽，洗净后置于70％酒精中浸泡1min，弃酒精，加入2％次氯酸钠消毒10min，期间摇动数次，弃去消毒液，用无菌水漂洗4～5次，置于无菌滤纸上晾干，用无菌刀片将竹节参腋芽切成5mm×5mm小片，置于预培养固体培养基上，在(23±1)℃暗箱培养箱中预培养2d。
3)经过夜培养的发根农杆菌A4菌液离心后，菌体沉淀用1/2MS重悬，置于4℃中2h后取出。将预培养过的竹节参腋芽浸泡于1/2MS重悬的菌液中5min，用无菌滤纸吸去多余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中，(23±1)℃黑暗条件下培养，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素的无激素1/2MS固体培养基中培养，每2周转移到新鲜培养基中至无菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素1/2MS培养基中培养。
4)把在固体培养基上的毛状根继代培养物接种于装有150ml无激素1/2MS液体培养基的500ml三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养20d后，将毛状根从培养基中取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存-80℃中备用。
阳性株利用常规real-time PCR进行进一步的筛选验证，本发明所用方法具体如下：
提取具有卡那霉素抗性的转化珠节参植株的总RNA，利用Takara反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，半定量所用引物为珠节参β-香树素合酶基因特异引物(正向引物5’-CACTGTCGGATGGTTTAT-3’；反向引物5’-CAAGGGACGGTGATGG-3’)，反应程序为94℃时3分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸45秒，25个循环；循环完成后72℃延伸5分钟。用植物beta-actin基因做为内参基因(正向引物5'-GGAAAAGATTTGGCATC-3'，反向引物5'-GGGCGTAACCCTCATA-3’)。对竹节参的野生型和转化系在相同生长状态下进行目的基因表达水平的分析。最终选择相对于野生型植株，基因表达量的Fold-change值高于4倍以上(P<0.01)的转化植株作为阳性株进行后续实验。
5)含竹节参β-香素树合酶基因的转基因发根的齐墩果烷型皂苷含量测定
根据2010版《中华人民共和国药典》，人参属植物中的皂苷都为三萜皂苷。
转基因竹节参发根中齐墩果烷型皂苷含量的检测可使用本领域的常规技术，本发明具体采用以下步骤：
参考袁丁等(华西药学杂志，2008，23(6)：692-694)的齐墩果烷型皂苷待测溶液处理方法及检测方法，利用高效液相色谱法对过表达竹节参PJβAS基因的转基因竹节参发根系和野生型对照组进行齐墩果烷型皂苷的含量测定，每组各测20株，标准品为齐墩果酸，购自中国药品生物制品检定所(批号：110709-200505)。
测定结果发现，在过表达竹节参PJβAS基因的转基因竹节参发根中齐墩果烷型皂苷含量比非转基因对照组平均提高了2.3倍(P<0.05)。由此证明，竹节参β-香素树合酶基因对促进齐墩果烷型化合物含量的提高有显著作用，竹节参β-香素树合酶基因可用于利用转基因技术提高齐墩果酸型皂苷含量的研究和产业化中，具有很好的应用前景。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  黄璐琦 陈平 张绍鹏 杨涛 朱闻君 宋佳 孙巧 伍翀 郑用琏  王如峰 邓琛 陈超
 
<120>  一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用
 
<130>  一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
<210>  1
<211>  2292
<212>  DNA
<213>  竹节参
 
<400>  1
atgtggaagc ttaagatagc ggaagggaat aagaatgacc cgtatttgta cagtaccaat     60
 
aattttgtag ggcggcaaac gtgggagttc gacccggatt atgtggctag tcccggagag    120
 
ctagaggagg tggaacaagg tcgacgtcag ttttggaata accggtatca gataaagcct    180
 
agtggtgatc tcctctggcg tatgcagttc ctaagagaga agaatttcaa acaaacaatc    240
 
cagcaagtga aggtaggaga tgacgaggca gttacttatg aggccgccac caccacactc    300
 
cgaagggccg tccacttttt ttcagctttg caggccagcg acggtcattg gcctgcagag    360
 
aatgccggac ctctcttttt ccttccgccc ttggtgatgt gtgtatacat tacagggcat    420
 
cttgatacag tgttcccagc agaacatcga aaagaaattc ttcgctacct atattgtcat    480
 
cagaatgaag atggcgggtg gggattccat attgaggggc atagcaccat gttctgcaca    540
 
actcttagct acatttgtat gcgtatactt ggagaagggc ccgatggtgg tgtaaacaat    600
 
gcatgtgcca gaggccgaaa atggatcctt gaccatggca gtgtaaccgc tataccttca    660
 
tggggcaaga cttggctttc gatactcggt gtatatgaat ggataggaag caacccaatg    720
 
cccccagaat tctggattct cccttctttc cttcctatgc acccagctaa aatgtggtgt    780
 
tattgccgga tggtttacat gccaatgtca tatttatatg ggaagaggtt tgttggtcca    840
 
atcactcctc ttattttaca attaagagaa gaactttatg ctcaacccta caatgaaatc    900
 
aattggagaa aaacacgtca tgtgtgtgcc aaggaggaca tctactatcc tcatccttta    960
 
atacaagacc tgctctggga tagtctctat gtattaactg aaccactttt aactcgttgg   1020
 
ccatttaaca agttgagaga gaaagctctg cagactacca tgaaacacat tcactatgaa   1080
 
gatgagaaca gtcgatatat taccattgga tgtgtggaaa aggttttgtg tatgcttgct   1140
 
tgttgggttg aggatccaaa tggagattat ttcaagaaac accttgcaag gatcccagat   1200
 
tatatatggg ttgctgaaga tggaatgaag atgcagagtt ttggtagtca ggaatgggat   1260
 
acaggtttcg gcattcaagc attgttggat agtgatctaa ctcatgaaat tggacctact   1320
 
ctaatgaaag gacacgactt catcaaaaag tcccaggtca aggataatcc ttctggtgac   1380
 
tttaaaagca tgtatcgtca catttcgaaa ggatcgtgga ctttttcaga tcaagatcac   1440
 
ggatggcaag tttctgattg cactgcagaa ggactaaagt gttgccttat tttatcaacg   1500
 
atgccagagg aaatagttgg caagaaaatg gaaccagaaa gactgtatga ttctgttaat   1560
 
gtgctacttt ctctacagag caaaaatggt ggcttatcag catgggagcc tgcaggagct   1620
 
caggaatggt tggagttact caatcctaca gaattctttg cagacattgt cattgagcac   1680
 
gagtatgtag agtgcacttc atcggcaatc caagctctgg ttctgtttaa aaagttatat   1740
 
cctggacacc gaaagaagga gatagataat tttattacga atgctgtccg ttaccttgaa   1800
 
gacatacaaa tgcctgatgg ttcatggtat ggaaactggg gtgtgtgctt tacttatggt   1860
 
agctggtttg ctcttggggg gctagcggct gctggaaaga cgtactacaa ttgtgcagct   1920
 
gttcgtaaag ctgttgaatt tctactcaaa tcacagatgg atgatggcgg ttggggagaa   1980
 
agctaccttt cttgtccgaa aaaggtatat gtaccattag aaggaaaccg ctcaaatttg   2040
 
gtacataccg gatgggcctt gatgggactc attcattctg agcaggctga gagagaccca   2100
 
acacctcttc accgtgcagc caagttattg atcaattctc agatggaaga tggtgatttt   2160
 
ccccaacagg aaataactgg agtttttatg aagaattgca tgttgcacta tgcagcttac   2220
 
cggaatatat acccattgtg ggctctagca gagtatcgga ggcgggtccc atcaccgtcc   2280
 
cttggcacct aa                                                       2292
 
 
<210>  2
<211>  763
<212>  PRT
<213>  竹节参
 
<400>  2
 
Met Trp Lys Leu Lys Ile Ala Glu Gly Asn Lys Asn Asp Pro Tyr Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Tyr Ser Thr Asn Asn Phe Val Gly Arg Gln Thr Trp Glu Phe Asp Pro
            20                  25                  30         
 
 
Asp Tyr Val Ala Ser Pro Gly Glu Leu Glu Glu Val Glu Gln Gly Arg
        35                  40                  45             
 
 
Arg Gln Phe Trp Asn Asn Arg Tyr Gln Ile Lys Pro Ser Gly Asp Leu
    50                  55                  60                 
 
 
Leu Trp Arg Met Gln Phe Leu Arg Glu Lys Asn Phe Lys Gln Thr Ile
65                  70                  75                  80 
 
 
Gln Gln Val Lys Val Gly Asp Asp Glu Ala Val Thr Tyr Glu Ala Ala
                85                  90                  95     
 
 
Thr Thr Thr Leu Arg Arg Ala Val His Phe Phe Ser Ala Leu Gln Ala
            100                 105                 110         
 
 
Ser Asp Gly His Trp Pro Ala Glu Asn Ala Gly Pro Leu Phe Phe Leu
        115                 120                 125            
 
 
Pro Pro Leu Val Met Cys Val Tyr Ile Thr Gly His Leu Asp Thr Val
    130                 135                 140                 
 
 
Phe Pro Ala Glu His Arg Lys Glu Ile Leu Arg Tyr Leu Tyr Cys His
145                 150                 155                 160
 
 
Gln Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Phe His Ile Glu Gly His Ser Thr
                165                 170                 175    
 
 
Met Phe Cys Thr Thr Leu Ser Tyr Ile Cys Met Arg Ile Leu Gly Glu
            180                 185                 190        
 
 
Gly Pro Asp Gly Gly Val Asn Asn Ala Cys Ala Arg Gly Arg Lys Trp
        195                 200                 205            
 
 
Ile Leu Asp His Gly Ser Val Thr Ala Ile Pro Ser Trp Gly Lys Thr
    210                 215                 220                
 
 
Trp Leu Ser Ile Leu Gly Val Tyr Glu Trp Ile Gly Ser Asn Pro Met
225                 230                 235                 240
 
 
Pro Pro Glu Phe Trp Ile Leu Pro Ser Phe Leu Pro Met His Pro Ala
                245                 250                 255    
 
 
Lys Met Trp Cys Tyr Cys Arg Met Val Tyr Met Pro Met Ser Tyr Leu
            260                 265                 270        
 
 
Tyr Gly Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Leu Ile Leu Gln Leu
        275                 280                 285            
 
 
Arg Glu Glu Leu Tyr Ala Gln Pro Tyr Asn Glu Ile Asn Trp Arg Lys
    290                 295                 300                
 
 
Thr Arg His Val Cys Ala Lys Glu Asp Ile Tyr Tyr Pro His Pro Leu
305                 310                 315                 320
 
 
Ile Gln Asp Leu Leu Trp Asp Ser Leu Tyr Val Leu Thr Glu Pro Leu
                325                 330                 335    
 
 
Leu Thr Arg Trp Pro Phe Asn Lys Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gln Thr
            340                 345                 350        
 
 
Thr Met Lys His Ile His Tyr Glu Asp Glu Asn Ser Arg Tyr Ile Thr
        355                 360                 365            
 
 
Ile Gly Cys Val Glu Lys Val Leu Cys Met Leu Ala Cys Trp Val Glu
    370                 375                 380                
 
 
Asp Pro Asn Gly Asp Tyr Phe Lys Lys His Leu Ala Arg Ile Pro Asp
385                 390                 395                 400
 
 
Tyr Ile Trp Val Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Ser Phe Gly Ser
                405                 410                 415    
 
 
Gln Glu Trp Asp Thr Gly Phe Gly Ile Gln Ala Leu Leu Asp Ser Asp
            420                 425                 430        
 
 
Leu Thr His Glu Ile Gly Pro Thr Leu Met Lys Gly His Asp Phe Ile
        435                 440                 445            
 
 
Lys Lys Ser Gln Val Lys Asp Asn Pro Ser Gly Asp Phe Lys Ser Met
    450                 455                 460                
 
 
Tyr Arg His Ile Ser Lys Gly Ser Trp Thr Phe Ser Asp Gln Asp His
465                 470                 475                 480
 
 
Gly Trp Gln Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly Leu Lys Cys Cys Leu
                485                 490                 495    
 
 
Ile Leu Ser Thr Met Pro Glu Glu Ile Val Gly Lys Lys Met Glu Pro
            500                 505                 510        
 
 
Glu Arg Leu Tyr Asp Ser Val Asn Val Leu Leu Ser Leu Gln Ser Lys
        515                 520                 525            
 
 
Asn Gly Gly Leu Ser Ala Trp Glu Pro Ala Gly Ala Gln Glu Trp Leu
    530                 535                 540                
 
 
Glu Leu Leu Asn Pro Thr Glu Phe Phe Ala Asp Ile Val Ile Glu His
545                 550                 555                 560
 
 
Glu Tyr Val Glu Cys Thr Ser Ser Ala Ile Gln Ala Leu Val Leu Phe
                565                 570                 575    
 
 
Lys Lys Leu Tyr Pro Gly His Arg Lys Lys Glu Ile Asp Asn Phe Ile
            580                 585                 590        
 
 
Thr Asn Ala Val Arg Tyr Leu Glu Asp Ile Gln Met Pro Asp Gly Ser
        595                 600                 605            
 
 
Trp Tyr Gly Asn Trp Gly Val Cys Phe Thr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala
    610                 615                 620                
 
 
Leu Gly Gly Leu Ala Ala Ala Gly Lys Thr Tyr Tyr Asn Cys Ala Ala
625                 630                 635                 640
 
 
Val Arg Lys Ala Val Glu Phe Leu Leu Lys Ser Gln Met Asp Asp Gly
                645                 650                 655    
 
 
Gly Trp Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Pro Lys Lys Val Tyr Val Pro
            660                 665                 670        
 
 
Leu Glu Gly Asn Arg Ser Asn Leu Val His Thr Gly Trp Ala Leu Met
        675                 680                 685            
 
 
Gly Leu Ile His Ser Glu Gln Ala Glu Arg Asp Pro Thr Pro Leu His
    690                 695                 700                
 
 
Arg Ala Ala Lys Leu Leu Ile Asn Ser Gln Met Glu Asp Gly Asp Phe
705                 710                 715                 720
 
 
Pro Gln Gln Glu Ile Thr Gly Val Phe Met Lys Asn Cys Met Leu His
                725                 730                 735    
 
 
Tyr Ala Ala Tyr Arg Asn Ile Tyr Pro Leu Trp Ala Leu Ala Glu Tyr
            740                 745                 750        
 
 
Arg Arg Arg Val Pro Ser Pro Ser Leu Gly Thr
        755                 760            
 
 

Claims (7)

1.一种分离的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。
4.含有权利要求2所述核苷酸序列的植物表达载体。
5.含有权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因的转基因植株。
6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高植物齐墩果烷型皂苷含量中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高竹节参齐墩果烷型皂苷含量中的应用。
CN201410441707.6A 2014-09-01 2014-09-01 一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用 Pending CN104212787A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410441707.6A CN104212787A (zh) 2014-09-01 2014-09-01 一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410441707.6A CN104212787A (zh) 2014-09-01 2014-09-01 一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104212787A true CN104212787A (zh) 2014-12-17

Family

ID=52094696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410441707.6A Pending CN104212787A (zh) 2014-09-01 2014-09-01 一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104212787A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866029A (zh) * 2018-08-08 2018-11-23 首都医科大学 雷公藤三萜合酶TwOSC3及其编码基因与应用
CN108866030A (zh) * 2018-08-08 2018-11-23 首都医科大学 雷公藤三萜合酶TwOSC1及其编码基因与应用
CN109295080A (zh) * 2018-09-19 2019-02-01 昆明理工大学 珠子参β-香树脂醇合成酶基因Pjβ-AS的用途
CN111647589A (zh) * 2020-06-08 2020-09-11 上海大学 大戟二烯醇合酶及其编码基因与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101796182A (zh) * 2007-06-25 2010-08-04 植物生物科学有限公司 涉及三萜合成的酶
CN103602691A (zh) * 2007-06-25 2014-02-26 植物生物科学有限公司 涉及三萜合成的酶

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101796182A (zh) * 2007-06-25 2010-08-04 植物生物科学有限公司 涉及三萜合成的酶
CN103602691A (zh) * 2007-06-25 2014-02-26 植物生物科学有限公司 涉及三萜合成的酶

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUSHIRO,T ET AL: "AB0090301 GI:3688599", 《GENBANK》 *
詹冬玲等: "人参β-香树素合成酶同源模建及高通量虚拟筛选抑制剂的研究", 《化学学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866029A (zh) * 2018-08-08 2018-11-23 首都医科大学 雷公藤三萜合酶TwOSC3及其编码基因与应用
CN108866030A (zh) * 2018-08-08 2018-11-23 首都医科大学 雷公藤三萜合酶TwOSC1及其编码基因与应用
CN108866029B (zh) * 2018-08-08 2019-06-04 首都医科大学 雷公藤三萜合酶TwOSC3及其编码基因与应用
WO2020029564A1 (zh) * 2018-08-08 2020-02-13 首都医科大学 雷公藤三萜合酶TwOSC1及其编码基因与应用
CN109295080A (zh) * 2018-09-19 2019-02-01 昆明理工大学 珠子参β-香树脂醇合成酶基因Pjβ-AS的用途
CN109295080B (zh) * 2018-09-19 2021-08-20 昆明理工大学 珠子参β-香树脂醇合成酶基因Pjβ-AS的用途
CN111647589A (zh) * 2020-06-08 2020-09-11 上海大学 大戟二烯醇合酶及其编码基因与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107012164A (zh) CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用
CN107709562A (zh) 指导rna/cas内切核酸酶系统
CN105695485A (zh) 一种用于丝状真菌Crispr-Cas系统的Cas9编码基因及其应用
CN101993482B (zh) 与水稻长粒卷叶相关的蛋白及其编码基因与应用
CN101115841A (zh) 用于增强植物干旱耐受性的核苷酸序列及其编码的多肽
CN111235169A (zh) 一种GTP环化水解酶I基因folE及应用
US20130312136A1 (en) Methods and Compositions for Modulating Gene Expression in Plants
CN104212787A (zh) 一种竹节参β-香树素合酶基因及其应用
WO2021254077A1 (zh) Shr-scr在豆科植物皮层细胞命运决定和改造非豆科植物皮层细胞分裂潜能中的应用
CN109609524A (zh) 一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用
CN107574178B (zh) 真菌人工染色体、组成、方法和用途
CN108753744A (zh) 倍半萜环化酶及其制备与应用、2Z,4E-α-芷香乙烷合成方法
CN111117942B (zh) 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用
CN104293758B (zh) 一种珠子参β‑香树素合酶基因及其应用
CN110818784B (zh) 水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用
CN104293755A (zh) 一种珠子参达玛烯二醇合成酶基因及其应用
Joäo et al. Long-term stability of root cultures of tomato transformed with Agrobacterium rhizogenes R1601
CN106749584A (zh) 一种与植物耐碱性相关蛋白GsERF71及其编码基因与应用
CN108384800B (zh) 转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定及应用
CN106520766B (zh) 一种海藻内源组成型启动子及其应用
CN114573669B (zh) 蛋白质Ghd7在调控植物抗低氮性中的应用
CN112646820B (zh) 改变玉米开花期的基因及方法
KR102358538B1 (ko) 유전자 총법을 이용한 미세조류의 교정 방법
CN104232597A (zh) 一种羽叶三七鲨烯环氧酶基因及其应用
KR20140043202A (ko) 감자 유래 건조 스트레스 저항성 유전자 및 이를 이용하여 제조한 건조 스트레스 저항성 형질전환체

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20141217

RJ01 Rejection of invention patent application after publication