CN107663524A

CN107663524A - 一种调控草莓匍匐茎发生的FvGAIP基因及其应用

Info

Publication number: CN107663524A
Application number: CN201710851020.3A
Authority: CN
Inventors: 张志宏; 李伟佳; 张俊祥; 孙洪影
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2037-09-20
Also published as: CN107663524B

Abstract

本发明涉及一种调控草莓匍匐茎发生的FvGAIP基因及其应用，属于分子生物学中的基因工程领域，草莓匍匐茎发生的草莓FvGAIP基因的全长编码区序列如序列表SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明提供草莓匍匐茎发生调控基因FvGAIP并用于构建FvGAIP基因的沉默载体，构建的植物表达载体经农杆菌转化草莓，获得转基因草莓植株并产生匍匐茎，表明该基因具有调控草莓匍匐茎发生的功能。

Description

一种调控草莓匍匐茎发生的FvGAIP基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种调控草莓匍匐茎发生的FvGAIP基因及其应用。

背景技术

草莓果实果肉多汁、风味浓郁，含有丰富的营养物质和具有很高的经济价值，已成为栽培最为广泛的浆果之一。目前我国草莓种植面积200万亩，年产草莓200万吨，种植面积和产量均居世界第一位。

草莓优质、高产的关键问题是培育优质壮苗，生产上常用的是匍匐茎分株繁殖和组织培养繁殖。匍匐茎是草莓重要的繁殖器官，其从腋芽发育而来。在长日照(LD)条件下，腋芽分化成匍匐茎，而在短日照(SD)条件下，则形成花序(Hartmann,1947)。光周期会影响腋芽向着匍匐茎或者花序轴的方向发育，同时温度也对其起作用。国外学者对草莓匍匐茎抽生进行了QTL作图的初步研究。在森林草莓中，匍匐茎被认为是由一个显性单基因R调控(Brown and Wareing,1965)。而在Madeira群岛发现了一个具有表型相反的arborea(arb)突变体，可持续产生匍匐茎。有学者将该突变体与栽培品种‘Baron Solemacher’进行杂交分析，发现树状性状是由一个隐性基因控制的，该基因对R基因具有上位效应(Guttridge,1973)。利用森林草莓(F.vesca)x西藏草莓(F.nubicola)的遗传群体进行作图定位，R基因被定位于连锁群Ⅱ的中间区域的0.49cM区间内(Sargent et al.,2004)，但是该位点的分离比并不符合3:1分离比例，说明该定位不是很准确。

综上所述，关于草莓匍匐茎的遗传研究，至今只是遗传规律分析和基因的初步定位，尚无匍匐茎发生基因克隆和鉴定的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控草莓匍匐茎发生的FvGAIP基因，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的调控草莓匍匐茎发生的FvGAIP基因编码的蛋白质具有序列表中SEQ IDNO.2所述的氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供利用RNAi沉默FvGAIP基因调控草莓匍匐茎发生的方法。

本发明的技术问题可通过如下技术方案解决：

草莓赤霉素信号转导途径负调控DELLA基因FvGAIP，选取其中335bp片段进行干扰载体构建。

(1)RNAi干扰靶序列的获得：

提取草莓叶片中的总RNA，然后将RNA反转录成cDNA；

以cDNA为模板，针对FvGAIP基因的保守区段，设计两对特定引物GAIP-RNAi-F1和GAIP-RNAi-R1，在上游引物GAIP-RNAi-F1上引入XhoⅠ酶切位点，下游引GAIP-RNAi-R1上引入EcoRⅠ酶切位点；GAIP-RNAi-F2和GAIP-RNAi-R2，在上游引物GAIP-RNAi-F2上引入XbaⅠ酶切位点，下游引物GAIP-RNAi-R2上引入HindⅢ酶切位点；PCR扩增得到引入相应酶切位点的FvGAIP基因的正反向片段；

其中，所述的特定引物是：

GAIP-RNAi-F1：5-GCCTCGAGGCTTCTGGCTGTGTTGGGTT-3’

GAIP-RNAi-R1：5’-CTGAATTCTGCTCTTGGTGTTCATGCTTTG-3’

GAIP-RNAi-F2：5’-GCTCTAGAGCTTCTGGCTGTGTTGGGTT-3’

GAIP-RNAi-R2：5’-CTAAGCTTTGCTCTTGGTGTTCATGCTTTG-3’

注：GAIP-RNAi-F1、GAIP-RNAi-R1、GAIP-RNAi-F2和GAIP-RNAi-R2引物序列中前八个碱基，即GCCTCGAG、CTGAATTC、GCTCTAGA和CTAAGCTT，是保护碱基和酶切位点，是为构建载体而人为引入的碱基，不属于FvGAIP基因序列。

(2)RNAi干扰载体构建：

(a)将带有酶切位点的FvGAIP基因的正反向片段，连接到克隆载体pGM-T上，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pGM-GAIP-S和pGM-GAIP-A；

(b)正向片段S的获得：限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ对阳性质粒pGM-GAIP-S进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，

(c)中间载体pGAIP-S的获得：限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ中间

载体pKANNIBAL进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，然后用T4DNA连接酶将回收产物与正向片段S连接，并将连接产物转化至

大肠杆菌感受态TOP10中，挑取阳性克隆验证，得到中间载体pGAIP-S；

(d)反向片段A的获得：限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ对阳性质粒pGM-GAIP-A进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收；

(e)中间载体pGAIP-SA的获得：限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ分别对阳性质粒pGM-GAIP-A和中间载体pGAIP-S进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，然后用T4DNA连接酶将回收产物连接，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态TOP10中，挑取阳性克隆验证，得到以pKANNIBAL载体上的内含子intron作为间隔区、具有发卡结构反向互补序列的中间载体pGAIP-SA；

(f)发卡结构片段的获得：用NotⅠ单酶切中间载体pGAIP-SA，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收发卡结构片段；所述发卡结构片段的序列为序列表中SEQ IDNO.3所示。

(g)RNAi干扰载体RNAi-FvGAIP的获得：用NotⅠ单酶切pART27载体，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，然后用T4DNA连接酶将回收产物与发卡结构片段连接，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态TOP10中，挑取阳性克隆验证，得到可用于草莓遗传转化的RNAi干扰载RNAi-FvGAIP。

(3)遗传转化、转基因草莓的培育及匍匐茎鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体RNAi-FvGAIP质粒DNA，用冻融法转入农杆菌，用叶盘法遗传转化草莓，分子检测获得阳性转基因植株，并进行转基因草莓匍匐茎性状鉴定。上述的草莓赤霉素信号转导途径负调控DELLA基因FvGAIP，所述的草莓为二倍体森林草莓"Yellow Wonder”和“Ruegen”。

本发明的有益效果：

1.本发明构建的含草莓赤霉素信号转导途径负调控DELLA基因FvGAIP的RNAi沉默载体,为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，获得FvGAIP沉默新种质。

2.本发明草莓赤霉素信号转导途径负调控DELLA基因FvGAIP的是一个新的草莓赤霉素信号转导途径负调控DELLA基因FvGAIP，该基因为赤霉素信号转导途径的重要成员之一。通过实验，将草莓FvGAIP基因在森林草莓中进行沉默，降低其在草莓中表达量，在温室培养3个月的转基因草莓与对照相比，产生了大量匍匐茎。说明沉默草莓FvGAIP基因起到了促进匍匐茎发生的功能。

附图说明

图1为FvGAIP基因编码区序列的扩增结果。

图2为植物表达载体RNAi-FvGAIP构建方法示意图。

图3为转基因植株PCR鉴定电泳图；

其中，M：DL5000Marker；转基因植株及对照植株标注如图所示。

图4为RNAi干扰FvGAIP转基因植株的表型。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂盒生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

实施例1：草莓FvGAIP基因的克隆

以二倍体森林草莓‘Ruegen’为试材，材料在温室大棚中生长。

RNA提取：用CTAB法进行试验材料的总RNA提取，整个操作过程按照CTAB法RNA提取流程，然后再以该总RNA为模板反转录得到cDNA第一链。

基因的克隆：以反转录的果实cDNA第一链为模板，利用引物FvGAIP-F和FvGAIP-R进行PCR扩增，回收PCR产物，获得1836bp的目的片段如图1所示。

FvGAIP-F：ATGAAAAGAGAGCATCAC；

FvGAIP-R：TCAGTGAGTCATCACCGCTTG。

胶回收目的片段之后，将其连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10(购自北京天根生物技术有限公司)，筛选阳性单菌落，提取质粒，测序序列SEQ ID NO.1所示。

实施例2：植物表达载体RNAi-FvGAIP的构建如图2所示

利用Primer Primer 5.0软件分析设计引物并扩增FvGAIP正反片段

GAIP-RNAi-F1：5-GCCTCGAGGCTTCTGGCTGTGTTGGGTT-3’

GAIP-RNAi-R1：5’-CTGAATTCTGCTCTTGGTGTTCATGCTTTG-3’

GAIP-RNAi-F2：5’-GCTCTAGAGCTTCTGGCTGTGTTGGGTT-3’

GAIP-RNAi-R2：5’-CTAAGCTTTGCTCTTGGTGTTCATGCTTTG-3’

以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应；

PCR反应体系为：取1μL cDNA加入Taq DNA聚合酶0.2μL,10×PCR Buffer 2μL,dNTPs(2.5mmol·L^-1)1.6μL,正反向引物各0.5μL，最后用水补足到20μL；

PCR反应程序:94℃3min；94℃30s,57℃30s,72℃30s,35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；产物进行琼脂糖凝胶电泳；

3.使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

回收后，将回收的PCR产物与pGM-T载体进行连接，操作步骤按天根公司产品pGM-T试剂盒说明书进行。

PCR反应体系为：取7μL回收的PCR产物，1μL T₄DNA连接酶，10×T₄DNA连接酶Buffer1μL，T₄载体1μL；

PCR反应程序：16℃连接16h；

然后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,在表面涂有24μg·mL^-1异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和40μg·mL^-15-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的含Amp(60μg·mL^-1)的LB培养基平板上，37℃培养12-16h。挑取单个白色克隆,分别涂布于新的含有Amp(60μg·mL^-1)的LB培养基平板上(二转),37℃培养12-16h,之后进行菌落PCR扩增。将验证正确的菌株培养后,送北京华大公司测序,得到序列如序列表中草莓FvGAIP基因序列所示，即重组载体pGM-GAIP-S和pGM-GAIP-A的构建成功。

1.正向片段S的获得：

限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ对阳性质粒pGM-GAIP-S进行双酶切，双酶切体系(20μL)：pGM-ARF4/pRI101-AN 16μL，10×H Buffer 2μL，Nde I和Sal I各1μL；37℃酶切,4h；取质粒pGM-GAIP-S双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物。

2.中间载体pGAIP-S的获得：

限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ对中间载体pKANNIBAL进行双酶切，酶切体系同上，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，然后用T₄DNA连接酶将回收产物与正向片段S连接，连接体系为：取7μL回收的正向片段，1μL T₄DNA连接酶，10×T₄DNA连接酶Buffer 1μL，pKANNIBAL载体1μL；并将连接产物转化至大肠杆菌感受态TOP10中，挑取阳性克隆验证，得到中间载体pGAIP-S；

3.反向片段A的获得：

限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ对阳性质粒pGM-GAIP-A进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收；所述发卡结构片段的序列为序列表中SEQ ID NO.3所示。

4.中间载体pGAIP-SA的获得：限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ分别对阳性质粒pGM-GAIP-A和中间载体pGAIP-S进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，然后用T4DNA连接酶将回收产物连接，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态TOP10中，挑取阳性克隆验证，得到pKANNIBAL载体上的内含子intron作为间隔区、具有发卡结构反向互补序列的中间载体pGAIP-SA；

5.发卡结构片段的获得：用NotⅠ单酶切中间载体pGAIP-SA，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收发卡结构片段；

6.RNAi干扰载体RNAi-FvGAIP的获得：用NotⅠ单酶切pART27载体，

将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，然后用T4DNA连接酶将回收产物与发卡结构片段连接，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态TOP10中，挑取阳性克隆验证，并进行双酶切验证，得到可用于草莓遗传转化的RNAi干扰载RNAi-FvGAIP。

实施例3：RNAi干扰FvGAIP转化森林草莓及其基因功能鉴定

1.农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化

将冻存的农杆菌EHA105菌液在含有50mg/L利福平(Rif)的YEP(pH＝7.0)固体培养基上划线培养，28℃倒置培养48h，出现菌斑挑取农杆菌EHA105单菌落接种于含有50mg/LRif的YEP(pH＝7.0)液体培养基中，28℃，200rpm/min振荡培养过夜(约16h)取上述菌液按1:50比例接种于50mL含有50mg/L Rif的YEP(pH＝7.0)液体培养基中，28℃，150rpm/min振荡培养至OD₆₀₀为0.5左右，取1.5mL摇好的菌液，冰上冷却10min，4℃，5000rpm/min离心5min，弃上清液液，收集菌体加入等体积冰预冷的25mM CaCl₂溶液重悬沉淀，冰上放置20min，4℃，5000rpm/min离心5min，弃上清液，每管加入50μL预冷的25mMCaCl₂溶液重悬沉淀,冰上放置20min后使用。剩余的感受态细胞在液氮中速冻后于-80℃超低温冰箱中保存。

2.将RNAi-FvGAIP质粒DNA迅速加入制备好的50μL农杆菌感受态细胞中(约10μL)，轻混，冰浴5min后于液氮中速冻l min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min，然后加入800μL YE(pH＝7.0)液体培养基，28℃，160rpm/min震荡培养，4-6h后离心后剩约100μL菌液涂布于含50mg/L Rif和50mg/L Kan的YEP(pH＝7.0)固体培养基中，28℃倒置培养48h，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于草莓叶片转化。

3.挑取已活化的含RNAi-FvGAIP质粒的EHA105农杆菌单菌落。在添加了50mg/LKan和100mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃条件下200rpm/min振荡培养，直至OD₆₀₀值达到0.8。然后将lmL的菌液移入到新的YEP液体培养基中，继续28℃200rpm/min振荡培养，直至OD₆₀₀为0.5。然后在25℃条件下，5000rpm/min离心5min收集菌体后，用等量MS液体培养基重悬备用。

4.将在三角瓶内继代生长30天的组织培养苗的叶片剪成1㎝大小，置于步骤2中重悬好的菌液中，轻轻摇晃8min后取出，用无菌的干滤纸吸干叶块上多余的农杆菌菌液，然后置于再生培养基上。在黑暗条件下培养7d后，将草莓叶片转移到加入250mg/L cef和100mg/L Kan的再生培养基中进行抗性芽筛选。在抗性芽再生出后，将抗性芽转移到新的附加250mg/L cef、100mg/L Kan的增殖培养基中进行增殖培养直到获得转化植株。

5.PCR鉴定及基因功能初步鉴定:

待抗性苗长至7-8片叶，提取草莓转基因植株幼嫩叶片RNA，进行RT-PCR检测目的基因是否转入

上游引物:5'-GCGATAAAGGAAAGGC-3',

下游引物:5'-CGAAGCCAGATGAGACAGC-3',

结果如图3所示，从图3可见,转基因植株出现了350bp片段，而对照植株没有，说明草莓FvGAIP沉默载体成功导入草莓中。

6.对转基因草莓表型观察

非转基因的草莓组织培养植株(4株)设为空白对照组，转入FvGAIP沉默载体植株(10株)设为试验组，将两组组织培养植株同时移栽至温室，在相同栽培条件下，培养3个月后，分别测量两组草莓的匍匐茎数量。空白对照组均没有匍匐茎，试验组均产生匍匐茎数量如图4所示。可见，沉默草莓FvGAIP的草莓匍匐茎数量增加(如表1所示)，说明FvGAIP基因的表达影响了草莓发育，即抑制草莓FvGAIP基因的表达，进一步说明草莓FvGAIP基因负调控草莓匍匐茎的发生。

表1：转基因植株和对照植株匍匐茎数目比较

植株	匍匐茎数量
		Control(YW)	0
RNAi-YW1#	5.00±0.71**
		RNAi-YW3#	4.80±0.84**
RNAi-YW10#	4.20±0.84**
		Control(RG)	0
RNAi-RG5#	5.20±0.84**
		RNAi-RG14#	4.80±0.84**
RNAi-RG15#	4.20±0.84**

**代表(P＜0.01)水平存在显著差异。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 一种调控草莓匍匐茎发生的FvGAIP基因及其应用

<130> 20170919

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1836

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

atgaaaagag agcatcacag tcacccccac caccctaatc caaacccatc cgtggcttcc 60

acttccaacg ataaggccgg taaggcggcg atgtgggagg agtcccagca cgacgacggc 120

atggatgagc ttctggctgt gttgggttac aaggtgaagt catcaagcat ggccgatgtg 180

gcccagaaga ttgaacagct tgaagagttc atggggactg ttcagcaaga tgggctgtct 240

catctggctt cggatactgt tcattacaat ccgtcggatc tgtcgaattg gctggagagc 300

atgatttcgg agattactcc gccttcgaat ttcgagccgg taatggcgcc gccaccgccg 360

ctgggcagct ctgttatgat gaacgattcg tttttggctc cggccgaatc ttccaccata 420

acctctatag attttgcaga tcaaagcatg aacaccaaga gcaaatctgt aagtccaaga 480

acccagtttg aggactgctc ttcttcttcc aattacgagc tgaaagctat acctggtaag 540

gccatcttca gtcagcaaac ccagttcgat tcttccccaa gagagcccaa acgactcaaa 600

ccctcgccgg atttctactc caccacctcc tcctcctccc tccagcccgt ctccctcccc 660

ctccccaccg ccgcggagtc aactcgcccg gtggtggttg tcgattcgca agaaaacgga 720

gtcagattag tccacggtct catggcctgc gccgaagccg tccagcagaa caacctcaac 780

ctagccaagg ccctggtcac ccagatcagc tacttagcta tttcccaagc cggcgctatg 840

cgtaaagtcg ccaccttctt cgccgaggct ctagcccagc ggatcttccg ggtctacccc 900

gccgctccga tcgaccactc ctactccgag atgctccaga tgcacttcta cgagacctgc 960

ccttacctca aattcgctca tttcacagct aatcaagcca ttctagaagg tttccaaggc 1020

aagaagcggg ttcatgtcat cgatttctcc atgaaccaag ggatgcaatg gcctgctctg 1080

atgcaggccc tcgctctccg ccccggcggc ccgcccgtgt tccgccttac cggaatcggc 1140

ccaccggcgg cggacaactc ggaccatctc caagaagttg ggtggaaact ggcgcagcta 1200

gcggagacca tacatgtgga attcgagtac agagggtttg ttgctaacag cttagctgat 1260

ctagatgctt ctatgctgga gctcagaccc agcgaggtcg agtcggtcgc ggttaactcg 1320

gtgttcgagc tgcacaagct gttagctcgg cccggtgcga tcgagaaagt gctgtccgtt 1380

gtgaagcaga tgaagccgga gatcgttacg gtggtagagc aggaggcgaa ccacaacggt 1440

ccggtttttc tgaaccggtt caatgagtcg cttcactatt actcgaccct gtttgactcg 1500

ctggagggtt cggtcaacag tcaagataaa atgatgtccg aggtgtactt ggggaagcaa 1560

atcttcaatg tggtggcatg tgagggcgtc gagcgggtgg agcgccacga gacgctggct 1620

cagtggcgaa cccggttcga caagtccggt tttactccgg ttcatctcgg ttccaacgcg 1680

ttcaagcagg ccagcatgct tctggccctc ttcgccggcg gagatgggta cagagtggag 1740

gagaacgacg ggtgtttgat gttagggtgg catactcggc cgctcattgc cacctcggcc 1800

tggaaactcg gcgcccaagc ggtgatgact cactga 1836

<210> 2

<211> 611

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 2

Met Lys Arg Glu His His Ser His Pro His His Pro Asn Pro Asn Pro

1 5 10 15

Ser Val Ala Ser Thr Ser Asn Asp Lys Ala Gly Lys Ala Ala Met Trp

20 25 30

Glu Glu Ser Gln His Asp Asp Gly Met Asp Glu Leu Leu Ala Val Leu

35 40 45

Gly Tyr Lys Val Lys Ser Ser Ser Met Ala Asp Val Ala Gln Lys Ile

50 55 60

Glu Gln Leu Glu Glu Phe Met Gly Thr Val Gln Gln Asp Gly Leu Ser

65 70 75 80

His Leu Ala Ser Asp Thr Val His Tyr Asn Pro Ser Asp Leu Ser Asn

85 90 95

Trp Leu Glu Ser Met Ile Ser Glu Ile Thr Pro Pro Ser Asn Phe Glu

100 105 110

Pro Val Met Ala Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ser Ser Val Met Met Asn

115 120 125

Asp Ser Phe Leu Ala Pro Ala Glu Ser Ser Thr Ile Thr Ser Ile Asp

130 135 140

Phe Ala Asp Gln Ser Met Asn Thr Lys Ser Lys Ser Val Ser Pro Arg

145 150 155 160

Thr Gln Phe Glu Asp Cys Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Glu Leu Lys Ala

165 170 175

Ile Pro Gly Lys Ala Ile Phe Ser Gln Gln Thr Gln Phe Asp Ser Ser

180 185 190

Pro Arg Glu Pro Lys Arg Leu Lys Pro Ser Pro Asp Phe Tyr Ser Thr

195 200 205

Thr Ser Ser Ser Ser Leu Gln Pro Val Ser Leu Pro Leu Pro Thr Ala

210 215 220

Ala Glu Ser Thr Arg Pro Val Val Val Val Asp Ser Gln Glu Asn Gly

225 230 235 240

Val Arg Leu Val His Gly Leu Met Ala Cys Ala Glu Ala Val Gln Gln

245 250 255

Asn Asn Leu Asn Leu Ala Lys Ala Leu Val Thr Gln Ile Ser Tyr Leu

260 265 270

Ala Ile Ser Gln Ala Gly Ala Met Arg Lys Val Ala Thr Phe Phe Ala

275 280 285

Glu Ala Leu Ala Gln Arg Ile Phe Arg Val Tyr Pro Ala Ala Pro Ile

290 295 300

Asp His Ser Tyr Ser Glu Met Leu Gln Met His Phe Tyr Glu Thr Cys

305 310 315 320

Pro Tyr Leu Lys Phe Ala His Phe Thr Ala Asn Gln Ala Ile Leu Glu

325 330 335

Gly Phe Gln Gly Lys Lys Arg Val His Val Ile Asp Phe Ser Met Asn

340 345 350

Gln Gly Met Gln Trp Pro Ala Leu Met Gln Ala Leu Ala Leu Arg Pro

355 360 365

Gly Gly Pro Pro Val Phe Arg Leu Thr Gly Ile Gly Pro Pro Ala Ala

370 375 380

Asp Asn Ser Asp His Leu Gln Glu Val Gly Trp Lys Leu Ala Gln Leu

385 390 395 400

Ala Glu Thr Ile His Val Glu Phe Glu Tyr Arg Gly Phe Val Ala Asn

405 410 415

Ser Leu Ala Asp Leu Asp Ala Ser Met Leu Glu Leu Arg Pro Ser Glu

420 425 430

Val Glu Ser Val Ala Val Asn Ser Val Phe Glu Leu His Lys Leu Leu

435 440 445

Ala Arg Pro Gly Ala Ile Glu Lys Val Leu Ser Val Val Lys Gln Met

450 455 460

Lys Pro Glu Ile Val Thr Val Val Glu Gln Glu Ala Asn His Asn Gly

465 470 475 480

Pro Val Phe Leu Asn Arg Phe Asn Glu Ser Leu His Tyr Tyr Ser Thr

485 490 495

Leu Phe Asp Ser Leu Glu Gly Ser Val Asn Ser Gln Asp Lys Met Met

500 505 510

Ser Glu Val Tyr Leu Gly Lys Gln Ile Phe Asn Val Val Ala Cys Glu

515 520 525

Gly Val Glu Arg Val Glu Arg His Glu Thr Leu Ala Gln Trp Arg Thr

530 535 540

Arg Phe Asp Lys Ser Gly Phe Thr Pro Val His Leu Gly Ser Asn Ala

545 550 555 560

Phe Lys Gln Ala Ser Met Leu Leu Ala Leu Phe Ala Gly Gly Asp Gly

565 570 575

Tyr Arg Val Glu Glu Asn Asp Gly Cys Leu Met Leu Gly Trp His Thr

580 585 590

Arg Pro Leu Ile Ala Thr Ser Ala Trp Lys Leu Gly Ala Gln Ala Val

595 600 605

Met Thr His

610

<210> 3

<211> 1499

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

ctcgaggctt ctggctgtgt tgggttacaa ggtgaagtca tcaagcatgg ccgatgtggc 60

ccagaagatt gaacagcttg aagagttcat ggggactgtt cagcaagatg ggctgtctca 120

tctggcttcg gatactgttc attacaatcc gtcggatctg tcgaattggc tggagagcat 180

gatttcggag attactccgc cttcgaattt cgagccggta atggcgccgc caccgccgct 240

gggcagctct gttatgatga acgattcgtt tttggctccg gccgaatctt ccaccataac 300

ctctatagat tttgcagatc aaagcatgaa caccaagagc agaattcggt accccaattg 360

gtaaggaaat aattattttc ttttttcctt ttagtataaa atagttaagt gatgttaatt 420

agtatgatta taataatata gttgttataa ttgtgaaaaa ataatttata aatatattgt 480

ttacataaac aacatagtaa tgtaaaaaaa tatgacaagt gatgtgtaag acgaagaaga 540

taaaagttga gagtaagtat attattttta atgaatttga tcgaacatgt aagatgatat 600

actagcatta atatttgttt taatcataat agtaattcta gctggtttga tgaattaaat 660

atcaatgata aaatactata gtaaaaataa gaataaataa attaaaataa tattttttta 720

tgattaatag tttattatat aattaaatat ctataccatt actaaatatt ttagtttaaa 780

agttaataaa tattttgtta gaaattccaa tctgcttgta atttatcaat aaacaaaata 840

ttaaataaca agctaaagta acaaataata tcaaactaat agaaacagta atctaatgta 900

acaaaacata atctaatgct aatataacaa agcgcaagat ctatcatttt atatagtatt 960

attttcaatc aacattctta ttaatttcta aataatactt gtagttttat taacttctaa 1020

atggattgac tattaattaa atgaattagt cgaacatgaa taaacaaggt aacatgatag 1080

atcatgtcat tgtgttatca ttgatcttac atttggattg attacagttg ggaaattggg 1140

ttcgaaatcg ataagctttg ctcttggtgt tcatgctttg atctgcaaaa tctatagagg 1200

ttatggtgga agattcggcc ggagccaaaa acgaatcgtt catcataaca gagctgccca 1260

gcggcggtgg cggcgccatt accggctcga aattcgaagg cggagtaatc tccgaaatca 1320

tgctctccag ccaattcgac agatccgacg gattgtaatg aacagtatcc gaagccagat 1380

gagacagccc atcttgctga acagtcccca tgaactcttc aagctgttca atcttctggg 1440

ccacatcggc catgcttgat gacttcacct tgtaacccaa cacagccaga agctctaga 1499

Claims

1.一种草莓匍匐茎发生调控基因FvGAIP，其特征在于，其编码区序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述的草莓匍匐茎发生调控基因的引物，其特征在于，包含：所述的特定引物是：

FvGAIP-F：ATGAAAAGAGAGCATCAC；

FvGAIP-R：TCAGTGAGTCATCACCGCTTG。

3.一种由权利要求1所述的草莓匍匐茎发生调控基因FvGAIP编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种含有权利要求1所述的草莓匍匐茎发生调控基因FvGAIP的重组植物沉默表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组植物沉默表达载体，其特征在于，所述的重组植物沉默表达载体中的载体为pART27。

6.一种用于构建权利要求4所述的草莓匍匐茎发生调控基因FvGAIP的重组植物沉默表达载体的引物，其特征在于，包含：所述的特定引物是：

GAIP-RNAi-F1：5’-GCCTCGAGGCTTCTGGCTGTGTTGGGTT-3’

GAIP-RNAi-R1：5’-CTGAATTCTGCTCTTGGTGTTCATGCTTTG-3’

GAIP-RNAi-F2：5’-GCTCTAGAGCTTCTGGCTGTGTTGGGTT-3’

GAIP-RNAi-R2：5’-CTAAGCTTTGCTCTTGGTGTTCATGCTTTG-3’

注：GAIP-RNAi-F1、GAIP-RNAi-R1、GAIP-RNAi-F2和 GAIP-RNAi-R2引物序列中前八个碱基，即GCCTCGAG、CTGAATTC、GCTCTAGA和CTAAGCTT，是保护碱基和酶切位点，是为构建载体而人为引入的碱基，不属于FvGAIP基因序列。

7.一种含有权利要求4所述的重组植物表达载体的植物细胞系。

8.一种含有权利要求4所述的重组植物表达载体的植物转化体。

9.根据权利要求7所述的植物转化体，其特征在于，所述的植物转化体中的受体植物为森林草莓。

10.权利要求1所述的草莓匍匐茎发生调控基因FvGAIP在调控草莓匍匐茎发生中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的草莓为二倍体森林草莓。