CN111471691A - FveCHA1基因及RNAi载体在促进草莓愈伤形成及离体芽再生中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种FveCHA1基因及RNAi载体在促进草莓愈伤形成及离体芽再生中的应用。本发明从森林草莓中筛选得到森林草莓FveCHA1基因，构建得到森林草莓FveCHA1基因的植物抑制表达载体GN2300‑FveCHA1，进而转染得到转基因工程菌，转入二倍体森林草莓‘Ruegen’中，获得FveCHA1基因的RNAi表达干扰株系。在离体叶片组织培养条件下，FveCHA1基因抑制表达株系的愈伤形成和芽点再生时间早于野生型，表明下调森林草莓FveCHA1基因可促进森林草莓草莓愈伤形成及离体芽再生。本发明对优化草莓再生体系和促进植物快繁具有重要意义。

Description

FveCHA1基因及RNAi载体在促进草莓愈伤形成及离体芽再生 中的应用

技术领域

本发明涉及一种草莓离体再生的调控，具体涉及一种FveCHA1基因及RNAi载体在促进草莓愈伤形成和离体芽再生中的应用。

背景技术

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)属于浆果类果树，其果肉味道鲜美且散发着浓郁芳香，营养价值高，是一种重要的经济作物。它属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragariaspp.)，是多年生草本植物，植株矮小，呈半平卧丛状生长。二倍体森林草莓(Fragariavesca)(2n＝2x＝14)与栽培草莓亲缘关系最相近，且易于遗传转化，有基因组小、再生周期短、植株较小等优势，森林草莓是一种研究草莓组织培养的理想模式植物，对森林草莓的组织培养的研究可以作为其他草莓的一种参考。因此，理解草莓的发育调控机制能够促进草莓育种和生产的发展。

植物在受到伤害，侵染或被嫁接时，在各种生物和非生物的刺激下，会自然形成愈伤组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。愈伤的形成可减少水分蒸腾、氧化变质，还可阻止病菌侵入，从而恢复被破坏的表面保护结构。来自完整植株的一些部位可用作外植体以形成愈伤组织。良好的外植体材料通常是一种或几种细胞类型的幼嫩组织，幼茎的髓细胞通常是外植体材料的良好来源。起初，愈伤组织细胞增殖而没有分化，并且分化最终发生在组织内。活跃的分裂细胞一般是愈伤组织中最上层和外围的细胞，整体分化的程度通常取决于培养介质的激素平衡和愈伤组织的生理状态。愈伤组织的形成是组织培养研究和应用的核心。愈伤组织可以繁殖，然后用于克隆完整的植株。另外，许多基因工程技术在DNA插入细胞后启动愈伤组织程序，然后从转化的愈伤组织再生转基因植物。在其他实验技术中，产生愈伤组织用于生物技术程序，例如悬浮培养物的形成，可以收获有价值的植物产物。

不定芽是指从植物的根、叶、茎的节点长出的芽。不定芽离体再生(in vitroshoot regeneration)被定义为在组织培养流程中，从植物体细胞分化出不定芽的过程。植物的不定芽再生过程与许多基因相关，科学家们在拟南芥中鉴别出与芽再生相关的一些重要的基因。例如，Hwang最近发现与编码细胞分裂素信号传导途径的组分相关的基因会影响芽的形成。在组织培养过程中，通常将根外植体先在放在富含生长素的愈伤组织诱导培养基(Callus Induction Medium)上孵育，随后将外植体转移到富含细胞分裂素的芽诱导培养基(Shoot Induction Medium)中，在此期间，外植体逐渐形成芽。植物不定芽的再生过程被分为三个主要部分：首先，激素诱导体细胞产生反应，随后产生反应的体细胞发生特异性细胞分裂，最后，这些特异性分裂的细胞开始向不定芽再生的方向发展。DNA甲基化(DNAmethylation)是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，是目前表观遗传学研究的热点之一。它是由DNA甲基化和DNA去甲基化共同调节的。广义的DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作为甲基供体，通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程。这种DNA甲基化修饰可以发生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位及鸟嘌呤的N-7位等位点。一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，其产物称为5-甲基胞嘧啶(5-mC)，是植物、动物等真核生物DNA甲基化的主要形式，也是发现的哺乳动物DNA甲基化的唯一形式。DNA甲基化作为一种对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制。DNA甲基化是重要的表观遗传标记，甲基化水平过低或过高，都会影响植物生长发育和分化，导致发育和形态异常。

目前对草莓繁殖的调控在采用分株繁殖，低温及短日照处理、改善栽培措施和激素处理等方面，关于CHA1调控植物愈伤形成的报道鲜有发现。

发明内容

发明目的：本发明通过构建干扰DNA甲基化水平的相关基因沉默载体，并用农杆菌转化法，获得了FveCHA1的RNAi转基因材料，证明了该转基因材料愈伤形成和离体芽再生时间早于野生型，验证了FveCHA1基因与草莓愈伤形成和离体芽再生相关。

技术方案：本发明第一方面提供了FveCHA1基因在促进草莓愈伤形成和离体芽再生中的应用。

上述的应用，通过抑制所述FveCHA1基因的表达促进草莓愈伤形成及离体芽再生。

上述FveCHA1基因通过RNA干扰载体FveCHA1-RNAi抑制。

上述的RNA干扰载体FveCHA1-RNAi通过以下方法制备：

(1)以森林草莓cDNA序列为模板，设计特异性引物，得到FveCHA1基因RNA干扰片段的正向序列(SEQ ID NO.8)以及反向序列(SEQ ID NO.9)；

(2)将FveCHA1基因RNA干扰片段的正向序列连接到GN2300通用载体，将FveCHA1基因RNA干扰片段的反向序列连接到GN2300通用载体；

(3)将得到的重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，提取阳性质粒，得到含有FveCHA1基因RNA干扰片段反向序列-FveCHA1基因RNA干扰片段正向序列的FveCHA1基因的RNAi载体GN2300-FveCHA1。

本发明第二方面提供了FveCHA1基因的RNAi载体在促进草莓愈伤形成及离体芽再生中的应用。

本发明第三方面提供了转染了FveCHA1基因的RNAi载体的工程菌在促进草莓愈伤形成及离体芽再生中的应用。

有益效果：(1)本发明通过下调Fve CHA1基因表达可获得促进草莓愈伤形成的草莓植株，这为生产草莓新生苗提供了一种新思路；(2)本发明通过转基因方式促进草莓愈伤的形成及离体芽再生，克服了目前转基因草莓苗难以培育的缺点，通过遗传转化的方式，为草莓的再生苗获得提供了一种更高效的方法；(3)本发明将Fve CHA1-RNAi载体转入草莓中，成功获得了再生能力强的植株，实现了利用RNA干扰技术获得再生强的目标，为RNA干扰的植物分子育种提供了参考。

附图说明

图1为野生型森林草莓Ruegen的愈伤生长状况与转入森林草莓FveCHA1基因的GN2300-FveCHA1-RNAi载体后的T1代叶片愈伤生长状况对比，其中，(a)为野生型森林草莓T1代叶片愈伤生长状况，(b)为转入森林草莓FveCHA1基因的GN2300-FveCHA1-RNAi载体后的T1代叶片愈伤生长状况；

图2为转入森林草莓FveCHA1基因的GN2300-FveCHA1-RNAi载体后的T1代叶片愈伤与野生型Ruegen叶片愈伤的芽再生率的对比；

图3为转入森林草莓FveCHA1基因的GN2300-FveCHA1-RNAi载体后的T1代茎段愈伤与野生型Ruegen茎段愈伤的芽再生率的对比。

具体实施方式

实施例1：FveCHA1基因的克隆

在GDR(https://www.rosaceae.org/)中寻找森林草莓对应的FveCHA1基因，主要根据Tair(https://www.arabidopsis.org/)公布的拟南芥CHA1基因全长cDNA(序列如SEQID NO.1所示)，(1840bp，序列如SEQ ID NO.2所示，FveCHA1基因编码的氨基酸序列如SEQID NO.3所示)，提取野生型森林草莓品种Ruegen的总RNA，反转录为cDNA，所述森林草莓的CDS序列获取于GDR网站(下载网址为ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Fragaria_vesca/Fvesca-genome.v2.0.a2/genes/)以野生型森林草莓的cDNA为模板，对FveCHA1基因PCR扩增，插入正向片段。用Snap gene软件设计引物SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5用来扩增基因正向目的片段，PCR反应体系如表1所示。

表1：

引物序列如下：

FveCHA1-RNAi-F1:5’-ACTctgcaggTCGACTTGGCCCGAACTTCC-3’(SEQ ID NO.4)，

FveCHA1-RNAi-R1:5’-AATAATATGGTCGAcGAGAAGAAAGGGACG-3’(SEQ ID NO.5)

将PCR程序设定为：94℃预变性2min，98℃变性10s、56℃退火30s、延伸温度为68℃，延伸时间根据扩增片段长度来计算(1kb/min)，延伸时间为25s，设置33个循环，最后68℃延伸10min。

扩增得到如SEQ ID NO.8所示的长度为392bp的森林草莓FveCHA1基因RNA干扰片段的正向序列。

以野生型森林草莓的cDNA为模板，对FveCHA1基因PCR扩增，插入反向片段。PCR反应体系与表1相同。用Snap gene软件设计引物SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.7用来扩增基因反向目的片段。

引物序列如下：

FveCHA1-RNAi-F2:5’-TTGCAAAGCTctagaGAGAAGAAAGGGACG-3’(SEQ ID NO.6)，

FveCHA1-RNAi-R2:5’-TGAACGATCtctagATTGGCCCGAACTTCC-3’(SEQ ID NO.7)

PCR程序与扩增基因正向目的片段时相同。

扩增得到如SEQ ID NO.9所示的长度为392bp的森林草莓FveCHA1基因RNA干扰片段的反向序列。

实施例2:GN2300-FveCHA1-RNAi载体的构建

(1)正向片段的连接

采用One Step Cloning Kit(Vazyme)重组克隆试剂盒，选择Sal I作为酶切位点，在GN2300-35S-FAQ-NOS载体上，用限制性内切酶对克隆载体进行线性化处理，置于37℃水浴锅中，反应4小时。反应体系如表2所示：

表2：

酶切后失活65℃，20分钟，用于重组反应。

于冰水浴中配制反应体系，如表3所示：

表3：

配制好上述混合好的反应液后将其放置在37℃水浴锅中水浴30min。将反应液在冰上冷却5min；

(2)反向片段的连接

选择XbaI作为酶切位点，在已连接上正向片段的GN2300-35S-FAQ-NOS载体上，连接反向片段，连接方法除将反应体系中正向片段扩增产物替换为反向片段扩增产物外，其他与正向片段连接反应相同。

(3)转化反应

①从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞DH5α，大肠杆菌感受态在冰上冻融时，加入10μL已正向、反向连接后得到的第(2)步骤中的反应液，冰上放置30min；

②放入42℃恒温水浴锅中水浴45s；

③冰水中放置2min；

④在超净工作台上加入700μL的不含任何抗生素的LB液体培养基，在速度为200转/分钟的37℃摇床上培养，时间为1h；

⑤4500转/分钟，离心1min；

⑥在超净工作台中弃去上清液，留下约200μl，重悬菌块，用枪头将菌液吸出，打在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，用灭菌后的冷却的涂抹棒均匀地涂抹开，等菌液完全风干后，用封口膜封上，写上名字。将其倒置在37℃过夜培养12-16小时；

⑦待菌落形成约2mm直径的菌落时，挑取单菌落，放入含有Kana的LB液体培养基中，进行菌落PCR验证，经过电泳检测后选择可能为阳性的克隆菌株，送公司测序，比对其基因序列完全正确后，得到含有森林草莓FveCHA1基因RNA干扰片段正向序列-森林草莓FveCHA1基因RNA干扰片段反向序列的森林草莓FveCHA1基因的GN2300-FveCHA1-RNAi载体。

⑧吸取验证成功的菌株50μl，放入含有Kana的5ml的LB液体培养基中，在速度为200转/分钟的37℃摇床上培养，时间为8-12h；提取大肠杆菌重组质粒，测定质粒浓度，转化到GV3101农杆菌菌株中，进行菌落PCR验证，经过电泳检测后，将50％的无菌甘油按与菌液1：1的比例加入，保存菌液，放-80°冰箱保存。

实施例3：转化草莓进行功能验证

(1)外植体的准备

外植体选择森林草莓生态型Ruegen的幼嫩叶片。

用镊子剥下Ruegen的果实的种子，放在滤纸上，待风干后，挑选约200粒饱满的种子，装在2ml离心管中。

在超净工作台上进行以下操作：在离心管中加入1ml的75％酒精，震荡颠倒约5分钟后吸出全部酒精。接着加入1ml的10％次氯酸钠(次氯酸钠需要避光保存)，震荡8分钟后吸出次氯酸钠。向离心管中加入无菌水，清洗7-8次以去除次氯酸钠，避免残留。清洗完毕后将种子倒在无菌滤纸上，用无菌的冷却的镊子在每一个装有MS固体培养基的组培瓶中放置4-5颗种子，在瓶盖上做好标记，放于黑暗的28℃恒温培养箱，待发芽后，置于光下培养。外植体选用叶龄15-20天左右、长势一致、饱满的嫩叶。

(2)农杆菌侵染转化

①菌种活化：在-80℃冰箱中取出含有森林草莓FveCHA1基因GN2300-FveCHA1-RNAi载体的GV3101根癌农杆菌菌株100μL，在LB固体培养基平板上划线，在28℃恒温箱中倒置培养1-2天，待长出单菌落后，将挑取的单菌落置于加了50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的LB液体培养基中，在28℃恒温摇床中以200rpm培养1-2天，待菌液颜色小摇至浅黄，上下颠倒有浑浊出现。吸取100-150μL小摇的菌液，加入50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的LB液体培养基中在28℃恒温摇床上以200rpm过夜大摇，将摇好的菌液4500rpm室温离心5min,弃滤液，收集菌块并用灭菌的MS悬浮液(MS悬浮液中加入乙酰丁香酮(AS)至100μM)重新悬浮，测定OD₆₀₀值，将OD₆₀₀调至约0.48，然后将菌液放置于28℃恒温摇床，100rpm，悬浮1h。

②侵染叶片：在菌液悬浮的空隙时间，从组培瓶中剪下状态一致的叶龄在15-20天左右的嫩叶，用刀片将草莓叶片背面划伤，叶片全都切完后，将叶片放入MS菌液悬浮液，放28℃摇床，100rpm侵染20分钟。侵染完毕后将菌液倒尽，用无菌滤纸吸干叶片上残留的菌液，并将其转移至共培养培养基上，在黑暗环境中共培养3天。待弱光下脱菌15天后，将长出愈伤的外植体移动到筛选培养基上，移到光下进行培养，温度设置为22℃，每2周更换一次培养基。

③当产生不定芽时，把不定芽切成若干小段，转移至生芽培养基中。待叶片长出后转到生根培养基中，当长成完整小苗时，缓苗后移入花盆。

实验中所用到的培养基配方如下(如无特别标注，PH均调至5.8)：

1/2MS固体培养基：蔗糖20g/L、1/2MS培养基粉末4.302g/L、琼脂7g/L。

LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast Extract)5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉10g/L。

LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast Extract)5g/L、氯化钠10g/L。

MS固体培养基：MS培养基粉末(包含维生素)4.406g/L、蔗糖30g/L、琼脂粉7g/L。

MS-B5固体培养基：MS培养基粉末(不含维生素)4.302g/L、蔗糖20g/L、B5有机溶液5mL/L、琼脂粉7g/L。

草莓共培养培养基：MS-B5培养基+2mg/L TDZ+0.2mg/L IBA+20mg/L AS。

草莓脱菌培养基：MS-B5培养基+2mg/LTDZ+0.2mg/L IBA+300mg/L Ti。

草莓筛选培养基：MS-B5培养基+3mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+300mg/L Ti+20mg/LKan。

草莓生芽培养基：MS-B5培养基+2mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+300mg/L Ti+20mg/LKan。

草莓生根培养基：MS-B5培养基+0.2mg/L IBA+300mg/L Ti。

草莓愈伤培养基：MS-B5培养基+2mg/LTDZ+0.2mg/L IBA。

草莓愈伤生芽培养基:MS-B5培养基+2mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA。

实验中所用的激素配制方法如下：

TDZ(2mg/mL)：称取20mg TDZ粉末，用200μL的1M氢氧化钠溶液溶解后，待完全溶解后加入纯酒精，定容到10ml，放-20℃保存备用。

IBA(1mg/mL)：称取10mg IBA粉末，用无菌蒸馏水定容至10mL，放-20℃保存备用。

AS(20mg/mL)：称取20mg AS粉末，用DMSO定容至1mL，放-20℃保存备用。

Ti(300mg/mL)：称取3g Ti，用蒸馏水定容至10mL，放-20℃保存备用。

Kan(100mg/mL)：称取Kan 500mg，用蒸馏水定容至5mL，放-20℃保存备用。

MS-B5有机溶液：称取烟酸0.2g，肌醇20g，维生素B1 2g，维生素B6 0.2g，用蒸馏水溶解定容至1L，放4℃冰箱保存备用。

1M氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠片状物6.0g，用蒸馏水溶解，定容至150mL，室温保存。

(3)转基因植株的GUS染色验证

配制好GUS染液，剪下转基因草莓植株的叶片，将叶片进行染色处理。若染色成功，则表明GUS报告基因已在植株内成功表达，转入草莓基因组中。

(4)转基因植株进行观察分析

结果如图1所示，与野生型草莓叶片愈伤相比，转基因的草莓愈伤的出芽时间比野生型植株要早。同等培养条件下，野生型草莓叶片愈伤组织呈黑色，愈伤组织和不定芽再生的情况相对较差。与野生型草莓相比，FveCHA1基因沉默植株的叶片出芽时间早一周，不定芽再生频率更高。从愈伤组织颜色来看，野生型草莓叶片呈现褐色，而FveCHA1基因沉默植株叶片更绿。

由图2结果所示，统计转入森林草莓FveCHA1基因的GN2300-FveCHA1-RNAi载体后的T1代叶片愈伤与野生型Ruegen叶片愈伤的芽的再生率相比，FveCHA1基因沉默植株的叶片的不定芽频率高达94％，野生型的不定芽再生频率仅有24％，是野生型的3.9倍。对比发现，FveCHA1基因沉默植株的叶片愈伤的不定芽再生情况相对于野生型的不定芽再生的情况较好，不定芽再生的频率更高。

图3为转入森林草莓FveCHA1基因的GN2300-FveCHA1-RNAi载体后的T1代茎段愈伤与野生型Ruegen茎段愈伤的芽再生率的对比，FveCHA1基因沉默植株的茎段的不定芽频率为30％，野生型茎段的不定芽再生频率为23％。对比发现，FveCHA1基因沉默植株茎段愈伤的不定芽再生情况相对于野生型茎段的不定芽再生的情况较好，不定芽再生的频率更高。

根据以上结果表明，将针对森林草莓FveCHA1基因的RNAi载体导入森林草莓，从而抑制所述森林草莓FveCHA1基因的表达，能够促进草莓愈伤形成和离体芽再生。FveCHA1-RNAi载体能促进草莓愈伤形成和离体芽再生，FveCHA1-RNAi载体是具有功能的载体，它能促进生殖生长，促使草莓愈伤再生芽。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> FveCHA1基因及RNAi载体在促进草莓愈伤形成及离体芽再生中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2770

<212> DNA

<213> 拟南芥CHA1 基因(Arabidopsis thaliana CHA1 gene)

<400> 1

aaaaaataag aaaataggcg taaatatgag agtgtgtttt ttcaatatac cctcggtttt 60

gaatttgctc tcaaaagcga cggagacgac tgtttggctc ggtgatttct cccgccgttt 120

gggtttttct taccggaatt tccttctcct tcgatggtta gtctgcgctc cagaaaagtt 180

attccggctt cggaaatggt cagcgacggg aaaacggaga aagatgcgtc tggtgattca 240

cccacttctg ttctcaacga agaggaaaac tgtgaggaga aaagtgttac tgttgtagag 300

gaagagatac ttctagccaa aaatggagat tcttctctta tttctgaagc catggctcag 360

gaggaagagc agctgctcaa acttcgggaa gatgaagaga aagctaacaa tgctggatct 420

gctgttgctc ctaatctgaa tgaaactcag tttactaaac ttgatgagct cttgacgcaa 480

actcagctct actctgagtt tctccttgag aaaatggagg atatcacaat taatgggata 540

gaaagtgaga gccaaaaagc tgagcccgag aagactggtc gtggacgcaa aagaaaggct 600

gcttctcagt acaacaatac taaggctaag agagcggttg ctgctatgat ttcaagatct 660

aaagaagatg gtgagaccat caactcagat ctgacagagg aagaaacagt catcaaactg 720

cagaatgaac tttgtcctct tctcactggt ggacagttaa agtcttatca gcttaaaggt 780

gtcaaatggc taatatcatt gtggcagaat ggtttgaatg gaatattagc tgatcaaatg 840

ggacttggaa agacgattca aacgatcggt ttcttatcac atctgaaagg gaatgggttg 900

gatggtccat atctagtcat tgctccactg tctacacttt caaattggtt caatgagatt 960

gctaggttca cgccttccat caatgcaatc atctaccatg gggataaaaa tcaaagggat 1020

gagctcagga ggaagcacat gcctaaaact gttggtccca agttccctat agttattact 1080

tcttatgagg ttgccatgaa tgatgctaaa agaattctgc ggcactatcc atggaaatat 1140

gttgtgattg atgagggcca caggttgaaa aaccacaagt gtaaattgtt gagggaacta 1200

aaacacttga agatggataa caaacttctg ctgacaggaa cacctctgca aaataatctt 1260

tctgagcttt ggtctttgtt aaattttatt ctgcctgaca tctttacatc acatgatgaa 1320

tttgaatcat ggtttgattt ttctgaaaag aacaaaaacg aagcaaccaa ggaagaagaa 1380

gagaaaagaa gagctcaagt tgtttccaaa cttcatggta tactacgacc attcatcctt 1440

cgaagaatga aatgtgatgt tgagctctca cttccacgga aaaaggagat tataatgtat 1500

gctacaatga ctgatcatca gaaaaagttc caggaacatc tggtgaataa cacgttggaa 1560

gcacatcttg gagagaatgc catccgaggt caaggctgga agggaaagct taacaacctg 1620

gtcattcaac ttcgaaagaa ctgcaaccat cctgaccttc tccaggggca aatagatggt 1680

tcatatctct accctcctgt tgaagagatt gttggacagt gtggtaaatt ccgcttattg 1740

gagagattac ttgttcggtt atttgccaat aatcacaaag tccttatctt ctcccaatgg 1800

acgaaacttt tggacattat ggattactac ttcagtgaga aggggtttga ggtttgcaga 1860

atcgatggca gtgtgaagct ggatgaaagg agaagacaga ttaaagattt cagtgatgag 1920

aagagcagct gtagtatatt tctcctgagt accagagctg gaggactcgg aatcaatctt 1980

actgctgctg atacatgcat cctctatgac agcgactgga accctcaaat ggacttgcaa 2040

gccatggaca gatgccacag aatcgggcag acgaaacctg ttcatgttta taggctttcc 2100

acggctcagt cgatagagac ccgggttctg aaacgagcgt acagtaagct caagctggaa 2160

catgtggtta ttggccaagg gcagtttcat caagaacgtg ccaagtcttc aacaccttta 2220

gaggaagagg acatactggc gttgcttaag gaagatgaaa ctgctgaaga taagttgata 2280

caaaccgata taagcgatgc ggatcttgac aggttacttg accggagtga cctgacaatt 2340

actgcaccgg gagagacaca agctgctgaa gcttttccag tgaagggtcc aggttgggaa 2400

gtggtcctgc ctagttcggg aggaatgctg tcttccctga acagttagga cacattaata 2460

agccaggcct tgaaaccact tctgtgtttt tttttttttt ttccggaaca tgatcggtta 2520

cttttggctg ggaggattta attattagag ggctcggaag tttttgtaag ttaaagaact 2580

cacttaaaac cctgaaaaca tgacagttaa tggtgattag ctctcaatgt gatgaaaaca 2640

attggccctc tgattttgct gttgcggtaa tattatgact tgtgtacgtt tatagtcttt 2700

gtagtctgca attttggcat tgagctattt ctcacgaact tatgggatct tatgttttgg 2760

atttgggatt 2770

<210> 2

<211> 1840

<212> DNA

<213> FveCHA1 基因(FveCHA1 gene)

<400> 2

atgtcaatga tatctactcc cacccggacc tttttaatcc attctaaatc caggcttaaa 60

cgtctaaaca ggtttaacgc cgcctcgtca acaaacttgc tacgtctaaa tcacagggtg 120

tccaaataca atatgctggt gccctcataa tcccaatccc tcaaagtaat ctcctgaccc 180

gacccaccga aacatggacc ttacaattta acagtccaag gacaaggccg tcattttcac 240

aaaagcaaag ggcaacaccc ctaatgggcc ggccttcata tataaaccct agcgaaaacc 300

tatctctgaa aacctaaccc tttgccgctc tcgcagtcaa gccccaactc agagaccaaa 360

gcagagagct cagctgcaat catgggtcgt atgcacagcc atgggaaggg tatgtcagct 420

tcggctctgc cctacaagag aaccccaccg agctggttga agatctctac tcccgatgta 480

agtgaatctc tctataaacc ctagattttt gatttggggg tttttgattg agacccagaa 540

ctgagatgtg tggttttgaa ggtggaggat agtatctgta agtttgcgaa gaagggtatg 600

acgccgtctc agatcggtgt gattcttcgt gactctcatg ggattgctca ggttaagagc 660

gttactggaa gcaagatctt gaggattctt aaggctcatg gtataccctt tttgcttttt 720

gttaatctct ttgtgttttt gagggtgttt gtgttttggt taatataaag ttttcgattg 780

aatgtgaaat ggggattgtg ggatttgagt gtttgtgttt gtgaagttac gttttgaatt 840

gaatgtgtaa atgaggttta tgctgtttgt ttagtgttta gttatgtgat tgagacttga 900

ttgcggtagc acattgacat tagcttgata cactgagctg tttttgcatt ttgatgttgt 960

gtggtcgaaa gtgttttatg tctgaatctt ctttattatc gttcctactt tgaattggcc 1020

gtcttgtttt atgatttttg tttgtaacag tgtggctaac ttacttttga tttgttaggt 1080

cttgctcctg agattcctga ggatctgtac caccttatca agaaggctgt gtcagtgagg 1140

aagcatttgg agaggaacag gaaggacaag gactccaagt tccgtttgat tcttgtggag 1200

agcaggattc acaggcttgc tcgttactac aagaagacca agaagctccc cccagtctgg 1260

aaatagtaag catgctcact tcttttgcag tttggtttgc ttattgtact gctgatttgc 1320

taaatttgca gtacattttt gtagtgagct ctaacggttt aagtgacatt atggtagttg 1380

aaatcctgta ggtctttcct gtgtactgta atctctgaac ttcacattta actagttggt 1440

gtcctgctta tttactatcg aagaatatcc cgatttagtc ttggtctagt tgaaacttgc 1500

tgtttgatgg ttttttaagg gcatatgcct caaaattctg tagctcttgt gaactgtatt 1560

ctctcacatt cccagtaaaa taggatcctt ctttctgatt tgtggatact cttataattt 1620

aggagtgaag tgaattaaga gagtagatta accatgtttg taatttcata gtcaagacat 1680

gttgtttgtt tatattcttt gagaggttta tttcaatctt actttgcttt tatattattt 1740

gaggctcagt cagcatagtt atccaatttg tatgtacact aacttatcca atgtgttttt 1800

ttacagcgag tccaccactg ccagcactct tgttgcttag 1840

<210> 3

<211> 692

<212> PRT

<213> FveCHA1 基因(FveCHA1 gene)

<400> 3

Met Ala Thr Lys Thr Glu Pro Ala Ala Asp Ser Pro Thr Ser Val Leu

1 5 10 15

Glu Glu Glu Asp Leu Cys Gly Glu Ile Asp Val Lys Leu Val Lys Ala

20 25 30

Glu Glu Glu Leu Leu Glu Val Arg Val Lys Glu Glu Glu Thr Glu Arg

35 40 45

Glu Lys Glu Thr Pro Val Leu Ser Glu Thr Gln Phe Ser Lys Leu Asp

50 55 60

Glu Leu Leu Thr Lys Thr Gln Leu Phe Thr Asp Phe Leu Leu Glu Lys

65 70 75 80

Met Asp Asp Ile Ser Phe Asp Val Pro Glu Gln Leu Asn Glu Pro Glu

85 90 95

Pro Val Gln Lys Lys Arg Gly Arg Gly Thr Lys Arg Lys Ala Pro Thr

100 105 110

Tyr Asn Asn Thr Lys Ala Lys Arg Ala Val Ala Ala Met Leu Thr Arg

115 120 125

Ser Lys Glu Gly Glu Lys Ile Glu Asp Val Asn Leu Thr Glu Glu Glu

130 135 140

Arg Leu Glu Lys Gln Gln Lys Glu Leu Val Pro Leu Leu Thr Gly Gly

145 150 155 160

Lys Leu Lys Ser Tyr Gln Leu Lys Gly Val Lys Trp Leu Ile Ser Leu

165 170 175

Trp Gln Asn Gly Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp Gln Met Gly Leu Gly

180 185 190

Lys Thr Ile Gln Thr Ile Gly Phe Leu Ser His Leu Lys Ser Met Gly

195 200 205

Leu Asp Gly Pro Tyr Leu Val Ile Ala Pro Leu Ser Thr Leu Ser Asn

210 215 220

Trp Ile Asn Glu Ile Ser Arg Phe Thr Pro Ser Ile Lys Ala Ile Ile

225 230 235 240

Tyr His Gly Asn Lys Lys Glu Arg Asp Glu Ile Ile Arg Lys His Met

245 250 255

Pro Lys Ser Val Gly Pro Asn Phe Pro Ile Ile Val Thr Ser Tyr Glu

260 265 270

Val Ala Leu Ala Asp Ala Arg Arg Cys Leu Arg His Tyr Asn Trp Lys

275 280 285

Tyr Leu Val Val Asp Glu Gly His Arg Leu Lys Asn Ser Lys Cys Lys

290 295 300

Leu Val Gln Gln Leu Lys Tyr Ile Pro Val Glu Asn Lys Ile Leu Leu

305 310 315 320

Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Asn Leu Ala Glu Leu Trp Ser Leu Leu

325 330 335

Asn Phe Ile Leu Pro Asp Ile Phe Ser Ser His Glu Glu Phe Glu Ser

340 345 350

Trp Phe Asp Leu Glu Gly Lys Cys His Asn Glu Ala Met Lys Glu Glu

355 360 365

Leu Glu Glu Lys Arg Arg Ala Gln Val Leu Pro Lys Leu His Ala Ile

370 375 380

Leu Arg Pro Phe Leu Leu Arg Arg Met Lys Ile Asp Val Glu Leu Met

385 390 395 400

Leu Pro Arg Lys Lys Glu Ile Ile Leu Tyr Ala Thr Met Thr Glu His

405 410 415

Gln Lys Lys Phe Gln Glu His Leu Ile Asn Lys Thr Leu Glu Lys His

420 425 430

Leu Ile Leu Glu Lys Gly Ser His Val Asn Gly Leu Lys Gly Lys Leu

435 440 445

Asn Asn Leu Met Ile Gln Leu Arg Lys Asn Cys Asn His Pro Asp Leu

450 455 460

Leu Glu Ser Ala Phe Asp Gly Ser Tyr Phe Tyr Pro Pro Val Asp Gln

465 470 475 480

Ile Val Glu Gln Cys Gly Lys Phe Ser Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys

485 490 495

Leu Leu Leu Ala Gly Lys His Lys Val Leu Ile Phe Ser Gln Trp Thr

500 505 510

Lys Ile Leu Asp Ile Met Asp Tyr Tyr Phe Ser Glu Lys Gly Tyr Glu

515 520 525

Val Cys Arg Ile Asp Gly His Val Lys Leu Asp Asp Arg Arg Arg Gln

530 535 540

Ile Ala Ser Phe Asn Asp Leu Asp Ser Thr Cys Arg Ile Phe Leu Leu

545 550 555 560

Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Thr Ala Ala Asp Thr

565 570 575

Cys Ile Leu Tyr Asp Ser Asp Trp Gly Arg Met Leu Lys Arg Ala Phe

580 585 590

Ser Lys Leu Lys Leu Glu His Val Val Ile Gly Lys Gly Lys Phe His

595 600 605

Gln Glu Arg Ala Lys Pro Glu Ala Asp Phe Leu Glu Glu Glu Asp Leu

610 615 620

Ile Ala Leu Leu Arg Asp Glu Glu Ser Ala Glu Asp Lys Met Ile Gln

625 630 635 640

Thr Asp Ile Thr Asp Glu Glu Leu Glu Lys Val Leu Asp Arg Ser Asp

645 650 655

Leu Ile Gly Thr Pro Pro Asp Ala Ala Asp Ala Leu Pro Leu Lys Gly

660 665 670

Pro Gly Trp Glu Val Val Val Pro Thr Ala Ser Gly Gly Met Leu Ser

675 680 685

Ser Leu Asn Ser

690

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actctgcagg tcgacttggc ccgaacttcc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aataatatgg tcgacgagaa gaaagggacg 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgcaaagct ctagagagaa gaaagggacg 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaacgatct ctagattggc ccgaacttcc 30

<210> 8

<211> 392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaccgggctt gaagggttat taacaatgaa gtatacttca ccgcaaccga ctacgttctt 60

ctacaaattc tgtgatgttg acctttatag agcaccaact acttcctgtg tctaactttt 120

tgaggttcac gtttgatcac gtcgtcaact tcatgtatgg acatctctta ttctaagaca 180

actgaccttg tggagaggtc ttattaaacc gactcgaaac cagcaacaac ttgaaataaa 240

acggcctata taagagtagg gtacttctta aactcagcac caaactggat cttcctttca 300

cggtattact tcgttacttc cttcttaatc ttctcttctc ttctcgagtt cacgatggct 360

ttgaggtacg ttataacgca gggaaagaag ag 392

<210> 9

<211> 392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctcttctttc cctgcgttat aacgtacctc aaagccatcg tgaactcgag aagagaagag 60

aagattaaga aggaagtaac gaagtaatac cgtgaaagga agatccagtt tggtgctgag 120

tttaagaagt accctactct tatataggcc gttttatttc aagttgttgc tggtttcgag 180

tcggtttaat aagacctctc cacaaggtca gttgtcttag aataagagat gtccatacat 240

gaagttgacg acgtgatcaa acgtgaacct caaaaagtta gacacaggaa gtagttggtg 300

ctctataaag gtcaacatca cagaatttgt agaagaacgt agtcggttgc ggtgaagtat 360

acttcattgt taataaccct tcaagcccgg tt 392

Claims (6)

1.FveCHA1基因在促进森林草莓愈伤形成及离体芽再生中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过抑制所述FveCHA1基因的表达促进草莓愈伤形成及离体芽再生。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述FveCHA1基因通过RNA干扰载体FveCHA1-RNAi抑制。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述RNA干扰载体RNAi通过以下方法制备：

(1)以森林草莓cDNA序列为模板，设计特异性引物，得到FveCHA1基因RNA干扰片段的正向序列(SEQ ID NO.8)以及反向序列(SEQ ID NO.9)；

(2)将FveCHA1基因RNA干扰片段的正向序列连接到GN2300通用载体，将FveCHA1基因RNA干扰片段的反向序列连接到GN2300通用载体；

(3)将得到的重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，提取阳性质粒，得到含有FveCHA1基因RNA干扰片段反向序列-FveCHA1基因RNA干扰片段正向序列的FveCHA1基因的RNAi载体GN2300-FveCHA1。

5.FveCHA1基因的RNAi载体在促进草莓愈伤形成及离体芽再生中的应用。

6.转染了FveCHA1基因的RNAi载体的工程菌在促进草莓愈伤形成及离体芽再生中的应用。

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