CN109355312A - 一种基于基因枪的海带转基因育种方法 - Google Patents

一种基于基因枪的海带转基因育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于基因枪的海带转基因育种方法，涉及转基因技术领域，该方法使用由游孢子附着培养而来的海带配子体为受体细胞进行基因枪转化，金粉用量为600μg/枪；外源质粒用量为1.0μg/枪；轰击次数2次；可裂膜规格为1100psi；轰击距离为9cm；真空度26inch Hg。该方法对影响基因枪转化效率的各项参数和细胞培养体系进行了优化，从而获得更适合海带基因枪的转化体系，提高了转化效率。

Description

一种基于基因枪的海带转基因育种方法
技术领域
本发明涉及转基因技术领域，尤其涉及一种基于基因枪的海带转基因育种方法。
背景技术
海带(Laminaria japonica)是一种生长在低温海水中的大型海生褐藻，具有明显的无性繁殖与有性繁殖世代交替现象，即有配子体世代和孢子体世代。藻体孢子囊释放游动孢子，放散的孢子为单细胞，是天然的原生质体，经萌发后形成配子体，配子体的卵囊和精囊结合形成合子，合子进一步萌发产生幼孢子体，经无性繁殖发育为海带。海带是我国一种重要的大型经济海藻，其用途广泛，主要应用于医药、食品、化工等方面。目前，我国海带养殖面积超过24万公顷，养殖产量83万吨，总体养殖产量占全球总量的29.8％，产量、规模处于世界领先地位。
目前，在我国主要经济海藻栽培方面，海带良种覆盖率总体不足30％，良种数量、优良种苗繁育能力严重不足，已成为制约我国海带产业持续、高效和稳定发展的重大瓶颈因素。目前应用的传统育种方法存在着育种周期长、品系纯度低、品系连续退化、成本高、风险大等缺点，随着分子生物学和基因组学等的飞速发展，分子育种应运而生，将现代生物技术手段整合于传统育种方法中，大幅度提高育种效率，缩短育种周期已成为现代育种的主流方向。
转基因技术(gene transfer)也称遗传转化技术(genetic transformation)是指同源或异源的游离DNA分子被感受态细胞摄取，并得以在新背景下(如细胞、组织、整体水平)表达和遗传的过程。根据感受态建立方式的不同，可以将遗传转化技术分为自然遗传转化和人工转化，人工转化包括基因枪法、聚乙二醇法、脂质体介导法、电击法、超声波法、激光法、显微注射法和低能离子束介导法等。由于基因枪法具有无宿主限制，靶受体材料类型广泛，操作简便快速等优点，在海带基因工程中是常用的遗传转化方法。
基因枪法的基本原理是利用高压气体作为驱动力，将吸附或包裹有DNA的金粉微粒高速发射，击中并穿透受体的细胞壁及细胞膜，达到导入外源DNA的目的。经研究结果表明，基因枪法对海带组织切块、雌配子体以及孢子体幼苗均有效，而且粒子轰击对雌配子体孤雌生殖没有抑制作用，采用其雌配子体，转入外源基因后，某些细胞可萌发为幼孢子体并最终发育为孢子体。基因枪轰击的随机性、对受体细胞的损伤、轰击过程中可能造成外源基因的断裂等导致了转化效率不高。
在基因枪操作过程中，可裂膜压力、DNA浓度、基因枪轰击次数、受体的生理因素、阻挡网与受体之间的距离和真空度等都能影响外源基因的转化效率。中国专利公布CN1057566C公开了一种生产转基因海带的方法，将外源基因用基因枪法转入海带雌配子体中，但未公开可裂膜压力、基因枪轰击次数、轰击距离和真空度等。中国专利公布CN107760721A公开了一种基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其中金粉用量750μg/枪、真空度28inch Hg、质粒用量1.5μg/枪、轰击距离9cm、轰击次数1次，其作用的受体是鹅掌楸的胚性愈伤组织和悬浮细胞系。中国专利公告CN101024844B公开了高羊茅高频基因枪转化方法，其中轰击距离为2.5cm，氦气压力为1100psi，轰击高度6cm，轰击2次，转化率为6％。
目前，对于基于基因枪技术的海带转基因方法有一定的理论研究，然而一方面是在实验室阶段，实际应用的效果未可知；另一方面，其转化率也不能完全满足实际生产需求。因此，需要找到满足实际生产需求且转化率更好的海带基因枪育种方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于基因枪的海带转基因育种方法。获得更适合海带基因枪的转化体系，提高转化效率。
如没有特殊说明，本发明中使用的“水”为双蒸水，本领域常规使用的简写为ddH2O。
本发明提供了一种基于基因枪的海带转基因育种方法，包括如下步骤：
(1)海带受体细胞的制备；
(2)基因枪子弹的制备；
(3)基因枪轰击；
(4)避光恢复培养；
(5)光照培养。
所述海带转基因育种方法的步骤(1)中，海带受体细胞的制备方法为：
选取发育良好的种海带，放散游孢子，将玻片用胶纸封闭边缘，留中间1.5cm×1.5cm空白用于附着游孢子，玻片平铺于托盘中过夜附着游孢子，镜检固着孢子数，收取玻片置于盛有灭菌海水的染缸中，4℃光照培养至配子体阶段。
所述海带转基因育种方法的步骤(2)中，基因枪子弹的制备方法为外源质粒混合包埋金粉。
进一步地，海带转基因育种方法的步骤(2)中，所述的金粉和外源质粒的质量比为2-3mg金粉：5μg外源质粒；优选为3mg金粉：5μg外源质粒。
具体地，海带转基因育种方法的步骤(2)中，基因枪子弹的制备方法包括以下步骤：
A.乙醇水溶液洗涤金粉；
B.无菌水重复洗涤金粉3次；
C.无菌水重悬金粉；
D.冰上操作：将外源质粒、CaCl2、亚精胺和步骤(3)得到的金粉悬液混合均匀后，静置；离心，弃上清；依次使用70％的乙醇水溶液和无水乙醇漂洗沉淀；弃去上清，用无水乙醇重悬沉淀，即得基因枪子弹。
在一些具体的实施方案中，海带转基因育种方法的步骤(2)中，基因枪子弹的制备方法包括以下步骤：
A.称取直径为1.0μm的金粉30mg置于1.5mL离心管中；加入1mL 70％乙醇水溶液，充分涡旋3-5min；静置15min；10000rpm离心10s，小心去除上清液，得到金粉沉淀；
B.在步骤(1)得到的金粉沉淀中加1mL无菌水，充分涡旋1min，静置15min，10000rpm离心10s，弃上清，保留沉淀；重复3次；
C.将步骤(2)最后一次得到的沉淀悬浮于500μl无菌水中，得到金粉水溶液；
D.冰上操作：将50μl步骤(3)得到的金粉水溶液转移到1.5mL离心管，充分涡旋5min后；依次加入5μg pPha-GFP外源质粒、50μl CaCl2(2.5mol/L)、20μl亚精胺(0.1mol/L，现配先用)，每加入一种试剂振荡几下，最后充分振荡3分钟；静置1min；)l0000rpm离心l0s，弃上清；140μl 70％乙醇水溶液漂洗沉淀，离心去上清；140μl无水乙醇漂洗沉淀，离心去上清；60μl无水乙醇重悬沉淀，振荡后，即得基因枪子弹。
所述海带转基因育种方法的步骤(3)中，基因枪轰击时，金粉用量为400-600μg/枪；优选为500-600μg/枪，更优选为600μg/枪。
所述海带转基因育种方法的步骤(3)中，基因枪轰击时，外源质粒用量为0.8-1.2μg/枪；优选为1.0-1.2μg/枪，更优选为1.0μg/枪。
所述海带转基因育种方法的步骤(3)中，基因枪轰击时，轰击次数1-2次；优选为轰击2次。
所述海带转基因育种方法的步骤(3)中，基因枪轰击时，可裂膜规格为1100-1350psi；优选为1100psi。
所述海带转基因育种方法的步骤(3)中，基因枪轰击时，轰击距离为3-9cm；优选为6-9cm，更优选为9cm。
所述海带转基因育种方法的步骤(3)中，基因枪轰击时，真空度25-27inch Hg，优选为26inch Hg，
所述海带转基因育种方法的步骤(4)中，避光恢复培养的培养条件为：培养温度10℃，培养时间24h；
所述海带转基因育种方法的步骤(4)中，避光恢复培养的培养基配方为灭菌海水；
所述海带转基因育种方法的步骤(5)中，光照培养的培养条件为：培养温度10℃，培养时间2-8d，光照强度30μEm-2s-1；
所述海带转基因育种方法的步骤(5)中，光照培养的培养基配方为灭菌海水。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
1、本发明提供的方法所用的受体来源与现有技术不同，现有技术直接取海带丝状雌配子体，利用机械物理手段使其松动散开并断裂，再恢复培养，而本发明所用的海带配子体是由游孢子附着培养而来，与现有技术相比，本发明所用的受体生理状态更好，更有利于基因枪转化。
2、本发明提供的方法对影响基因枪转化效率的各项参数进行优化，包括金粉用量、外源质粒用量、轰击次数、可裂膜规格为、轰击距离(即受体细胞和阻挡网的距离)和真空度等，从而获得更适合海带基因枪的转化体系，提高了转化效率。
附图说明
图1为基础实施例的步骤(2)中pPha-GFP外源质粒的图谱；
图2为基础实施例的步骤(4)中转化成功的海带配子体的荧光显微图片。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
本发明实施过程中使用到的仪器及耗材：
表1：仪器
表2：耗材
一、基础实施例：
(1)海带受体细胞的制备：
选取发育良好的种海带，放散游孢子，放散密度大于2-3个/视野(100*)将玻片用胶纸封闭边缘，留中间1.5cm×1.5cm空白用于附着游孢子，玻片平铺于托盘中过夜附着游孢子，镜检固着孢子数>200个/视野(100*)，收取玻片置于染缸中，4℃光照培养至配子体阶段，得到海带雌配子体，即受体细胞。
(2)基因枪子弹的制备：
①称取适量金粉置于1.5mL离心管中；加入1mL70％乙醇水溶液，充分涡旋3-5min；静置15min；10000rpm离心10s，小心去除上清液，得到金粉沉淀；
②将得到的金粉沉淀中加1mL无菌水，充分涡旋1min，静置15min，10000rpm离心10s，弃上清，保留沉淀；重复3次；
③将最后一次得到的沉淀悬浮于500μl无菌水中，得到金粉水溶液；
④冰上进行：将50μl金粉水溶液转移到1.5mL离心管，充分涡旋5min后；依次加入适量pPha-GFP外源质粒，其图谱如图1所示，50μl CaCl2(2.5mol/L)、20μl亚精胺(0.1mol/L，现配先用)，每加入一种试剂振荡几下，最后充分振荡3分钟；静置1min；)l0000rpm离心l0s，弃上清；140μl 70％乙醇水溶液漂洗沉淀，离心去上清；140μl无水乙醇漂洗沉淀，离心去上清；60μl无水乙醇重悬沉淀，振荡后，即得基因枪子弹。
(3)基因枪轰击：
本实施例采用Bio-Rad公司生产的PDS1000/He型高压氦气式基因枪对步骤(1)得到的海带雌配子体受体细胞进行轰击，具体过程为：
①在超净工作台中，用70％的乙醇将基因枪表面及内部擦拭消毒；阻挡网(购自Bio-Rad公司)预先在70％无水乙醇中浸泡20分钟，紫外灯下晾干待用；可裂膜(购自Bio-Rad公司)，DNA载片(购自Bio-Rad公司)在70％乙醇中蘸一下，晾干备用；
②打开电源开关，真空泵，氦气瓶阀(压力高于可裂膜压力200psi)，基因枪左下角两个黄铜旋钮，左边旋松，右边紧；将可裂膜装入灭菌后套筒，装入基因枪，一定用金属杆旋紧；取12μl金属颗粒无水乙醇悬液点于DNA载片中心，干燥；DNA载片及阻挡网装入发射装置中，阻挡网在下，DNA载片反向放置在上，旋上盖子；受体放置于适当的距离，关紧真空室门；
③按VAC(最上档)抽真空，按HOLD(最下档)，按FIRE轰击，按VENT(中间档)，当真空室压力恢复至零时取出样品。
(4)避光恢复培养：
轰击后1小时加入消毒海水，避光恢复培养：将轰击后的海带配子体置于玻璃皿中，加入灭菌海水，放置10℃培养室，避光恢复培养24h，观察表达情况。
因为配子体细胞死亡后其叶绿体的红色荧光消失，并会转为绿色，从而干扰对表达结果的判断，因此为了准确判定实验结果，按照如下标准来判断绿色荧光蛋白的表达情况：
a.假阳性判定标准：
眀视场观察：细胞形态不规则，叶绿体等色素体破裂；
荧光视场观察：细胞内部呈现出斑块状的暗绿色，或散的不连续的绿色亮点。
b.阳性判定标准：
眀视场观察：整个细胞形态完整，呈现健康的褐色；
荧光视场下观察：阴性配子体细胞内部仅有红色叶绿体荧光斑块分散在胞质中，但是细胞轮廓不清晰，因为细胞膜和细胞壁在荧光视场中都没有可见的荧光。阳性转化细胞内部充盈亮绿色，造成细胞轮廓比较清晰，红色的叶绿体影像散布在呈现绿色的胞质中。
观察时记录总阳性荧光数，随机选取九个视野统计活细胞、死细胞、总细胞数目，计算转化率。避光恢复培养24h后，转化成功的海带配子体的荧光显微图片如图2所示。
(5)光照培养：
将盛有轰击后海带配子体的玻璃皿中转移至10℃，光强30μE m-2s-1的培养室继续培养2-8d。
实施例1
与基础实施例的区别在于，外源质粒用量为1.0μg/枪，轰击次数2次，可裂膜规格为1100psi，轰击距离为9cm，真空度26inch Hg。设置三组实验组，金粉用量分别为：400μg/枪、500μg/枪和600μg/枪，对照组轰击不携带DNA的金粉颗粒。结果见表3。
表3：不同金粉用量对转化率的影响
由表3可看出，当金粉用量为600μg/枪时，转化率最大，达到了14.35％，死亡率最小。
实施例2
与基础实施例的区别在于，金粉用量分别为600μg/枪，轰击次数2次，可裂膜规格为1100psi，轰击距离为9cm，真空度26inch Hg。设置三组实验组，外源质粒用量：0.8μg/枪、1.0μg/枪和1.2μg/枪，对照组轰击不携带DNA的金粉颗粒。结果见表4。
表4：不同质粒用量对转化率的影响
由表4可看出，当外源质粒用量为1.0μg/枪时，转化率最大，达到了14.35％，死亡率最小。
实施例3
与基础实施例的区别在于，金粉用量分别为600μg/枪，外源质粒用量为1.0μg/枪，可裂膜规格为1100psi，轰击距离为9cm，真空度26inch Hg。设置两组实验组，轰击次数分别为：1次和2次，对照组轰击不携带DNA的金粉颗粒。结果见表5。
表5：不同轰击次数对转化率的影响
由表5可看出，当轰击次数为2次时，转化率最大，达到了14.35％，死亡率最小。
实施例4
与基础实施例的区别在于，金粉用量分别为600μg/枪，外源质粒用量为1.0μg/枪，轰击次数2次，轰击距离为9cm，真空度26inch Hg。设置两组实验组，可裂膜规格分别为：1100psi和1350psi，对照组轰击不携带DNA的金粉颗粒。结果见表6。
表6：不同可裂膜规格对转化率的影响
由表6可看出，当可裂膜规格为1100psi时，转化率最大，达到了14.35％，死亡率最小。
实施例5
与基础实施例的区别在于，金粉用量分别为600μg/枪，外源质粒用量为1.0μg/枪，轰击次数2次，可裂膜规格为1100psi，真空度26inch Hg。设置三组实验组，轰击距离分别为：3cm、6cm和9cm，对照组轰击不携带DNA的金粉颗粒。结果见表7。
表7：不同轰击距离对转化率的影响
由表7可看出，当轰击距离为9cm时，转化率最大，达到了14.35％，死亡率最小。
实施例6
与基础实施例的区别在于，金粉用量分别为600μg/枪，外源质粒用量为1.0μg/枪，轰击次数2次，可裂膜规格为1100psi。设置三组实验组，真空度分别为：25inch Hg、26inchHg和27inch Hg，对照组轰击不携带DNA的金粉颗粒。结果见表8。
表8：不同真空度对转化率的影响
由表8可看出，当真空度为26inch Hg时，转化率最大，达到了14.35％，死亡率最小。
综上，在基于基因枪的海带转基因育种过程中，当金粉用量为600μg/枪、外源质粒用量为1.0μg/枪、轰击次数2次、可裂膜规格为1100psi、轰击距离为9cm、真空度为26inchHg时，转化率最大，达到了14.35％，死亡率最小。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于基因枪的海带转基因育种方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)海带受体细胞的制备；
(2)基因枪子弹的制备；
(3)基因枪轰击；
(4)避光恢复培养；
(5)光照培养。
2.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(1)中海带受体细胞的制备方法为：
选取发育良好的种海带，放散游孢子，将玻片用胶纸封闭边缘，留中间1.5cm×1.5cm空白用于附着游孢子，玻片平铺于托盘中过夜附着游孢子，镜检固着孢子数，收取玻片置于染缸中，4℃光照培养至配子体阶段。
3.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(2)中基因枪子弹的制备方法为：外源质粒混合包埋金粉，具体包括以下步骤：
A.乙醇水溶液洗涤金粉；
B.无菌水重复洗涤金粉3次；
C.无菌水重悬金粉；
D.冰上操作：将外源质粒、CaCl2、亚精胺和步骤(3)得到的金粉悬液混合均匀后，静置；离心，弃上清；依次使用70％的乙醇水溶液和无水乙醇漂洗沉淀；弃去上清，用无水乙醇重悬沉淀，即得基因枪子弹。
4.根据权利要求3所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述的基因枪子弹的制备中金粉和外源质粒的质量比为2-3mg金粉：5μg外源质粒。
5.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(3)中，基因枪轰击时，金粉用量为400-600μg/枪；外源质粒用量为0.8-1.2μg/枪；轰击次数1-2次；可裂膜规格为1100-1350psi；轰击距离为3-9cm；真空度25-27inch Hg。
6.根据权利要求5所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(3)中，基因枪轰击时，金粉用量为600μg/枪；外源质粒用量为1.0μg/枪；轰击次数2次；可裂膜规格为1100psi；轰击距离为9cm；真空度26inch Hg。
7.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(4)中，避光恢复培养的培养条件为：培养温度10℃，培养时间24h。
8.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(4)中，避光恢复培养的培养基为灭菌海水。
9.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(5)中，光照培养的培养条件为：培养温度10℃，培养时间2-8d，光照强度30μE m-2s-1。
10.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(5)中，光照培养的培养基为灭菌海水。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112813095A (zh) * 2021-02-08 2021-05-18 中国科学院海洋研究所 一种提高海藻过表达基因遗传转化效率的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1524955A (zh) * 2003-02-26 2004-09-01 中国科学院海洋研究所 一种构建转基因大型海藻的方法
CN1827769A (zh) * 2006-01-26 2006-09-06 深圳大学 一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法
CN102771394A (zh) * 2012-07-27 2012-11-14 山东东方海洋科技股份有限公司 一种海带配子体克隆培育方法
CN106701816A (zh) * 2016-12-22 2017-05-24 青岛农业大学 一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法
CN106755051A (zh) * 2016-12-22 2017-05-31 中国农业大学烟台研究院 一种抗除草剂海带孢子体及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1524955A (zh) * 2003-02-26 2004-09-01 中国科学院海洋研究所 一种构建转基因大型海藻的方法
CN1827769A (zh) * 2006-01-26 2006-09-06 深圳大学 一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法
CN102771394A (zh) * 2012-07-27 2012-11-14 山东东方海洋科技股份有限公司 一种海带配子体克隆培育方法
CN106701816A (zh) * 2016-12-22 2017-05-24 青岛农业大学 一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法
CN106755051A (zh) * 2016-12-22 2017-05-31 中国农业大学烟台研究院 一种抗除草剂海带孢子体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DENG, XIANGYUAN等: "Microprojectile bombardment of Laminaria japonica gametophytes and rapid propagation of transgenic lines within a bubble-column bioreactor", 《PLANT CELL TISSUE AND ORGAN CULTURE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112813095A (zh) * 2021-02-08 2021-05-18 中国科学院海洋研究所 一种提高海藻过表达基因遗传转化效率的方法
CN112813095B (zh) * 2021-02-08 2022-06-24 中国科学院海洋研究所 一种提高海藻过表达基因遗传转化效率的方法

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