CN112813095B - 一种提高海藻过表达基因遗传转化效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于海藻基因工程技术领域，具体是一种基因枪介导的提高紫菜过表达基因遗传转化效率的方法，1)金粉溶液制备：称取24‑26mg混合金粉，混合金粉中粒径0.6‑0.8微米金粉占混合金粉质量的30‑50％(优选35‑45％)，粒径大于0.8至1.5微米金粉占混合金粉质量的50‑70％(优选55‑65％),加入容器中,向容器中加入乙醇和超纯水，震荡洗涤，离心后，弃上清；用甘油溶解，混匀；2)微弹制备；3)将微弹平均分配到载体膜上，采用基因枪轰击实验材料4)轰击后的海藻先黑暗培养24h后，再按照海藻的正常培养条件用含抗生素的培养基进行培养筛选。

Description

一种提高海藻过表达基因遗传转化效率的方法
技术领域
本发明属于海藻基因工程技术领域，具体是一种基因枪介导的提高紫菜过表达基因遗传转化效率的方法。
背景技术
基因工程(genetic engineering)又称DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术。
基因工程包括基因过表达、基因干扰、基因敲除和基因编辑等方面。目前基因工程手段主要有基因枪轰击、电转化、显微注射和细菌感染四种方式，而大型海藻遗传转化的主要方式是基因枪轰击。即将含有目的基因的转化质粒用金粉包裹后，采用基因枪轰击的方式将其转入紫菜、海带、裙带菜或浒苔等大型海藻中。
相对于高等植物和微藻的基因工程，大型海藻在这方面的研究则起步较晚。一方面大型海藻每一类群都有其独特复杂的生活史类型和繁殖方式，另一方面大型海藻的细胞培养、组织培养、遗传背景等方面研究基础薄弱，所以对大型海藻开展遗传操作难度较大。鉴于多种大型海藻基因组全序列的公布，利用基因工程进行基因功能研究和遗传育种则成为必要手段和必然趋势。纵观国内外紫菜基因工程的研究进展，在2013年之前的研究报道，紫菜遗传转化往往是瞬时表达,不能获得稳定遗传的突变株(参考文献：Mikami etal.2013(Mikami k.Current Advances in Seaweed Transformation.In TECH.2013,http://dx.doi.org/10.5772/52978)。参考文献：Fukuda et al.2008(Fukuda S.,MikamiK.,Uji T.,Park Eun-Jeong,Ohba T.,et al.Factors influencing efficiency oftransient gene expression in the red macrophyte Porphyra yezoensis.PlantScience.2008,174:329–339))。2014年Hirata等(参考文献：Hirata R.,Uji T.,FukudaS.,Mizuta H.,Fujiyama A.,Tabata S.,Saga N.Development of a nucleartransformation system with a codon-optimized selection marker and reportergenes in Pyropia yezoensis(Rhodophyta).J Appl Phycol.2014,26:1863–1868)采用报告基因(GUS和CFP)获得核遗传转化的效率是40-60％，但他们并未报道转化其它功能基因的研究报道。我们的研究团队目前能获得紫菜稳定核遗传转化突变株(参考文献：Zheng etal.2020(Zhenbing Zheng,Bangxiang He,Xiujun Xie,Guangce Wang.Co-suppression inPyropia yezoensis(Rhodophyta)Reveals the Role of PyLHCI in Light Harvestingand Generation Switch.2020,https://doi.org/10.1111/jpy.13073))，特别是目的片段较小(200-500nt)的RNA干扰突变株，而对于目的基因编码区(Coding DNA sequence,CDS)较大(>2000nt)的突变株，则转化效率偏低(5-10％)。因此，在研究紫菜核遗传转化的过程中，我们一直在探索提高转化效率及获得稳定核遗传突变株的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高海藻遗传转化效率的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种提高海藻过表达基因遗传转化效率的方法，其为基因枪介导转化方法，将需要将转化质粒与金粉混合，然后用基因枪将金粉轰击进海藻中，进行培养获得转基因苗；
所述金粉为不同粒径的混合金粉，混合金粉中粒径0.6-0.8微米金粉(平均粒径0.65-0.75微米)占混合金粉质量的30-50％，粒径大于0.8至1.5微米(平均粒径1.0-1.2微米)(优选粒径0.9至1.5微米)金粉占混合金粉质量的50-70％；
优选：混合金粉中粒径0.6-0.8微米金粉(平均粒径0.68-0.72微米)占混合金粉质量35-45％，粒径大于0.8至1.5微米(平均粒径1.05-1.15微米)(优选粒径0.9至1.5微米)金粉占混合金粉质量55-65％。
具体过程为：
1)金粉溶液制备：称取24-26mg混合金粉，混合金粉中粒径0.6-0.8微米金粉占混合金粉质量的30-50％(平均粒径0.65-0.75微米)(优选35-45％,平均粒径0.68-0.72微米)，粒径大于0.8至1.5微米(平均粒径1.0-1.2微米)(优选粒径0.9至1.5微米)金粉占混合金粉质量的50-70％(优选55-65％,平均粒径1.05-1.15微米),加入容器中,向容器中加入0.8-1.5ml 60-80％乙醇(V/V)和0.8-1.5ml超纯水，震荡洗涤，离心后，弃上清；用400-600μl 45-55％甘油(V/V)溶解，混匀；
2)微弹制备：取上述金粉溶液48-50μl与6-8μg转化质粒混匀，然后加入40-60μlCaCl2(2.3-2.7M),15-25μl亚精胺(0.1-0.15M)，8000-12000g离心2-5秒，弃上清，然后用48-50μl无水乙醇溶解；
3)将48-50μl微弹平均分配到4-6张载体膜上，然后用氦压1.2-1.5Mpa，真空压力达到3-5英寸汞柱时采用基因枪轰击实验材料海藻，每张载体膜对应8-10mg新鲜海藻；
4)轰击后的海藻先黑暗培养18-30h后，再按照海藻的正常培养条件进行培养。
于正常培养条件，用含抗生素的培养基培养6-8周后，挑选单棵紫菜苗，每棵苗对应一个培养瓶培养，一般挑选10-20棵苗进行培养检验；待长成后(培养4-6周)，提取其基因组DNA，然后进行PCR扩增以筛选突变株。
海藻为条斑紫菜。
黑暗培养为15-19℃黑暗18-30h；
正常培养为15-19℃，光照强度2500-3500lux，10-12：14-12＝L:D(光暗时间比，小时)条件下培养。
转化质粒为带有功能基因CDS区的过表达质粒；所述功能基因为丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PYC)或其它来自条斑紫菜的功能基因PEPC，MDH和PEPCK中的一种或二种以上；
所述质粒为PEA7:PyAct1:PyPYC、PEA7:PyAct1:PyPEPC PEA7:PyAct1:PyMDH和PEA7:PyAct1:PyPEPCK中的一种或二种以上,(质粒构建可参考文献Development of anuclear transformation system with a codon-optimized selection marker andreporter genes in Pyropia yezoensis(Rhodophyta)。
功能基因CDS大小为1100-3400个碱基；
所述功能基因的CDS序列插入质粒的启动子终止子之间。
本发明的优点
1.大大提高遗传转化效率。
2.节省实验成本；
3.减少质粒DNA浓度。
本发明利用基因枪(Biolistic PDS-1000/He)对紫菜进行遗传转化操作时，使用0.6-1.5微米混合金粉(粒径0.6-0.8微米占30-50％，粒径大于0.8至1.5微米占50-70％)，而不是单一直径的金粉效果更佳，即大片段目的基因阳性突变株得率至少提高2倍(可达到28-35％)，而且金粉用量和质粒用量都少于使用0.6微米(粒径波动范围为0.5-0.7微米)和1微米(粒径波动范围为0.9-1.1微米)匀质金粉。
具体实施方式
实施例1：
实施例中采用的过表达转化质粒PEA7:PyAct1:PyPYC的制备方法参考文献(Hirata et al.2014.Development of a nuclear transformation system with acodon-optimized selection marker and reporter genes in Pyropia yezoensis(Rhodophyta))，所不同的是将文献中的报告基因GUS或者CFP替换为紫菜的丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase，PYC)基因CDS，该基因CDS由3222个碱基组成。
利用引物对(Forward:5’-GTCACCTTCGCCACCATGTTTGGCACCAAGACGTCG-3’；Reverse：5’-GGGAAATTCGAGCTCTCACGCCCCAGCCGC-3’)扩增获得PYC基因编码区，将此编码区利用infusion方法插入质粒PEA7(质粒来自文献Development of a nucleartransformation system with a codon-optimized selection marker and reportergenes in Pyropia yezoensis(Rhodophyta))中，即获得含有PYC编码区的转化质粒(PEA7:PyAct1:PyPYC)。
遗传转化操作：
1)金粉溶液制备：称取30mg直径0.6微米匀质金粉(粒径范围为0.5-0.7微米，平均粒径0.6微米),加入1.5ml EP管中,向EP管中加入1ml 70％乙醇(V/V)和1ml超纯水，震荡洗涤，离心(10000g,1min)后，弃上清；用500μl 50％甘油(V/V)溶解，快速震荡混匀，置于冰上备用；
2)微弹制备：取上述金粉溶液50μl与10μg转化质粒(PEA7:PyAct1:PyPYC)混匀，然后加入50μl CaCl2(2.5M),20μl亚精胺(0.1M)，10000g离心2秒，弃上清，然后用48μl无水乙醇溶解，此为DNA与金粉混合物。
3)将上述48μl DNA与金粉混合物平均分配到5张微粒载片(Biolistic，P/N9202964”C”)上，加样时要将其加于载片中央，干燥2min。
基因枪操作参考文献(吴春辉浒苔(Ulva prolifera)遗传转化体系的建立，2014年硕士论文)进行基因枪介导转化操作，安装可裂解膜于可裂膜托座上，将该托座顺时针安到加速器上固定；将空间环、阻挡网、阻挡网托座、微粒载片及固定环(带有微粒面朝下)安好，旋紧插入基因枪枪体中。
4)取8-10mg新鲜条斑紫菜叶状体平铺在直径25mm滤纸上，然后将该滤纸置于90mm培养皿中央，将该培养皿放在样品托盘(Biolistic PDS-1000/He基因枪配套样品托盘)放入基因枪(Biolistic PDS-1000/He)轰击室一档位置，关好轰击室门。然后用氦压1000Psi，真空压力达到600mm汞柱时轰击紫菜。
5)轰击后的紫菜从滤纸上取下放在PES液体培养基(Provasoli 1968)中，先在培养箱(GXZ智能光照培养箱)15-19℃黑暗24h，然后在15-19℃，光照强度2500-3500lux，12：12＝L:D(光暗时间比)条件下培养；
6)用含潮霉素B(终浓度1mg/mL)的紫菜培养基(PES液体培养基)培养6-8周后(在此为8周后)，挑选单棵紫菜苗，每棵苗对应一个培养瓶培养，一般挑选10-20棵苗(在此为20棵苗)进行培养检验。待长成后(一般培养4-6周，在此为5周)，提取其基因组DNA，然后进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行DNA测序后判断是否阳性突变株。
7)统计计算目的基因PYC过表达阳性突变株得率为8％。
实施例2：
过程和条件同与实施例1，与实施例1不同之处在于：除所用金粉为1微米匀质金粉(粒径范围0.9-1.1微米，平均粒径1微米)，其余实验步骤及基因枪轰击条件和紫菜培养条件与实施例1完全相同，此次统计计算目的基因PYC过表达阳性突变株得率为12％。
实施例3：
过程和条件同与实施例1，与实施例1不同之处在于：此次实验所用金粉为0.6-1.5微米混合金粉(其中粒径0.6-0.8微米金粉占混合金粉质量的40％，平均粒径0.7微米；粒径大于0.8至1.5微米金粉占混合金粉质量的60％，平均粒径1.1微米)，金粉用量25mg，含目的基因PYC的转化质粒用量为8μg，其余实验步骤及基因枪轰击条件和紫菜培养条件与实施例1完全相同，此次统计计算目的基因PYC过表达阳性突变株得率为35％。
实施例4：
过程和条件同与实施例1，与实施例1不同之处在于：所用过表达转化质粒PEA7:PyAct1:PyPEPC。PEPC为来自于条斑紫菜的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)，其CDS区由2974个碱基组成，利用引物对(Forward:5’-GTCACCTTCGCCACCCTGTGCTGTGGGGTGTGG-3’；Reverse：5’-GGGAAATTCGAGCTCCTACCCCGTGTTCTGGAGGG-3’)扩增获得。
基因枪转化操作和转化后培养同实施例1，统计计算PEPC过表达阳性突变株得率为8％。
实施例5：
过程和条件同与实施例2，与实施例2不同之处在于：所用过表达转化质粒PEA7:PyAct1:PyPEPC(其制备过程同实施例4)。
基因枪转化操作和转化后培养同实施例2，统计计算PEPC过表达阳性突变株得率为10％。
实施例6：
过程和条件同与实施例3，与实施例3不同之处在于：此次实验所用金粉为0.6-1.5微米混合金粉(其中粒径0.6-0.8微米金粉占混合金粉质量的45％，平均粒径0.72微米；粒径大于0.8至1.5微米金粉占混合金粉质量的55％，平均粒径1.05微米)；所用过表达转化质粒PEA7:PyAct1:PyPEPC(其制备过程同实施例4)。
基因枪转化操作和转化后培养同实施例3，统计计算PEPC过表达阳性突变株得率为30％。
实施例7：
过程和条件同与实施例1，与实施例1不同之处在于：所用过表达转化质粒PEA7:PyAct1:PyMDH。MDH为来自于条斑紫菜的苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase，MDH)，该基因的CDS区由1128个碱基组成，利用引物对(Forward:5’-GTCACCTTCGCCACCATGTCGGAGAAAGAACCAGAGAAAG-3’；Reverse：5’-GGGAAATTCGAGCTCTCAGCTGGCACCCCCAC-3’)扩增获得。
基因枪转化操作和转化后培养同实施例1，统计计算MDH过表达阳性突变株得率为6％。
实施例8：
过程和条件同与实施例2，与实施例2不同之处在于：所用过表达转化质粒PEA7:PyAct1:PyMDH(其制备过程同实施例7)。
基因枪转化操作和转化后培养同实施例2，统计计算MDH过表达阳性突变株得率为10％。
实施例9：
过程和条件同与实施例3，与实施例3不同之处在于：此次实验所用金粉为0.6-1.5微米混合金粉(其中粒径0.6-0.8微米金粉占混合金粉质量的35％，平均粒径0.68微米；粒径大于0.8至1.5微米金粉占混合金粉质量的65％，平均粒径1.02微米)，所用过表达转化质粒PEA7:PyAct1:PyMDH(其制备过程同实施例7)。
基因枪转化操作和转化后培养同实施例3，统计计算MDH过表达阳性突变株得率为38％。
实施例10：
过程和条件同与实施例1，与实施例1不同之处在于：所用过表达转化质粒PEA7:PyAct1:PyPEPCK。PEPCK为来自于条斑紫菜的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)，该基因的CDS区由1656个碱基组成，利用引物对(Forward:5’-GTCACCTTCGCCACCATGCTGTCTAGACTCACCAGAAAGT-3’；Reverse：5’-GGGAAATTCGAGCTCTTAGAGCTTTGGTCCTCCGTTGAC-3’)扩增获得。
基因枪转化操作和转化后培养同实施例1，统计计算PEPCK过表达阳性突变株得率为8％。
实施例11：
过程和条件同与实施例2，与实施例2不同之处在于：所用过表达转化质粒PEA7:PyAct1:PyPEPCK(其制备过程同实施例10)。
基因枪转化操作和转化后培养同实施例2，统计计算PEPCK过表达阳性突变株得率为9％。
实施例12：
过程和条件同与实施例3，与实施例3不同之处在于：此次实验所用金粉为0.6-1.5微米混合金粉(其中粒径0.6-0.8微米金粉占混合金粉质量的40％，平均粒径0.75微米；粒径大于0.8至1.5微米金粉占混合金粉质量的60％，平均粒径1.2微米)，所用过表达转化质粒PEA7:PyAct1:PyPEPCK(其制备过程同实施例10)。
基因枪转化操作和转化后培养同实施例3，统计计算PEPCK过表达阳性突变株得率为36％。

Claims (7)

1.一种提高海藻过表达基因遗传转化效率的方法，其特征在于：
其为基因枪介导转化方法，将转化质粒与金粉混合，然后用基因枪将金粉轰击进海藻中，进行培养获得转基因苗；海藻为条斑紫菜；转化质粒为带有功能基因CDS区的过表达质粒；
所述金粉为不同粒径的混合金粉，混合金粉中粒径为0.6-0.8微米平均粒径0.65-0.75微米的金粉占混合金粉质量的30-50%，粒径为0.8-1.5微米且不为0.8微米平均粒径1.0-1.2微米的金粉占混合金粉质量的50-70%。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：混合金粉中粒径为0.6-0.8微米平均粒径0.68-0.72微米的金粉占混合金粉质量35-45%，粒径为0.8-1.5微米且不为0.8微米平均粒径1.05-1.15微米的金粉占混合金粉质量55-65%。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：具体过程为，
1）金粉溶液制备：称取 24-26 mg混合金粉，混合金粉中粒径0.6-0.8微米金粉占混合金粉质量的30-50%，粒径大于0.8至1.5微米金粉占混合金粉质量的50-70%, 加入容器中,向容器中加入0.8-1.5 ml 60- 80% V/V乙醇和0.8- 1.5 ml 超纯水，震荡洗涤，离心后，弃上清；用400-600 μl V/V为 45-55%甘油溶解，混匀；
2）微弹制备： 取上述金粉溶液48-50μl与6-8 μg转化质粒混匀，然后加入40-60 μl2.3-2.7M的 CaCl2 , 15-25 μl 0.1-0.15M的亚精胺，8000-12000 g离心2-5秒，弃上清，然后用48-50 μl无水乙醇溶解；
3）将48-50 μl微弹平均分配到4-6张载体膜上，然后用氦压1.2-1.5Mpa，真空压力达到3-5英寸汞柱时采用基因枪轰击实验材料海藻，每张载体膜对应8-10 mg新鲜海藻；
4）轰击后的海藻先黑暗培养18-30h后，再按照海藻的正常培养条件进行培养。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：
正常培养条件，用含抗生素的培养基培养6-8周后，挑选单棵条斑紫菜苗，每棵苗对应一个培养瓶培养，挑选10-20棵苗进行培养检验；培养4-6周待长成后，提取其基因组DNA，然后进行PCR扩增以筛选突变株。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：
黑暗培养为 15-19℃黑暗18-30h ；
正常培养为15-19℃，光照强度2500-3500 lux，光暗时间比10-12：14-12=L:D条件下培养。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述功能基因为紫菜的丙酮酸羧化酶PYC或其它来自条斑紫菜的功能基因PEPC，MDH和PEPCK中的一种。
7.按照权利要求1、2或6所述的方法，其特征在于：
功能基因CDS大小为1100-3400个碱基；
所述功能基因的CDS序列插入质粒的启动子终止子之间。
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