CN104293758B

CN104293758B - 一种珠子参β‑香树素合酶基因及其应用

Info

Publication number: CN104293758B
Application number: CN201410474222.7A
Authority: CN
Inventors: 陈平; 张绍鹏; 陈燕; 杨涛; 朱闻君; 曾万勇; 霍梦蕊; 伍翀; 王如峰; 邓琛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-09-17
Filing date: 2014-09-17
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2034-09-17
Also published as: CN104293758A

Abstract

本发明公开了一种珠子参β‑香树素合酶基因及其应用，利用以珠子参cDNA为模板，利用P1：5'ATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG 3'；反向引物P2:5'TCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG 3'进行PCR反应，可获得珠子参β‑香树素合酶基因，将珠子参β‑香树素合酶（PBβAS）基因通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参，可获得高齐墩果烷型皂苷含量的转基因植株，为获得高皂苷含量的珠子参提供理论基础和应用实例，具有广大的应用前景。

Description

一种珠子参β-香树素合酶基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及珠子参中β-香树素合酶(β-amyrinsynthase)基因的克隆和应用，

背景技术

珠子参(Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Buck.)C.Y Wu et K.M.Fen g)是五加科人参属(Panax L.)植物竹节参的变种，也是传统的名贵中药材之一，主要分布在我国陕西、四川、湖北、云南等省。具有较高的药用价值，用于气阴两虚、烦热口渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节疼痛、咳血、吐血、外伤出血等。其主要有效成分是三萜皂苷，以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主。

珠子参是中国药典收载品种，具有广阔的应用前景和可观的经济价值,通过研究珠子参中活性成分五环三萜皂苷生物合成的途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对齐墩果烷型五环三萜皂苷生物合成进行人工调控，进一步实现齐墩果烷型五环三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。

β-香树素合酶(β-amyrin synthase，βAS)基因在三萜类皂苷的生物合成途径中起着重要的作用。βAS催化2，3-氧化角鲨烯生成β-香树素，β-香树素再经一系列生化反应生成齐墩果烷型皂苷。βAS被公认为是控制2，3-氧化角鲨烯流向齐墩果烷型皂苷合成途径的关键酶。

本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行珠子参全株的转录组测序及Denovo拼接。分析找到珠子参中编码β-香树素合酶的候选基因并进行体外克隆表达，验证其功能，为珠子参齐墩果烷型皂苷的生物合成提供理论基础。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的珠子参β-香树素合酶基因及其氨基酸序列，此基因编码的酶在珠子参中齐墩果烷型皂的生物合成的过程中有重要的作用，本研究认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来调控珠子参中齐墩果烷型皂苷化合物生物合成的关键点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因，其序列为SEQ IDNO.1所示。该基因编码的β-香树素合酶催化2，3-氧化角鲨烯生成β-香树素，在齐墩果烷型五环三萜皂苷合成途径中起关键性作用，可通过调节酶量提高齐墩果烷型皂苷合成量。

本发明的第二个目的是提供一种珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明的最后一个目的在于珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因在提高珠子参齐墩果烷型皂苷含量中的应用。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到珠子参中，可提高珠子参中齐墩果烷型皂苷的含量。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因(以下称为PBβAS基因)，其制备方法如下：

以珠子参cDNA为模板，利用正向引物P1：5'ATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3'；反向引物P2:5'TCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG 3'进行PCR反应。

反应条件：35个PCR反应循环，94℃变性1min，42℃退火2min，75℃延伸3min。最后75℃延伸10min。

最终获得了PBβAS基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

一种珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因在提高珠子参齐墩果烷型皂苷含量中的应用，其应用过程如下：

将珠子参β-香树素合酶蛋白质(SEQ ID NO.2所示)对应的PBβAS基因(优选SEQ IDNO.1所示核苷酸序列)通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参，可获得高齐墩果烷型皂苷含量的的转基因植株。

本发明的所要保护的内容还包括：编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

含有本发明的珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因全序列或其ORF序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围，包括但不限于pBI121，pCAMBIA1301。

含有本发明的珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因全序列或其ORF序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围，所述的宿主细胞包括但不限于酵母菌、大肠杆菌、珠子参。

本发明的珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因全序列或其ORF序列的转化获得转基因生物体，所述的转基因生物体包括但不限于烟草、酵母、拟南芥、珠子参发根。

本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

利用本发明的珠子参β-香树素合酶(PBβAS)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与珠子参β-香树素合酶(PBβAS)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明所提供的珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因是首次从珠子参植物中克隆制备所得，利用本发明的技术可以对珠子参等含有同类化合物的药用植物进行基因工程改造，通过转基因来提高植物体内的齐墩果烷型皂苷的含量。珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因可参与珠子参齐墩果烷型皂苷的生物合成，因此本专利为珠子参齐墩果烷型皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。

进一步添加其产业上积极的效果本发明利用转基因技术得到了齐墩果烷型皂苷含量增加的高产株，为齐墩果烷型皂苷的的工业化生产提供了技术支撑。

附图说明

图1为珠子参总RNA电泳图。

图2为PBβAS功能域预测分析。

图3为PBβAS系统进化树。

图4为表达载体pYES2-PBβAS构建示意图。

图5为酶活力检测示意图。

具体实施方式

本发明所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。

实施例1：

珠子参转录组测序及数据分析

1、样品采集

珠子参(Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Buck.)C.Y Wu et K.M.Fen g)植株来源于湖北恩施，分别取根茎、叶、花，果实置液氮中速冻后，在-80℃冰箱中冷冻保存备用。

2、珠子参总RNA的分离和检测

对-80℃保存的各类样本于液氮中充分研磨，然后采用优化的Trizol法对样本进行总RNA的提取，全过程保证在低温条件下进行，加入一定浓度的PVP溶液(聚乙烯吡咯烷酮)，并适当加大β-巯基乙醇的浓度，离心去除PVP和β-巯基乙醇后，采用高浓度NaAc溶液析出RNA，DNase去除残留DNA完成RNA的纯化。用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性(图1),用Nanodrop2000核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度，RNA样本置于-80℃冰箱备用。

3、转录组测序(RNA-Seq)

用oligo(dT)的磁珠从总RNA中富集mRNA，接加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cD NA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加poly(A)并连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小，PCR扩增构建测序文库，利用第二代Solexa HiSeq2000进行RNA测序，及De novo拼接。

4、候选基因初步筛选

通过GO注释，Blast比对分析以及MEGA5.0构建系统发育树(图3)等软件分析初步筛选到珠子参中编码β-香树素合酶的候选基因。

实施例2：

珠子参β-香树素合酶基因的克隆

分析候选基因读码框范围，以珠子参根茎cDNA文库为模板利用正向引物P1:5'ATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG 3'；反向引物P2:5'TCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG 3'克隆候选基因全长序列，链接到克隆载体pMD18-T上并转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α中，步骤如下：

a)从-80℃超低温冰箱中取100μL感受态细胞悬液，解冻后置于冰上；

b)加入5μL连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min；

c)42℃热激90s，迅速置冰上5min；

d)向EP管中加入1mL LB液体培养基(不含抗生素)，37℃200rpm 45min；

e)摇菌后取100μL菌液涂布于含抗生素的平板上，37℃培养箱过夜；

f)挑取单菌落于4mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜选取阳性克隆送样测序。

至此获得了珠子参β-香树素合酶基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。

实施例3：

PBβAS基因的生物信息学分析

本发明涉及的珠子参β-香树素合酶(PBβAS)基因全长为2280bp，其序列为SEQ IDNO.1所示，其中开放读码框位于1～2280bp，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2所示。将拼接分析好的β-香树素合酶全长序列在NCBI数据库中进行Blast。该基因具有典型的ISOP REN_C2_like superfamily结构域，如图2。

实施例4：

PBβAS基因功能的研究

1、表达载体的构建

依据珠子参βAS基因全长序列(SEQ ID NO.1)的ORF，设计扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点KpnI和XhoI，利用正向引物P1：5'GGTACCATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3'反向引物P2：5'CTCGAGTCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG3'进行PCR反应，进行琼脂糖凝胶电泳，30min后照相，观察胶图，扩增片段为2292bp，TA克隆，提取质粒。以KpnI和XhoI酶切扩增产物2h，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用KpnI和XhoI酶在37℃下酶切pYES2载体2h，进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用试剂盒回收大小约5856bp的片段。

二者经连接酶在16℃连接过夜。转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。PCR检测阳性菌斑，提取阳性克隆质粒，进行限制性内切酶酶切电泳鉴定，保存且有正确目标的重组质粒pYES2-PBβAS用于表达转化。该表达载体命名为pYES2-PBβAS(图4)。

2、蛋白的诱导表达

以pYES2-PBβAS质粒转化突变酵母宿主菌GIL77，在缺少尿嘧啶的完全合成培养基SC-U(20ug/ml麦角固醇，13ug/ml血红素，5mg/mlTween80)上30℃震荡培养2d，收集细胞在不含葡萄糖的SC-U培养基(20ug/ml麦角固醇，13ug/ml血红素，5mg/mlTween80，2％半乳糖)上30℃培养10h.收集细胞悬浮于0.1M，pH7.0的磷酸钾溶液中添加3％葡萄糖和血红素30℃培养24h。回收菌体，分离微粒体，纯化蛋白。

3、酶促反应鉴定

对表达纯化的β-香树素合酶进行酶活力的检测，加入2ug的纯化表达蛋白到反应体系0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)，2，3-环氧角鲨烯，1mM的DDT，1mg/ml的BAS，0.05％的Triton X-100。2，3-环氧角鲨烯作为反应底物，底物浓度越高产生的β-香树素含量越高。反应总体系在37℃下预孵20min。在100℃下加热3min终止反应，用氯仿提取反应产物。检测β-香树素的含量，当添加的底物2，3-环氧角鲨烯浓度越高时产生的β-香树素含量越高，反应速率随着β-香树素合酶的减少而逐渐减少，如图5。

实施例5：

珠子参β-香树素合酶在提高珠子参中齐墩果烷型皂苷含量中的应用，其步骤如下：

转基因用的受体材料珠子参(Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Buck.)C.YWu et K.M.Feng)采自湖北恩施。

根据珠子参β-香树素合酶基因的全长cDNA序列(SEQ ID NO.1)，在扩增编码区的正反方向引物上引入限制性内切酶位点(视选用的载体而定)，构建植物表达载体，通过农杆菌介导遗传转化转入珠子参，筛选转基因植株检测其齐墩果烷型皂苷的含量。

以实施例2中获得的含有PBβAS基因编码区(SEQ ID NO.1所示)的pMD18-T为模版，在上述构建的正向引物前引入BamH I酶切位点，在反向引物前引入Sac I酶切位点，正向引物P1：5'GGATCCATGTGGAAGCTTAAAATTGCAGAGG3'；反向引物P2：5'GAGCTCTCAGACGCTTTTAGATGGTAATCG3'进行PCR扩增后，TA克隆，提取质粒。以BamH I和Sac I酶切扩增产物4h，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BamH I和Sac I酶在37℃下酶切pBI121载体4h，，在16℃下利用T4连接酶连接产物过夜在保证阅读框正确的前提下将珠子参βAS基因的编码区克隆到植物表达载体pBI 121上，将酶切鉴定好的表达载体pBI121-βAS转入农杆菌中，遗传转化珠子参。

利用发根农杆菌介导的珠子参的遗传转化，所需的材料和操作步骤如下：

发根农杆菌A4，使用前自冰箱中取出，用YEB培养基传代2次，菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28℃培养过夜。

取珠子参细嫩叶片，洗净后置于70％酒精中浸泡1min，弃酒精，加入2％次氯酸钠消毒10min，期间摇动数次，弃去消毒液，用无菌水漂洗4～5次，置于无菌滤纸上晾干，用无菌刀片将珠子参叶片切成5mm×5mm小片，置于预培养固体培养基上，在(23±1)℃暗箱培养箱中预培养2d。

经过夜培养的发根农杆菌A4菌液离心后，菌体沉淀用1/2MS重悬，置于4℃中2h后取出。将预培养过的珠子参叶片浸泡于1/2MS重悬的菌液中5min，用无菌滤纸吸去多余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中，(23±1)℃黑暗条件下培养，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素的无激素1/2MS固体培养基中培养，每2周转移到新鲜培养基中至无菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素1/2MS培养基中培养。

把在固体培养基上的毛状根继代培养物接种于装有150ml无激素1/2MS液体培养基的500ml三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养25d后，将毛状根从培养基中取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存-80℃中备用。

阳性株筛选步骤如下：

提取具有卡那霉素抗性的转化珠子参植株的总RNA，利用Takara反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，半定量所用引物为珠子参珠子参β-香树素合酶基因特异引物(正向引物5’-CACTGTCGGATGGTTTAT-3’；反向引物5’-TAGCGAGGTGCTTCTTG-3’)，反应程序为94℃时3分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸45秒，25个循环；循环完成后72℃延伸5分钟。用植物beta-actin基因做为内参基因(正向引物5'-GGAAAAGATTTGGCATC-3'，反向引物5'-GGGCGTAACCCTCATA-3’)。对珠子参的野生型和转化系在相同生长状态下进行目的基因表达水平的分析。选择相对于野生型植株，基因表达量的Fold-change值高于4倍以上(P<0.01)的转化植株作为阳性株进行后续的目的物质的含量检测。

过表达珠子参β-香树素合酶基因的转基因珠子参发根的齐墩果烷型皂苷化合物含量测定：

根据2010版《中华人民共和国药典》，人参属植物中的皂苷都为三萜皂苷。

转基因珠子参发根中齐墩果烷型皂苷的检测可使用本领域的常规技术，本发明具体采用以下步骤：

发根系样品的前处理：用研钵将样品研磨成粉末，过4号筛，各取0.1g放入具塞锥形瓶中，加入5ml甲醇，称定重量，超声处理(250 W、50 kHz)40min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤；量取续滤液，回收溶剂至干，残渣加20ml 25％盐酸、25ml氯仿，加热水解1h，水解物用氯仿振摇提取(25ml×2)，合并提取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶液并转移至10ml量瓶中，加甲醇定容，过滤，续滤液即为样品溶液。

参考袁丁等(华西药学杂志，2008,23(6)：692-694)的高效液相色谱法，对过表达珠子参βAS基因的转基因发根系进行齐墩果烷型皂苷的含量测定，非转基因的野生型珠子参的发根系为对照组，每组各测20株。标准品为齐墩果酸，购自中国药品生物制品检定所(批号：110709-200505)。

测定结果发现，在过表达珠子参βAS基因的转基因珠子参发根中齐墩果烷型皂苷的平均含量比非转基因对照组平均含量提高了1.4倍(P<0.05)。由此证明，珠子参β-香树素合酶基因对促进珠子参齐墩果烷型皂苷化合物含量的提高有显著作用，珠子参β-香树素合酶基因可用于利用转基因技术提高齐墩果烷型皂苷含量的研究和产业化中，具有一定的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 陈平张绍鹏陈燕杨涛朱闻君曾万勇霍梦蕊伍翀王如峰

邓琛

<120> 一种珠子参β-香树素合酶基因及其应用

<130> 一种珠子参β-香树素合酶基因及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2280

<212> DNA

<213> 珠子参

<400> 1

atgtggaagc ttaaaattgc agagggagga aatccatggc ttcggagtct gaacgatcac 60

gtcggccggc aaacttggga gttcgatccc aaactcggat ctccggaaga gcttgcggag 120

atcgagaaag ctcgcgaaac ttttcgcaaa catcgtttcg agaaaaagca tagttccgat 180

ctcctcatgc gcattcagtt ttccaatgag aatcgaggca gtatactctt accacaagtt 240

aaagtaaaag atacagaaga tatttcagat gacaaagtaa cagttacgtt aaaaagagct 300

attaatttcc attcaactct tcaggcccat gatggacatt ggccaggaga ttatggtggt 360

cctatgtttc taatgcctgg tttggttatt acgctatcga taactggggc actgaatgca 420

gtcttatcca aagaacataa acgtgagatg tgccgttatc tttacaatca tcagaacaga 480

gatggtgggt ggggtttgca cattgagggt ccaagtacta tgtttggtac tgctttgaac 540

tatgttactt tgaggttgct tggcgaggga gctaatgatg gacaaggggc aatggaaaaa 600

gggcgtcaat ggattctgga tcatggtggt gctactgcaa tatcatcatg gggaaaaatg 660

tggctttcag ttcttggtgt atttgaatgg tccggaaata atcctctgcc cccagagata 720

tggctatttc catatatcct tccgttccac ccaggaagga tgtggtgtca ctgtcggatg 780

gtttatctgc ctatgtcata cttgtatggg aagaggtttg ttggtccaat cactcctctt 840

attttacaat taagagaaga actttatgct caaccctaca atgaaatcaa ttggagaaaa 900

acacgtcatg tgtgtgccaa ggaggacatc tactatcctc atcctttaat acaagacctg 960

ctctgggata gtctctatgt attaactgaa ccacttttaa ctcgttggcc atttaacaag 1020

ttgagagaga aagctctgca gactaccatg aaacacattc actacgaaga tgagaacagt 1080

cgatatatta ccattggaaa tgtggaaaag gttttgtgta tgcttgcttg ttgggttgag 1140

gatccaaatg gtgattactt caagaagcac ctcgctagga tcccagatta tatatgggtt 1200

gctgaagatg gaatgaaaat gcagagtttt ggcagtcaag agtgggatac tggttttgcc 1260

atacaagcat tgttggcgag tgatctcact gatgaaattc gtcctaccct tatgaaaggg 1320

catgacttca taaaaaagtc ccaggtcaag gagaaccctt ctggcgactt caaaagcatg 1380

catcgccaca tttctaaagg atcctggacc ttttcagatc aagatcatgg atggcaagtt 1440

tcggattgta ctgcagaagc tttgaagtgt tgcctactct tttcaaggat gccaacagaa 1500

attgttggtg ataaaatgga agacaaccaa ttgtttgatg ctgtcaatat actgctatcc 1560

ctacagagca aaaatggcgg cctagctgca tgggagcctg caggatcatc agaatggttg 1620

gagctgctca atcctacaga attctttgaa gacattgtca ttgaacatga gtatgtcgaa 1680

tgcacttcat cagcaattca ggctatggtt atgtttaaga agttataccc tgggcatagg 1740

aagaaagaga tagaagtttc aatcacaaat gctgtacagt accttgaaga catacaaaag 1800

cctgatggtt catggtacgg aaactggggt gtgtgcttca catatggtac ttggtttgct 1860

atgggaggtc taaccgcggc tggaaagaca tacaacaaca gccaaactct tcataaagca 1920

gtggattttc taataaaatc gcaacgcagt gatggtggtt ggggagaaag ctatctttct 1980

tgcccaaaca aggaatatac acctttagaa ggaaataggt caaatttggt acacacttca 2040

tgggccatga tgggtctgat tcattctggg caggccgaaa gagacccaac acctcttcat 2100

cgtgcagcca agttgttgat caattcccaa atggaaagtg gtgattttcc ccaacaggaa 2160

atcactggag ttttcatgaa gaactgcatg ttacactatg cagcgtatag aaacatatat 2220

ccgttgtggg ctttagcaga atatcgaaaa aatgttcgat taccatctaa aagcgtctga 2280

<210> 2

<211> 759

<212> PRT

<213> 珠子参

<400> 2

Met Trp Lys Leu Lys Ile Ala Glu Gly Gly Asn Pro Trp Leu Arg Ser

1 5 10 15

Leu Asn Asp His Val Gly Arg Gln Thr Trp Glu Phe Asp Pro Lys Leu

20 25 30

Gly Ser Pro Glu Glu Leu Ala Glu Ile Glu Lys Ala Arg Glu Thr Phe

35 40 45

Arg Lys His Arg Phe Glu Lys Lys His Ser Ser Asp Leu Leu Met Arg

50 55 60

Ile Gln Phe Ser Asn Glu Asn Arg Gly Ser Ile Leu Leu Pro Gln Val

65 70 75 80

Lys Val Lys Asp Thr Glu Asp Ile Ser Asp Asp Lys Val Thr Val Thr

85 90 95

Leu Lys Arg Ala Ile Asn Phe His Ser Thr Leu Gln Ala His Asp Gly

100 105 110

His Trp Pro Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Met Phe Leu Met Pro Gly Leu

115 120 125

Val Ile Thr Leu Ser Ile Thr Gly Ala Leu Asn Ala Val Leu Ser Lys

130 135 140

Glu His Lys Arg Glu Met Cys Arg Tyr Leu Tyr Asn His Gln Asn Arg

145 150 155 160

Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Glu Gly Pro Ser Thr Met Phe Gly

165 170 175

Thr Ala Leu Asn Tyr Val Thr Leu Arg Leu Leu Gly Glu Gly Ala Asn

180 185 190

Asp Gly Gln Gly Ala Met Glu Lys Gly Arg Gln Trp Ile Leu Asp His

195 200 205

Gly Gly Ala Thr Ala Ile Ser Ser Trp Gly Lys Met Trp Leu Ser Val

210 215 220

Leu Gly Val Phe Glu Trp Ser Gly Asn Asn Pro Leu Pro Pro Glu Ile

225 230 235 240

Trp Leu Phe Pro Tyr Ile Leu Pro Phe His Pro Gly Arg Met Trp Cys

245 250 255

His Cys Arg Met Val Tyr Leu Pro Met Ser Tyr Leu Tyr Gly Lys Arg

260 265 270

Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Leu Ile Leu Gln Leu Arg Glu Glu Leu

275 280 285

Tyr Ala Gln Pro Tyr Asn Glu Ile Asn Trp Arg Lys Thr Arg His Val

290 295 300

Cys Ala Lys Glu Asp Ile Tyr Tyr Pro His Pro Leu Ile Gln Asp Leu

305 310 315 320

Leu Trp Asp Ser Leu Tyr Val Leu Thr Glu Pro Leu Leu Thr Arg Trp

325 330 335

Pro Phe Asn Lys Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gln Thr Thr Met Lys His

340 345 350

Ile His Tyr Glu Asp Glu Asn Ser Arg Tyr Ile Thr Ile Gly Asn Val

355 360 365

Glu Lys Val Leu Cys Met Leu Ala Cys Trp Val Glu Asp Pro Asn Gly

370 375 380

Asp Tyr Phe Lys Lys His Leu Ala Arg Ile Pro Asp Tyr Ile Trp Val

385 390 395 400

Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Ser Phe Gly Ser Gln Glu Trp Asp

405 410 415

Thr Gly Phe Ala Ile Gln Ala Leu Leu Ala Ser Asp Leu Thr Asp Glu

420 425 430

Ile Arg Pro Thr Leu Met Lys Gly His Asp Phe Ile Lys Lys Ser Gln

435 440 445

Val Lys Glu Asn Pro Ser Gly Asp Phe Lys Ser Met His Arg His Ile

450 455 460

Ser Lys Gly Ser Trp Thr Phe Ser Asp Gln Asp His Gly Trp Gln Val

465 470 475 480

Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ala Leu Lys Cys Cys Leu Leu Phe Ser Arg

485 490 495

Met Pro Thr Glu Ile Val Gly Asp Lys Met Glu Asp Asn Gln Leu Phe

500 505 510

Asp Ala Val Asn Ile Leu Leu Ser Leu Gln Ser Lys Asn Gly Gly Leu

515 520 525

Ala Ala Trp Glu Pro Ala Gly Ser Ser Glu Trp Leu Glu Leu Leu Asn

530 535 540

Pro Thr Glu Phe Phe Glu Asp Ile Val Ile Glu His Glu Tyr Val Glu

545 550 555 560

Cys Thr Ser Ser Ala Ile Gln Ala Met Val Met Phe Lys Lys Leu Tyr

565 570 575

Pro Gly His Arg Lys Lys Glu Ile Glu Val Ser Ile Thr Asn Ala Val

580 585 590

Gln Tyr Leu Glu Asp Ile Gln Lys Pro Asp Gly Ser Trp Tyr Gly Asn

595 600 605

Trp Gly Val Cys Phe Thr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Met Gly Gly Leu

610 615 620

Thr Ala Ala Gly Lys Thr Tyr Asn Asn Ser Gln Thr Leu His Lys Ala

625 630 635 640

Val Asp Phe Leu Ile Lys Ser Gln Arg Ser Asp Gly Gly Trp Gly Glu

645 650 655

Ser Tyr Leu Ser Cys Pro Asn Lys Glu Tyr Thr Pro Leu Glu Gly Asn

660 665 670

Arg Ser Asn Leu Val His Thr Ser Trp Ala Met Met Gly Leu Ile His

675 680 685

Ser Gly Gln Ala Glu Arg Asp Pro Thr Pro Leu His Arg Ala Ala Lys

690 695 700

Leu Leu Ile Asn Ser Gln Met Glu Ser Gly Asp Phe Pro Gln Gln Glu

705 710 715 720

Ile Thr Gly Val Phe Met Lys Asn Cys Met Leu His Tyr Ala Ala Tyr

725 730 735

Arg Asn Ile Tyr Pro Leu Trp Ala Leu Ala Glu Tyr Arg Lys Asn Val

740 745 750

Arg Leu Pro Ser Lys Ser Val

755

Claims

1.珠子参β-香树素合酶基因及其对应的蛋白质在提高珠子参齐墩果烷型皂苷含量中的应用，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，对应的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。