CN109097388B - GmCOP1a和/或GmCOP1b在调控植物株高方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了GmCOP1a和/或GmCOP1b在调控植物株高方面的应用。所述GmCOP1a与所述GmCOP1b来源于大豆，二者的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示。本发明通过利用CRISPR‑Cas9系统对所述GmCOP1a和/或所述GmCOP1b的编码基因进行编辑，发现GmCOP1a发生突变后，植株株高无明显变化的表型，GmCOP1b发生突变后，植株株高变矮，GmCOP1a和GmCOP1b均发生突变后，植株株高变矮，且相对仅GmCOP1b发生突变后的植株，株高变矮得更为显著。由此，本发明为植株株高的调控手段提供了新的选择。

Description

GmCOP1a和/或GmCOP1b在调控植物株高方面的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及GmCOP1a和/或GmCOP1b在调控植物株高方面的应用。

背景技术

COP1是E3泛素连接酶，无论在动物还是植物中，COP1在进化过程中都是比较保守的，并且在多种生长发育过程中都扮演着十分重要的角色。已有研究表明，在拟南芥中，COP1是光不稳定类型的光受体在光下发生快速降解的主要作用因子。同时，COP1也是光形态建成的核心抑制因子，可以促使靶蛋白选择性降解。拟南芥COP1基因在光信号转导途径中处于核心位置，该基因响应并整合各种光信号，调控植物的光形态建成、开花诱导及生物节律等(Lau and Deng,2012)。

大豆是世界上重要的粮食、油料和饲料作物之一，与国民经济密切相关。我国大豆资源丰富，有许多高产、高油、高蛋白、抗病和抗逆性强的优质品种。大豆的生长发育对光照环境非常敏感。作为典型的短日照植物，多数大豆品种的生育期对不同纬度地区的光周期适应性狭窄；此外不同生态地区及栽培模式下的光照环境对大豆的株型、产量和品质也有显著影响。因此解析光环境影响大豆生长发育的遗传和分子机制对培育广适高产大豆新品种具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供GmCOP1a和/或GmCOP1b在调控植物株高方面的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了GmCOP1a和/或GmCOP1b在调控植物株高方面的应用，其中，所述GmCOP1a与所述GmCOP1b来源于大豆，二者的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQID NO.4所示，二者的编码基因分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示。

本发明通过利用CRISPR-Cas9系统对所述GmCOP1a和/或所述GmCOP1b的编码基因进行编辑，发现GmCOP1a发生突变后，植株株高无明显变化的表型，GmCOP1b发生突变后，植株株高变矮，GmCOP1a和GmCOP1b均发生突变后，植株株高变矮，且相对仅GmCOP1b发生突变后的植株，株高变矮得更为显著。

由此可以合理推断，敲除所述GmCOP1a和/或所述GmCOP1b的编码基因，或使所述GmCOP1a和/或所述GmCOP1b的编码基因发生沉默，或使所述GmCOP1a和/或所述GmCOP1b的编码基因发生低表达，可降低植物株高。

同时可以预测，当将所述编码基因导入目的植物中，或在植物中过表达所述编码基因，也可实现调控植株株高的目的，且预测将提高植株株高。

进一步地，本发明所述植物优选为大豆。

第二方面，本发明提供了GmCOP1a和/或GmCOP1b在制备转基因植物新品种中的应用。

第三方面，本发明还提供了靶向编辑GmCOP1a和/或GmCOP1b编码基因的CRISPR-Cas9系统在调控植物株高方面的应用。

所述CRISPR-Cas9系统中靶向GmCOP1a编码基因的gRNA的核苷酸序列为：

1a-4：GGGTTCAGGTTTGACGACGGCGG；

和/或

1a-8：GTGCAGATGCTTGACGGTTCTGG。

所述CRISPR-Cas9系统中靶向GmCOP1b编码基因的gRNA的核苷酸序列为：

1b-8：GTACGGATGCTTGACGACTCTGG；

和/或

1b-9：GCTTCATTAGTGCTGTATGCTGG。

本发明的有益效果在于：

本发明首次通过客观实验发现并证实了大豆GmCOP1a、GmCOP1b两个基因在调控植株株高方面的功能，为植株株高的调控手段提供了新的选择。

附图说明

图1为GmCOP1a突变后，在转基因植株中株高无明显变化的表型。

图2为GmCOP1b突变后，在转基因植株中株高变矮的表型。

图3为GmCOP1a/1b双突变体，在转基因植株中株高变矮的表型。

图4为GmCOP1a与GmCOP1b在长短日下生物节律分析。

图5为GmCOP1a与GmCOP1b受蓝光诱导。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1大豆GmCOP1s基因突变体植物表达载体的构建。

本发明提供了用于构建表达载体所用的引物，

其包括用于扩增包含guide RNA序列的引物：

COP1a-F1-4：

AATGTGCCACCACATGGATTGGGTTCAGGTTTGACGACGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA；

COP1a-F1-8：

AATGTGCCACCACATGGATTGTGCAGATGCTTGACGGTTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA；

COP1b-F1-8：

AATGTGCCACCACATGGATTGTACGGATGCTTGACGACTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA；

COP1b-F1-9：

AATGTGCCACCACATGGATTGCTTCATTAGTGCTGTATGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA；

gRNA-Xbal-R：

GCTCGGCAACGCGTTCTAGAAAAAAAAGCACCGACTCGGT；

用于扩增U6片段的引物：

U6-Xbal-F：

GGAAGCTTAGGCCTTCTAGAAAAATAAATGGTAAAATGTC；

U6-R：CAATCCATGTGGTGGCACAT。

1、Prime Star扩增目的片段

1)反应体系：

JRH0951载体骨架为pUC19，GmU6及sgRNA序列来源于文献(Sun et al.,2015)，具体构建方法参考文献(Meng et al.,2017)。

2)反应程序：

预热98℃2min；变性98℃10s，退火57℃10s，延伸72℃30s(1kb/min)，35个循环；终延伸72℃7min；12℃保存。

利用引物U6-XbaI-F/U6-R扩增U6片段，利用引物COP1-F1/gRNA-XbaI-R扩增含有不同gRNA的片段。

2、PCR产物回收和产物连接

琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司)回收PCR产物，回收后，按照上述程序(其中temple变为U6和gRNA片段)，利用引物U6-XbaI-F/gRNA-XbaI-R进行扩增，将两个片段连在一起。

3、酶切

利用XbaI酶切载体JRH0645，该载体由本实验室构建完成，在已发表的文献中曾经用过，但没有具体命名，这里我们将其命名为JRH0645，具体构建方法为：

Cas9表达载体是基于pFGC5941质粒(Kerschen等人，2004年)构建的。简单地说，(2×35S)-(3×Flag)-NOS序列被插入到pFGC5941质粒的EcoRI和HindIII酶切位点之间，然后在SpeI酶切位点(Meng et al.,2017)插入从质粒pJIT163-2NLSCas9(Shan et al.,2013)中提取的密码子优化的链球菌pyogene Cas9基因。

1)反应体系：

2)反应条件：37℃水浴，30min。

4、In-fusion连接

所用试剂为Clontech 5×In-

HD Enzyme Premix。

将回收得到的DNA片段与酶切完回收的JRH0645载体进行连接。

1)反应体系：

In-fusion 0.5μL

DNA片段 1μL

载体片段 1μL

2)反应条件：50℃，30min。

5、大肠杆菌TOP10转化

1)从-80℃取出TOP10感受态细胞(康为世纪)置于冰盒中，待感受态细胞稍微融化后，取50μL到1.5mL EP管中，用移液枪将2.5μL连接产物加入其中，轻弹管壁使二者充分混匀，将其在冰中静置约30min；

2)将离心管置于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速冰浴2min；

3)在每个离心管加入600μL不含抗生素的LB培养基，混匀后置于37℃摇床，200rpm振荡培养1h；

4)12000rpm瞬时离心，在超净工作台中，取出离心管，去除大部分上清LB培养基，留下约50μL，移液器吹打混匀；

5)将菌液均匀涂在加入卡那霉素抗生素的LB平板培养基上，待平板干了之后，倒置于37℃恒温箱中培养过夜。

6、阳性克隆的鉴定

用牙签挑取平板上的单克隆，在含有抗生素的LB平板划线，然后将牙签在含有PCR反应混合物的管中轻轻搅动几下，进行菌落PCR鉴定。可以挑取多个单克隆，并在平板上做好标记，以增加获得阳性克隆的概率。之后将平板置于37℃过夜培养。

1)反应体系：(2×Taq MasterMix购自康为公司)

2)反应程序：

预热95℃2min；变性95℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s(2kb/min)，35个循环；终延伸72℃5min；12℃保存。

PCR产物经电泳检测，有目的片段的克隆，把对应平板上的划线，送菌液测序，得到连有正向基因的阳性克隆。

7、质粒提取对于测序正确的单克隆，扩摇菌液，用试剂盒提取质粒，步骤如下：

1)取2mL培养过夜的菌液，12000g离心1min，弃尽上清。

2)加250μL Buffer S1(含有RNase)用移液器吹打悬浮细菌沉淀，一定要保证均匀。

3)加入250μL Buffer S2，温和地上下翻转数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min，以防质粒DNA被裂解。

4)加入350μL Buffer S3，温和并充分地混合数次，12000g离心10min。

5)吸取上清转移到制备管(置于2mL离心管中)，12000g离心1min，弃滤液。

6)将制备管放回2mL离心管中，加500μL Buffer W1，12000g离心1min，弃滤液。

7)将制备管放回离心管，加700μL Buffer W2，12000g离心1min，弃滤液；重复一次。

8)将制备管放回2mL离心管中，12000g离心1min。

9)将制备管移入干净的1.5mL离心管中，在吸附管膜中央加40μL ddH₂O，室温静置1min。12000g离心1min，洗脱质粒DNA。

实施例2转基因大豆植株的获得

将构建好含有GmCOP1 cDNA的质粒转化农杆菌后，进行大豆转化。

1、农杆菌感受态的制备与转化

1)农杆菌感受态的制备

挑取农杆菌K599、EHA105单菌落分别置于5mL含相应抗生素的LB液体培养基中，K599抗性为：100μg/mL链霉素；EHA105抗性为：100μg/mL利福平(Rif)。28℃培养过夜；取过夜培养菌液500μL接种于50mL LB含相应抗生素的液体培养基中，28℃培养到OD600约为0.5；冰上放置30min；4℃，5,000rpm离心10min，用15mL预冷的10mM CaCl₂重悬农杆菌细胞，4℃，5,000rpm离心10min；用2mL预冷的10mM CaCl₂重悬沉淀，冰上100μL/管分装，液氮速冻，-80℃保存。

2)农杆菌转化

取100μL感受态细胞冰上解冻，加入1μg质粒DNA混匀后，冰上放置30min，液氮速冻3-5min后立即放于37℃水浴5min，加入1mL无抗LB液体培养基，28℃，160rpm复苏3-5h后菌液均匀涂于含相应抗生素的固体培养基上。28℃倒置培养2～3d，挑单菌用PCR鉴定阳性克隆。

2、大豆发根检测CRISPR载体编辑效率

(1)种子消毒：挑选出健康，饱满，无病斑的种子(要不然容易长菌)。用4mL浓盐酸和100mL消毒水(花王Bleach)反应出的氯气对豆子进行灭菌，16-18小时左右，拿出，在超净工作台中吹干净氯气。

(2)种子催芽：将豆子均匀摆放在催芽培养基上，每皿摆6-8颗左右。(如果其中某一颗豆子染菌，则一板豆子都不要)温室中光照培养三天左右。

(3)切豆子，调菌液OD值：切子叶，取萌发4-7天(5-6最好)的大豆种子，自下胚轴0.3-0.5cm处切下，将子叶一分为二切开，去除顶芽。取出摇好的菌液(K599农杆菌，OD值＝0.6-0.8，一般切豆子前两天小摇，前一天晚上大摇，当天上午可以用)，离心(4000rpm，10min)，液体共培培养基重悬，使菌液OD值＝0.6-0.8，将豆子中加入调好的菌液中，隔几分钟用手摇一次，共浸染15min，取出吹10min左右。

(4)共培养：在共培培养基中铺上已灭菌滤纸，然后将菌液浸染过的种子均匀的摆放在培养基中，黑暗条件下培养三天，温度26℃左右。

(5)诱导培养：暗培3天后，胚芽长长，用无菌水和加入激素的液体诱导培养基各洗4-5次，确保将农杆菌洗净。胚芽朝上斜插入固体诱导培养基中，放入温室中光照培养。在温室培养15天左右，有的豆瓣开始生根。

(6)取根检测：取豆瓣伤口处长出的根，2-3根一管，一般取3个重复，CTAB法提取DNA，进行PCR检测，测序。

(7)选取工作的位点进行大豆转化。

3、大豆转化

(1)用浓盐酸和次氯酸钠反应出的氯气灭过菌的豆子，摇菌。

(2)将豆子对半切开，去掉一部分胚尖，在豆子的分生区部分划伤口，泡在无菌水中。下午取出摇好的菌液，离心(4000prm，10min)，调菌，使菌液OD值＝0.4～0.6，将豆子中的无菌水倒掉，加入调好的菌液，放在摇床中摇30min(28℃，200prm左右)，取出吹10min左右，平铺在共培培养基中暗培3天。

(3)暗培3天后，胚芽长长，用无菌水和加入激素的液体诱导培养基各洗4-5次，确保将农杆菌洗净。

(4)将长出的胚芽切掉，只保留3-4mm长度，胚芽朝下，有伤口的一面朝上斜插入固体诱导培养基中，放入温室中光照培养。

(5)在温室培养10天后，有的豆瓣开始出芽，有芽的从桩部将芽切掉并转到新的固体诱导培养基中，没长芽的扔掉。

(6)温室中培养10天后，将长芽的继代到新的固体诱导培养基中，没有长芽的豆瓣扔掉，温室培养10天。豆瓣在固体诱导培养基中一共培养30天。

(7)将长好的愈伤组织与豆瓣分离，扔掉豆瓣，把愈伤组织上黑色表面刮掉，转到固体伸长培养基中，每20天更换一次新的固体伸长培养基，一般继代3-4次，合计60-80天。

(8)愈伤在伸长培养的同时也在筛选，在筛选的过程中会有苗长出来。

(9)当苗长到超过100mL刻度的时候从愈伤上切下来，移到生根培养基中。

(10)苗子在培养基中培养20-30天左右，长得壮实有发达根系的苗子就可以开始放在背光处炼苗了，一般炼苗五天。

(11)每种一棵苗就表上豆子品种，基因名称，生根日期和土培日期，以及培养人的名字。加入适量水，绿肥和缓释肥，盖上一层薄膜放在光照下，使其适应强光，3天后去膜。

实施例3转基因阳性株系的鉴定

为了确定转基因阳性植株，取一片鲜嫩的叶片，提取DNA，进行PCR检测。其中对于CRISPR敲除突变体，我们检测其Basta抗性基因、Cas9蛋白和U6启动子。并对其gRNA所在位置进行PCR扩增，测序。

经PCR检测，Gmcop1a-4、Gmcop1a-8、Gmcop1b-8和Gmcop1a-8/1b-9植株，其Basta、Cas9和U6均在，Gmcop1b-9均不在。具体测序结果见图1、2和3。

实施例4转基因大豆表型鉴定

本实验所用转基因样本数量为10株，具有统计学意义。

如图1所示，GmCOP1a突变后，在转基因植株中株高无明显变化的表型。

如图2所示，GmCOP1b突变后，在转基因植株中株高变矮的表型。

如图3所示，GmCOP1a/b双突变体，在转基因植株中株高变矮的表型。

实施例5 GmCOP1a和GmCOP1b生物节律性分析

分别在长日照与短日照条件下种植大豆Williams 82品种，待第二片三重复叶展开进行取样，其中一份样品为三个不同株系的第二片三重复叶，并取三个重复，其中取样时间点分别为熄灯点0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h和48h(前24h为正常光周期，后24h为持续光照)。

1、Williams 82 RNA提取(Trizol reagent购自天根公司)

1)选取所需植物部位进行取样，放入离心管中，并立即放入液氮中，根据需要打样或研钵磨样(本实验取大豆Williams 82黑暗条件下培养基中生长10天左右幼苗的叶、根和茎等部位)；

2)加入1mL Trizol，涡旋混匀，室温静置10min；

3)加入200μL氯仿，混匀，室温放置2min，12000rpm，4℃离心15min；

4)吸取上清500μL，转入新的RNase-free的1.5mL离心管中，加入等体积500μL异丙醇(提前4℃预冷)，混匀，-20℃静置，10min；

5)12000rpm，4℃离心10min，弃上清；

6)加入1000μL 75％乙醇(提前4℃预冷)，振荡混匀，7500rpm，4℃离心5min，重复一次；

7)弃上清，并用移液器吸出多余上清，室温干燥10min；

8)加入RNase-free Water 30μL，4℃溶解20min；

9)取1μL样品跑胶检测RNA质量，1μL Nano测其浓度。

2、反转录获取cDNA(

III One-step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix反转录试剂盒购自全式金公司)

1)反应体系：

2)反应程序：

42℃ 30min

85℃ 5min

12℃ ∞。

3、qRT-PCR(SYBR Premix Ex Taq购自Takara公司)

1)反应体系：

所用引物：

GmCOP1aQ-F：GGCGCCTCCGCCGCTGCCTC；

GmCOP1aQ-R：GGTAGTCGCCGCAGCAAGGG；

GmCOP1bQ-F：TATAGTGTCAAGCATAGAGT；

GmCOP1bQ-R：AGCATCTGTAGGTTCATT。

2)反应程序：

实施例6 GmCOP1a和GmCOP1b蓝光响应分析

蓝光响应实验样品为种植在持续光照(100μmol m^-2s^-1左右)下10天的Williams82幼苗，分别移至黑暗和蓝光(50μmol m^-2s^-1)下生长2天。然后将黑暗中的幼苗移至蓝光；蓝光中幼苗移至黑暗，立即开始取样。取样时间点为0min、15min、30min、60min、120min和240min，每份样品为3片真叶，共3个重复。

后续RNA提取、反转录及qRT-PCR工作同实施例5中步骤。

由图4、图5可以看出，大豆GmCOP1a，GmCOP1b两个基因均呈现明显的昼夜节律；且表达均受蓝光诱导。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> GmCOP1a和/或GmCOP1b在调控植物株高方面的应用

<141> 2018-06-06

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2010

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atggaagagc tctcagcggg gcctctcgtc cccgccgtcg tcaaacctga accgtccaaa 60

ggcgcctccg ccgctgcctc cggcggcacg ttcccggcct ccacgtcgga gccggacaag 120

gacttcctct gtccgatttg catgcagatc atcaaggacc cgttcctcac cgcgtgcggc 180

cacagcttct gctacatgtg catcatcacg cacctccgca acaagagcga ttgcccttgc 240

tgcggcgact acctcaccaa caccaacctc ttccctaact tgttgctcga caagctactg 300

aagaagactt ctgcgcgtca aatatcaaaa accgcttcac ctgtcgaaca ttttcggcag 360

gtattgcaaa agggttctga tgtgtcaatt aaggagctag acaccctttt gtcacttctt 420

gccgagaaga aaagaaaaat ggaacaagaa gaagctgaga gaaatatgca aatattgtta 480

gacttcttgc attgcttacg caagcaaaaa gttgatgagt tgaaggaggt acaaactgat 540

ctccacttta taaaagagga cataaatgct gtggagaaac atagaatgga attgtatcgt 600

gcacgggaca ggtactctgt aaaattgcag atgcttgacg gttctggggg aagaaaatca 660

tggcattcat caatggacaa gaacagcagt ggccttttat ctagtcctct aaatcttcga 720

ggagggttgt catcagggag ccatactaag aaaaatgatg gaaagtctca tattagctct 780

catgggcatg gaattcagag aaggaatgtc atcactggat ccgattcaca atatataaat 840

caatcgggtc ttgctctagt tagaaagaag agggtgcata cacagttcaa tgatctacaa 900

gaatgttacc tacaaaagcg acggcatgca gctgataggt cccatagcca acaagaaaga 960

gatataagtc tcataagtcg agaaggttat actgctggtc ttgaagattt tcagtcagtc 1020

ttgacaactt tcacacgcta cagccgattg agagtcattg cggaactaag acatggggat 1080

atatttcatt cagcaaatat agtgtcaagc atagagtttg accgcgatga tgatttgttt 1140

gctactgctg gagtttcgcg gcgcatcaaa gtttttgact tttctgctgt tgtgaatgaa 1200

cctacagatg ctcattgtcc tgttgtggag atgtctacac gttcaaaact tagttgcttg 1260

agttggaata aatttgctaa gaatcaaata gctagtagtg attatgaagg aattgtgact 1320

gtttgggatg taaccactcg gaagagttta atggaatatg aagagcatga aaagcgtgca 1380

tggagtgtag acttttcaag aacagatccc tctatgcttg tatctggtag cgatgactgt 1440

aaggtcaaaa tttggtgcac taatcaggaa gctagtgttc taaatataga catgaaagca 1500

aacatatgtt gtgtcaaata taatcctgga tctggcaatt atattgcagt tgggtcagca 1560

gaccatcata tccattatta tgatttgaga aatattagcc gtccagtcca tgttttcagt 1620

gggcacagga aggctgtttc atacgtgaaa tttctgtcta atgatgaact tgcttctgca 1680

tcaacagata gtacactgcg attatgggat gtgaaggaaa acttaccagt tcgtactttc 1740

aaaggccatg caaatgagaa aaactttgtt ggtcttacag taagcagtga atatattgcg 1800

tgtggcagtg aaacaaatga agtctttgtt taccacaagg aaatctcgag acctttgact 1860

tcgcacagat ttgggtcccc tgatatggat gacgctgaag atgaggctgg atcatatttc 1920

atcagcgctg tttgctggaa gagtgatcgc cccactattc taacagcaaa tagtcaaggc 1980

accatcaaag tgctggtgct tgcagcttga 2010

<210> 2

<211> 669

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

Met Glu Glu Leu Ser Ala Gly Pro Leu Val Pro Ala Val Val Lys Pro

1 5 10 15

Glu Pro Ser Lys Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Pro

20 25 30

Ala Ser Thr Ser Glu Pro Asp Lys Asp Phe Leu Cys Pro Ile Cys Met

35 40 45

Gln Ile Ile Lys Asp Pro Phe Leu Thr Ala Cys Gly His Ser Phe Cys

50 55 60

Tyr Met Cys Ile Ile Thr His Leu Arg Asn Lys Ser Asp Cys Pro Cys

65 70 75 80

Cys Gly Asp Tyr Leu Thr Asn Thr Asn Leu Phe Pro Asn Leu Leu Leu

85 90 95

Asp Lys Leu Leu Lys Lys Thr Ser Ala Arg Gln Ile Ser Lys Thr Ala

100 105 110

Ser Pro Val Glu His Phe Arg Gln Val Leu Gln Lys Gly Ser Asp Val

115 120 125

Ser Ile Lys Glu Leu Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Ala Glu Lys Lys

130 135 140

Arg Lys Met Glu Gln Glu Glu Ala Glu Arg Asn Met Gln Ile Leu Leu

145 150 155 160

Asp Phe Leu His Cys Leu Arg Lys Gln Lys Val Asp Glu Leu Lys Glu

165 170 175

Val Gln Thr Asp Leu His Phe Ile Lys Glu Asp Ile Asn Ala Val Glu

180 185 190

Lys His Arg Met Glu Leu Tyr Arg Ala Arg Asp Arg Tyr Ser Val Lys

195 200 205

Leu Gln Met Leu Asp Gly Ser Gly Gly Arg Lys Ser Trp His Ser Ser

210 215 220

Met Asp Lys Asn Ser Ser Gly Leu Leu Ser Ser Pro Leu Asn Leu Arg

225 230 235 240

Gly Gly Leu Ser Ser Gly Ser His Thr Lys Lys Asn Asp Gly Lys Ser

245 250 255

His Ile Ser Ser His Gly His Gly Ile Gln Arg Arg Asn Val Ile Thr

260 265 270

Gly Ser Asp Ser Gln Tyr Ile Asn Gln Ser Gly Leu Ala Leu Val Arg

275 280 285

Lys Lys Arg Val His Thr Gln Phe Asn Asp Leu Gln Glu Cys Tyr Leu

290 295 300

Gln Lys Arg Arg His Ala Ala Asp Arg Ser His Ser Gln Gln Glu Arg

305 310 315 320

Asp Ile Ser Leu Ile Ser Arg Glu Gly Tyr Thr Ala Gly Leu Glu Asp

325 330 335

Phe Gln Ser Val Leu Thr Thr Phe Thr Arg Tyr Ser Arg Leu Arg Val

340 345 350

Ile Ala Glu Leu Arg His Gly Asp Ile Phe His Ser Ala Asn Ile Val

355 360 365

Ser Ser Ile Glu Phe Asp Arg Asp Asp Asp Leu Phe Ala Thr Ala Gly

370 375 380

Val Ser Arg Arg Ile Lys Val Phe Asp Phe Ser Ala Val Val Asn Glu

385 390 395 400

Pro Thr Asp Ala His Cys Pro Val Val Glu Met Ser Thr Arg Ser Lys

405 410 415

Leu Ser Cys Leu Ser Trp Asn Lys Phe Ala Lys Asn Gln Ile Ala Ser

420 425 430

Ser Asp Tyr Glu Gly Ile Val Thr Val Trp Asp Val Thr Thr Arg Lys

435 440 445

Ser Leu Met Glu Tyr Glu Glu His Glu Lys Arg Ala Trp Ser Val Asp

450 455 460

Phe Ser Arg Thr Asp Pro Ser Met Leu Val Ser Gly Ser Asp Asp Cys

465 470 475 480

Lys Val Lys Ile Trp Cys Thr Asn Gln Glu Ala Ser Val Leu Asn Ile

485 490 495

Asp Met Lys Ala Asn Ile Cys Cys Val Lys Tyr Asn Pro Gly Ser Gly

500 505 510

Asn Tyr Ile Ala Val Gly Ser Ala Asp His His Ile His Tyr Tyr Asp

515 520 525

Leu Arg Asn Ile Ser Arg Pro Val His Val Phe Ser Gly His Arg Lys

530 535 540

Ala Val Ser Tyr Val Lys Phe Leu Ser Asn Asp Glu Leu Ala Ser Ala

545 550 555 560

Ser Thr Asp Ser Thr Leu Arg Leu Trp Asp Val Lys Glu Asn Leu Pro

565 570 575

Val Arg Thr Phe Lys Gly His Ala Asn Glu Lys Asn Phe Val Gly Leu

580 585 590

Thr Val Ser Ser Glu Tyr Ile Ala Cys Gly Ser Glu Thr Asn Glu Val

595 600 605

Phe Val Tyr His Lys Glu Ile Ser Arg Pro Leu Thr Ser His Arg Phe

610 615 620

Gly Ser Pro Asp Met Asp Asp Ala Glu Asp Glu Ala Gly Ser Tyr Phe

625 630 635 640

Ile Ser Ala Val Cys Trp Lys Ser Asp Arg Pro Thr Ile Leu Thr Ala

645 650 655

Asn Ser Gln Gly Thr Ile Lys Val Leu Val Leu Ala Ala

660 665

<210> 3

<211> 2028

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 3

atggaagagc tctccgcggg gcctctcgtc cccgccgtcg tcaaaccgga agcgtccaaa 60

ggcgccgccg tcgccgccga cacctccgcc gcggcctccg gcggcacgtt cccggcctcc 120

acgtcggagc cggacaagga cttcctctgc ccgatttgca tgcagatcat caaggacgcg 180

ttcctcaccg cgtgcggcca cagcttctgc tacatgtgca tcatcacgca cctccgcaac 240

aagagcgatt gcccttgctg cggccactac ctcaccaaca ccaacctctt ccctaacttc 300

ttgctcgaca agctactgaa gaagacttct gcgcgtcaaa tatcaaaaac cgcttcacct 360

gtggaacatt tccggcaggc attgcaaaag ggttgtgatg tatcaataaa ggagctagac 420

acccttttgt cacttcttgc cgagaagaaa agaaaaatgg aacaagaaga agctgagaga 480

aatatgcaaa tattgttaga cttcttgcat tgcttacgca agcaaaaagt tgatgagttg 540

aaggaggtac aaactgatct ccagtttata aaagaggaca ttaatgctgt ggagaaacat 600

agaatggatt tgtatcgtgc acgggacagg tactctgtaa aattacggat gcttgacgac 660

tctggtggaa gaaaatcatg gcattcatca atggacaaga acaacagtgg ccttatatct 720

agtcctctaa atctacgagg agggttgtca tcagggagcc atactaagaa aaatgatgga 780

aagtcccaaa ttagctctca cgggcatgga gttcagagaa gggatgccat cactggatcc 840

gattcacaat atataaatca atcgggtctt tctctagtta gaaagaagag ggtgcataca 900

cagttcaatg acctacaaga atgttaccta caaaagcgac gacatgcagc tgataggccc 960

catagccaac aagtaagaga tataaatctc ataagtcgag aaggttatac tgctggtctt 1020

gaagattttc agtcagtctt gacaactttc acacgctata gccgattgag agtcattgca 1080

gaactaaggc atggggatat atttcattca gcaaatatag tgtcaagcat agagtttgac 1140

tgcgatgatg atttgtttgc tactgctgga gtttcccggc gcatcaaagt ttttgacttt 1200

tctgctgttg tgaatgaacc tacagatgct cactgtcctg ttgtggagat gtctacacgt 1260

tcaaaactta gttgcttgag ttggaataaa tatgctaaga atcaaatagc tagtagtgat 1320

tatgaaggaa ttgtgactgt ttgggatgta accactcgaa agagtttaat ggaatatgaa 1380

gagcatgaaa agcgtgcatg gagtgttgat ttttcaagaa cagacccctc tatgcttgta 1440

tctggtagcg atgactgtaa ggtcaaaatt tggtgtacaa atcaggaagc tagtgttcta 1500

aatatagaca tgaaagcaaa catatgctgt gtcaaatata atcctggatc tggcaattat 1560

attgcagttg gatcagcaga ccatcacatc cattattatg atttgagaaa tattagccgt 1620

ccagtccatg ttttcagtgg gcacaggaag gctgtttcat atgtgaaatt tctgtctaat 1680

gatgaacttg cttctgcatc aacagatagt acactgcgat tatgggatgt gaaggaaaac 1740

ttaccagttc gtactttcaa aggccatgca aatgagaaaa actttgttgg ccttacagta 1800

agcagtgaat acattgcgtg tggcagtgaa acaaatgaag tctttgtgta ccacaaggaa 1860

atctcgagac ctttgacttg ccacagattt gggtcccctg atatggatga cgctgaagat 1920

gaggctggat cgtacttcat tagtgctgta tgctggaaga gtgatcgccc cactattcta 1980

actgcaaata gtcaaggcac catcaaagtg ctggtgcttg cagcttga 2028

<210> 4

<211> 675

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 4

Met Glu Glu Leu Ser Ala Gly Pro Leu Val Pro Ala Val Val Lys Pro

1 5 10 15

Glu Ala Ser Lys Gly Ala Ala Val Ala Ala Asp Thr Ser Ala Ala Ala

20 25 30

Ser Gly Gly Thr Phe Pro Ala Ser Thr Ser Glu Pro Asp Lys Asp Phe

35 40 45

Leu Cys Pro Ile Cys Met Gln Ile Ile Lys Asp Ala Phe Leu Thr Ala

50 55 60

Cys Gly His Ser Phe Cys Tyr Met Cys Ile Ile Thr His Leu Arg Asn

65 70 75 80

Lys Ser Asp Cys Pro Cys Cys Gly His Tyr Leu Thr Asn Thr Asn Leu

85 90 95

Phe Pro Asn Phe Leu Leu Asp Lys Leu Leu Lys Lys Thr Ser Ala Arg

100 105 110

Gln Ile Ser Lys Thr Ala Ser Pro Val Glu His Phe Arg Gln Ala Leu

115 120 125

Gln Lys Gly Cys Asp Val Ser Ile Lys Glu Leu Asp Thr Leu Leu Ser

130 135 140

Leu Leu Ala Glu Lys Lys Arg Lys Met Glu Gln Glu Glu Ala Glu Arg

145 150 155 160

Asn Met Gln Ile Leu Leu Asp Phe Leu His Cys Leu Arg Lys Gln Lys

165 170 175

Val Asp Glu Leu Lys Glu Val Gln Thr Asp Leu Gln Phe Ile Lys Glu

180 185 190

Asp Ile Asn Ala Val Glu Lys His Arg Met Asp Leu Tyr Arg Ala Arg

195 200 205

Asp Arg Tyr Ser Val Lys Leu Arg Met Leu Asp Asp Ser Gly Gly Arg

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Ser Met Asp Lys Asn Asn Ser Gly Leu Ile Ser

225 230 235 240

Ser Pro Leu Asn Leu Arg Gly Gly Leu Ser Ser Gly Ser His Thr Lys

245 250 255

Lys Asn Asp Gly Lys Ser Gln Ile Ser Ser His Gly His Gly Val Gln

260 265 270

Arg Arg Asp Ala Ile Thr Gly Ser Asp Ser Gln Tyr Ile Asn Gln Ser

275 280 285

Gly Leu Ser Leu Val Arg Lys Lys Arg Val His Thr Gln Phe Asn Asp

290 295 300

Leu Gln Glu Cys Tyr Leu Gln Lys Arg Arg His Ala Ala Asp Arg Pro

305 310 315 320

His Ser Gln Gln Val Arg Asp Ile Asn Leu Ile Ser Arg Glu Gly Tyr

325 330 335

Thr Ala Gly Leu Glu Asp Phe Gln Ser Val Leu Thr Thr Phe Thr Arg

340 345 350

Tyr Ser Arg Leu Arg Val Ile Ala Glu Leu Arg His Gly Asp Ile Phe

355 360 365

His Ser Ala Asn Ile Val Ser Ser Ile Glu Phe Asp Cys Asp Asp Asp

370 375 380

Leu Phe Ala Thr Ala Gly Val Ser Arg Arg Ile Lys Val Phe Asp Phe

385 390 395 400

Ser Ala Val Val Asn Glu Pro Thr Asp Ala His Cys Pro Val Val Glu

405 410 415

Met Ser Thr Arg Ser Lys Leu Ser Cys Leu Ser Trp Asn Lys Tyr Ala

420 425 430

Lys Asn Gln Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Glu Gly Ile Val Thr Val Trp

435 440 445

Asp Val Thr Thr Arg Lys Ser Leu Met Glu Tyr Glu Glu His Glu Lys

450 455 460

Arg Ala Trp Ser Val Asp Phe Ser Arg Thr Asp Pro Ser Met Leu Val

465 470 475 480

Ser Gly Ser Asp Asp Cys Lys Val Lys Ile Trp Cys Thr Asn Gln Glu

485 490 495

Ala Ser Val Leu Asn Ile Asp Met Lys Ala Asn Ile Cys Cys Val Lys

500 505 510

Tyr Asn Pro Gly Ser Gly Asn Tyr Ile Ala Val Gly Ser Ala Asp His

515 520 525

His Ile His Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Ile Ser Arg Pro Val His Val

530 535 540

Phe Ser Gly His Arg Lys Ala Val Ser Tyr Val Lys Phe Leu Ser Asn

545 550 555 560

Asp Glu Leu Ala Ser Ala Ser Thr Asp Ser Thr Leu Arg Leu Trp Asp

565 570 575

Val Lys Glu Asn Leu Pro Val Arg Thr Phe Lys Gly His Ala Asn Glu

580 585 590

Lys Asn Phe Val Gly Leu Thr Val Ser Ser Glu Tyr Ile Ala Cys Gly

595 600 605

Ser Glu Thr Asn Glu Val Phe Val Tyr His Lys Glu Ile Ser Arg Pro

610 615 620

Leu Thr Cys His Arg Phe Gly Ser Pro Asp Met Asp Asp Ala Glu Asp

625 630 635 640

Glu Ala Gly Ser Tyr Phe Ile Ser Ala Val Cys Trp Lys Ser Asp Arg

645 650 655

Pro Thr Ile Leu Thr Ala Asn Ser Gln Gly Thr Ile Lys Val Leu Val

660 665 670

Leu Ala Ala

675

Claims (5)

1.GmCOP1b，或GmCOP1a和GmCOP1b在降低植物株高方面的应用，其特征在于，所述GmCOP1a与所述GmCOP1b来源于大豆，所述GmCOP1a的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述GmCOP1b的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述植物为大豆；

所述应用具体为敲除所述GmCOP1b，或所述GmCOP1a和所述GmCOP1b的编码基因，或使所述GmCOP1b，或所述GmCOP1a和所述GmCOP1b的编码基因发生沉默，或使所述GmCOP1b，或所述GmCOP1a和所述GmCOP1b的编码基因发生低表达。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用CRISPR-Cas9系统对所述GmCOP1b，或所述GmCOP1a和所述GmCOP1b的编码基因进行编辑。

3.靶向编辑GmCOP1b，或GmCOP1a和GmCOP1b编码基因的CRISPR-Cas9系统在降低植物株高方面的应用，所述植物为大豆；所述GmCOP1a的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述GmCOP1b的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CRISPR-Cas9系统中靶向GmCOP1a编码基因的gRNA的核苷酸序列为：

1a-4：GGGTTCAGGTTTGACGACGGCGG；

和/或

1a-8：GTGCAGATGCTTGACGGTTCTGG。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CRISPR-Cas9系统中靶向GmCOP1b编码基因的gRNA的核苷酸序列为：

1b-8：GTACGGATGCTTGACGACTCTGG；

和/或

1b-9：GCTTCATTAGTGCTGTATGCTGG。

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