CN1409762A - 玉米肌动蛋白解聚因子的启动子和内含子 - Google Patents

Abstract

来自玉米肌动蛋白解聚因子的启动子和内含子、及其遗传变体或缺失型，可用于控制植物中转基因的表达。

Description

玉米肌动蛋白解聚因子的启动子和内含子

发明领域

本发明涉及植物基因工程技术，提供了用于控制植物中重组基因表达的DNA序列和构建体。更具体地，本发明提供了来源于玉米肌动蛋白解聚因子(ADF)的新的调控序列。

背景技术

植物基因工程技术需要使用用于调节转基因表达的各种不同遗传元件，比如启动子和内含子。

转录的起始由启动子调控。一个典型的方案一般要使用几种不同的启动子。例如，一个启动子用来启动目的基因，另一个启动子用来启动可选择性标记基因。

真核基因经常被称为内含子的非编码序列所中断。真核基因转录的最初产物是含有与内含子相应的序列的前体mRNA。转录后加工过程中除去内含子产生mRNA，该mRNA翻译产生蛋白质。对内含子在基因表达调节中的作用的研究表明，玉米的醇脱氢酶基因(Adh-1)的第一个内含子在厌氧条件下能够增强表达。Callis J.，M.Fromm，和V.Walbot.(1987)，Gene Dev.1：1183-1200。在非厌氧条件下该内含子也能促进表达(较低程度的)。这种增强被认为是核内前体mRNA稳定化作用的结果。Mascarenhas等报道利用Adh-1内含子使CAT的表达提高了12倍和20倍。Mascarenhas等，″Intron-Mediated Enhancementof Heterologous Gene Expression in Maize，″Plant MolecularBiology，15：913-920，1990。从玉米和其他单子叶植物中已经分离了另外几种能增强基因表达的内含子。Vain，P.等(1996)，Plant CellReports 15：489-494，也参见WO98/5921。

玉米ADF的cDNA序列是已知的(GenBank的登记号为X97726)，但是基因组ADF序列没有公开。特别地，迄今为止ADF启动子的序列没有被公开，也没有任何ADF内含子被鉴定。序列的简要描述

SEQ ID NO：1是AP2/BC294 PCR产物的DNA序列，包括ADF启动子和ADF内含子1的序列。

SEQ ID NO：2是pDAB305的DNA序列。

发明概述

本发明提供了与ADF启动子和ADF内含子1相应的或来源于ADF启动子和ADF内含子1的DNA分子。

本发明的另一个方面是提供了DNA构建体，该构建体包含从5’到3’方向操作性地连接的

a)玉米ADF启动子；

b)非翻译前导序列；

c)内含子；

d)目的基因；和

e)3’UTR。

在优选的实施方式中，ADF启动子包含SEQ ID NO 1的bp 1-734，内含子选自Adhl内含子1和ADF内含子1(SEQ ID NO：1的bp882-2161)。

本发明的另一个方面是提供了DNA构建体，该构建体从5’到3’方向含有：

a)在植物中具有功能的启动子；

b)非翻译前导序列；

c)ADF内含子1；

d)克隆位点；

e)3’UTR。

本发明的另一个方面是提供了一种质粒，该质粒含有玉米ADF启动子，优选SEQ ID NO：1的bp1-878，或含有玉米ADF内含子1序列，优选SEQ ID NO：1的bp882-2161。

本发明的另一个方面是提供一种转化植物，该转化植物至少含有一个包含本发明DNA构建体的植物细胞。该植物可以是单子叶植物或双子叶植物，优选的植物是玉米、稻、棉花和烟草。

本发明的另一个方面是提供包含本发明的DNA构建体的种子或谷粒。

本发明的一个方面是本发明涵盖了所有提供功能性植物启动子的任何ADF启动子缺失型变体，这种启动子都属于“ADF启动子”。为了本申请的目的，用实施例5的方法分析时，如果一个序列能代替pDAB621的bp3056-3790或pDAB625的bp3962-4694而产生一种使GUS发生本底水平以上瞬时表达的构建体，那么该序列就认为是提供了“功能性”启动子。本领域的普通技术人员能够理解，在不破坏序列的启动子功能的前提下，对SEQ ID NO：1中作为ADF启动子的733bp的序列可以作各种不同的缺失。缺失试验是现有技术。优选地，本发明的ADF启动子包含200个连续碱基对，该连续碱基对与SEQ ID NO：1的bp1-734所定义序列的200个连续碱基对一致。更优选的是这样的ADF启动子，其包含500个连续碱基对，该连续碱基对与SEQ ID NO：1的bp1-734所定义序列的500个连续碱基对一致。

相似地，本发明涵盖了与启动子一起使用时具有增强表达功能的ADF内含子缺失型变体。术语“ADF内含子1”包含了这种缺失型变体。优选地，本发明的ADF内含子1包含600个连续碱基对，该连续碱基对与SEQ ID NO：1的bp882-2161所定义序列的600个连续碱基对序列一致。更优选这样的ADF内含子，其包含SEQ ID NO：1的bp882-2161所定义序列的1000个连续碱基对。本发明的详细描述

ADF启动子优选地用在含有内含子的构建体中，该内含子被插入在目的基因5’端和启动子3’端的非翻译前导区中。适合的内含子包括ADF内含子1、Adhl内含子1、泛素内含子1和Bronze2内含子1。

用于本发明构建体的非翻译前导序列可以来自任何合适的来源，并可以进行特定的修饰以增加mRNA的翻译。5’非翻译区可以来源于启动子的天然前导序列、待表达基因或编码区域的天然前导序列、病毒RNAs、合适的真核基因，也可以是合成的序列。

用于本发明构建体的目的基因可以是希望在植物中表达的任何基因。特别有用的基因是那些能够提供除草剂、昆虫或病毒耐性的基因和能够改善植物的营养价值或加工特性的基因。合适的农艺学有用基因的例子包括能提供昆虫抗性的来源于苏云金芽苞杆菌的杀虫基因，和5’-烯醇式丙酮酰-3’-磷酸莽草酸合成酶(5’-enolpyruvyl-3’-phosphoshikimate synthase，EPSPS)基因及其提供草甘膦除草剂抗性的任何变体。本领域的普通技术人员能很容易地理解，能够赋予期望性状的任何农艺学重要基因都是可用的。

本发明的构建体所用的3’UTR，或3’端非翻译区是能够使mRNA进行有效加工，能够保持信息的稳定和指导腺苷核糖核苷酸加到转录后mRNA序列3’末端的3’UTR。此3’UTR可以是启动子区天然的，结构基因天然的，或者来自其他来源。许多在植物宿主中能够表达的基因来源的各种终止区域都是可用的，所述基因例如，细菌基因、冠瘿碱基因、病毒和植物基因。合适的3’UTRs包括但不限于以下的举例：pre53’UTR(WO98/56921)、胭脂碱合成酶(nos)基因的3’UTR、tmL3’、或acp3’。

本发明一般适用于在单子叶植物和双子叶植物中表达结构基因。本发明特别适合于单子叶植物种类的任何成员，包括但不限于玉米、稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、裸麦、甘蔗、菠萝、洋芋、洋葱、香蕉、椰子、和海枣。本发明优选的应用是生产转基因玉米植物。本发明特别适用于禾本科(Graminaceae)植物，特别是玉米、小麦、稻、燕麦、大麦和高粱。双子叶植物种包括烟草、西红柿、向日葵、棉花、甜菜、马铃薯、莴苣、瓜类、大豆和canola(菜子油菜)。

除了ADF启动子外，ADF内含子1可以和其它启动子一起使用以增强表达。和ADF内含子1一起使用的启动子可以是适合用于植物的任何启动子。所选择的启动子单独使用应能使目的蛋白充分表达，但尤其是当和ADF内含子1一起使用时应如此，导致产生有效量的目的蛋白，从而使植物细胞和由此再生的植物显现出由该表达蛋白所导致的表型特征。合适的启动子可以有不同的来源，比如植物或植物DNA病毒。优选的启动子是ADF启动子、per5启动子、35T启动子(在实施例20和23中描述)和泛素启动子。有用的启动子包括那些从花椰菜病毒类中分离出来的启动子，比如花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S和CaMV35S)转录启动子。其他有用的启动子包括Kat等(1987)Science236：1299-1302描述的CaMV35S增强启动子(eCaMV35S)和核酮糖1，5二磷酸羧化加氧酶(RUBISCO)的小亚基启动子。其它适当启动子例如稻肌动蛋白启动子、亲环蛋白启动子、泛素启动子、ADH1启动子。Callis等，同上；Class I patatin promoter，Bevan等(1986)Nucleic Acids Res.14(11)，4675-4638；ADP glucosepyrophosphorylase promoter；. beta.-conglycinin promoter，Tiemey等(1987)Planta 172：356-363；E8 promoter，Deikman等(1988)Embo J.7(11)3315-3320；2AII promoter，Pear等(1989)Plant Mol.Biol.13：639-651；acid chitinase promoter，Samac等.(1990)Plant Physiol.93：907-914。

可容易地构建利用ADF启动子或ADF内含子1的基因盒，所用的技术是已知的，比如在如下文献中所公开的技术：Sambrook等，(1989)， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，冷泉港出版社；和Ausubel等.(1987) Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，纽约，NY。编码ADF启动子的DNA可以用已知的方法从染色体DNA来制备或直接合成。基因组DNA可以用标准的方法分离，Sambrook等.(1989)；Mullis等.(1987)， Meth. Enz.，155：335；Horton等。(1989)，Gene，77：61.；Erlich(ed.)(1989)). PCR Technolog：Principles and Applications for DNA Amplification。用寡核苷酸合成法制备合成序列也是可行的，参见Caruthers(1983)in： Methodology of DNA and RNA，(ed.)Weissman，和Beaucage等.(1981)， Tetrahedron Letters，22：1859-1962)。

本发明也包括与本发明具体公开的调控序列有实质性序列同源性，以致对表达有所公开作用的DNA序列。

本发明中的术语“实质性序列同源性”是指一个核苷酸序列(在DNA或RNA的情况下)或氨基酸序列(在蛋白质或多肽的情况下)与另一个核苷酸序列或氨基酸序列表现出实质性功能或结构等同性。具有实质性序列同源性的序列之间的任何功能或结构的差别是微小的(de minimis)，也就是说不影响该序列发挥本申请所指功能的能力。与本文公开的序列具有实质性序列同源性的序列通常是本文所公开序列的变体，如突变体，但也可以是合成序列。

在大多数情况下，与本申请具体公开的序列有95％同源性的序列能行使等同的功能，有时，更低的同源性，如75％或80％也能接受。确定这些序列非关键部分的位置是费时的，但对于本领域的普通技术人员来说是常规技术且容易实现。

可以想象，相应于上面提及序列的序列在野生型序列的基础上可以含有一个或更多个的修饰，但相对于本发明的教导而言，仍使相应的元件具有可比性。例如正如上文提到的，可使用片断。可在分离的序列中引入修饰，包括有限数量的各种核苷酸的插入、缺失、或非保守性替换或多个核苷酸的保守性替换。而且，这种DNA分子构建可使用以下来源，此来源已显示能增强置于其调节控制之下的异源基因的表达。修饰寡核苷酸序列的示例性技术包括采用多核苷酸介导的定点诱变，参见Zoller等.(1984)， DNA，3：479；Higuchi等.(1988)， Nucl. Acids Res.，16：7351-7367；Horton等.(1989)，Gene，77：61；和 PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，(ed.)Erlich(1989)。

将生物材料导入到宿主细胞中的常规技术包括电穿孔(参见Shigekawa和Dower(1988)，Biotechniques，6：742；Miller，等(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：856-860；和Powell，等(1988)，Appl.Environ.Microbiol.，54：655-660)、直接DNA摄取机制(参见Mandel和Higa(1972)，J.Mol.Biol.，53：159-162；Dityatkin，等(1972)，Biochimica et Biophysica Acta，281：319-323；Wigler，等.(1979)，CeU，16：77；和Uchimiya，等.(1982)，In：Proc.5th Intl.Cong.Plant Tissue and Cell Culture，A.Fujiwara(ed.)，Jap.Assoc.for Plant Tissue Culture，Tokyo，pp.507-508)；融合机制(参见Uchidaz，等.(1980)，In：Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells，Baserga等.(eds.)Wistar Symposium Series，1：169-185)；感染因子(参见Fraley，等.(1986)，CRC Crit.Rev.Plant Sci.，4：1-46)；和Anderson(1984)，Science，226：401-409)；显微注射机制(参见Crossway，等.(1986)，Mol.Gen.Genet.，202：179-185)；和高速微粒轰击机制(参见授予Miller，Schuchardt，Skokut和Gould的专利EPO 0 405 696，(The Dow Chemical Company)。

可以根据所用的宿主细胞选择合适的转化宿主细胞的方法。根据迄今为止的经验，一旦基因插入到细胞中，转化方法本身引起的基因表达差异很小。一旦导入植物组织中，结构基因的表达可以用一个瞬时表达系统来检验，或者通过选择植物基因组中的稳定整合来检验。

体外培养植物组织以及，在许多情况下，使之再生成完整植株的技术是现有技术。生产成熟转基因植物的合适方法可以根据所用的植物种类来选择。再生随着植物种类的不同而不同。有效的再生受培养基、基因型和培养史的影响。一旦获得了完整植株，他们就能进行有性或无性繁殖，使繁殖的后代细胞中至少含有一个拷贝的上述序列。收集再生植物的种子作进一步的研究，这些种子能长成植株。从最初的转化植物转移导入的基因至商业上有用的栽培品种中的步骤对于本领域的普通技术人员来说是已知的。

在下文的实施例中，所有的分子生物学操作都是按照《分子克隆：实验室指南》(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.，1982，冷泉港实验室)中的描述进行的。

                      实施例1

                  ADF5’侧翼序列

从玉米基因组DNA，var.OQ414(Dow AgroSciences proprietaryline)中分离出肌动蛋白解聚因子基因(Zmbap3)的5’侧翼序列。用含有AmpliTaq^聚合酶FS的ABI Prism DNA序列分析试剂盒根据厂商(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division，福斯得市，加拿大)的描述测定DNA序列。测序反应在Applied Biosystem373A型DNA测序仪(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division)上进行。

ADF5’侧翼序列与公开的cDNA序列相比发现不同，其紧接ATG起始密码子的3’端存在一个内含子。

下表列出了AP2/BC294 PCR产物(SEQ ID NO：1)的特征：

        AP2/BC294 PCR产物的特征

SEQ ID NO：1的碱基对	特征
		1-734	ADF启动子
735-878	5’非翻译前导区(和已公开的cDNA序列一致)
		879-881	ATG起始位点
882-2161	ADF内含子
		2162-2273	ADF编码序列的起点(和已公开的cDNA序列一致)

该内含子的头两个碱基和最后两个碱基是该内含子内在的共有内含子拼接位点序列。紧靠内含子外的序列也接近一致。

在下面的实施例中，用基于质粒pDAB305的表达载体来检测ADF启动子和ADF内含子。pDAB305是一个5796bp的质粒，包括：含串联拷贝花椰菜花叶病毒35S增强子(35S)的启动子、Adhl内含子1的缺失型变体、与uidA基因融合的来源于玉米条斑花叶病毒外壳蛋白的非翻译前导区、和随后的nos3’UTR。

pDAB305的序列如SEQ ID NO：2所示。下表描述了该序列的特征。pDAB305的特征

SEQ ID NO：2的碱基对	特征描述
		1-401	与pUC19的bp1-401相对应
404-656	nos3’UTR的反向互补序列
		657-675	含有ScaI限制位点的接头序列
676-2536	Genbank登记号U02456的bp26-1889的反向互补序列，含有编码GUS的uidA基因的反向互补序列(bp728-2536)
		2534-2573	玉米条斑病毒基因组(MSV，Genbank登记号为X01633K02026)278-317位碱基的反向互补序列，参见Mullineaux，P.M.，J.Donson，B.A.M.Morris-Krsinich，M.I.Boulton，and J.W.Davies(1984)The nucleotide sequence of Maize Streak VirusDNA.EMBO J.3：3063-3068.
2584-2701	玉米AdhlS内含子1碱基1657-1774的反向互补序列，GenBank保存为MZEADH1.S，登记号为X00581，[Dennis，E.S.，W.L.Gerlach，A.J.Pryor，J.L.Bennetzen，A.Alios，D.llewel lyn，M.M.Sachs，R.J.Ferl，and W.J.Peacock(1984)Molecular analysis of the alcoholdehydrogenase(Adhl)gene of maize.Nuci.Acids Res.12：3983-4000].
		2702-2793	GenBank登记号X00581的AdhlS内含子1核苷酸1222-1312位的反向互补序列，[Dennis等(同上)公开的碱基119-209位]。
2795-2904	MSV基因组[Genbank登记号为X01633 K02026，和Mullineaux等.(同上)]核苷酸167-277的反向互补序列，除了野生型序列在pDAB305的2884和2885碱基之间有一个额外T插入
		2905-2924	含有BamHI和XbaI限制位点的接头序列
2925-3271	花椰菜花叶病毒基因组35S启动子7093-7439位核苷酸的反向互补序列(CabbB-S菌株，GenBank登记号为V0014J02048)
		3272-3279	含有Clal位点的接头
3280-3531	GenBank登记号V00141 J02048的7093-7344位核苷酸的反向互补序列
		3532-3544	接头
3545-5796	与pUC19的435-2686位碱基相对应

                     实施例2

                  pDAB620的构建

质粒pDAB620基本上是pDAB305，但用ADF启动子替换了CaMV35S双增强启动子和ADH内含子的I/MSV内含子前导区。为了克隆GUS编码区后的不含内含子的ADF启动子，用含有5’Hind III位点和3’Nco I位点的引物扩增ADF启动子。PCR扩增使用70ng模板DNA(克隆进PCR^2.1-Topo载体的SEQ ID NO：1)，GeneAmp^10 x PCR Buffer(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division)，引物各50皮摩尔，和5单位的AmpliTaq Gold^TM聚合酶(Perkin Elmer/AppliedBiosystems Division)，反应总体积为100μl。扩增在GeneAmp^9600型PCR仪(PE/ABI)中进行，使用的循环条件为：96℃ 10分钟，94℃，1分钟，55℃ 2分钟，72℃ 3分钟，20个循环，接着72℃延伸7分钟。把906bp PCR终产物克隆进PCR^2.1-Topo(Invitrogen)中。挑选出单个克隆，抽提出DNA，用上文描述的方法测序。为了把ADF启动子克隆进pDAB305中，用Nco I和Hind III限制内切酶(NewEngland Biolabs，Inc.，Beverly，MA)消化重组PCR^2.1-Topo(Invitrogen)克隆的Hind III和Nco I片断，从中分离出ADF启动子片断。该ADF片断用制备型琼脂糖凝胶纯化，用GenElute AgaroseSpin Columns(Supelco，Inc.，Bellefonte，PA)抽提DNA。用Hind III和Nco I(New England Biolabs)消化质粒pDAB305以除去其含有的启动子和内含子。被消化的质粒在琼脂糖凝胶(FMC)上跑电泳，切下质粒片断，用GenElute Agarose Spin Columns(Supelco，Inc.)从凝胶中抽提出DNA。Hind III/Nco I ADF启动子片断与该缺失型pDAB305载体混合，依照制造商的说明用快速DNA连接试剂盒(Rapid DNALigation Kit)(Roche Diagnostics formerly Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)连接。再按说明书用连接混合物转化亚克隆高效DH5α^TM感受态细胞(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，在含有75μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上涂平板，37℃下过夜培养。挑选单菌落，抽提出DNA，用上文描述的方法测序。替换CaMV启动子/ADH内含子I/MSV前导区片断而含有ADF启动子的质粒称为pDAB620。

                      pDAB 620的特征

pDAB 620的碱基对	特征描述
		1-2538	与pDAB305(SEQ D NO：2)的bp1-2538对应
2539-2682	非翻译前导序列(SEQ ID NO：1的bp735-878)的反向互补序列
		2683-3416	ADF启动子(SEQ ID NO：1的bp1-734)的反向互补序列
3417-5656	和pDAB305(SEQ ID NO：2)的3557-5796对应

                     实施例3

                  pDAB621的构建

质粒pDAB621和实施例2中的pDAB620不同在于该质粒的ADF启动子的3’端紧接有ADH/MSV内含子前导区。为了将ADF启动子克隆到修饰过了的ADH内含子I/MSV前导区之前，用PCR扩增分别在ADF启动子的5’端和3’端引入Hind III位点和BamH位点。ADF启动子的PCR扩增是在Robocycler^Gradient96 Temperature Cycler(Stratagene)中进行的，条件如下：70ng克隆到PCR^2.1-Topo载体中的DNA(SEQ ID NO：1)，15μl GeneAmp^XL PCR试剂盒中的3.3xXL Buffer II(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division)，引物各50pmol，1mM醋酸镁，dNTP各0.2mM，1.5μl rTth DNA聚合酶(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division)。扩增产物克隆到PCR^2.1 Topo(Invitrogen)中。挑选单个的克隆，用碱裂解法抽提出DNA，该ADF片断用琼脂糖凝胶纯化和用GenElute Agarose SpinColumns(Supelco，Inc.，Bellefonte，PA)抽提出DNA。为了把ADF启动子克隆进pDAB305中，从重组PCR^2.1-Topo(Invitrogen)中以BamHI和Hind III片断的形式分离出ADF启动子。质粒pDAB305经Hind III和BamHI(New England Biolabs)消化以除去其含有的启动子来制备。Hind III/BamHI ADF启动子片断与该缺失型pDAB305载体混合，依照制造商的说明用快速DNA连接试剂盒(Rapid DNA LigationKit)(Roche Diagnostics formerly Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)连接。用连接混合物转化亚克隆高效DH5α^TM感受态细胞(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)。细胞在含有75μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上涂平板。37℃下隔夜培养。挑选单个菌落，抽提出DNA，用上文描述的方法测序。含有替换了CaMV启动子的ADF启动子片段的质粒称为pDAB621。

                      pDAB621的特征

pDAB621的碱基对	特征描述
		1-2912	和pDAB305(SEQ ID NO：2)的bp1-2912对应
2913-3056	非翻译前导序列(SEQ ID NO：1的bp735-878)的反向互补序列
		3057-3790	ADF启动子(SEQ ID NO：1的bp1-734)的反向互补序列
3791-6030	与pDAB305(SEQ ID NO：2)的bp3557-5796对应

                      实施例4

                   pDAB625的构建

质粒pDAB625和质粒pDAB620有本质的不同，该质粒的ADF启动子的3’端紧接有ADF内含子1。为了构建ADF启动子/ADF内含子载体，用PCR剪接重叠延伸策略(PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications，ed.Innis，M.；Gelfand，D.；Sninsky，J.；White，T.，1990，Academic Press)使该启动子和该增强子序列融合。用合适的引物在不同反应中分别扩增ADF启动子和ADF内含子。反应条件如下：10ng模板DNA(克隆进PCR^2.1-Topo载体的SEQ ID NO：1)，10μlGenekmp^10x PCR缓冲液(PE/ABI)，引物各100pmoles，5单位的AmpliTaq Gold^TM聚合酶(PE/ABI)，总体积100μl。在GeneAmp^PCRSystem9600温度循环仪中进行循环，条件如下：95℃ 10min，(94℃30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min)15个循环，72℃反应5min。再进行PCR反应使启动子片断和内含子产物融合，该反应包括如下成分：PCR产物各50ng，30μl 3.3x XL Buffer(PE/ABI)，4μl 25mM醋酸镁，10μl 2mM dNTPs，引物各100pmoles，6单位的rTth DNA聚合酶(PE/ABI)，总体积50μl。反应在RoboCycler^Gradient96Temperature Cycler(Stratagene)中进行，循环条件如下：94℃ 1min，(94℃ 30sec，70℃ 4min)×20循环，72℃ 10min。2148bp的终产物在琼脂糖凝胶(FMC)上跑电泳。切下目标片断，用GenEluteAgarose Spin Columns(Supelco，Inc.)抽提出DNA。进行另一个PCR反应扩增该2148bp的片断，将反应产物克隆到PCR^2.1-Topo(Invitrogen)中。挑选出单个菌落，抽提出DNA，用上文描述的方法测序。为了把ADF启动子/ADF内含子融合物克隆进pDAB305中，用NcoI和Hind III限制内切酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)消化重组PCR2.1-Topo(Invitrogen)克隆，以Hind III和Nco I片断从中分离出融合产物。质粒pDAB305以Hind III和Nco I(NewEngland Biolabs)消化以除去其含有的启动子和内含子/前导区。HindIII/Nco I的ADF启动子/ADF内含子片断与该Hind III/Nco I缺失型pDAB305载体混合，依照制造商的说明用快速DNA连接试剂盒(RapidDNA Ligation Kit)(Roche Diagnostics formerly BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)连接。再用连接混合物转化亚克隆高效DH5α^TM感受态细胞(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，在含有75ug/ml氨苄青霉素的LB培养基上涂平板，37℃下隔夜培养，挑选单个菌落，抽提出DNA，用上文描述的方法测序。将含有替换CaMV启动子/ADH内含子的ADF启动子/ADF内含子片断的质粒称为pDAB625。

                  pDAB625的特征

pDAB625的碱基对	特征描述
		1-2538	与pDAB305(SEQ ID NO：2)的bp1-2538一致
2539-3818	ADF内含子(SEQ ID NO：1的bp882-2161)的反向互补序列
		3819-3962	ADF前导序列(SEQ ID NO：1的bp735-878)的反向互补序列
3963-4694	ADF启动子(SEQ ID NO：1的bp1-734)的反向互补序列，除了PCR方法产生的如下修饰：bp4059和4060间的G缺失，bp4131和4132间的G缺失，4195位的G替换为A，和4508位的A替换为G
		4695-6934	与pDAB 305(SEQ ID NO：2)的bp3557-5796一致

                      实施例5

                ADF-GUS结构的瞬时测试

II型愈伤组织的培养是从基因型为″Hi-II″的未成熟合子胚开始的(Armstrong等.(1991)Maize Genet.Coop.News Lett.65：92-93)。胚从Hi-II亲本A与Hi-II亲本B杂交产生杂种的温室培养的植物穗中分离，或从Hi-II植物自花授粉或同胞授粉产生的F2胚中分离获得。未成熟胚(1.5-3.5mm)培养在15AglO愈伤组织起始培养基中，该培养基包含N6盐和维生素(Chu等，(1978)，N6 medium and itsapplication to anther culture of cereal crops.Proc.Symp.PlantTissue Culture，北京出版社，43-56)、1.0mg/L2，4-D、25mM L-脯氨酸、100mg/L酪蛋白水解产物、10mg/L AgNO₃，2.5g/L脱乙酰吉兰糖胶(GELRITE)(Schweizerhall，South Plainfield，NJ)、和20g/L蔗糖，pH为5.8。4到6星期后，将愈伤组织接种到保持培养基中(在起始培养基的基础上去掉AgNO₃，同时将L-脯氨酸的量减到6mM)。约12-16周后挑选II型愈伤组织。

根据下文的实验方案，每一个用于测试的GUS结构和pDeLux(含有一个带有Nos 3’UTR的修饰35S启动子驱动的萤光素酶)一起共沉淀到金颗粒上。使用等摩尔量的GUS质粒。总共70μg DNA：35μg的pDeLux加上35μg的测试DNA和Bluescript^TM DNA(Stratagene，La Jolla，CA)(必要时)用蒸馏水稀释到150μL。再把该DNA和水加到30mg表面无菌的1.0μm金颗粒球中(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。短时间涡旋该混合物(大约15秒)后，加入37μL的2.5M氯化钙和15μL的0.1M亚精胺(游离碱)。涡旋30秒后，DNA和金从溶液中沉淀出来，去掉上清液，加入1mL乙醇。DNA/金混合物以1∶4的比例稀释后用于转化。

II型愈伤组织在渗透培养基(osmotic medium)中预处理约16小时。渗透培养基是在保持培养基的基础上还含有0.2M山梨糖醇和0.2M甘露糖醇。然后，将愈伤组织放在盛有渗透培养基的60×20mm培养皿中用于氦轰击，该培养基含有2％的琼脂糖而固化。每个靶(500-600mg的愈伤组织)用104μm的网筛覆盖，以阻止组织溅出和丢失。在Dow AgroSciences Helium Blast Device1.0(美国专利No.5,141,131)中每个靶都分别用DNA/金混合物轰击。在25英寸Hg的部分真空，轰击距离为10cm，压强为1500psi的条件下，DNA/金混合物轰击每个靶4次，每次轰击的送出体积为20μl。还在该程序中途时混合组织，以暴露未轰击的愈伤组织。轰击结束后，将靶组织放在原先的渗透培养基中黑暗条件下26℃过夜培养。

每个试验挑选4个II型愈伤组织细胞系。每一结构要用到来源于每一个细胞系的两个靶。还包括由来源于全部上述4个细胞系的混合组织构成的两个非转化对照组织(NTC)。根据上述相同的方案将该对照组织转移到渗透和轰击培养基中，然而并不进行氦轰击。

轰击后大约20小时，将每种靶组织各200-400mg转移到1.5mL样品管中(Kontes，Vineland，NJ)。为了抽提蛋白质，用由0.35A、40W马达驱动的不锈钢Kontes Pellet Pestle(Model102，RaeCorporation，McHenry，IL)匀浆愈伤组织，设置为″90″。以萤光素酶分析试剂盒(Promega，Madison，WI)的细胞培养物裂解试剂作为抽提缓冲液。向裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟(PMSF)和亮抑酶肽半硫酸盐(leupeptin hemisulfate salt)使其终浓度分别为1mM和50μM。再研磨前向样品管中每1mg组织加入0.5L裂解缓冲液。每隔25秒研磨一次，反复进行4次以匀化愈伤组织，每个研磨期后在冰上保温10秒钟。之后向样品中每1mg组织加入1.0μL裂解缓冲液，样品放在冰上直到全部样品研磨完。然后在5℃全速离心样品2次(Eppendorf Centrifuge Model5415)，每次时间为7分钟。转移第一次离心后的上清液，去掉其沉淀。第二次离心后收集愈伤组织提取物(上清液)，在冰上保温以进行GUS和LUC分析。

根据制造商的指导，制备LUC分析试剂盒的LUC分析缓冲液。将缓冲液加热到室温，加到自动发光光度计(Model1251 Luminometerand Model1291 Dispenser，Bio-Orbit，Finland)的分配泵中。每个样品分析三份，向三个聚丙烯光度计分析皿(Wallac，Gaithersburg，MD)中各加20μl抽提物。每管加入100μl分析缓冲液，45秒整合(integration)期后检测发光。“空白反应”是用20μl的抽提缓冲液代替愈伤组织抽提物并在每个试验中进行测定。

为了分析GUS活性，使用一种GUS-Light^TM分析试剂盒(Tropix，Bedford，MA)。同样，每个样品分析三份，每个光度计分析皿中加20μl抽提物。根据制造商的指导用分析试剂盒制备GUS-Light^TM反应缓冲液。该缓冲液加热到室温，间隔10秒向每个光度计分析皿中等份加入180μl。室温下保温1小时后，加入300μL GUS-Light^TM光发射加速缓冲液，5秒的整合期过后检测发光。在GUS分析中也包括“空白反应”，用20μl的抽提缓冲液代替愈伤组织抽提物。

GUS和LUC结果用相对光单位(RLU)表示。样品RLU的读数减去空白和NTC读数。为了便于比较各个GUS结构，取平方根使GUS读数相对于LUC读数标准化，计算每个测试样品的GUS/LUC比率值。每种结构所有样品的该比值取平均值，用统计显著性分析T检验法进行比较，一种修饰35S启动子(35T)/GUS/Nos多聚A结构(pDAB305)作为每个试验的对照。测试结构的表达水平表示为pDAB305活性的百分比。

相对于35T对照，质粒pDAB620被证明没有高于本底水平的表达。然而，将pDAB621和pDAB625进行重复试验，平均分别能达到标准表达水平的62％和82％。pDAB621的表达水平一直比对照要显著地低。但是pDAB625的表达有点更不稳定，有时和pDAB305的表达水平一样好。

                    实施例6

                在玉米中稳定表达

ADF启动子的活性用质粒pDAB630(ADF启动子/ADF内含子/PAT/nosA)转化的玉米组织在含选择剂的培养基中形成愈伤组织的频率来表征。产生含有在稻肌动蛋白启动子控制下的PAT的转基因玉米事件为内对照。在15个并行试验中，ADF构建体恢复除草剂抗性分离株的效果和稻肌动蛋白启动子构建体一样好，或超过了稻肌动蛋白启动子构建体。Southern分析证实所有产生的ADF事件中均含有PAT基因。

                       实施例7

                      转基因玉米

分析从两例转化了质粒pDAB625的事件来源的转基因植物在叶组织中的GUS表达。在定量分析中，观察到GUS水平占总的可提取蛋白的0.02％。

                        序列表<110>Rubin-Wilson，Beth

 Smith，Kelley A<120>玉米肌动蛋白解聚因子的启动子和内含子<130>50695<140><141><150>US60/167，111<151>1999-11-23<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2253<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：AP2/BC294 PCR产物<400>1cgcccgggca ggtaaatagc aagtgatttt ctctctatgg attccatcta ttttcctggc 60caccaaacta gccttaagat ttgttttgtc tggatagcac aaaaattgtc catcttgctt 120gcacccataa cactgccttg aacagaagat gcatgattac ctgcatgcat tgaacgacat 180accagataag tgccaccagt accacaaact tacatctcgg agacacctta ctatatgatt 240tatgttgtca caacatacag gtattatact cacttcttag agttgtattt ttatattcgt 300attgtagtgt aatttgattt gtattagttt agttctgtat tggttgtttc taaaaaaatc 360gttagattat atcgataata tatgtggtat tcgtttttac gtaatcattg tgcactaaca 420ttttgttgaa tatattatat accgttgcaa cgcacgggca cccaactagt ctattcatta 480ttttcccagg atgctcattc cgaaatctct ctcgcggaga agaaaacgaa cgaaagatca 540cgaaagatcg cgcatcggcg gcccgtccat ctcgacatcc gacgaccgcg caagctcgca 600gtgggccgct ccgttccgtc gcggggcagc taccgcctac cacacccccg ctccccgcac 660cgcacggacc ggggtggtaa aacccggcga ccacatcaaa acacgaggcg tccccgactc 720cgcagtccgc aggaccggtc actcggcacg caggctagca gcacagcagc agccagagcc 780atcccctctc ctcgctacgc ttcgcttcct cggcgccgat tcctcctcct cctcctccac 840cctcgtccgt ccccttccgg cgcacgagct cgcccgagat ggtaaggccc ccgctcccat 900ccgctacccc tccctccccc tccgcgcact ctggttcctc cccggatcgg cgagcgcgtg 960ctgattccgg gccttctgtt ctcgcggagc ggtagcgtag cgcttcggat ctagttggat 1020tcagggggtg aggaggatcg ccgctgctcg gcttgctcgt gggctgattc gtggtttcgt 1080cgggagggag ttctgatcgg gatcatgggg ttgttcatgg ttccgtgacg cttgggagcc 1140agaaacttgc gtgggattcc gcgatctgtg gcttggattt ctggctcttc gtctagcgct 1200agctgcagac cgtggcgtgg tgcgcggccg cttggatccg ttgctgtttg cgccgtgcgg 1260tgtaaaatcg aactgtttag atctaagtcc cgctagatgc cgtggcggtg gaatctcggt 1320tgatctgtgt gtctgagcgc ctgtgtagct cttgtggctg taacatacat ctgctgattt 1380ggctctcgac ggcttaggcc gcgggagcct agatggcgga gcaccagctg ctccctaatc 1440aggttggttc tcgtgtggat ctgttgactt gactgtaggt tgcagacttg cagtaggacg 1500ctggcactgc cattgaccag gagctgcaca acaggggcga agctaggtta tttttaggag 1560gtgcagatag gggtggtaat gacctctaga ttttgcacta taaaatgtaa tgatcggatc 1620gaatcgggat catcctccat tcctattcat ttttgaacta aaaataatta agggccctaa 1680cttattatga agaaacattt gggtcgtgat ccactactac ccctaggggg agatgcaccc 1740caaaaaaatt ctatagattt agttaaaatt tcaccatata tgcatcccta taaaaaattc 1800ttatgcacat tcaattttgt tctagcttcg ccactgagta ctgagcacta gcataagaat 1860tttgttctag aatatgtggc ggtagtatac cctgctagca ctcactaggt gtctcccact  1920ctcccgagaa atgcgtttct tgtttagaca cttggcacta tcggtcgaga gtcaagacta  1980tgagctgaac tgctgaaatg tctaatgtta gcagtttctg cactggttca attgcagcct  2040gatttagaaa tgctggggac agctggctgt gccatgcaaa ataaaatgtg gtagtaggta  2100ctttgaaggg agactcaaac tttgcatttc caattaacca tgatttaact tgtggttgca  2160ggcgaacgcg agatcgggtg tcgctgtgaa cgatgagtgc atgctgaagt ttggcgagct  2220gcagtcgaag aggctgcacc gcttcataac ttt                               2253<210>2<211>5796<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：pDAB305<400>2tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cccgatctag taacatagat 420gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat 480taaatgtata attgcgggac tctaatcata aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat 540tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca 600agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa ctttattgcc aaatgtttga acgatcgggg 660aaattcgagc tctccaattc cccaccgagg ctgtagccga cgatggtgcg ccaggagagt 720tgttgattca ttgtttgcct ccctgctgcg gtttttcacc gaagttcatg ccagtccagc 780gtttttgcag cagaaaagcc gccgacttcg gtttgcggtc gcgagtgaag atccctttct 840tgttaccgcc aacgcgcaat atgccttgcg aggtcgcaaa atcggcgaaa ttccatacct 900gttcaccgac gacggcgctg acgcgatcaa agacgcggtg atacatatcc agccatgcac 960actgatactc ttcactccac atgtcggtgt acattgagtg cagcccggct aacgtatcca 1020cgccgtattc ggtgatgata atcggctgat gcagtttctc ctgccaggcc agaagttctt 1080tttccagtac cttctctgcc gtttccaaat cgccgctttg gacataccat ccgtaataac 1140ggttcaggca cagcacatca aagagatcgc tgatggtatc ggtgtgagcg tcgcagaaca 1200ttacattgac gcaggtgatc ggacgcgtcg ggtcgagttt acgcgttgct tccgccagtg 1260gcgaaatatt cccgtgcact tgcggacggg tatccggttc gttggcaata ctccacatca 1320ccacgcttgg gtggtttttg tcacgcgcta tcagatcttt aatcgcctgt aagtgcgctt 1380gctgagtttc cccgttgact gcctcttcgc tgtacagttc tttcggcttg ttgcccgctt 1440cgaaaccaat gcctaaagag aggttaaagc cgacagcagc agtttcatca atcaccacga 1500tgccatgttc atctgcccag tcgagcatct cttcagcgta agggtaatgc gaggtacggt 1560aggagttggc cccaatccag tccattaatg cgtggtcgtg caccatcagc acgttatcga 1620atcctttgcc acgtaagtcc gcatcttcat gacgaccaaa gccagtaaag tagaacggtt 1680tgtggttaat caggaactgt tcgcccttca ctaccactga ccggatgccg acgcgaagcg 1740ggtagatatc acactctgtc tggcttttgg ctgtgacgca cagttcatag agataacctt 1800cacccggttg ccagagg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Claims (18)

1.含有ADF启动子的分离的DNA分子。

2.分离的DNA分子，其含有SEQ ID NO：1第1-734位碱基对，或该序列保持有充当植物细胞启动子的能力的片断、遗传变体或缺失型(deletion)。

3.权利要求2的分子的片断、遗传变体或缺失型，其特征是含有至少200个连续碱基对，该连续碱基对与SEQ ID NO：1第1-734位碱基对所定义序列的200个连续碱基对一致。

4.具有20个碱基对的核苷酸部分的分离的DNA分子，该核苷酸部分在序列上与SEQ ID NO：1第1-734位碱基对所示序列的20个连续碱基对的部分一致。

5.含有ADF内含子1的分离的DNA分子。

6.分离的DNA分子，其含有SEQ ID NO：1第882-2161位碱基对，或在植物细胞中和启动子一起使用时保持有增强表达的能力的该序列的片断、遗传变体或缺失型。

7.权利要求6的分子的片断、遗传变体或缺失型，其特征是含有至少600个连续碱基对，该连续碱基对与SEQ ID NO：1第882-2161位碱基对所定义序列的600个连续碱基对一致。

8.具有20个碱基对的核苷酸部分的分离DNA分子，该核苷酸部分在序列上与SEQ ID NO：1第882-2161位碱基对所示序列的20个连续碱基对的部分一致。

9.含有与异源核酸序列可操作地连接的启动子的DNA构建体，其中该启动子选择性地与SEQ ID NO：1杂交。

10.权利要求9的DNA构建体，其中启动子包含：

(a)SEQ ID NO：1第1-734位的碱基对，或

(b)至少200个连续碱基对，该连续碱基对与SEQ ID NO：1第1-734位碱基对所定义序列的200个连续碱基对一致，或

(c)20个碱基对的核苷酸部分，该核苷酸部分在序列上与SEQ IDNO：1第1-734位碱基对所示序列的20个连续碱基对的部分一致。

11.含有与异源核酸序列连接的内含子的DNA构建体，其中所述内含子选择性地与SEQ ID NO：1杂交。

12.被转化的植物，该植物含有至少一个包含权利要求9的DNA构建体的植物细胞。

13.被转化的植物，该植物含有至少一个包含权利要求11的DNA构建体的植物细胞。

14.含有权利要求9的DNA构建体的种子或谷粒。

15.含有权利要求11的DNA构建体的种子或谷粒。

16.在植物中表达异源核酸序列的方法，包括：

a)将含有与异源核酸序列可操作地连接的ADF启动子的载体导入到植物细胞中；和

b)将所述细胞再生成植物。

17.产生种子的方法，包括：

a)将含有与异源核酸序列可操作地连接的ADF启动子的载体导入到植物细胞中；

b)将所述细胞再生成植物；和

c)将所述与所述异源核酸序列可操作地连接的ADF启动子以有性的方式传递给后代。

18.权利要求17的产生种子的方法，包括收集所述后代产生的种子的额外步骤。