KR20200098424A

KR20200098424A - 유전자 총법을 이용한 미세조류의 교정 방법

Info

Publication number: KR20200098424A
Application number: KR1020200016514A
Authority: KR
Inventors: 진언선; 장광석
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2019-02-11
Filing date: 2020-02-11
Publication date: 2020-08-20
Also published as: KR102358538B1; WO2020166943A1

Abstract

본 발명은 RGNE (RNA-guided engineered nuclease) RNP의 복합체를 유전자총법을 이용하여 미세조류의 유전자를 교정하는 방법에 관한 것으로 본 발명에 따른 유전자 교정 방법은 외래의 DNA 도입 없이 원하는 유전자를 정확하게 선택적으로 교정하는 RGNE RNP 방법을 테트라셀미스 속 미세조류에 적용할 수 있고, 이를 통해 개선된 지질 생산능을 갖는 테트라셀미스 변이체를 제공할 수 있다.

Description

유전자 총법을 이용한 미세조류의 교정 방법{METHOD FOR GENE EDITING IN MICROALGAE USING PARTICLE BOMBARDMENT}

본 발명은 유전자 총법을 이용한 미세조류의 교정 방법, 이에 따른 지질생산능이 개선된 미세조류 및 상기 미세조류를 이용해서 바이오에너지를 생산하는 방법에 관한 것이다.

미세조류(microalgae)는 이산화탄소와 물을 원료로 광합성을 하는 단세포 생물로서 고등식물보다 세포분열 및 성장의 주기가 매우 짧아(약 5-8시간) 건강보조식품, 항노화 성분, DHA, 화장품 원료 등의 유용한 고부가가치 산업용 소재로 이용되는 경제적 잠재력이 높은 생물자원이다. 그 중에서 클라미도모나스(Chlamydomonas reinhardtii)는 미세조류 연구에서 모델종으로서 가장 많이 연구가 되어 왔으며 게놈프로젝트가 완료되어 유전자 연구 및 조작에 용이하다. 학술적 연구뿐만 아니라 산업분야에서 활용하기 위한 다양한 연구가 진행 중이다.

한편, 크리스퍼 유전자 가위(RNA-guided engineered nuclease; RGEN)는 2013년 처음 개발된 이래, 지난 2년 여간 비약적으로 발전하여 인간세포는 물론, 가축, 곤충, 벼, 밀과 같은 식물세포, 병원균 등 다양한 종에 대하여 폭넓게 이용되고 있다. 이 방법은 박테리아가 외부 DNA의 침입을 막고자 형성한 크리스퍼 면역시스템을 유전자가위로 차용한 것이다. 즉, 특정 유전자의 염기서열을 찾아가는 염기서열 조각(크리스퍼 부분)을 제작해 절단 효소인 카스9(Cas9)와 짝을 이루게 하면, 짝을 이룬 크리스퍼 시스템은 표적이 되는 DNA 염기서열에 달라붙어 유전자의 특정 부위를 절단한다. 크리스퍼 유전자 가위는 현재까지 개발된 가위 중에 가장 제작이 용이하고 저렴할 뿐 아니라 정확성과 효율성도 높은 것으로 확인되었다. 그러나, 크리스퍼 유전자 가위를 세포에 도입하는데 있어 징크핑거뉴클레아제 (zinc finger nuclease; ZFN), 탈렌(transcription activator-like effector nuclease; TALEN), 크리스퍼 유전자 가위(RGEN)와 같은 유전자 가위를 DNA 플라스미드를 통하여 도입하여 형질 전환시키는 경우, 형질전환체를 만드는 과정에서 외부 DNA를 삽입하였기 때문에, GMO(Genetically Modified Organism)로 분류될 가능성이 높아 식품, 의료, 화장품 및 기타 산업분야에서 활용되는데 한계가 있다. 따라서, GMO 문제가 발생하지 않는 유전자 교정방법의 개발이 요구된다.

최근 크리스퍼 유전자 가위를 세포에 도입시 외부 DNA 삽입 없는(DNA-free) 가이드 RNA와 단백질 복합체(ribonucleoprotein, RNP)로 전달하는 방법이 개발되었다. 이는 획기적인 형질전환 방법이 될 수 있으나, 이러한 방법은 일부 미세조류에만 적용이 가능하다는 한계가 있고, 현재까지는 화학물질 처리를 통해서 세포벽이 약화된 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)나 규조류인 페오닥틸럼 트리코뉴튬(Phaeodactylum tricornutum)에서만 크리스퍼 유전자 가위를 이용한 형질전환 방법이 개발되었으나, 상기 두 종류의 미세조류 이외에 다양한 유용 미세조류를 대상으로 RGEN-RNP 기술을 동일한 방법으로 이용할 수 없다는 문제가 있다. 특히, 국내에서 발견되고, 다양한 산업에서 활용가치가 높은 테트라셀미스 속 미세조류에 적용가능한 크리스퍼 유전자 가위를 이용한 DNA Free에 의한 유전자 교정 방법은 아직 개발된바 없어, 테트라셀미스 속 미세조류에 적용가능한 유전자 교정방법에 대한 개발이 여전히 요구되고 있다.

상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질의 RGEN(RNA guided endonuclease) RNP(ribonucleoprotein)를 외부 DNA 도입 없이 미세조류로 전달하여 유전자를 교정하는 방법; 및 유전자가 교정된 미세조류 변이체를 제공하는 것이다.

특히, 본 발명은 테트라셀미스 속 미세조류에 대한 유전자 교정방법 및 상기 교정방법에 의하여 변이된 지질 생산능이 증가된 테트라셀미스 속 미세조류 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 지질 생산능이 증가된 테트라셀미스 속 미세조류 변이체를 이용해서 바이오에너지를 생산하는 방법 및 이의 배양물을 포함하는 바이오에너지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 테트라셀미스속 미세조류의 형질전환을 위해서, 유전자총법(bombardment)에 의한 RNP를 이용한 유전자 교정을 통해 타겟 유전자를 knock-out 시킨 돌연변이체의 제조 방법을 개발하고 본 발명을 완성하였다. 특히, 본 발명자들은 DNA-free RGEN RNP 복합체를 미세조류에 적용함에 있어, 금입자 전달 시스템을 통한 유전자총법을 이용하고자 해당 미세조류의 세포 수, 가이드 RNA 농도, 가이드 RNA 종류 수, Cas9 단백질의 농도, 반응 조건 등 최적화 조건을 확립하여 미세조류의 유전자 교정 방법을 개발하였다.

이러한 측면에서 본 발명은 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질의 RGEN(RNA guided endonuclease) RNP(ribonucleoprotein) 복합체를 유전자총을 이용하여 테트라셀미스 속 미세조류로 도입하는 것;을 포함하는 미세조류의 유전자 교정방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 교정방법에 의해 제조된 미세조류 변이체를 제공한다. 상기 변이체는 테트라셀미스 속(Tetraselmis sp.)의 AGP 유전자가 넉아웃된 세포 내 지질함량이 증가된 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 SEQ ID No.: 4로 표시되는 서열에서 99번째 내지 524번째에 상응하는 뉴클레오티드가 결실된 AGP 유전자 변이를 포함하는 테트라셀미스 속 변이체를 제공한다.

상기 변이체는 SEQ ID No: 5의 AGP 변이 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

상기 변이체는 기탁번호 KCTC 13787BP이고, 전분 생산능을 갖지않고, 야생형과 비교해서 개선된 지질 생산능을 갖는 테트라셀미스 TspAGP-M1 미세조류 일 수 있다.

상기 테트라셀미스 TspAGP-M1은 C16:0과 C18:1 지방산 생산능이 야생형 균주와 비교해서 개선된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 테트라셀미스 속 변이체를 배양하여 지질을 축적시키는 단계; 및 배양물로부터 축정된 지질을 단리시키는 단계를 포함하는 바이오에너지 생산방법을 제공한다.

본 발명의 바이오에너지 생산방법은 상기 단리된 지방산 성분을 화학적 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 변이체는 기탁번호 KCTC 13787BP이고, 전분 생산능을 갖지않고, 야생형과 비교해서 개선된 지질 생산능을 갖는 테트라셀미스 TspAGP-M1 미세조류일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 테트라셀미스 속 변이체의 배양물을 포함하는 바이오에너지 조성물을 포함할 수 있다. 상기 변이체는 기탁번호 KCTC 13787BP이고, 전분 생산능을 갖지않고, 야생형과 비교해서 개선된 지질 생산능을 갖는 테트라셀미스 TspAGP-M1 미세조류일 수 있다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 의도는 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질의 RGEN(RNA guided endonuclease) RNP(ribonucleoprotein) 복합체를 유전자총을 이용하여 미세조류에 도입하는 것을 포함하는 미세조류의 유전자 교정 방법 또는 유전자 녹아웃(knock out) 방법에 관한 것이다.

본 발명의 유전자 교정 방법은 가이드 RNA 및 Cas 단백질의 RGEN(RNA guided endonuclease) RNP(ribonucleoprotein) 복합체를 플라스미드 등의 DNA 운반체를 통하지 않고 직접 미세조류 세포 내에 유전자총(법)(particle bombardment 또는 particle gun)에 의하여 전달하는 것을 특징으로 한다. 상기 유전자총법에 의하여 미세조류 세포 내로 유전자를 직접 전달하여 미세조류의 유전자를 교정하는 것은 다른 용어로 유전자총법 형질전환(Biolistic transformation)으로도 표현될 수 있다.

본 명세서에서 "유전자 교정" 또는 "유전자 녹아웃(knock out)"은 타겟 유전자의 타겟 부위에서 일부 뉴클레오타이드의 결실, 치환, 중복 및/또는 삽입을 통해서 구조이동 돌연변이(frameshift mutation)를 유도하여 유전자가 정상적 기능을 하는 단백질을 생산하지 못하도록 하는 모든 유전자 조작을 의미한다.

본 명세서에서 유전자총(법)은 금 또는 텅스텐의 미세입자의 표면에 DNA를 응집(도마)시켜서 헬륨가스압(력) 등의 물리적인 힘을 이용해서 세포 내로 쏘아 넣어 세포에 DNA를 도입하는 방법을 의미한다. 유전자총에서 사용하는 유전자가 도말(응집)된 금속 미세입자는 크기에 비해서 무겁기 때문에 세포를 잘 뚫고 들어가는 장점이 있으나, 유전자의 표적부위로의 전달 및 성공 여부가 일정하지 않고, 삽입 유전자가 여러 번 삽입될 때 과발현될 수 있으며, 투과할 수 있는 조직의 두께가 한정되어 있고, 미세입자를 이용하기 때문에 세포 내 독성을 유발할 수 있다는 문제 때문에, 테트라셀미스 미세조류 내 유전자 도입에 적용하는 어려움이 있었다.

그러나, 본 발명은 크리스퍼 유전자 가위(RNA-guided engineered nuclease; RGEN) 기술과 함께 유전자 교정을 위해 유전자 총을 이용함으로써, 교정 또는 넉아웃을 원하는 타겟 위치에서 정확하게 유전자 교정이 일어나게 할 수 있고, 세포 독성 등을 유발하지 않는 최적의 조건을 확립하여, 본 발명을 완성하였다. 본 발명을 이용하는 경우, 종래 일부 미세조류에만 적용가능 했던 RGEN RNP 방법에 의한 유전자 교정을 테트라셀미스 속 미세조류에 적용할 수 있고, 이에 최적화된 유전자 교정방법을 제공할 수 있다는 점에서 의미가 있다.

본 명세서에서 "미세조류"는 이산화탄소와 물을 원료로 광합성을 하는 모든 단세포 생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 미세조류는 테트라셀미스 속(Tetraselmis sp.) 미세조류일 수 있다.

상기 테트라셀미스 속(Tetraselmis sp.) 미세조류는 테트라셀미스 아라크리스(Tetraselmis alacris), 테트라셀미스 아피쿨라타(Tetraselmis apiculata), 테트라셀미스 아스쿠스(Tetraselmis ascus), 테트라셀미스 아스티그마티카(Tetraselmis astigmatica), 테트라셀미스 추이(Tetraselmis chui), 테트라셀미스 콘볼루테(Tetraselmis convolutae), 테트라셀미스 코디포미스(Tetraselmis cordiformis), 테트라셀미스 데시카카르이(Tetraselmis desikacharyi), 테트라셀미스 그라실리스(Tetraselmis gracilis), 테트라셀미스 하제니(Tetraselmis hazeni), 테트라셀미스 임펠루시다(Tetraselmis impellucida), 테트라셀미스 인콘스피쿠아(Tetraselmis inconspicua), 테트라셀미스 레비스(Tetraselmis levis), 테트라셀미스 마쿨라테(Tetraselmis maculate), 테트라셀미스 마리나(Tetraselmis marina), 테트라셀미스 마이크로파필라타(Tetraselmis micropapillata), 테트라셀미스 루벤스(Tetraselmis rubens), 테트라셀미스 스트리아타(Tetraselmis striata), 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 테트라셀미스 테트라브라키아(Tetraselmis tetrabrachia), 테트라셀미스 테트라헬레(Tetraselmis tetrathele), 테트라셀미스 벨루코사(Tetraselmis verrucosa), 및 테트라셀미스 웨스트니(Tetraselmis wettsteinii)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구체예로서, 본 발명의 미세조류의 유전자 교정방법은 구체적으로 다음 단계를 포함하여 수행될 수 있다:

표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cas 단백질을 포함하는 반응 혼합물과 미세 금속입자를 혼합하여 리보핵산단백질(ribonucleoprotein, RNP)이 표면에 코딩된 미세 금속입자를 포함하는 RNP-전달용조성물을 준비하는 것;

상기 RNP-전달용조성물을 마크로-캐리어 디스크 상에서 건조시키는 것; 및

파열 디스크(rupture disk)에 500 psi 이상의 압력을 가하여 상기 RGEN RNP 복합체가 표면에 코팅된 미세 금속입자를 테트라셀미스 속 미세조류 세포로 발사하여 세포를 형질전환 하는 것.

상기 교정방법은 RGEN RNP 복합체가 표면에 코팅된 미세 금속입자가 전달된 세포를 2 내지 5일 동안 인큐베이션한 후 미세조류 세포들을 수확하는 것을 더 포함하여 수행될 수 있다. 상기 반응 혼합물은 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA(sgRNA), Cas 단백질 및 반응완충액을 포함할 수 있다. 또한, 상기 반응 혼합물은 증류수를 포함하는 물을 더 포함할 수 있다.

상기 반응 혼합물 10 μL에 대하여 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA(sgRNA) 1 내지 5 ug 와 Cas 단백질 1 내지 5 ug이 포함될 수 있다. 또한, 상기 반응 혼합물 10 μL에 대하여 반응완충액 0.5 내지 2 μL를 더 포함할 수 있다.

상기 반응버퍼는 Cas 뉴클레아제(Nuclease) 반응 시 사용될 수 있는 버퍼라면 모두 이용할 수 있고,

상기 반응완충액은 양쪽 이온성 완충제, 염화나트륨(NaCl), 및 염화마그네슘(MgCl₂)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 반응 완충액은 킬레이트제를 더 포함할 수 있고, 상기 킬레이트제는 일 예로 EDTA 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 반응완충액은 일 예로, 이온성 완충제로 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 10 내지 50 mM, 염화나트륨 50 내지 200 mM, 염화마그네슘 2.5 내지 10 mM 및 킬레이트제 0.1 내지 1 mM를 포함하거나; 40 내지 60 mM NaCl, 8 내지 12 mM Tris-HCl, 8 내지 12 mM MgCl₂ 및 80 내지 120 μg/mL BSA를 포함하거나; 80 내지 120 mM NaCl, 40 내지 600 mM Tris-HCl, 8 내지12 mM MgCl₂, 및 0.8 내지 1.2 mM DTT를 포함할 수 있다. 또한, 뉴클레아제 버퍼로서 상업적으로 판매되는 것을 이용할 수 있고, 본 발명의 일 구현예에서는 NEB(New England Biolabs)사의 Cas9 Nuclease buffer #M0386를 이용하였다.

본 발명의 반응완충액은 pH는 6.0 내지 8.0 일 수 있다.

상기 반응 혼합물은 전달용조성물에 포함되어, 유전자 총에 의해 세포 내로 전달될 수 있다. 본 발명에서 전달용조성물은 목적하는 세포 내로 전달되는 물질로서 표면에 리보핵산단백질이 코팅된 미세 금속입자를 포함하는 것으로, RNP-전달용조성물로도 지칭될 수 있다. 본 발명의 전달용조성물은 반응 혼합물과 미세 금속입자를 혼합하여 준비할 수 있다.

상기 전달용조성물은 가이드 RNA를 1종 이상 포함할 수 있고, 구체적으로 서로 다른 타겟팅 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 2종 이상 포함할 수 있다. 또는, 가이드 RNA를 1종만 포함하는 형태로 혼합조성물을 준비할 수 있고, 이 경우 서로 다른 타겟팅 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 각각 포함하는 혼합조성물을 1종 이상 준비할 수 있다. 이 경우 상기 인큐베이션은 각각의 혼합조성물에 대해서 수행될 수 있다. '1종의 가이드 RNA'를 포함하는 혼합조성물을 2종 이상 준비한 경우, RNP-전달용조성물을 준비하기 위해 미세입자와 혼합하는 단계에서 상기 '2종 이상의 혼합조성물'을 하나의 RNP-전달용조성물에 혼합시킬 수 있다.

구체적으로, 상기 RNP-전달용조성물은 제1 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 포함하는 제1 반응 혼합물;과 제2 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 포함하는 제2 반응 혼합물을 미세 금속입자와 혼합하여 2개 이상의 리보핵산단백질(RNP)가 코팅된 미세 금속입자를 포함하는 RNP-전달용조성물 일 수 있다. 이 경우, 2 개이상의 유전자를 표적하여 돌연변이를 유도할 수 있기 때문에, 유전자 넉아웃 돌연변이를 일으키는 확률을 더욱 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.

상기 반응 혼합물과 미세 금속입자는 1 내지 3 : 1의 부피비로 혼합될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 반응 혼합물 40uL에 대해 금 나노입자 20uL (1.2mg)을 혼합하여 RNP-전달용 조성물을 제조하여 사용하였다.

상기 미세 금속입자는 유전자 총법에서 사용될 수 있는 입자라면 그 성분에 관계없이 본 발명에 포함되어 사용될 수 있다.

상기 전달용조성물은 마크로-캐리어 상에 놓여서, 유전자 총으로 전달될 수 있는데, 이 경우 전달용조성물은 마크로-캐리어 상에 위치시키고, 건조시킨 형태로 유전자 총 발사를 수행할 수 있다.

상기 마크로-캐리어 디스크 상에 전달용조성물은 5 내지 20 μL 수준으로 놓을 수 있고, 상기 전달용조성물을 올린 마크로-캐리어 디스크는 1 내지 8장 준비할 수 있다. 상기 마크로-디스크를 건조하는 것은 자연건조 또는 인공건조를 모두 사용할 수 있고, 바람직하게는 공기건조(풍건, Air-dry) 방법을 이용할 수 있다.

상기 RNP-전달용조성물을 발사하는 단계는 1 내지 10회 반복수행하는 것을 포함할 수 있다.

테트라셀미스 속 미세조류의 경우, 상기 파열디스크 압력(rupture disk)은 500 psi 이상 일 수 있고, 보다 구체적으로는 1,000 내지 혹은 1,500 psi의 압력을 이용하여 유전자총을 수행할 수 있다. 바람직하게는 가장 바람직하게는 1100 내지 1500 psi로 수행할 수 있다. 유전자총 수행 시 압력이 상기한 범위보다 낮은 경우 유전자 전달 효율이 떨어지는 문제가 있고, 상기한 압력보다 높은 경우 테트라셀미스 미세조류 세포가 터져서 사멸하거나, 세포를 통과해서, 세포 내 도입율이 낮은 문제가 있다.

상기 발사 시, 정지스크린(stop screen)과 미세조류가 포함된 세포플레이트(cell plate)의 거리는 1cm 내지 20cm 일 수 있고, 일 실시예에 따라, 테트라셀미스 속 미세조류에 1100 내지 혹은 1,500 psi의 압력을 적용하는 경우 5 cm 내지 10 cm 또는 8 cm 내지 10 cm의 거리로 유전자총을 수행할 수 있다.

미세조류에 상기한 본 발명의 유전자총 수행 방법을 적용하는 경우, 종래 크리스퍼 유전자 가위에 의한 형질전환이 어려웠던 미세조류의 형질전환 성공률을 높일 수 있다.

본 발명의 미세조류 유전자 교정 방법은 상기 유전자 도입 전에 유전자 교정을 하고자 하는 미세조류를 포함하는 세포 플레이트를 준비하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 세포 플레이트는 지수기의 미세조류 세포를 원심 분리한 후, 신선한 액체 배지에서 농축하고, 준비된 상기 세포 농축물을 배지 플레이트 위에 도말한 후, 건조를 통해 액체배지를 증발시켜서 세포 접시를 제조하는 것 일 수 있다. 여기서 상기 세포 농축물은 배지 플레이트 위에 지름 2 내지 5cm 크기로 도말할 수 있다. 상기 세포는 1x10⁶ 내지 1x10⁸ 개 세포로 배지 플레이트에 도말될 수 있다.

본 발명에서 "배지"는 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연 배지, 합성 배지 또는 선택 배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 배지는 MBL배지 HS 배지 또는 TAP 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 않고 대상 미세조류에 따라 다르게 이용될 수 있다.

본 발명의 미세조류 유전자 교정 방법은 상기 유전자 도입 전에 유전자총법을 수행하기 미세 금속입자를 준비하는 것을 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 미세입자는 나노 또는 마이크로 사이즈의 입자일 수 있고, 금, 텅스텐 또는 그 외 금속 미세입자를 이용할 수 있다. 구체적으로 0.1 내지 1.0 μm, 또는 0.4 내지 0.8 μm의 입자를 이용할 수 있다. 상기 미세입자는 에탄올 및 물을 이용하여 세척하여 준비될 수 있다.

본 발명의 교정방법은 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA를 준비하는 것을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 "RNA 가이드 엔도뉴클레아제(RGEN)"는 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA와 복합체를 형성하며 RNA에 포함된 유전자 표적부위 타겟팅 서열을 절단하여 유전자 교정 작용을 하는 엔도뉴클레아제를 의미하는 것으로, 대표적으로 Cas9 단백질 (CRISPR associated protein 9) 등과 같은 타입 Ⅱ의 CRISPR/Cas 시스템에 수반되는 엔도뉴클레아제일 수 있다.

상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.), 예컨대, 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 것 (SwissProt Accession number Q99ZW2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예로 SEQ ID No: 31의 Cas9 단백질 또는 이와 80% 이상의 상동성을 갖는 Cas9 단백질을 포함하는 것 일 수 있다.

상기 Cas9 단백질은 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 진핵세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소 (예컨대, 핵위치신호(nuclear localization signal; NLS) 등)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 스트렙토코커스 피요게네스 유래의 Cas9 단백질을 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정에 사용하였고, 구체적으로 재조합 Cas9 단백질(Recombinant Cas9 protein; Cat No# TGEN_CP4)을 ㈜툴젠으로부터 구입하여 사용하였다.

일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기에 충분한, 표적 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열에서 '표적서열에 상보성을 갖는 부위의 서열'과 '그의 상응하는 표적 서열' 간의 상보성의 정도는 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적절한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 트랜스폼(Burrows-Wheeler Transform)에 기초한 알고리즘(예를 들어, 버로우즈 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign)(노보크라프트 테크놀로지즈(Novocraft Technologies), ELAND(일루미나(Illumina), 미국 캘리포니아주 샌디에고), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능) 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용가능)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 5개 뉴클레오티드 이상의 길이를 가지며, 보다 구체적으로는 5개 뉴클레오티드 내지 500개 뉴클레오티드의 길이 일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 10 내지 100개 뉴클레오티드 길이일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적절한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 예를 들어, CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터로의 트랜스펙션 후에, 차세대염기서열 분석 기술을 이용한 검정에 의한 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가에 의해서 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포로 제공될 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 시험되는 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하며, 당업자에게 떠오를 것이다. 가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 독특한 것들을 포함한다.

즉, 상기 가이드 RNA는 표적 서열에 따라 또는 복합체를 형성할 엔도뉴클레아제의 종류 및/또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA(crRNA), trans-activating crRNA(tracrRNA), 및 단일 가닥 가이드 RNA(sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 엔도뉴클레오타이드 종류에 따라서, CRISPR RNA(crRNA) 및 trans-activating crRNA(tracrRNA)의 이중가닥 복합체, 또는 단일 가닥 가이드 RNA(sgRNA)일 수 있다. 상기 sgRNA는 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함할 수 있다.

예컨대, Cas9 단백질을 포함하는 복합체(Cas9 시스템)은 목적하는 유전자 교정을 위하여 두 개의 가이드 RNA, 즉, 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 CRISPR RNA(crRNA)와 추가적인 trans-activating crRNA(tracrRNA)를 필요로 하며, 이들 crRNA와 tracrRNA는 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체 형태, 또는 링커를 통하여 연결되어 단일 가닥 가이드 RNA (single-stranded guide RNA; sgRNA) 형태로 사용될 수 있다.

상기 가이드 RNA의 구체적 서열은 Cas9 단백질의 종류(유래 미생물)에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있는 사항이다.

일 예에서, Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 포함한 Cas9 시스템에 사용되는 crRNA는 다음의 일반식 1로 표현될 수 있다:

5'-(N_cas9)_l-GUUUUAGAGCUA-(X_cas9)_m-3' (일반식 1)

상기 일반식 1에서,

N_cas9는 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 서열 부위로서 표적 유전자의 표적 부위에 따라서 결정되는 부위이며, l은 상기 타겟팅 서열 부위에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 18 내지 22의 정수, 예컨대 20일 수 있고;

상기 타겟팅 서열 부위의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 연속하는 12개의 뉴클레오타이드(GUUUUAGAGCUA)를 포함하는 부위는 crRNA의 필수적 부분이다.

또한, X_cas9는 crRNA의 3' 쪽에 위치하는(즉, 상기 crRNA의 필수적 부분의 3' 방향으로 인접하여 위치하는) m개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, m은 0 내지 12의 정수, 예컨대 0일 수 있다.

본 명세서에서, "표적서열에 상보성을 갖는 부위의 서열", 즉, 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열은 유전자 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다 (이하, 특별한 언급이 없는 한 동일한 의미로 사용된다).

일 예에서, 상기 X_cas9는 UGCUGUUUUG를 포함할 수 있으며, 생략될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 포함한 Cas9 시스템에 사용되는 tracrRNA는 다음의 일반식 2로 표현될 수 있다:

(일반식 2)

5'-(Y_cas9)_p-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-3'

상기 일반식 2에서,

60개의 뉴클레오타이드 (UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)를 포함하는 부위는 tracrRNA의 필수적 부분이고,

Y_cas9는 상기 tracrRNA의 필수적 부분의 5' 말단에 인접하여 위치하는 p개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, 생략될 수 있다. 즉, p는 0 내지 20의 정수, 예컨대 0 내지 5의 정수일 수 있으며, 상기 p개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.

또한, Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 포함한 Cas9 시스템에 사용되는 sgRNA는 상기 Cas9의 crRNA의 타겟팅 서열 부위와 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부위와 상기 Cas9의 tracrRNA의 필수적 부위를 포함하는 tracrRNA 부위가 뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조를 형성하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 sgRNA는 crRNA의 타겟팅 서열 부위와 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부위와 상기 Cas9의 tracrRNA의 필수적 부위를 포함하는 tracrRNA 부위가 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서 crRNA 부위의 3' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.

crRNA의 타겟팅 서열 부위와 필수적 부위 및 tracrRNA의 필수적 부위는 앞서 설명한 바와 같다. 상기 sgRNA에 포함되는 뉴클레오타이드 링커는 crRNA과 tracrRNA 상의 loop 부분을 의미하며, 3 내지 5개, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.

또한, Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 포함한 Cas9 시스템에 사용되는 gRNA는 다음의 일반식 3으로 표현될 수 있다:

(일반식 3)

5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3'

상기 일반식 3에서 N으로 표시된 연속하는 20개의 뉴클레오티드는 표적서열 타겟팅 부위(표적하는 유전자의 타겟팅하는 부위의 서열과 상보적인 서열)이다.

상기 gRNA 합성 시, 상기 일반식 3에서, N으로 표시되는 타겟팅 부위 앞에 프라이머 서열부위가 존재할 수 있다. 일 예로 본 발명에서는 T7 프라이머로 TAATACGACTCACTATAG 서열을 포함한 뉴클레오티드를 이용하였다.

상기 crRNA (예컨대, 일반식 1로 표현됨) 또는 sgRNA는 5' 말단 (즉, crRNA의 타겟팅 서열 부위의 5' 말단)에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.

상기 tracrRNA 또는 sgRNA는 tracrRNA의 필수적 부분(60nt)의 3' 말단에 5개 내지 7개의 우라실 (U)을 포함하는 종결부위를 추가로 포함할 수 있다.

일 예에서 상기 가이드 RNA는 "Kim, H. & Kim, J.-S. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014)"에 기재된 내용을 참조하여 준비할 수 있다.

다른 예는 미세조류의 특정 유전자의 교정(치환, 결실 및/또는 삽입)을 위한 가이드 RNA를 제공한다.

본 발명에서 표적 유전자는 내재적 유전자일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 상기 표적 유전자는 AGP(ADP glucose pyrophosphorylase), FTSY (Chloroplast SRP receptor), ZEP (Zeaxanthin epoxidase) 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 교정방법을 이용하는 경우, 형질전환을 목적하는 미세조류 내 타겟 유전자의 유전정보를 기초로 타겟부위를 설정하는 경우, 타겟부위 특이적으로 유전자 교정이 나타날 수 있게 할 수 있어, 미세조류 내에 포함된 유전자의 종류에 제한되지 않고 사용되리 수 있다.

상기 가이드 RNA는 앞서 설명한 바와 같은 crRNA와 tracrRNA의 이중가닥 복합체 또는 sgRNA일 수 있으며, 상기 이중가닥 복합체 또는 sgRNA에 포함된 crRNA는 교정하고자하는 유전자의 임의의 특정 부위와 혼성화 가능한 타겟팅 서열부위를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 유전자 총법에서 1x10⁶ 개의 테트라셀미스 세포에 대하여, 유전자총을 1회 분사하는 경우, 가이드 RNA 0.7 ~ 2 ㎍ 및 Cas 단백질 0.7 ~ 2 ㎍을 전달할 수 있다. 이 경우 테트라셀미스 세포가 망가지거나 전달이 잘 되지않는 문제점이 발생하지 않아, 형질전환 효율을 높일 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 다른 양태로, 상기 유전자 교정방법에 의해 제작된 유전자 교정 미세조류 변이체를 제공한다.

일 구현예에서, 상기 변이체는 AGP 유전자가 넉아웃된 테트라셀미스 속 미세조류일 수 있다. 상기 테트라셀미스 속 미세조류는 본 발명의 유전자 교정에 따라 AGP 유전자 넉아웃이 나타나 전분을 합성하지 않고, 미세조류 세포 내 지질 생성량이 우수한 특성을 갖는다. 상기 변이체는 SEQ ID No: 4의 AGP의 유전체 DNA에서 99번째 뉴클레오티드에서 524번째에 상응하는 뉴클레오티드 결실의 유전자 변이된 AGP 유전자를 포함하는 테트라셀미스 속 미세조류일 수 있다. 즉, 상기 SEQ ID No: 4의 AGP의 유전체는 AGP의 일부 서열을 나타내는 것이므로, 테트라셀미스 속 미세조류의 AGP 유전체 서열에서 SEQ ID No.: 4로 표시되는 서열에서 99번째 내지 524번째에 상응하는 뉴클레오티드의 결실은 본 발명의 변이에 포함되는 것이다.

상기 변이체는 SEQ ID No: 2의 AGP 유전자의 cDNA에서 301번째 내지 589번째에 상응하는 뉴클레오티드 결실의 유전자 변이된 AGP 유전자를 포함하는 것 일 수 있다. 상기 변이체는 SEQ ID No: 5의 cDNA 서열을 포함하는 AGP 유전자를 갖는 것 일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 테트라셀미스 속. KCTC12432BP를 원균주로하여, 본 발명의 유전자 교정방법에 따른 AGP 유전자 넉아웃을 수행하여 AGP 돌연변이체를 선발하였으며, 선발된 돌연변이체는 TspAGP-M1으로 명명하여, 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2019년 1월 10일자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 13787BP를 부여받았다.

본 발명의 테트라셀미스 TspAGP-M1 돌연변이는 AGP 유전자의 넉아웃으로 지질 생산능이 야생형 균주와 비교해서 높아진 특성을 갖는다.

본 발명의 일 실시예에 확인한 건조 중량 중 지질 함량이 야생형 균주와 비교해서 274% (w/w) 향상되었고, 배양액 1L당 지질 함량(지질 생산성)은 야생형 균주와 비교해서 225% 향상되었음을 확인하였다. 특히, 연료 성분 중 활용성이 높은 포화 지방산인 C16:0과 C18:1 함량이 현저히 증가하여, 바이오매스 생산을 위한 미세조류로서 그 활용성이 우수한 특성을 갖는다.

본 발명의 테트라셀미스 변이체 제조 방법에 의하는 경우, DNA 운반체를 사용하지 않고, 외부의 DNA 도입없이 형질전환이 가능하여 유전자 변형 유기체의 위험성이 없다는 이점이 있다. 특히, 목적하는 유전자의 특이적 변이를 통해서 유전자 변이확률을 더욱 높일 수 있으며, 본 발명의 유전자 총 조건은 테트라셀미스 세포의 형질전환에 최적화되어 있어, 그 효율을 더욱 높일 수 있다는 점에서 매우 의미가 있다. 특히, 본 발명의 Cas 단백질 가이드 RNA 복합체의 경우, 플라스미드 과발현에 의한 방법이 아닌 일시적으로 RNA가 존재하는 형태이므로, repair 등에 의해 형질전환 효율이 매우 낮아지는 문제가 있으나, 상기와 같이 서로 다른 타겟팅 서열을 표적화하는 가이드 RNA를 2종 이상 포함하여 유전자총법에 의한 형질전환을 수행하는 경우, 유전자의 2 이상의 부위에서 동시에 변이를 발생시키므로 유전자 변이를 일으키는 확률이 매우 높아지는 장점이 있다.

본 발명의 테트라셀미스 TspAGP-M1 돌연변이는 건조 중량 중 지질 함량이 야생형과 비교해서 매우 우수한 특성을 가지며, 특히, 연료 성분 중 활용성이 높은 포화 지방산인 C16:0과 C18:1 함량이 높다는 측면에서 바이오에너지 생산에 적합한 특성을 갖는다. 이러한 측면에서 본 발명은 기탁번호 KCTC 13787BP이고, 전분 생산능을 갖지않고, 야생형과 비교해서 개선된 지질 생산능을 갖는 테트라셀미스 TspAGP-M1 미세조류를 배양하여 지질을 축적시키는 단계; 및 배양물로부터 축정된 지질을 단리시키는 단계를 포함하는 바이오에너지 생산방법을 제공한다.

상기 테트라셀미스 TspAGP-M1 미세조류를 배양하는 단계는 앞서 기술한 배양배지 및 테트라셀미스가 생존가능한 배양배지에서 수행될 수 있고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 사용되는 배양기, 광원, 온도 및 시간 등을 포함하는 배양 조건을 이용해서 수행될 수 있다. 상기 배양은 테트라셀미스 TspAGP-M1 미세조류의 건조 중량 당 지질 함량이 20% 이상이 될 때까지 배양하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 테트라셀미스 TspAGP-M1 미세조류는 온도 18 내지 25℃, 백색형광원 40 내지 120 μmol photon m^-2s^-1 세기 조건에서, 14 내지 18시간 광조건, 7 내지 9시간 암조건으로 배양될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 지질을 단리시키는 단계는 세포를 용해하고 지질을 포함한 탄화수소를 추출하는 것으로 수행될 수 있다. 상기 세포의 용해는 열, 염기, 산성, 효소, 물리적 처리 (예를 들어 기계적 파괴, 초음파, 삼투처리), 용균 바이러스 또는 용균 유전자 발현에 의한 자가용해 등의 방법에 따라 수행될 수 있다.

상기 지질을 포함한 탄화수소를 추출하는 것은 세포로부터 분비된 탄화수소를 원심분리시켜 소수성 층의 탄화수소를 분리하거나, 세포 또는 세포 분획물을 프로테아제로 처리하여, 원심분리 전이나 후에 오염성 단백질을 분해시킬 수 있다.

본 발명의 바이오에너지 생산방법은 상기 단리된 지질을 화학적 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 지질은 상기 화학적 반응에 의해서 산업 및 생활에서 사용되는데 보다 적합한 연료로 가공될 수 있다. 상기 화학적 반응은 효소에 의한 가공 또는 열 및 기타 촉매에 의한 가공에 의하여 수행될 수 있다. 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합의 수를 감소시키고, 탄화수소 내의 고리형 구조를 제거하거나, 수소:탄소 비를 증가시키시도록 가공될 수 있다. 상기 화학적 반응은 바이오에너지로부터 자동차 또는 엔진의 사용에 적합한 연료를 생산하기 위해 사용되는 통상적인 방법을 이용해서 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13787BP이고, 전분 생산능을 갖지않고, 야생형과 비교해서 개선된 지질 생산능을 갖는 테트라셀미스 TspAGP-M1 미세조류의 배양물을 포함하는 바이오에너지 조성물을 포함할 수 있다.

상기 배양물은 본 발명 대상 미세조류를 배양한 것으로 배양 이후 미세조류를 제거한 형태, 배양물의 농축물, 건조물 또는 또는 분획에 의해서 목적하는 성분(예를 들어 지질, 탄화수소 성분)을 고함량으로 포함하는 분획물을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 테트라셀미스 TspAGP-M1 미세조류는 세포 건조중량 당 지질의 함량이 20% 이상으로 높고, 상기 지질 중 포화 지방산인 C16:0과 C18:1 함량이 특히 높아, 상기 조류의 배양물은 바이오 에너지 조성물로 우수한 효과를 갖는다.

상기 바이오 에너지는 본 발명 테트라셀미스 TspAGP-M1 미세조류로부터 생산된 지질을 포함하거나, 상기 지질의 가공된 성분을 에너지원으로 포함하는 가솔린 또는 디젤 조성물 일 수 있다.

본 발명에 따른 교정방법은 외래의 DNA 도입이 없이 크리스퍼 유전자 가위를 이용하여 원하는 유전자를 선택적으로 녹아웃시키는 것으로, RNP를 유전자총법을 이용하여 미세조류 세포 내로 도입시킴으로서, 외부 DNA의 도입 없이 원하는 유전자를 선택적으로 교정할 수 있다는 이점을 갖는다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 유전자총법에 의해 RNP가 도입된 테트라셀미스 속 미세조류의 AGP 유전자의 염기서열을 PCR로 분석한 결과를 보여준다. Wt는 야생형 테트라셀미스 속 미세조류를 나타내고, 1-1-1 내지 2-2-7 라인은 각각 본 발명의 일 실시예에 따라 형질전환된 테트라셀미스 속 미세조류를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 형질전환된 테트라셀미스 속 미세조류 중에서 선발된 돌연변이 개체(mutant, 도 1에서 2-1-6 라인의 개체)의 AGP 유전정보를 게놈수준에서 확인한 결과를 보여준다. Wt는 야생형 테트라셀미스 속 미세조류를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 선발된 AGP 돌연변이 테트라셀미스 속 미세조류(Mutant)와 야생형 테트라셀미스 속 미세조류(WT)의 전분합성능을 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 선발된 AGP 돌연변이 테트라셀미스 속 미세조류(AGP mutant)와 야생형 테트라셀미스 속 미세조류(WT)의 질소 결핍(ND)/또는 질소 충분(NS) 조건에서 세포내 지질 용적을 Nile-red 염색을 통해서 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 선발된 AGP 돌연변이 테트라셀미스 속 미세조류(AGP)와 야생형 테트라셀미스 속 미세조류(WT)의 세포내 지질 용적을 Bodipy 염색을 통해서 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 선발된 AGP 돌연변이 테트라셀미스 속 미세조류(AGP mutant)와 야생형 테트라셀미스 속 미세조류(WT)의 건조중량(DW) 당 지방산 총 함량 및 지방산 종류 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 선발된 AGP 돌연변이 테트라셀미스 속 미세조류(AGP mutant)와 야생형 테트라셀미스 속 미세조류(WT)의 건조중량(DW) 당 지방산 종류별 함량을 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 야생형 테트라셀미스속 미세조류의 AGP유전자의 cDNA 서열(SEQ ID No:1)을 나타낸다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에서 확인된 야생형 테트라셀미스속 미세조류의 AGP유전자의 전장 cDNA 서열(SEQ ID No:2)을 나타낸다.
도 10는 본 발명의 일 실시예에서 확인된 야생형 테트라셀미스속 미세조류의 AGP유전자의 단백질 서열(SEQ ID No:3)을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 분리된 테트라셀미스속 미세조류 돌연변이체 TspAGP-M1의 AGP유전자의 cDNA 서열(SEQ ID No:5)을 나타낸다. 그림에서 /는 RGEN RNP를 위한 두 개의 타겟 서열 사이에 야생형 AGP 서열과 비교해서 결실된 부위를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 분리된 테트라셀미스속 미세조류 돌연변이체 TspAGP-M1의 AGP유전자의 단백질 서열(SEQ ID No:6)을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 확인된 야생형 테트라셀미스 미세조류의 AGP 단백질 서열(SEQ ID No:3)과 클라미도모나스 레인하드티이의 AGP 단백질 서열(SEQ ID No:12)의 상동성을 비교한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 확인된 야생형 테트라셀미스 미세조류의 AGP 단백질 서열(SEQ ID No:3)과 테트라셀미스속 미세조류 돌연변이체 TspAGP-M1의 AGP유전자의 단백질 서열(SEQ ID No:6)을 비교한 결과이다.

이하, 본 발명의 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식이 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

실험예 1. Tetraselmis sp. 의 AGP 유전자 클로닝

형질전환용 타겟 유전자로 전분(starch) 합성 유전자의 주요 효소인 ADP glucose pyrophosphorylase(AGP) 유전자 확보하기 위해, 인하대학교 이철균 교수 연구실에서 기 확보한 유전 정보 콘티그(contig)들 중에서 TR24688_c0_g13의 homology 분석을 통해 AGP 유전자의 정보를 확인하고, cDNA와 genomic DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 AGP 유전자를 클로닝하였다.

#455 정방향 프라이머: 5'-CAGAAGCAGACGGTGAATGC-3' (SEQ ID No: 7)

#456 역방향 프라이머: 5'-TGCGCGCTTAAATGATGGTG-3' (SEQ ID No: 8)

#455 & #456 프라이머에 의한 AGP1의 cDNA 서열 (SEQ ID No: 1)

(개시코돈:ATG, 종결코돈: TAA, 밑줄 프라이머 #455, #456의 위치)

CAGAAGCAGACGGTGAATGCGGCCACCGTGGAGGAGATGGCCGCCTCCAGTGTGGCTGCCCCTCTACCTGATGGCACCGTGCCCGATATCAGCAAGACTGTGCTGGGAATCATCCTGGGCGGCGGCGCGGGCACCCGCCTGTACCCGCTGACCAAGAAGAGGGCCAAGCCCGCGGTGCCGCTGGGCGCCAACTACCGCCTGATCGACATCCCCGTGAGCAACTGCATCAACAGCGGCGTGAACAAGATCTACTGCCTCACGCAGTTCAACTCGGCCTCCCTGAACCGCCACCTCTCCCAGGCCTACAACTCGAACATCGGAGGCTACATGGACAAGGGCTTCGTGGAGGTGCTGGCCGCGCAGCAGAGCCCGAAGAACCCCAACTGGTTCCAGGGCACGGCCGACGCGGTGCGCCAGTACATGTGGCTGTTTGAGGAGGCGATGGCCAACGGCGTGGAGGACTTCCTCATCCTGTCGGGCGACCACCTGTACCGCATGGACTACCAGGAGTTTGTGGCCGCGCACCGCGCCGCGAAGGCCGCCATCACTGTCGCCGCGCTGCCCTGCGCCGAGAAGCAGGCCGAGGCGTTTGGCCTCATGAAGATCGATGACTCTGGCCGTATCGTCGAGTTTGCGGAGAAGCCCACCGGCGACGCGCTCAAGGCTATGCGCATCGACACCACCGTGCTCGGCCTCGACGCGGAGCGGGCGGCGGAGATGCCGTACCTGGCCTCGATGGGCATCTACGTGATGAAGGGCACGCTGCTGCGCGAGCTGCTGGACGACAACCCGGACGCGAACGACTTCGGCTCGGAGATCATCCCGTTTGCCAAGGACAAGGGATCCAAGGTGCAGGCGTTCCTGTTTGACGGCTACTGGGAGGACATCGGAACCATCGAGGCCTTTTACAGCGCCAACCTGGCCCTCACCGACCCCGACGCCCCCAAATTCAGCTTCTACGAGCGCGAGGCGCCCATCTACACCATGCCGCGCTTCTTGCCGCCCTCCAAGATGCTGGACGCGGACGTGGCCAACAGCATCATCGGCGACGGCTGCGTCGTGCGCGCCAACGCAAAGATCTCCCACTCCGTTGTGGGCGTGCGTGCGCTGATCTCTGAGAACACCGTCGTGGAGGACTCCATGATCATGGGCGCGGACTACTACGAGACCCTGGAGGAGTGCCAGCTGGTGCCGGGCTGCCTGCCCATGGGCATCGGCCCCAACACGATCGTGAAGAAGGCGATCATCGACAAGAATGCCCGCATCGGCGCCAACTGCCAGATTGTGAACAAGGACAACGTGATGGAGGCCAACGAGGAGGAGAAGGGCTACATCATCAAGGATGGCATCATTGTGGTGTGCAAGGACGCCATTATCCCCGACGGCACCATCATT TAA GCGCGC

이후, 완전한 cDNA 유전자를 확인하기 위해서, 5'와 3' RACE(rapid amplification cDNA end) PCR을 수행하였다. 이때, 5'-RACE 분석을 위해서 특이적 역방향 프라이며(#512, 5'-AGTAGATCTTGTTCACGCCGCT-3', SEQ ID No: 9)와 특이적 역방향 프라이머(#513, 5'-TCTTCTTGGTCAGCGGGTACAG-3', SEQ ID No: 10)를 이용하였다. 3'-RACE 분석을 위해서는 특이적 정방향 프라이머(#511, GGGAGGACATCGGAACCATC, SEQ ID No: 11)를 이용하였다. 각각의 RACE 분석 결과 테트라셀미스의 AGP cDNA의 전장 서열을 다음과 같이 확인하였다.

RACE 분석을 통한 AGP의 전장 cDNA 서열 (SEQ ID No: 2)

(개시코돈:ATG, 종결코돈: TAA, 밑줄-프라이머의 위치, 이탤릭-5'UTR- region 과 3'UTR-region, 음영- Cas9 표적서열)

gactctgcgcctctccacggtgctcacacgcgcacgtttcttcctcacgcatcagccgcgtcactgtagccagg ATGGCGACCGCCACCATAGCCCAGGCCCAGCTCGGCGCTCGCGCTAAGACCGCCGGCGTCGGCAGCGTGCGCAGCGTCCGCGGCGTGCGCGTCCCGCAGATCAGCCGCCCTCGTGCTGCCCGCGTCGCACAGAGGCATGTGGTCGCGTCGGCGCAGAAGCAGACGGTGAATGCGGCCACCGTGGAGGAGATGGCCGCCTCCAGTGTGGCTGCCCCTCTACCTGATGGCACCGTGCCCGATATCAGCAAGACTGTGCTGGGAATCATCCTGGGCGGCGGCGCGGGCACCCGCCTGTACCCGCTGACCAAGAAGAGGGCCAAGCCCGCGGTGCCGCTGGGCGCCAACTACCGCCTGATCGACATCCCCGTGAGCAACTGCATCAACAGCGGCGTGAACAAGATCTACTGCCTCACGCAGTTCAACTCGGCCTCCCTGAACCGCCACCTCTCCCAGGCCTACAACTCGAACATCGGAGGCTACATGGACAAGGGCTTCGTGGAGGTGCTGGCCGCGCAGCAGAGCCCGAAGAACCCCAACTGGTTCCAGGGCACGGCCGACGCGGTGCGCCAGTACATGTGGCTGTTTGAGGAGGCGATGGCCAACGGCGTGGAGGACTTCCTCATCCTGTCGGGCGACCACCTGTACCGCATGGACTACCAGGAGTTTGTGGCCGCGCACCGCGCCGCGAAGGCCGCCATCACTGTCGCCGCGCTGCCCTGCGCCGAGAAGCAGGCCGAGGCGTTTGGCCTCATGAAGATCGATGACTCTGGCCGTATCGTCGAGTTTGCGGAGAAGCCCACCGGCGACGCGCTCAAGGCTATGCGCATCGACACCACCGTGCTCGGCCTCGACGCGGAGCGGGCGGCGGAGATGCCGTACCTGGCCTCGATGGGCATCTACGTGATGAAGGGCACGCTGCTGCGCGAGCTGCTGGACGACAACCCGGACGCGAACGACTTCGGCTCGGAGATCATCCCGTTTGCCAAGGACAAGGGATCCAAGGTGCAGGCGTTCCTGTTTGACGGCTACTGGGAGGACATCGGAACCATCGAGGCCTTTTACAGCGCCAACCTGGCCCTCACCGACCCCGACGCCCCCAAATTCAGCTTCTACGAGCGCGAGGCGCCCATCTACACCATGCCGCGCTTCTTGCCGCCCTCCAAGATGCTGGACGCGGACGTGGCCAACAGCATCATCGGCGACGGCTGCGTCGTGCGCGCCAACGCAAAGATCTCCCACTCCGTTGTGGGCGTGCGTGCGCTGATCTCTGAGAACACCGTCGTGGAGGACTCTATGATCATGGGCGCGGACTACTACGAGACCCTGGAGGAGTGCCAGCTGGTGCCGGGCTGCCTGCCCATGGGCATCGGCCCCAACACGATCGTGAAGAAGGCGATCATCGACAAGAATGCCCGCATCGGCGCCAACTGCCAGATTGTGAACAAGGACAACGTGATGGAGGCCAACGAGGAGGAGAAGGGCTACATCATCAAGGATGGCATCATTGTGGTGTGCAAGGACGCCATTATCCCCGACGGCACCATCATTTAA gcgcgcccccatgcataccttcctatcccccctcccctcccctcccctcccctcgtcaatggaaatagcgccgatagttacagagttaccgtgtgacctagtggacctggtgggggtgtaatgaatcccctttttgcgtcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

상기한 완전한 cDNA 서열정보를 통해서 야생형 테트라셀미스의 AGP 단백질의 아미노산 서열을 다음과 같이 확인하였다.

야생형 AGP 단백질 서열 (SEQ ID No: 3)

MATATIAQAQLGARAKTAGVGSVRSVRGVRVPQISRPRAARVAQRHVVASAQKQTVNAATVEEMAASSVAAPLPDGTVPDISKTVLGIILGGGAGTRLYPLTKKRAKPAVPLGANYRLIDIPVSNCINSGVNKIYCLTQFNSASLNRHLSQAYNSNIGGYMDKGFVEVLAAQQSPKNPNWFQGTADAVRQYMWLFEEAMANGVEDFLILSGDHLYRMDYQEFVAAHRAAKAAITVAALPCAEKQAEAFGLMKIDDSGRIVEFAEKPTGDALKAMRIDTTVLGLDAERAAEMPYLASMGIYVMKGTLLRELLDDNPDANDFGSEIIPFAKDKGSKVQAFLFDGYWEDIGTIEAFYSANLALTDPDAPKFSFYEREAPIYTMPRFLPPSKMLDADVANSIIGDGCVVRANAKISHSVVGVRALISENTVVEDSMIMGADYYETLEECQLVPGCLPMGIGPNTIVKKAIIDKNARIGANCQIVNKDNVMEANEEEKGYIIKDGIIVVCKDAIIPDGTII

상기한 테트라셀미스의 AGP 단백질 아미노산 서열을 클라미도모나스 레인하드티이의 AGP 단백질 서열(Sequence ID: XP_001691854.1, SEQ ID No: 12)과 비교한 결과, 66%의 동일성(identity)과 79%의 상동성 (homology)을 가짐을 확인하였다.

상기 유전자 정보를 바탕으로 개시 코돈(start codon)이 위치한 5'- 쪽 게놈 DNA(genomic DNA) 염기서열을 #488 Forward primer(ACAGAGGCATGTGGTCGC)와 #490 Reverse primer(TTCTCCGCAAACTCGACGAT) 을 이용하여 genomic PCR로 분석한 결과, 다음과 같은 유전정보를 확인할 수 있었다.

AGP 유전자의 5'-말단 영역의 게놈 DNA 유전정보 (SEQ ID No: 4)

(볼드표시: intron; 일반: exon; 밑줄: 프라이머 위치)

ACAGAGGCATGTGGTCGCGTCGGCGCAGAAGCAGACGGTGAATGCGGCCACCGTGGAGGAGATGGCCGCCTCCAGTGTGGCTGCCCCTCTACCTGATGGCACCGTGCCCGATATCAGCAAGGTGCTGCTGCACCGCCTCGTGCTGCTCCCTGCCCCAATCACATCCTACCCGCCCAATGAGAGAGTCATCGCCTGCCAGCCGCTCACTGCTTTCTACCCCCATCCACCCCCCTCCTCCACCCTGCTGCCGCCTCGCAGACTGTGCTGGGAATCATCCTGGGCGGCGGCGCGGGCACCCGCCTGTACCCGCTGACCAAGAAGAGGGCCAAGCCCGCGGTGCCGCTGGGCGCCAACTACCGCCTGATCGACATCCCCGTGAGCAACTGCATCAACAGCGGCGTGAACAAGATCTACTGCCTCACGCAGTTCAACTCGGCCTCCCTGAACCGCCACCTCTCCCAGGCCTACAACTCGAACATCGGAGGCTACATGGACAAGGGCTTCGTGGAGGTGCTGGCCGCGCAGCAGAGCCCGAAGAACCCCAACTGGTTCCAGGGGACGGCCGACGCGGTGCGCCAGTACATGTGGCTGTTTGAGGAGGCGATGGCCAACGGCGTGGAGGACTTCCTCATCCTGTCGGGCGACCACCTGTACCGCATGGACTACCAGGAGTTTGTGGCCGCGCACCGCGCCGCGAAGGCCGCCATCACTGTCGCCGCGCTGCCCTGCGCCGAGAAGCAGGCCGAGGCGTTTGGCCTCATGAAGATCGATGACTCCGGCCGTATCGTCGAGTTTGCGGAGAA

실험예 2. gRNA의 타겟 부위 선정 및 sgRNA 합성

위의 AGP 유전자 정보에서 노랑색 바탕으로 표시된 두 군데의 염기서열을 대상으로 Cas9 target 유전자 서열을 확정하고 이 위치의 상보적 염기서열에 작용 가능한 sgRNA를 제작하였다. sgRNA 합성에 invitrogen사의 "GeneArt^TM Precision gRNA Synthesis Kit"에서 제공한 방법에 따라 타겟 sgRNA를 제작하였다.

Target #	RGEN Target (5'-3') (AGP 타겟팅 서열)	Position	Cleavage Positin (%)	방향	GC Contents (%, w/o PAM)	Out-of-frame Score
T1(SEQ ID No: 15)	ATATCGGGCACGGTGCCATCAGG	92	12.1	-	60.0	67.9
T2(SEQ ID No: 16)	TGGCCCTCTTCTTGGTCAGCGGG	306	38.8	-	60.0	74.4
T3(SEQ ID No: 17)	GTTCTTCGGGCTCTGCTGCGCGG	518	65.2	-	65.0	65.8
T4(SEQ ID No: 18)	CATGTACTGGCGCACCGCGTCGG	563	70.8	-	65.0	68.8

상기 표 1에서 전체 게놈에서 65보다 더 높은 프레임-외 스코어(Out-of-frame Score)를 가진 AGP 유전자의 코딩 서열 영역에서 4개의 sgRNA를 신중하게 디자인하였다. 'CDS(코딩 서열) 위치'는 유전체 DNA에서 절단 지점의 상대적인 위치를 의미한다. 방향(Direction)의 +는 타겟 서열과 동일한 방향, 즉 같은 시퀀스가 RGEN의 시퀀스이며, -는 타겟 서열과 역 방향, 즉 표적 서열(target sequence)과 결합되어 있는 서열인 서로 상보적인(reverse complement) 관계의 서열을 의미한다. '프레임-외 스코어(Out-of-frame Score)'는 깨진 이중-가닥 DNA가 미세 상동성-매개된 단부 연결(MMEJ) 경로에 의해 수선될 때 발생하는 프레임쉬프트-유도 결실의 가능성을 가리킨다. 이때 사용한 타겟 gRNA 제조용 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다.

Target	Primer	Seuecne (5'-3') (밑줄은 타겟팅 서열)
AGP target #1	T1-FW (SEQ ID No: 19)	TAATACGACTCACTATAGATATCGGGCACGGTGCC
AGP target #1	T1-RV (SEQ ID No: 20)	TTCTAGCTCTAAAACGATGGCACCGTGCCCGATAT
AGP target #2	T2-FW (SEQ ID No: 21)	TAATACGACTCACTATAGTGGCCCTCTTCTTGGTC
AGP target #2	T2-RV (SEQ ID No: 22)	TTCTAGCTCTAAAACGCTGACCAAGAAGAGGGCCA
AGP target #3	T3-FW (SEQ ID No: 23)	TAATACGACTCACTATAGGTTCTTCGGGCTCTGCT
AGP target #3	T3-RV (SEQ ID No: 24)	TTCTAGCTCTAAAACCGCAGCAGAGCCCGAAGAAC
AGP target #4	T4-FW (SEQ ID No: 25)	TAATACGACTCACTATAGCATGTACTGGCGCACCG
AGP target #4	T4-RV (SEQ ID No: 26)	TTCTAGCTCTAAAACACGCGGTGCGCCAGTACATG

위의 프라이머들을 사용하여 제조사가 제공한 방법에 따라 각각의 타겟(target) sgRNA를 PCR과 in vitro 전사(transcription), 정제(purification) 과정을 통해 10 μL의 핵산가수분해효소 없는 물(nuclease free water)에서 제조하였다. 이들 생성된 sgRNA의 함량은 A260nm에서 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 측정하였다. 최종 합성된 gRNA의 서열은 다음과 같다.

AGP UargeU #1 (SEQ ID No: 27)

AUAUCGGGCACGGUGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3'

AGP UargeU #2 (SEQ ID No: 28)

UGGCCCUCUUCUUGGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3'

AGP UargeU #3 (SEQ ID No: 29)

GUUCUUCGGGCUCUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3'

AGP UargeU #4 (SEQ ID No: 30)

CAUGUACUGGCGCACCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3'

또한, 형질전환체 제조에 사용될 Cas9 단백질은 ㈜툴젠에서 재조합 Cas9 단백질(Recombinant Cas9 protein; S.pyogenes, Cat No# TGEN_CP4)을 구입하여 사용하였다.

실험예 3. 유전자총법(Bombardment) 위한 금 나노입자(Gold nano particle)와 미세조류 세포 플레이트의 준비

형질전환에 사용될 야생형 균주로서, 테트라셀미스 속(Tetraselmis sp., 기탁번호: KCTC12432BP) 미세조류는 온도 20℃, 백색형광원 50~100 μmol photon m^-2s^-1 세기 조건에서 16시간 광조건 8시간 암조건으로 MBL 액체 배지에서 배양하였다. MBL 액체 배지의 구성은 표 3에 나타낸 바와 같다

Components	/L
NaCl	24.7 g
KCl	0.66 g
MgCl₂·6H₂O	8.48 g
CaCl₂·2H₂O	1.90 g
MgSO₄·7H₂O	6.318 g
NaHCO₃	0.18 g
NaNO₃	225 mg
NaH₂PO₄·H₂O	15 mg
Tris (pH 7.4)	1.214 g
Trace element solution of f/2 media	1 mL
Vitamin solution of f/2 media	1 mL

성장이 활발한 지수 단계(exponential stage)의 테트라셀미스 속(Tetraselmis sp.) 미세조류 세포를 2000 x g, 5분 조건에서 원심분리한 후, 신선한 MBL 액체 배지에 1x10⁷ cell/mL 되도록 농축하고, 준비된 미세조류 1 mL(1x10⁷ cell)를 MBL 아가(1.2%) 플레이트의 중심에 지름 3 cm정도 크기로 올려놓았다. 그리고 클린벤치(Clean bench)에서 액체 배지가 증발되어 없어질 때까지 말려서 보관 후, 유전자총법(bombardment)에 사용하였다. 금 입자(Gold particle)는 Bio-Rad사의 마이크로캐리어(Microcarrier), 금 0.6 μm(Cat #165-2262) 60mg을 100% EtOH(1mL)에서 2분간 볼텍싱하여 세척하고, 원심분리하여 분리한 후, DEPC-처리된 뉴클레아제 없는 증류수로 세척하였다. 이를 3번 반복 세척하여 최종 1 mL의 핵산가수분해효소 없는 증류수(RNAse-free DW)에 보관하여, 이후 시험에 사용하였다.

실험예 4. RNP에 의한 유전자총법 형질전환(biolistic delivery)에 의한 유전자 교정

RGEN(RNA-guided engineered nuclear) RNP(ribonucleoprotein)를 in vitro에서 제작하고, 다음 방법에 따라, 이를 유전자총법에 의한 세포내 전달(particle biolistic delivery)을 수행하였다.

a) 상기 시험예 3에서 제조한 sgRNA와 Cas9 단백질을 각각 핵산가수분해효소 없는 증류수(nuclease free DW)에 준비하였다

b) 4번의 유전자총(bombardment) 충격(shot)을 위해 다음과 표 4와 같은 믹스쳐(mixture)를 준비하였다

c) 각각의 믹스쳐들을 상온에서 30분 동안 인큐베이션 한다. 이 때, 두 가지의 sgRNA를 혼합하여 동시에 유전자 총을 수행하였다.

d) Mixture-1(10 μL)과 Mixture-2(10 μL)를 섞어 준 후, 상기 혼합물에 세척해 둔 금 입자 10 μL (금 입자 농도: 6mg/ml)를 넣어, 바로 파이펫팅(pipeting)으로 혼합하였다.

e) 클린 벤치(Clean benchtop)에서 미리 세척해 준비해 두었던 마크로 캐리어 디스크(macro-carrier disk, Bio-rad 사) 위에 상기 d)의 혼합물을 10 μL씩 올려 주었다. 동일한 방법으로 총 4장의 마크로 캐리어 디스크를 준비하였다. 그 후 건조 (Air-dry) 하였다.

f) 이 후, 입자 전달(particle bombardment) 4회 수행하였다. 이때, 파열판(rupture disk)의 압력은 900 psi, 1100 psi, 1350 psi, 또는 1550 psi disk를 각각 사용하였고, 정지스크린(stop screen)과 세포 플레이트(cell plate)와의 거리는 9cm에서 수행하였다.

Mixture-1	Mixture-2
Cas9 단백질 2 ug 반응버퍼 (x10) 1 μL sgRNA 타겟 #1 2ug 전체 10 μL까지 증류수 첨가	Cas9 단백질 2 ug, 반응버퍼 (x10) 1 μL sgRNA 타겟 #3 2ug 전체 10 μL까지 증류수 첨가

상기 표 4에서, Cas9 단백질은 2 μL증류수에 포함된 형태로 사용하였다. 이때 반응 버퍼 (x10) 의 조성은 다음과 같다. 본 실험에서는 NEB사의 버퍼(NEB Cas9 Nuclease buffer #M0386)를 사용하였다.

반응완충액 (X10)

200 mM HEPES1 M NaCl
50 mM MgCl₂
1 mM EDTA, pH 6.5

각각 RNP가 전달된 세포 플레이트를 3일간 20℃ 조건으로 인큐베이터에서 보관한 후, 각 미세조류 세포들을 MBL 액체 배지로 스프레딩(spreading)하여 수확하였다. 상기 수확된 세포들이 콜로니(colony)로 분리되어 자랄 수 있도록, 희석하여 새로운 MBL 아가 배지에 도말하고, 20℃에서 16시간 8시간 명암 주기로 배양하였다.

시험예 1. CRISPR-Cas9 RNP 방법을 이용한 Tetraselmis sp. 형질전환체 확인

상기 실험예 4에서 유전자총법에 의한 RNP가 도입된 테트라셀미스 속 미세조류 중에서, AGP 유전자가 넉아웃(knock-out)된 돌연변이체 선별하기 위해 우선 PCR 방법으로 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 타겟 부위를 확보하고 이들의 염기서열을 분석하여, 1종의 돌연변이체(도 1에서 2-1-6 line의 개체)를 선발하였고, TspAGP-M1이라 명명하였다.

상기 TspAGP-M1 돌연변이 균주는 한국생명공학연구원 생명자원센터(KCTC)에 2019년 1월 10일자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 13787BP를 부여받았다.

확인된 돌연변이체 2-1-6 line (TspAGP-M1) 의 AGP 유전자의 cDNA 서열 (SEQ ID No: 5)

(/: 야생형 AGP 유전자 서열에서 사용된 두 군데의 Cas9 표적 위치 사이의 핵산 서열이 제거된 위치)

ATGGCGACCGCCACCATAGCCCAGGCCCAGCTCGGCGCTCGCGCTAAGACCGCCGGCGTCGGCAGCGTGCGCAGCGTCCGCGGCGTGCGCGTCCCGCAGATCAGCCGCCCTCGTGCTGCCCGCGTCGCACAGAGGCATGTGGTCGCGTCGGCGCAGAAGCAGACGGTGAATGCGGCCACCGTGGAGGAGATGGCCGCCTCCAGTGTGGCTGCCCCTCTACCTGATG/AGCAGAGCCCGAAGAACCCCAACTGGTTCCAGGGCACGGCCGACGCGGTGCGCCAGTACATGTGGCTGTTTGAGGAGGCGATGGCCAACGGCGTGGAGGACTTCCTCATCCTGTCGGGCGACCACCTGTACCGCATGGACTACCAGGAGTTTGTGGCCGCGCACCGCGCCGCGAAGGCCGCCATCACTGTCGCCGCGCTGCCCTGCGCCGAGAAGCAGGCCGAGGCGTTTGGCCTCATGAAGATCGATGACTCTGGCCGTATCGTCGAGTTTGCGGAGAAGCCCACCGGCGACGCGCTCAAGGCTATGCGCATCGACACCACCGTGCTCGGCCTCGACGCGGAGCGGGCGGCGGAGATGCCGTACCTGGCCTCGATGGGCATCTACGTGATGAAGGGCACGCTGCTGCGCGAGCTGCTGGACGACAACCCGGACGCGAACGACTTCGGCTCGGAGATCATCCCGTTTGCCAAGGACAAGGGATCCAAGGTGCAGGCGTTCCTGTTTGACGGCTACTGGGAGGACATCGGAACCATCGAGGCCTTTTACAGCGCCAACCTGGCCCTCACCGACCCCGACGCCCCCAAATTCAGCTTCTACGAGCGCGAGGCGCCCATCTACACCATGCCGCGCTTCTTGCCGCCCTCCAAGATGCTGGACGCGGACGTGGCCAACAGCATCATCGGCGACGGCTGCGTCGTGCGCGCCAACGCAAAGATCTCCCACTCCGTTGTGGGCGTGCGTGCGCTGATCTCTGAGAACACCGTCGTGGAGGACTCTATGATCATGGGCGCGGACTACTACGAGACCCTGGAGGAGTGCCAGCTGGTGCCGGGCTGCCTGCCCATGGGCATCGGCCCCAACACGATCGTGAAGAAGGCGATCATCGACAAGAATGCCCGCATCGGCGCCAACTGCCAGATTGTGAACAAGGACAACGTGATGGAGGCCAACGAGGAGGAGAAGGGCTACATCATCAAGGATGGCATCATTGTGGTGTGCAAGGACGCCATTATCCCCGACGGCACCATCATTTAA

상기한 돌연변이체의 AGP 유전자 단백질 서열(420 아미노산)은 다음과 같다:

MATATIAQAQLGARAKTAGVGSVRSVRGVRVPQISRPRAARVAQRHVVASAQKQTVNAATVEEMAASSVAAPLPDEQSPKNPNWFQGTADAVRQYMWLFEEAMANGVEDFLILSGDHLYRMDYQEFVAAHRAAKAAITVAALPCAEKQAEAFGLMKIDDSGRIVEFAEKPTGDALKAMRIDTTVLGLDAERAAEMPYLASMGIYVMKGTLLRELLDDNPDANDFGSEIIPFAKDKGSKVQAFLFDGYWEDIGTIEAFYSANLALTDPDAPKFSFYEREAPIYTMPRFLPPSKMLDADVANSIIGDGCVVRANAKISHSVVGVRALISENTVVEDSMIMGADYYETLEECQLVPGCLPMGIGPNTIVKKAIIDKNARIGANCQIVNKDNVMEANEEEKGYIIKDGIIVVCKDAIIPDGTII

또한, 야생형 AGP 단백질과 돌연변이 테트라셀미스의 AGP 단백질을 비교 분석한 결과, 97개의 아미노산이 제거되었고, 1개의 신규 아미노산(E)이 생성됨을 확인하였다.

시험예 2. 선발된 AGP 돌연변이체의 특성 분석

선발된 AGP 돌연변이체의 특성 분석을 위해 스테이셔널 성장(stational growth) 단계에서 질소결핍 배지조건(N-deficient media, ND)을 유도한 후, 루골(lugol) 염색(staining)을 통해 전분의 합성유무와 나일-레드 염색(nile-red staining)을 이용해서 세포내 지질 용적(intracellular lipid droplet)의 생성 정도를 확인하였다.

구체적으로, 질소가 충분한 배지와 질소 고갈 배지에서 각각 세포를 배양하여 건강한 상태의 세포를 획득하였다. OD₇₅₀ = 1인 세포 배양액 1ml에 루골용액 1μl를 넣고, 30초 동안 세포를 균일하게 섞어준 후, 질소 조건에 따라 루골용액에 반응한 색깔을 비교하였다.

질소 고갈 조건에서 세포는 스트레스를 받아 세포 내에 전분과 지질을 축적하는데, 도 3에 나타낸 바와 같이, 야생형 균주의 경우 질소 고갈 조건에서 세포 내 전분이 루골 용액으로 염색되어 보라색을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 그러나, AGP 돌연변이체에서는 AGP 유전자의 녹아웃으로 인해 전분 합성이 저해되어, 질소 고갈 환경에서도 루골에 의한 변색반응이 일어나지 않았다. 따라서, 도 3에 나타낸 바와같이, 본 발명의 AGP 녹아웃 변이체에서 AGP 녹아웃이 잘 된 것을 확인할 수 있다.

또한, 또한 스테이셔널 성장기에 도달한 대조구와 돌연변이체를 질소 성분이 첨가된 정상배지(Nitrogen sufficient media, NS)와 질소 결핍 배지(ND)에서 3일간 배양한 후, 나일 레드 염색(nile red staining)을 수행하고, 형광값을 측정하여 세포 내 지질 용적(intracellular lipid droplet)을 확인하였다.

도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 돌연변이체는 NS와 ND 조건 모두에서 대조구에 비해 강한 형광을 나타냄을 확인하였고, 특히 질소결핍 조건(ND)에서 보다 강력한 형광값을 확인할 수 있었다. 따라서 제작된 AGP 돌연변이체는 전분의 합성이 저해됨으로서 지질 함량의 증가를 촉진할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 3. 선발된 AGP 돌연변이체의 지질성분 함량과 성분 분석

플라스크 배양 조건에서 성장한 테트라셀미스 속. 세포들을 스테이셔너리 성장 단계에서 질소 결핍 배지 조건(N-deficient media, ND)으로 변경한 3일 후, 지질 성분의 함량과 성분 분석을 FAME 분석 방법을 수행하였다(Kim Z-Hun, Park Yong-Sung, Ryu Young-Jin, Lee Choul-Gyun. 2017 Enhancing biomass and fatty acid productivity of Tetraselmis sp. in bubble column photobioreactors by modifying light quality using light filters. Biotechnology and Bioprocess Engineering 22:397-404.).

분석 결과, AGP 돌연변이체는 지질 함량이 건조중량 중 21.05%로 대조구 대비 274%로 증가하였다.

	야생형	AGP 돌연변이체
지방산 함량(w/w%)	7.68 (100%)	21.05 (274%)

상기 분석된 지질함량의 변화 중에서 FAME 분석을 통해 성분 분석을 확인한 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, AGP 돌연변이체에서 지방산 함량이 더욱 높았고, 특히, 연료 성분 중 활용성이 높은 포화 지방산인 C16:0과 C18:1 함량이 현저히 증가하였다. 돌연변이체에서 야생형 보다 이 두 종류의 지방산의 농도의 급격한 증가와 총 지질 생산성의 증가는 바이오연료 생산성에 매우 중요한 의미를 갖는다고 할 수 있다.

시험예 4. AGP 돌연변이체의 지질성분 함량과 성분 분석

BC-PBR(Bubble column photobioreactor) 배양 방법으로 2L 컬럼에서 배양한 테트라셀미스속 대조구와 돌연변이체 세포들을 스테이셔너리 성장 단계에서 질소 결핍 배지조건 (N-deficient media, ND)으로 변경한 3일 후, 지질 성분의 함량과 성분 분석을 FAME 분석 방법을 수행하였다. 지질 성분의 함량을 세포 건조중량 당 지방산 함량(content)를 mg/g DCW(건조중량)으로 그리고 배양 부피당 지방산 농도(concentration)를 mg/L(배양배지 부피)으로 조사하였다.

야생형 테트라셀미스 속 미세조류와 본 발명 TspASP-M1 미세조류의 총 지방산 함량 및 조성은 3일 간 질소 기아 상태에서 측정되었다. 지방산의 총 함량은 건조 세포 중량 (DCW)을 기준으로 계산되었다. 값은 각 균주의 3 가지 생물학적 복제물의 평균 ± 표준 편차를 나타내며, 통계적으로 유의미한 차이는 스튜던트 t- 테스트 (* p <0.001)에 의해 결정되었다.

	*Tetraselmis* sp.
	Wild Type		TspAGP-M1
지방산 성분	mg/g DCW (% to total FAs)
C16:0	19.31 ± 0.98	(25.14)	51.23 ± 5.89^*	(24.33)
C16:1	2.52 ± 0.56	(3.28)	11.45 ± 0.54^*	(5.44)
C16:3	0		2.83 ± 0.11^*	(1.34)
C16:4	8.77 ± 1.99	(11.42)	19.42 ± 2.80^*	(9.22)
C18:0	4.99 ± 0.55	(6.50)	5.72 ± 0.40	(2.72)
C18:1	11.09 ± 1.35	(14.44)	60.68 ± 4.31^*	(28.82)
C18:2	5.85 ± 1.08	(7.62)	13.22 ± 1.07	(6.28)
C18:3	9.88 ± 2.12	(12.86)	24.02 ± 1.79^*	(11.41)
etc.	14.38 ± 0.21	(18.73)	22.00 ± 2.58^*	(10.45)
총 지방산 함량	76.78 ± 3.55		210.55 ± 7.18 ^* ^{(WT 대비 274% 증가)}
FA productivity^a(mg/L/day)	11.06 ± 1.56		24.86 ± 2.41 ^* ^{(WT 대비 225% 증가)}

(a: 8일간의 배양조건에서 측정된 지질함량 대비 생산성(productivity)을 계산함)

도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 건조중량 중 총 지질함량은 돌연변이체(TspAGP-M1)가 대조구(wild type)와 비교해서 274% 증가하였다. 하지만, 돌연변이체의 성장속도가 대조구에 비해 느려, 지방산, 즉 배양 부피당 총 지질함량 생산성은 225% 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서, 돌연변이체에서 총 지질 생산성도 높아졌음을 알 수 있다. 2L 컬럼 배양에서도 돌연변이체에서 연료 성분 중 활용성이 높은 포화 지방산인 C16:0과 C18:1 함량이 현저히 증가함을 확인하였다.

한국생명공학연구원

KCTC13787BP

20190110

SEQUENCE LISTING <110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY <120> METHOD FOR GENE EDITING IN MICROALGAE USING PARTICLE BOMBARDMENT <130> P20190683KR <150> KR 10-2019-0015770 <151> 2019-02-11 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1404 <212> DNA <213> tetraselmis sp. <400> 1 cagaagcaga cggtgaatgc ggccaccgtg gaggagatgg ccgcctccag tgtggctgcc 60 cctctacctg atggcaccgt gcccgatatc agcaagactg tgctgggaat catcctgggc 120 ggcggcgcgg gcacccgcct gtacccgctg accaagaaga gggccaagcc cgcggtgccg 180 ctgggcgcca actaccgcct gatcgacatc cccgtgagca actgcatcaa cagcggcgtg 240 aacaagatct actgcctcac gcagttcaac tcggcctccc tgaaccgcca cctctcccag 300 gcctacaact cgaacatcgg aggctacatg gacaagggct tcgtggaggt gctggccgcg 360 cagcagagcc cgaagaaccc caactggttc cagggcacgg ccgacgcggt gcgccagtac 420 atgtggctgt ttgaggaggc gatggccaac ggcgtggagg acttcctcat cctgtcgggc 480 gaccacctgt accgcatgga ctaccaggag tttgtggccg cgcaccgcgc cgcgaaggcc 540 gccatcactg tcgccgcgct gccctgcgcc gagaagcagg ccgaggcgtt tggcctcatg 600 aagatcgatg actctggccg tatcgtcgag tttgcggaga agcccaccgg cgacgcgctc 660 aaggctatgc gcatcgacac caccgtgctc ggcctcgacg cggagcgggc ggcggagatg 720 ccgtacctgg cctcgatggg catctacgtg atgaagggca cgctgctgcg cgagctgctg 780 gacgacaacc cggacgcgaa cgacttcggc tcggagatca tcccgtttgc caaggacaag 840 ggatccaagg tgcaggcgtt cctgtttgac ggctactggg aggacatcgg aaccatcgag 900 gccttttaca gcgccaacct ggccctcacc gaccccgacg cccccaaatt cagcttctac 960 gagcgcgagg cgcccatcta caccatgccg cgcttcttgc cgccctccaa gatgctggac 1020 gcggacgtgg ccaacagcat catcggcgac ggctgcgtcg tgcgcgccaa cgcaaagatc 1080 tcccactccg ttgtgggcgt gcgtgcgctg atctctgaga acaccgtcgt ggaggactcc 1140 atgatcatgg gcgcggacta ctacgagacc ctggaggagt gccagctggt gccgggctgc 1200 ctgcccatgg gcatcggccc caacacgatc gtgaagaagg cgatcatcga caagaatgcc 1260 cgcatcggcg ccaactgcca gattgtgaac aaggacaacg tgatggaggc caacgaggag 1320 gagaagggct acatcatcaa ggatggcatc attgtggtgt gcaaggacgc cattatcccc 1380 gacggcacca tcatttaagc gcgc 1404 <210> 2 <211> 1786 <212> DNA <213> tetraselmis sp. <400> 2 gactctgcgc ctctccacgg tgctcacacg cgcacgtttc ttcctcacgc atcagccgcg 60 tcactgtagc caggatggcg accgccacca tagcccaggc ccagctcggc gctcgcgcta 120 agaccgccgg cgtcggcagc gtgcgcagcg tccgcggcgt gcgcgtcccg cagatcagcc 180 gccctcgtgc tgcccgcgtc gcacagaggc atgtggtcgc gtcggcgcag aagcagacgg 240 tgaatgcggc caccgtggag gagatggccg cctccagtgt ggctgcccct ctacctgatg 300 gcaccgtgcc cgatatcagc aagactgtgc tgggaatcat cctgggcggc ggcgcgggca 360 cccgcctgta cccgctgacc aagaagaggg ccaagcccgc ggtgccgctg ggcgccaact 420 accgcctgat cgacatcccc gtgagcaact gcatcaacag cggcgtgaac aagatctact 480 gcctcacgca gttcaactcg gcctccctga accgccacct ctcccaggcc tacaactcga 540 acatcggagg ctacatggac aagggcttcg tggaggtgct ggccgcgcag cagagcccga 600 agaaccccaa ctggttccag ggcacggccg acgcggtgcg ccagtacatg tggctgtttg 660 aggaggcgat ggccaacggc gtggaggact tcctcatcct gtcgggcgac cacctgtacc 720 gcatggacta ccaggagttt gtggccgcgc accgcgccgc gaaggccgcc atcactgtcg 780 ccgcgctgcc ctgcgccgag aagcaggccg aggcgtttgg cctcatgaag atcgatgact 840 ctggccgtat cgtcgagttt gcggagaagc ccaccggcga cgcgctcaag gctatgcgca 900 tcgacaccac cgtgctcggc ctcgacgcgg agcgggcggc ggagatgccg tacctggcct 960 cgatgggcat ctacgtgatg aagggcacgc tgctgcgcga gctgctggac gacaacccgg 1020 acgcgaacga cttcggctcg gagatcatcc cgtttgccaa ggacaaggga tccaaggtgc 1080 aggcgttcct gtttgacggc tactgggagg acatcggaac catcgaggcc ttttacagcg 1140 ccaacctggc cctcaccgac cccgacgccc ccaaattcag cttctacgag cgcgaggcgc 1200 ccatctacac catgccgcgc ttcttgccgc cctccaagat gctggacgcg gacgtggcca 1260 acagcatcat cggcgacggc tgcgtcgtgc gcgccaacgc aaagatctcc cactccgttg 1320 tgggcgtgcg tgcgctgatc tctgagaaca ccgtcgtgga ggactctatg atcatgggcg 1380 cggactacta cgagaccctg gaggagtgcc agctggtgcc gggctgcctg cccatgggca 1440 tcggccccaa cacgatcgtg aagaaggcga tcatcgacaa gaatgcccgc atcggcgcca 1500 actgccagat tgtgaacaag gacaacgtga tggaggccaa cgaggaggag aagggctaca 1560 tcatcaagga tggcatcatt gtggtgtgca aggacgccat tatccccgac ggcaccatca 1620 tttaagcgcg cccccatgca taccttccta tcccccctcc cctcccctcc cctcccctcg 1680 tcaatggaaa tagcgccgat agttacagag ttaccgtgtg acctagtgga cctggtgggg 1740 gtgtaatgaa tccccttttt gcgtcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1786 <210> 3 <211> 516 <212> PRT <213> tetraselmis sp. <400> 3 Met Ala Thr Ala Thr Ile Ala Gln Ala Gln Leu Gly Ala Arg Ala Lys 1 5 10 15 Thr Ala Gly Val Gly Ser Val Arg Ser Val Arg Gly Val Arg Val Pro 20 25 30 Gln Ile Ser Arg Pro Arg Ala Ala Arg Val Ala Gln Arg His Val Val 35 40 45 Ala Ser Ala Gln Lys Gln Thr Val Asn Ala Ala Thr Val Glu Glu Met 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Val Ala Ala Pro Leu Pro Asp Gly Thr Val Pro Asp 65 70 75 80 Ile Ser Lys Thr Val Leu Gly Ile Ile Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr 85 90 95 Arg Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Lys Arg Ala Lys Pro Ala Val Pro Leu 100 105 110 Gly Ala Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ile Pro Val Ser Asn Cys Ile Asn 115 120 125 Ser Gly Val Asn Lys Ile Tyr Cys Leu Thr Gln Phe Asn Ser Ala Ser 130 135 140 Leu Asn Arg His Leu Ser Gln Ala Tyr Asn Ser Asn Ile Gly Gly Tyr 145 150 155 160 Met Asp Lys Gly Phe Val Glu Val Leu Ala Ala Gln Gln Ser Pro Lys 165 170 175 Asn Pro Asn Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp Ala Val Arg Gln Tyr Met 180 185 190 Trp Leu Phe Glu Glu Ala Met Ala Asn Gly Val Glu Asp Phe Leu Ile 195 200 205 Leu Ser Gly Asp His Leu Tyr Arg Met Asp Tyr Gln Glu Phe Val Ala 210 215 220 Ala His Arg Ala Ala Lys Ala Ala Ile Thr Val Ala Ala Leu Pro Cys 225 230 235 240 Ala Glu Lys Gln Ala Glu Ala Phe Gly Leu Met Lys Ile Asp Asp Ser 245 250 255 Gly Arg Ile Val Glu Phe Ala Glu Lys Pro Thr Gly Asp Ala Leu Lys 260 265 270 Ala Met Arg Ile Asp Thr Thr Val Leu Gly Leu Asp Ala Glu Arg Ala 275 280 285 Ala Glu Met Pro Tyr Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Met Lys Gly 290 295 300 Thr Leu Leu Arg Glu Leu Leu Asp Asp Asn Pro Asp Ala Asn Asp Phe 305 310 315 320 Gly Ser Glu Ile Ile Pro Phe Ala Lys Asp Lys Gly Ser Lys Val Gln 325 330 335 Ala Phe Leu Phe Asp Gly Tyr Trp Glu Asp Ile Gly Thr Ile Glu Ala 340 345 350 Phe Tyr Ser Ala Asn Leu Ala Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Lys Phe 355 360 365 Ser Phe Tyr Glu Arg Glu Ala Pro Ile Tyr Thr Met Pro Arg Phe Leu 370 375 380 Pro Pro Ser Lys Met Leu Asp Ala Asp Val Ala Asn Ser Ile Ile Gly 385 390 395 400 Asp Gly Cys Val Val Arg Ala Asn Ala Lys Ile Ser His Ser Val Val 405 410 415 Gly Val Arg Ala Leu Ile Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Asp Ser Met 420 425 430 Ile Met Gly Ala Asp Tyr Tyr Glu Thr Leu Glu Glu Cys Gln Leu Val 435 440 445 Pro Gly Cys Leu Pro Met Gly Ile Gly Pro Asn Thr Ile Val Lys Lys 450 455 460 Ala Ile Ile Asp Lys Asn Ala Arg Ile Gly Ala Asn Cys Gln Ile Val 465 470 475 480 Asn Lys Asp Asn Val Met Glu Ala Asn Glu Glu Glu Lys Gly Tyr Ile 485 490 495 Ile Lys Asp Gly Ile Ile Val Val Cys Lys Asp Ala Ile Ile Pro Asp 500 505 510 Gly Thr Ile Ile 515 <210> 4 <211> 803 <212> DNA <213> tetraselmis sp. <400> 4 acagaggcat gtggtcgcgt cggcgcagaa gcagacggtg aatgcggcca ccgtggagga 60 gatggccgcc tccagtgtgg ctgcccctct acctgatggc accgtgcccg atatcagcaa 120 ggtgctgctg caccgcctcg tgctgctccc tgccccaatc acatcctacc cgcccaatga 180 gagagtcatc gcctgccagc cgctcactgc tttctacccc catccacccc cctcctccac 240 cctgctgccg cctcgcagac tgtgctggga atcatcctgg gcggcggcgc gggcacccgc 300 ctgtacccgc tgaccaagaa gagggccaag cccgcggtgc cgctgggcgc caactaccgc 360 ctgatcgaca tccccgtgag caactgcatc aacagcggcg tgaacaagat ctactgcctc 420 acgcagttca actcggcctc cctgaaccgc cacctctccc aggcctacaa ctcgaacatc 480 ggaggctaca tggacaaggg cttcgtggag gtgctggccg cgcagcagag cccgaagaac 540 cccaactggt tccaggggac ggccgacgcg gtgcgccagt acatgtggct gtttgaggag 600 gcgatggcca acggcgtgga ggacttcctc atcctgtcgg gcgaccacct gtaccgcatg 660 gactaccagg agtttgtggc cgcgcaccgc gccgcgaagg ccgccatcac tgtcgccgcg 720 ctgccctgcg ccgagaagca ggccgaggcg tttggcctca tgaagatcga tgactccggc 780 cgtatcgtcg agtttgcgga gaa 803 <210> 5 <211> 1263 <212> DNA <213> tetraselmis sp. <400> 5 atggcgaccg ccaccatagc ccaggcccag ctcggcgctc gcgctaagac cgccggcgtc 60 ggcagcgtgc gcagcgtccg cggcgtgcgc gtcccgcaga tcagccgccc tcgtgctgcc 120 cgcgtcgcac agaggcatgt ggtcgcgtcg gcgcagaagc agacggtgaa tgcggccacc 180 gtggaggaga tggccgcctc cagtgtggct gcccctctac ctgatgagca gagcccgaag 240 aaccccaact ggttccaggg cacggccgac gcggtgcgcc agtacatgtg gctgtttgag 300 gaggcgatgg ccaacggcgt ggaggacttc ctcatcctgt cgggcgacca cctgtaccgc 360 atggactacc aggagtttgt ggccgcgcac cgcgccgcga aggccgccat cactgtcgcc 420 gcgctgccct gcgccgagaa gcaggccgag gcgtttggcc tcatgaagat cgatgactct 480 ggccgtatcg tcgagtttgc ggagaagccc accggcgacg cgctcaaggc tatgcgcatc 540 gacaccaccg tgctcggcct cgacgcggag cgggcggcgg agatgccgta cctggcctcg 600 atgggcatct acgtgatgaa gggcacgctg ctgcgcgagc tgctggacga caacccggac 660 gcgaacgact tcggctcgga gatcatcccg tttgccaagg acaagggatc caaggtgcag 720 gcgttcctgt ttgacggcta ctgggaggac atcggaacca tcgaggcctt ttacagcgcc 780 aacctggccc tcaccgaccc cgacgccccc aaattcagct tctacgagcg cgaggcgccc 840 atctacacca tgccgcgctt cttgccgccc tccaagatgc tggacgcgga cgtggccaac 900 agcatcatcg gcgacggctg cgtcgtgcgc gccaacgcaa agatctccca ctccgttgtg 960 ggcgtgcgtg cgctgatctc tgagaacacc gtcgtggagg actctatgat catgggcgcg 1020 gactactacg agaccctgga ggagtgccag ctggtgccgg gctgcctgcc catgggcatc 1080 ggccccaaca cgatcgtgaa gaaggcgatc atcgacaaga atgcccgcat cggcgccaac 1140 tgccagattg tgaacaagga caacgtgatg gaggccaacg aggaggagaa gggctacatc 1200 atcaaggatg gcatcattgt ggtgtgcaag gacgccatta tccccgacgg caccatcatt 1260 taa 1263 <210> 6 <211> 420 <212> PRT <213> tetraselmis sp. <400> 6 Met Ala Thr Ala Thr Ile Ala Gln Ala Gln Leu Gly Ala Arg Ala Lys 1 5 10 15 Thr Ala Gly Val Gly Ser Val Arg Ser Val Arg Gly Val Arg Val Pro 20 25 30 Gln Ile Ser Arg Pro Arg Ala Ala Arg Val Ala Gln Arg His Val Val 35 40 45 Ala Ser Ala Gln Lys Gln Thr Val Asn Ala Ala Thr Val Glu Glu Met 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Val Ala Ala Pro Leu Pro Asp Glu Gln Ser Pro Lys 65 70 75 80 Asn Pro Asn Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp Ala Val Arg Gln Tyr Met 85 90 95 Trp Leu Phe Glu Glu Ala Met Ala Asn Gly Val Glu Asp Phe Leu Ile 100 105 110 Leu Ser Gly Asp His Leu Tyr Arg Met Asp Tyr Gln Glu Phe Val Ala 115 120 125 Ala His Arg Ala Ala Lys Ala Ala Ile Thr Val Ala Ala Leu Pro Cys 130 135 140 Ala Glu Lys Gln Ala Glu Ala Phe Gly Leu Met Lys Ile Asp Asp Ser 145 150 155 160 Gly Arg Ile Val Glu Phe Ala Glu Lys Pro Thr Gly Asp Ala Leu Lys 165 170 175 Ala Met Arg Ile Asp Thr Thr Val Leu Gly Leu Asp Ala Glu Arg Ala 180 185 190 Ala Glu Met Pro Tyr Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Met Lys Gly 195 200 205 Thr Leu Leu Arg Glu Leu Leu Asp Asp Asn Pro Asp Ala Asn Asp Phe 210 215 220 Gly Ser Glu Ile Ile Pro Phe Ala Lys Asp Lys Gly Ser Lys Val Gln 225 230 235 240 Ala Phe Leu Phe Asp Gly Tyr Trp Glu Asp Ile Gly Thr Ile Glu Ala 245 250 255 Phe Tyr Ser Ala Asn Leu Ala Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Lys Phe 260 265 270 Ser Phe Tyr Glu Arg Glu Ala Pro Ile Tyr Thr Met Pro Arg Phe Leu 275 280 285 Pro Pro Ser Lys Met Leu Asp Ala Asp Val Ala Asn Ser Ile Ile Gly 290 295 300 Asp Gly Cys Val Val Arg Ala Asn Ala Lys Ile Ser His Ser Val Val 305 310 315 320 Gly Val Arg Ala Leu Ile Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Asp Ser Met 325 330 335 Ile Met Gly Ala Asp Tyr Tyr Glu Thr Leu Glu Glu Cys Gln Leu Val 340 345 350 Pro Gly Cys Leu Pro Met Gly Ile Gly Pro Asn Thr Ile Val Lys Lys 355 360 365 Ala Ile Ile Asp Lys Asn Ala Arg Ile Gly Ala Asn Cys Gln Ile Val 370 375 380 Asn Lys Asp Asn Val Met Glu Ala Asn Glu Glu Glu Lys Gly Tyr Ile 385 390 395 400 Ile Lys Asp Gly Ile Ile Val Val Cys Lys Asp Ala Ile Ile Pro Asp 405 410 415 Gly Thr Ile Ile 420 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #455 Forward primer for AGP cDNA of wildtype Tetraselmis <400> 7 cagaagcaga cggtgaatgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #456 Reverse primer for AGP cDNA of wildtype Tetraselmis <400> 8 tgcgcgctta aatgatggtg 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific reverse primer for 5'-RACE(#512) <400> 9 agtagatctt gttcacgccg ct 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific reverse primer for 5'-RACE(#513) <400> 10 tcttcttggt cagcgggtac ag 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific forward primer for 3'-RACE(#511) <400> 11 gggaggacat cggaaccatc 20 <210> 12 <211> 508 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 12 Val Ser Gln Arg Gln Ala Leu Gly Ser Gln Thr Phe Val Cys Pro His 1 5 10 15 Gly Ser Val Val Arg Lys Ala Val Ser Ser Lys Ala Arg Ala Val Ser 20 25 30 Arg Gln Ala Gln Val Val Arg Ala Gln Ala Val Ser Thr Pro Val Glu 35 40 45 Thr Lys Val Ala Asn Gly Val Ala Ala Ser Ser Ala Ala Gly Thr Gly 50 55 60 Gln Asn Asp Pro Ala Gly Asp Ile Ser Lys Thr Val Leu Gly Ile Ile 65 70 75 80 Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Arg Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Lys Arg 85 90 95 Ala Lys Pro Ala Val Pro Leu Gly Ala Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ile 100 105 110 Pro Val Ser Asn Cys Leu Asn Ser Asn Val Thr Lys Ile Tyr Cys Leu 115 120 125 Thr Gln Phe Asn Ser Ala Ser Leu Asn Arg His Leu Ser Gln Ala Tyr 130 135 140 Asn Ser Ser Val Gly Gly Tyr Asn Ser Arg Gly Phe Val Glu Val Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ser Gln Ser Ser Ala Asn Lys Ser Trp Phe Gln Gly Thr Ala 165 170 175 Asp Ala Val Arg Gln Tyr Met Trp Leu Phe Glu Glu Ala Val Arg Glu 180 185 190 Gly Val Glu Asp Phe Leu Ile Leu Ser Gly Asp His Leu Tyr Arg Met 195 200 205 Asp Tyr Arg Asp Phe Val Arg Lys His Arg Asn Ser Gly Ala Ala Ile 210 215 220 Thr Ile Ala Ala Leu Pro Cys Ala Glu Lys Glu Ala Ser Ala Phe Gly 225 230 235 240 Leu Met Lys Ile Asp Glu Glu Gly Arg Val Ile Glu Phe Ala Glu Lys 245 250 255 Pro Lys Gly Glu Ala Leu Thr Lys Met Arg Val Asp Thr Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Val Asp Pro Ala Thr Ala Ala Ala Lys Pro Tyr Ile Ala Ser Met 275 280 285 Gly Ile Tyr Val Met Ser Ala Lys Ala Leu Arg Glu Leu Leu Leu Asn 290 295 300 Arg Met Pro Gly Ala Asn Asp Phe Gly Asn Glu Val Ile Pro Gly Ala 305 310 315 320 Lys Asp Ala Gly Phe Lys Val Gln Ala Phe Ala Phe Asp Gly Tyr Trp 325 330 335 Glu Asp Ile Gly Thr Val Glu Ala Phe Tyr Asn Ala Asn Leu Ala Leu 340 345 350 Thr Asp Pro Glu Lys Ala Gln Phe Ser Phe Tyr Asp Lys Asp Ala Pro 355 360 365 Ile Tyr Thr Met Ser Arg Phe Leu Pro Pro Ser Lys Val Met Asp Cys 370 375 380 Asp Val Asn Met Ser Ile Ile Gly Asp Gly Cys Val Ile Lys Ala Gly 385 390 395 400 Ser Lys Ile His Asn Ser Ile Ile Gly Ile Arg Ser Leu Ile Gly Ser 405 410 415 Asp Cys Ile Ile Asp Ser Ala Met Met Met Gly Ser Asp Tyr Tyr Glu 420 425 430 Thr Leu Glu Glu Cys Glu Tyr Val Pro Gly Cys Leu Pro Met Gly Val 435 440 445 Gly Asp Gly Ser Ile Ile Arg Arg Ala Ile Val Asp Lys Asn Ala Arg 450 455 460 Ile Gly Pro Lys Cys Gln Ile Ile Asn Lys Asp Gly Val Lys Glu Ala 465 470 475 480 Asn Arg Glu Asp Gln Gly Phe Val Ile Lys Asp Gly Ile Val Val Val 485 490 495 Ile Lys Asp Ser His Ile Pro Ala Gly Thr Ile Ile 500 505 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #488 Forward primer for 5' part of AGP genomic DNA of wildtype Tetraselmis <400> 13 ttctccgcaa actcgacgat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #490 Reverse primer for 5' part of AGP genomic of wildtype Tetraselmis <400> 14 ttctccgcaa actcgacgat 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGEN Target1 Seq. for AGP <400> 15 atatcgggca cggtgccatc agg 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGEN Target2 Seq. for AGP <400> 16 tggccctctt cttggtcagc ggg 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGEN Target3 Seq. for AGP <400> 17 gttcttcggg ctctgctgcg cgg 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RGEN Target4 Seq. for AGP <400> 18 catgtactgg cgcaccgcgt cgg 23 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RGEN Target1 <400> 19 taatacgact cactatagat atcgggcacg gtgcc 35 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RGEN Target1 <400> 20 ttctagctct aaaacgatgg caccgtgccc gatat 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RGEN Target2 <400> 21 taatacgact cactatagtg gccctcttct tggtc 35 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RGEN Target2 <400> 22 ttctagctct aaaacgctga ccaagaagag ggcca 35 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RGEN Target3 <400> 23 taatacgact cactataggt tcttcgggct ctgct 35 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RGEN Target3 <400> 24 ttctagctct aaaaccgcag cagagcccga agaac 35 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RGEN Target4 <400> 25 taatacgact cactatagca tgtactggcg caccg 35 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RGEN Target4 <400> 26 ttctagctct aaaacacgcg gtgcgccagt acatg 35 <210> 27 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for RGEN Target1 <400> 27 auaucgggca cggugccguu uuagagcuag aaauagcaag uuaaaauaag gcuaguccgu 60 uaucaacuug aaaaaguggc accgagucgg ugcuuuu 97 <210> 28 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for RGEN Target2 <400> 28 uggcccucuu cuuggucguu uuagagcuag aaauagcaag uuaaaauaag gcuaguccgu 60 uaucaacuug aaaaaguggc accgagucgg ugcuuuu 97 <210> 29 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for RGEN Target3 <400> 29 guucuucggg cucugcuguu uuagagcuag aaauagcaag uuaaaauaag gcuaguccgu 60 uaucaacuug aaaaaguggc accgagucgg ugcuuuu 97 <210> 30 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for RGEN Target4 <400> 30 cauguacugg cgcaccgguu uuagagcuag aaauagcaag uuaaaauaag gcuaguccgu 60 uaucaacuug aaaaaguggc accgagucgg ugcuuuu 97 <210> 31 <211> 1381 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 31 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Thr Lys Lys Met 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asn Lys Gln Thr Ile Lys Lys Asn Leu Leu 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ala Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Asp 100 105 110 Asn Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Asn Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Glu Leu Ala Asp 130 135 140 Ser Thr Glu Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Val Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Gln Gly Asp Leu Asn Ser 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Glu Lys Leu Phe Lys Gln Leu Leu His Thr Tyr 180 185 190 Asn Glu Leu Phe Glu Glu Arg Pro Leu Glu Glu Ile Lys Val Asp Ala 195 200 205 Lys Gly Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Ala Phe Pro Asn Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ala Leu Gly Leu Met Pro Asn Phe Lys Ala Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asn Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Ser Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Glu Gly Leu Leu Gly Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Lys Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Gly 290 295 300 Ile Leu Arg Ala Asp Ser Glu Val Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Ala Leu Leu Lys 325 330 335 Val Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Lys Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Ser 340 345 350 Asp Lys Thr Thr Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Lys Thr Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Val Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Ala Lys Leu Asn Arg Asp Asp Phe Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Val His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Ala Tyr Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Glu Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Lys Arg Gln Arg Asn Glu Ala Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Asp 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Thr Ser Ala Gln Leu Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Val Asp Glu His Leu Pro Thr Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Arg 515 520 525 Tyr Ile Thr Asp Lys Met Arg Lys Ser Glu Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Ala Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Gln Lys Ile Glu Cys Cys Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Thr Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Asp Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Gly Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Lys Glu Met Ile Glu Lys Arg Leu Lys Lys Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Cys His Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Lys Lys Leu Ile Asn Gly Ile Lys Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Val Asp Asp Ile Lys Ala Ala Asn Glu Glu Val Phe Glu Gln Lys Asp 705 710 715 720 Ser Leu Lys Glu Gln Ile Ser Ala Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys 725 730 735 Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Ile Val Asp Glu Ile Ile Lys Val 740 745 750 Met Gly His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn 755 760 765 Gln Thr Thr Gln Glu Gly Gln Arg Arg Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg 770 775 780 Leu Leu Glu Gly Leu Asn Arg Phe Gly Ser Gly Ile Leu Asn Glu Lys 785 790 795 800 Ser Leu Ser Tyr Lys Lys Pro Ser Asn Ile Ser Gly Lys Val Lys Asp 805 810 815 Tyr His Leu Gln Ser Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly 820 825 830 Lys Asp Met Tyr Thr Gly Asp Glu Leu Asp Ile Asp Arg Leu Tyr Gln 835 840 845 Tyr Asp Val Asp His Ile Ile Pro Gln Ser Phe Ile Lys Asp Asp Ser 850 855 860 Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser 865 870 875 880 Asp Asp Val Pro Ser Glu Ala Val Val Lys Lys Met Lys Ser Tyr Trp 885 890 895 Arg Arg Leu Leu Lys Ala Lys Leu Ile Ser Gln Arg Lys Phe Asp Asn 900 905 910 Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Asp Asp Lys Ala Gly 915 920 925 Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val 930 935 940 Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Arg Asp Lys Asn Asp 945 950 955 960 Lys Pro Ile Arg Asp Val Lys Ile Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val 965 970 975 Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn 980 985 990 Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr 995 1000 1005 Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr 1010 1015 1020 Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Phe Gly Lys Ser 1025 1030 1035 Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Arg Phe Phe Tyr Ser 1040 1045 1050 Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly 1055 1060 1065 Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Glu Glu Thr Gly 1070 1075 1080 Glu Ile Val Trp Asp Lys Glu Lys Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys 1085 1090 1095 Val Leu Ser Met Pro Gln Val Thr Ile Val Lys Lys Thr Glu Val 1100 1105 1110 Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Gly Glu 1115 1120 1125 Ser Ala Lys Leu Ile Pro Arg Lys Lys Gly Trp Asp Thr Thr Lys 1130 1135 1140 Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val 1145 1150 1155 Ile Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Thr Lys Lys Leu Lys Pro Val 1160 1165 1170 Lys Glu Leu Val Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Asn Ser Phe Glu 1175 1180 1185 Lys Asp Pro Val Ser Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val 1190 1195 1200 Arg Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu 1205 1210 1215 Leu Glu Asn Gly Arg Arg Arg Leu Leu Ala Ser Ala Thr Glu Leu 1220 1225 1230 Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val His Phe 1235 1240 1245 Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Asp Thr Leu Lys Gly Ser Pro Glu 1250 1255 1260 Asp Asn Lys Gln Lys Gln Leu Phe Val Asp Gln His Gln Tyr Tyr 1265 1270 1275 Leu Asp Glu Ile Ile Asp Trp Ile Ser His Phe Ser Lys Arg Val 1280 1285 1290 Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Leu Arg Ala Thr Tyr Glu 1295 1300 1305 Lys Asn Thr His Leu Pro Ile Ser Glu Gln Ala Asp Ser Met Leu 1310 1315 1320 Asn Ala Phe Thr Phe Ser Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys 1325 1330 1335 Phe Phe Asn Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys 1340 1345 1350 Glu Ile Leu Asp Ser Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu 1355 1360 1365 Tyr Glu Thr Arg Leu Asp Leu Asn Gln Leu Gly Gly Asp 1370 1375 1380

Claims

표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cas 단백질을 포함하는 반응 혼합물과 미세 금속입자를 혼합하여 리보핵산단백질(ribonucleoprotein, RNP)이 표면에 코딩된 미세 금속입자를 포함하는 RNP-전달용조성물을 준비하는 것;
상기 RNP-전달용조성물을 마크로-캐리어 디스크 상에서 건조시키는 것; 및
파열 디스크(rupture disk)에 500 psi 이상의 압력을 가하여 상기 RGEN RNP 복합체가 표면에 코팅된 미세 금속입자를 테트라셀미스 속 미세조류 세포로 발사하는 것;
그 유전자총을 이용하여 테트라셀미스 속 미세조류 세포로 도입하는 것;을 포함하는 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제1항에 있어서,
상기 교정방법은 RGEN RNP 복합체가 표면에 코팅된 미세 금속입자가 전달된 세포를 2 내지 5일 동안 인큐베이션한 후 미세조류 세포들을 수확하는 것을 더 포함하는, 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제1항에 있어서,
상기 RNP-전달용조성물을 준비하는 단계는 제1 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 포함하는 제1 반응 혼합물;과 제2 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 포함하는 제2 반응 혼합물을 미세 금속입자와 혼합하여 2개 이상의 리보핵산단백질(RNP)가 코팅된 미세 금속입자를 포함하는 RNP-전달용조성물을 준비하는 것인, 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제1항에 있어서,
상기 반응 혼합물은 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA(sgRNA), Cas 단백질, 및 반응완충액을 포함하고,
상기 반응완충액은 양쪽 이온성 완충제, 염화나트륨(NaCl), 및 염화마그네슘(MgCl₂)를 포함하며, pH는 6.0 내지 8.0인, 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제4항에 있어서,
상기 반응 혼합물 10 μL에 대하여 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA(sgRNA) 1 내지 5 ug, Cas 단백질 1 내지 5 ug, 반응완충액 0.5 내지 2 μL 및 증류수를 포함하는 것인, 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제4항에 있어서,
상기 반응완충액은 킬레이트제를 더 포함하고,
양쪽 이온성 완충제 10mM 내지 50mM, 염화나트륨(NaCl) 50 내지 200mM, 염화마그네슘(MgCl₂) 2.5 내지 10mM 및 킬레이트제 0.1 내지 1mM을 포함하는 것인, 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제1항에 있어서,
상기 압력은 1,000 내지 1,500 psi인, 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제1항에 있어서,
금속입자 발사 시 정지스크린(stop sceen)과 테트라셀미스 미세조류 세포를 포함하는 세포 접시(cell plate)와의 거리는 8cm 내지 10cm인 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제1항에 있어서,
상기 마크로-캐리어 디스크 상에 5 내지 20μL의 RNP-전달용조성물을 건조하는 것인, 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제1항에 있어서,
반응 혼합물과 미세 금속입자를 1 내지 2 : 1의 부피비로 혼합하는 것인, 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제1항에 있어서,
상기 금속입자는 텅스텐 또는 금인, 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
제1항에 있어서,
상기 발사는 1 내지 10회 수행하는 것인, 테트라셀미스 속 미세조류의 유전자 교정방법.
SEQ ID No.: 4로 표시되는 서열에서 99번째 내지 524번째에 상응하는 뉴클레오티드가 결실된 AGP 유전자 변이를 포함하는 테트라셀미스 속 변이체.
제13항에 있어서,
상기 변이체는 SEQ ID No: 5의 AGP 변이 유전자를 포함하는 테트라셀미스 속 변이체.
제13항에 있어서,
기탁번호 KCTC 13787BP이고, 전분 생산능을 갖지않고, 야생형과 비교해서 개선된 지질 생산능을 갖는 테트라셀미스 TspAGP-M1인 테트라셀미스 속 변이체.
제15항에 있어서,
상기 테트라셀미스 TspAGP-M1은 C16:0과 C18:1 지방산 생산능이 야생형 균주와 비교해서 개선된 것인, 테트라셀미스 속 변이체.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 테트라셀미스 속 변이체를 배양하여 지질을 축적시키는 단계; 및 배양물로부터 축적된 지질을 단리시키는 단계를 포함하는 바이오에너지 생산방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 테트라셀미스 속 변이체의 배양물을 포함하는 바이오에너지 조성물.