KR101901990B1 - 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터, 그를 포함한 세포, 및 그를 이용하는 방법 - Google Patents

Abstract

대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터, 그를 포함한 세포, 및 그를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터, 그를 포함한 세포, 및 그를 이용하는 방법{Vector replicable both in E.coli and lactic acid bacteria cell, cell including the vector, and method of using the cell}

대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터, 그를 포함한 세포, 및 그를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 들어 생명공학 기법 등을 이용하여 유산균 원래의 특성 이외에 새로운 기능을 가진 유산균을 개발하기 위한 연구가 계속해서 진행되고 있다. 가장 활발한 유산균의 연구 분야는 유산 구균인 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 이용하는 것이며, 현재 대장균과 견줄만한 수준까지 와 있다. 그 외에도 유산 간균 락토바실러스(Lactobacillus) 속도 활발한 연구가 진행되어 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 등 다양한 균종에서의 형질전환이 보고되고 있으며, 류코노스톡(Leuconostoc) 또한 플라스미드가 분리된 이래 여러 외래 유전자의 복제, 전달 및 발현을 위한 연구가 이루어지고 있다.

한편, 대장균 및 유산균에 대하여 모두 복제가능한 셔틀벡터(shuttle vector)에 대한 연구가 이루어지고 있다. 셔틀 벡터는 복수의 균주에서 플라스미드의 형태로 유지될 수 있는 성질을 가지는 벡터를 말한다. 일반적인 셔틀 벡터는 대장균과 대장균 외의 균주에서 유지될 수 있는 성질을 가진다. 따라서 대장균을 이용한 클로닝과 대상 균주에서의 형질 도입을 모두 할 수 있는 특징을 가진다.

그러나, 이러한 연구에도 불구하고, 종래 개발된 대장균 및 유산균에 대한 셔틀벡터에 대해서는 보고된 수가 적다. 따라서, 대장균 및 유산균에 대하여 모두 복제가능한 대안적인 셔틀벡터가 요구되고 있다. 특히, 류코노스톡과 같은 특정 유산균뿐만 아니라 다른 유산균에서 복제가 가능한 광범위 숙주세포에서 복제가능한 셔틀벡터가 요구되고 있다.

일 양상은 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터를 제공한다.

다른 양상은 상기 벡터를 포함하는 유산균을 제공한다.

다른 양상은 상기 유산균으로부터 목적 산물을 생산하는 방법을 제공한다.

일 양상은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유산균의 DNA 복제 원점 pLMT1-74 ReP, 및 대장균의 DNA 복제 원점을 포함하는, 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터를 제공한다.

상기 벡터에 있어서, 상기 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열은 광범위 유산균 숙주 벡터인 pLMT1-74의 복제 원점인 Rep origin 서열 즉, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 즉, pLMT1-74의 일부분 서열로서, 유산균에서 복제능을 부여하는 것일 수 있다. 대장균의 DNA 복제 원점은 대장균에서 복제능을 제공하는 것이면 어느 것이나 포함된다. 대장균의 DNA 복제 원점은 pUC19 ori, 즉 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 벡터는 선발표지 유전자(selection marker gene)를 포함할 수 있다. 상기 선발표지 유전자는 항생제 내성 유전자, 발광 또는 형광 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 필수 영양소 생산 유전자인 것일 수 있다. 상기 항생제는 테트라시클린, 클로람페닐콜, 카나미신, 또는 암피실린을 포함할 수 있다. 상기 항생제 내성 유전자는 베타 락타마제를 코딩하는 유전자 또는 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제를 코딩하는 유전자, 테트라시클린 배출 시스템(tetracycline efflux system)을 코딩하는 클라스 A (RP1, RP4 또는 Tn1721 유도체 포함), B (Tn10 유도체) 및 C (pSC101 또는 pBR322 유도체)의 tetA 유전자일 수 있다. 상기 클로람페니콜 저항성 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것 즉, 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase: CAT) 유전자일 수 있다. 상기 발광 단백질 유전자는 루시퍼라제(Luciferase) 유전자 등일 수 있고, 상기 형광 단백질 유전자는 젤리피쉬 녹색형광단백질(green fluorescent protein: GFP) 또는 적색형광단백질(red fluorescent protein: RFP) 유전자일 수 있다. 필수 영양소 생산 유전자는 아미노산, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 핵산 염기, 또는 단백질을 생산하는데 관여하는 유전자일 수 있다.

상기 유산균의 DNA 복제 원점 pLMT1-74 ReP, 대장균의 DNA 복제 원점, 및 선발표지 유전자 중 둘 이상이 서로 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.

상기 벡터는 프로모터, 리보좀 결합 부위(ribosomal binding site: RBS), 다중클로닝 부위(multi-cloning site: MCS), 및 전사 터미네이터 중 하나 이상, 예를 들면 2, 3, 및 4개를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 벡터는 작동가능하게 연결된, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 다중클로닝 부위, 및 전사 터미네이터 중 두 개 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 프로모터는 P11 프로모터(서열번호 5, Rud et al., Microbiology, 2006)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 RBS는 유산균에서 유래된 것일 수 있다. 상기 리보좀 결합 부위는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 다중클로닝 부위(MCS)는 2개 이상, 예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 제한 효소 절단 부위를 갖는 것일 수 있다. 상기 MCS는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 MCS는 16개 제한 효소인 HindIII, PstI, EcoRⅤ, SalI, NotI, BglII, NdeI, SacI, XmaI, BamHI, XhaI,SpeI, SphI, PvuI, NheI, 및 XhoI 절단 인지 서열을 포함할 수 있다. 상기 전사 터미네이터는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 전사 터미네이터는 대장균, 또는 유산균 유래의 것일 수 있다. 상기 터미네이터 ref 기반으로 제작된 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 전사 또는 번역이 이루어져 기능적인 전사 또는 번역 산물을 생산할 수 있도록 하는 연결을 나타낸다.

상기 벡터는 도 2에 나타낸 벡터 지도를 갖는 pMT47, 또는 도 3에 나타낸 벡터 지도를 갖는 pMT48 벡터일 수 있다.

상기 벡터는 pUC19 벡터의 EcoRI 부위에 EcoRI으로 절단된 서열번호 1의 pLMT1-74가 결합된 것, 또는 pUC19 벡터의 EcoRI 부위에 서열번호 2의 LMT1-74 Rep 유전자가 연결된 것일 수 있다.

상기 벡터의 일 구체예는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열(pLMT1-74 ReP), 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 (pUC19 ori) 및 선발표지 유전자를 포함하고, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 목적 산물을 코딩하는 유전자, 및 전사 터미네이터가 작동가능하게 연결되어 있는 것인 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터이다. 상기 벡터는 도 6에 나타낸 벡터 지도를 갖는 pMT67인 것일 수 있다.

상기 목적 산물을 코딩하는 유전자는 질병 예방, 성장 촉진, 면역 증강 등의 기능을 부여하거나 향상시킬 수 있는 단백질, 예컨대 항원, 항체, 수용체, 호르몬, 사이토카인, 조절 단백질, 구조 단백질 등을 코딩하는 유전자일 수 있다.

상기 벡터는 에스케리키아(Escherichia) 속, 예를 들면 대장균과 유산균에서 복제될 수 있는 것일 수 있다. 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 류코노스톡(Leuconostoc)은 류코노스톡 메센터로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 또는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum)일 수 있다. 상기 락토바실러스(Lactobacillus)는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 또는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)일 수 있다. 상기 락토코커스(Lactococcus)는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)일 수 있다. 상기 스트렙토코커스(Streptococcus)는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus)일 수 있다. 상기 와이셀라(Weissella)는 와이셀라 시베리아(Weissella cibaria)일 수 있다. 상기 엔테로코커스(Enterococcus)는 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 또는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium)일 수 있다.

다른 양상은 상기한 벡터를 포함하는 대장균 또는 유산균을 제공한다.

다른 양상은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유산균의 DNA 복제 원점 pLMT1-74 ReP, 대장균의 DNA 복제 원점, 및 선발표지 유전자를 포함하고, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 목적 산물을 코딩하는 유전자, 및 전사 터미네이터가 작동가능하게 연결되어 있는 것인 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터를 포함하는 대장균 또는 유산균을 제공한다.

상기 세포에 있어서, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유산균의 DNA 복제 원점 pLMT1-74 ReP, 대장균의 DNA 복제 원점, 및 선발표지 유전자를 포함하고, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 목적 산물을 코딩하는 유전자, 및 전사 터미네이터가 작동가능하게 연결되어 있는 것인 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터는 상기한 바와 같다.

다른 양상은 목적 산물을 코딩하는 유전자를 포함하는 상기한 벡터를 포함하는 대장균 또는 유산균을 배양하는 단계;를 대장균 또는 유산균으로부터 목적 산물을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 목적 산물을 코딩하는 유전자는 상기한 벡터 중의 다른 유전자와 작동가능하게 연결될 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유산균의 DNA 복제 원점 pLMT1-74 ReP, 대장균의 DNA 복제 원점, 및 선발표지 유전자를 포함하고, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 목적 산물을 코딩하는 유전자, 및 전사 터미네이터가 작동가능하게 연결되어 있는 것인 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터를 포함하는 유산균을 배지 중에서 배양하여 배양물을 얻는 단계;를 포함하는 유산균으로부터 목적 산물을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 배양하는 단계는 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는, 당원으로서 예를 들면, 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프락토오스, 말토오스, 전분, 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 아세트산과 같은 유기산을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있다. 상기 배지는 질소원으로서 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있다. 상기 배지는 인원으로서 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 포함할 수 있다. 상기 배지는 예를 들면, 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양에서 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질 또는 적절한 전구체가 배양물에 첨가될 수 있다. 상기 물질은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식으로 예를 들면, 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

상기 배양은 호기 조건에서 수행하는 것일 수 있다.

상기 방법은, 얻어진 배양물로부터 목적 산물을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리는 목적 산물에 따라 다를 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 산물이 단백질인 경우, 배양액을 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액으로부터 단백질을 분리하거나, 세포를 회수하고 파쇄하여 단백질을 분리하는 것을 포함할 수 있다.

일 양상에 따른 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터에 의하면, 대장균 및 유산균에서 복제될 수 있다.

다른 양상은 따른 상기 벡터를 포함하는 유산균에 의하면, 유산균에서 상기 벡터를 복제할 수 있고, 목적 산물을 생산하는데 사용할 수 있다.

다른 양상에 따른 상기 유산균으로부터 목적 산물을 생산하는 방법에 의하면, 유산균으로부터 목적 산물을 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 플라스미드 pLMT1-74의 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 셔틀벡터 pMT47의 구성을 나타낸 도면이다.
도 3은 셔틀벡터 pMT48의 구성을 나타낸 도면이다.
도 4는 셔틀벡터 pMT48로 형질전환된 E. coli로부터 추출한 셔틀벡터 pMT48을 전기영동에 의하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 셔틀벡터 pMT48로 형질전환된 Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum , Lactobacillus casei , 및 Lactobacillus brevis 균주로부터 증폭된 CAT 유전자를 나타낸다.
도 6은 벡터 pMT67의 구성을 나타낸 도면이다.
도 7은 발현 벡터 pMT67을 숙주세포에 형질도입하고 배양하여 항-TNF-알파 VHH 유전자가 발현되는지를 웨스턴 블롯팅에 의하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : 대장균 및 유산균에서 복제될 수 있는 셔틀 벡터의 제조

본 실시예에서는 Leuconostoc mesenteroides LMT1-74 (이하 "LMT1-74"라고도 한다) 유래의 pLMT1-74 유래의 DNA 복제 원점 서열 pLMT1-74 Rep과 대장균 pUC19 벡터 유래의 대장균 복제원점 서열을 결합시켜 유산균과 대장균 세포에서 복제될 수 있는 셔틀벡터를 제작하였다.

(1) 실험 재료

대장균 MC1061은 셔틀벡터 제작 및 이형 단백질(heterologous protein)을 셔틀벡터에 클로닝하기 위하여 사용하였고, LMT1-74 균주는 김치 발효 초기에 야생에서 분리한 균주이며, 잠적 플라스미드인 pLMT1-74를 가지고 있다.

본 실시예에서 달리 언급이 없으면, 하기 표 1에 기재된 재료를 사용하였다.

표 1.

(2) Leuconostoc mesenteroides LMT1 -74로부터 pLMT1 -74 분리 및 뉴클레오티드 서열 확인

(2.1) 플라스미드 pLMT1 -74의 분리

김치에서 분리한 LMT1 -74 균주(Leuconostoc mesenteroides KCTC 13164BP)를 50 ml MRS 액체 배지(10g Proteose Peptone No. 3., 10g Beef Extract, 5g Yeast extract, 20g Dextrose, 1g Polysorbate, 2g Ammonium Citrate, 5g Sodium Acetate, 0.1g Magnesium Sulfate, 0.05g Manganese Sulfate, 2g Dipotassium Phosphate per 1L) 중에서 37℃에서 하루 동안 정치 배양하였다. 배양물을 13,000rpm에서 2분간 원심분리 하여 균체를 모은 후 200 uL의 lysozyme(20mg/mL)을 함유한 500uL TES buffer(30mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 5mM EDTA, pH8.0)에 현탁하였다. 현탁물을 37℃에서 1시간 동안 충분히 인큐베이션시킨 후 Plasmid midi kit(Qiagen, Inc., Valencia, CA)를 이용하여 잠적 플라스미드 pLMT1-74를 분리하였다.

(2.2) 플라스미드 pLMT1 -74의 뉴클레오티드 서열 분석

분리된 플라스미드 pLMT1-74를 여러 가지 제한효소 처리한 결과, EcoR I에 의해 절단하였다. 또한 pLMT1-74의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위하여 대장균 벡터인 pUC19를 EcoR I로 절단한 후, 동일한 효소로 절단된 플라스미드 pLMT1-74를 리가제를 사용하여 서로 연결하여 pUC19의 EcoR I 자리에 플라스미드 pLMT1-74를 연결하였다.

얻어진 벡터의 뉴클레오티드 서열을 결정하였고, 그로부터 플라스미드 맵을 그렸다. 도 1은 플라스미드 pLMT1-74의 구성을 나타낸 도면이다. 플라스미드 pLMT1-74는 길이가 3181nt를 갖고, G+C 함량은 38%이었다.

(3) 셔틀벡터 pMT47 , 및 pMT48 제작

(3.1) 셔틀벡터 pMT47 의 제작

셔틀벡터를 제조하기 위하여, 먼저 대장균에서 작용하는 복제원점(ori) 유전자를 가진 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 pUC19(New England Biolabs)의 대장균 DNA 복제 원점인 pUC19 ori 영역과 류코노스톡 속에서 작용하는 스타필로코커스(Staphylococcus) 유래의 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제(CAT) 유전자를 KpnI 제한효소를 사용하여 절단하여 얻고 이들을 연결하여, pUC19 ori 영역와 CAT 유전자의 연결체를 제한효소 EcoR I로 절단한 상기한 pLMT1-74와 연결하여 셔틀벡터 pMT47을 제조하였다. CAT 유전자의 도입에 따라, pUC19의 amp 저항성 유전자는 제거되었다. 도 2는 셔틀벡터 pMT47의 구성을 나타낸 도면이다. 따라서, 셔틀벡터 pMT47은 대장균 DNA 복제 원점 서열 즉, pUC19 ori 서열, 및 플라스미드 pLMT1-74 유래 복제 원점 ReP을 포함하고 있어서, 대장균과 류코노스톡 속에서 복제됨을 확인하였다. 도 2에서, CM은 클로람페니콜 저항성 유전자 마커를 나타낸다. 도 2에서 recombinase 1, 2, replication gene(ReP), 및 hypothetical protein은 pLMT1-74 유래의 유전자이다.

(3.2) 셔틀벡터 pMT48 의 제작

플라스미드 pLMT1-74에서 플라스미드 복제에 관여하는 최소한의 뉴클레오티드 서열인 복제 원점 pLMT1-74 ReP(서열번호 2)을 PCR에 의하여 증폭시켜서 동일한 제한효소 EcoR I로 절단한 후 pUC19과 연결하여 pMT48을 제조하였다. 도 3은 셔틀벡터 pMT48의 구성을 나타낸 도면이다.

PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다:

정방향 프라이어(pLMT1-74rep- For): 서열번호 11

역방향 프라이머 (pLMT1-74rep- Rev): 서열번호 12

셔틀벡터 pMT48을 숙주세포 대장균에 형질도입에 의하여 도입한 후, 48시간 동안 37℃에서 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/L, 박토 효모엑기스 5g/L, 염화나트륨 10g/L) 배지에서 배양한 후 원래의 숙주는 가지고 있지 않지만, pMT48만 가지고 있는 CM 유전자의 일부분, 즉 약 600 nt를 PCR로 증폭하여 제대로 삽입이 되었는지를 확인하였다. 또한, 대장균으로부터 셔틀벡터 pMT48을 분리하고 전기영동을 통하여 확인하였다. 도 4는 대장균으로부터 분리된 셔틀벡터 pMT48을 전기영동한 결과를 나타낸다. 그 결과, CM 유전자가 증폭되었으며, 이는 셔틀벡터 pMT48이 대장균 속에서 복제될 수 있다는 것을 나타낸다.

(4) 유산균에 셔틀벡터의 형질전환

제조한 셔틀벡터 pMT48이 Leuconostoc mesenteroides , Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei , 및 Lactobacillus brevis 균주에서 복제가 되는지를 조사하기 위하여, 각 균주에 상기 셔틀벡터를 형질전환시켰다. 상기 균주를 50mL의 MRS에서 중에서 37℃에서 OD₆₀₀가 0.5가 될 때까지 배양한 후 4℃, 7,000rmp에서 10분간 원심분리하고, 25mL 얼음 냉각된(ice-cold) 증류수로 2회 세척하였다. 이렇게 회수된 균체를 5mL 얼음 냉각된 EPS(EPS: 1mM MgCl₂ 및 0.5M 수크로스 함유 1mM K₂HPO₄ KH₂PO₄, pH7.4)로 1회 세척하고, 1mL 얼음 냉각된 EPS에 현탁하였다.

그 결과, 전기천공법(electroporation)에서 숙주 세포로 사용될 능력 세포(competent cell) LMT1-74 균주를 제조하였다. 이 능력 세포를 -80℃ 딥 프리저(deep freezer)에 보관하였다. 상기 능력 세포 40uL와 셔틀벡터(1ug/uL) DNA pMT48을 큐벳에 옮기고 5분간 얼음에 방치하였다. 25uF, 8kV/cm, 400ohms 조건에서 펄스(pulse)를 준 후, 즉시 1mL MRS 액체 배지를 첨가하고 37℃에서 1시간 가량 배양하였다. 10ug/ml 클로람페니콜이 포함된 MRS 배지에 도말한 후 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. pMT48 서열에 가지고 있는 클로람페니콜 저항성 유전자인 CM 유전자의 일부분인 약 600 nt(이하 "CAT 유전자"라고도 한다)를 PCR로 증폭하여 상기 각 균주에 형질전환된 셔틀벡터가 안정적으로 복제된다는 것을 확인하였다.

도 5는 셔틀벡터 pMT48로 형질전환된 유산균 균주로부터 증폭된 CAT 유전자를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, CAT 유전자가 4개 유산균 균주 모두에서 증폭되었다. 이는 셔틀벡터 pMT48이 류코노스톡, 및 락토바실러스 속에서 복제될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 2: pMT48 에 항- TNF -알파 VHH 유전자의 클로닝

실시예 1에서 만들어진 셔틀벡터 pMT48에 목적 단백질 유전자를 도입하여 발현 벡터 pMT67을 제작하였다. 목적 단백질로는 치료용 단백질로 항-TNF-알파 VHH(15kDa, Nanobody)를 선택하였다. 항-TNF-알파 VHH은 사람 인플루엔자 헤마글루티닌(human influenza hemagglutinin: HA)으로 태그(tag)되어 있다. 또한, 숙주세포에서 상기 목적 단백질이 발현 벡터 pMT67로부터 발현되는지를 확인하였다.

1. 항- TNF -알파 VHH 의 클로닝

서열번호 9의 항-TNF-알파 VHH 유전자(345bp)는 마크로젠 사에서 화학적으로 합성된 것을 구입하여 사용하였으며, HindⅢ 및 XhoI 제한효소를 처리하여 절단하였다. 또한 pMT48도 같은 제한효소로 처리하고, 겔 purification kit를 이용하여 정제한 후 알칼린 포스파타제를 사용하여 탈인산화 반응을 시켰다. 이렇게 준비한 벡터 pMT48 DNA 1uL, 삽입될 항-TNF-알파 VHH DNA 3uL, T4 DNA 리가제(TaKaRa) 0.5uL, 및 완충용액 1uL에 증류수 5.5uL를 채워 총 부피를 10uL로 한 후 16℃에서 12시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 결과, 항-TNF-알파 VHH DNA가 pMT48의 HindIII 및 XhoI 부위에 도입된 벡터 pMT67을 얻었다.

이 벡터를 대장균 MC1061에 삼브룩 등의 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn, 1989)에 의하여 형질전환시켰다. 구체적으로, LB 배지 중에서 37℃에서 200 rpm으로 교반하면서 대장균 MC1061을 배양하고, 열충격(heat shock, 42도 1분 30초)에 의하여 형질도입하였다. 이렇게 얻어진 형질도입된 대장균 MC1061를 10㎍/㎖ 클로람페니콜이 첨가된 LB배지(10g Tryptone, 5g Yeast extract, 10g Sodium chloride, 15g Agar per 1L)를 함유한 플레이트에 도말하여 콜로니를 분리하였다.

도 6은 벡터 pMT67의 구성을 나타낸 도면이다. 도 6에 있어서, VHH_P codon opti는 항-TNF-알파 VHH를 코딩하는 유전자로서 대장균에서 자주 사용되는 코돈으로 치환된 코돈-최적화된 유전자를 나타낸다.

2. 항- TNF -알파 VHH 유전자의 발현 벡터 pMT67 로부터의 발현

실시예1의 4절에 기재된 방법으로 류코노스톡 속에 속하는 Leuconostoc mesenteroides, 및 락토바실러스 속에 속하는 Lactobacillus plantarum , Lactobacillus casei , Lactobacillus brevis 균주를 능력 세포화 시키고, 준비한 벡터 pMT67을 능력세포화된 4개 균주에 전기천공법에 의하여 형질전환시켰다.

얻어진 형질전환체는 10ug/ml 클로람페니콜이 포함된 MRS 배지를 함유한 플레이트(10g Proteose Peptone No. 3., 10g Beef Extract, 5g Yeast extract, 20g Dextrose, 1g Polysorbate, 2g Ammonium Citrate, 5g Sodium Acetate, 0.1g Magnesium Sulfate, 0.05g Manganese Sulfate, 2g Dipotassium Phosphate, 15g Agar per 1L)에 도말한 후 48시간 동안 37℃에서 정치 배양하였다. 콜로니 중 pMT67 서열이 존재하는 것으로 확인된 콜로니만을 액체 배양한 후 항-TNF-알파 VHH의 양을 웨스턴 블롯팅에 의하여 확인하였다. 웨스턴 블롯팅에서 1차 항체는 anti-HA 항체(anti-HA antibody)를 사용하고, 2차 항체는 HRP(horse raddish peroxidase)가 붙어있는 항체를 사용하였다.

도 7은 발현 벡터 pMT67을 숙주세포에 형질도입하고 배양하여 항-TNF-알파 VHH 유전가 발현되는지를 웨스턴 블롯팅에 의하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 7의 결과는 형질도입된 숙주세포를 배양한 후 원심분리하여 균체를 분리한 후, 배양 상등액(supernatant)에 대하여 웨스턴 블롯팅한 결과이다. 즉, 세포로부터 분비되어 배양 상등액에 존재하는 VHH를 분석하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, Leuconostoc mesenteroides , Lactobacilus plantarum , Lactobacillus casei , 및 Lactobacillus brevis에서 15kDa의 단백질이 존재하는 것으로 보아, 항-TNF-알파 VHH이 발현되었다.

<110> Medytox Inc. <120> Vector replicable both in E.coli and Gram positive bacteria cell, cell including the vector, and method of using the cell <130> PN116395KR <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3175 <212> DNA <213> Leuconostoc mesenteroides KCTC 13164BP <400> 1 tgtgctatgc tctaaccaaa tttagctgtt tggaatggag tggtgaaatg agttatttag 60 tggctaatat gcagaaatta aaagctgata atttagttgg cttgggtaat catgatcaac 120 gccgaacgcg acatcacaaa aatactgata ttgacgttaa ccgttctgac ttaaattatg 180 atttagttgc tggtcggact aaccatttca aaacggatat tgaggcttat attaacgatc 240 ataaaaccag tcagcgagcg gtcagaaaag atgccgtttt agtcaatgaa tggattattt 300 cgagcgatag caatttcttt gctaatttaa cggcggctga tacgcgcaaa aagcttactt 360 tgctgaaaaa tttggtgaag aaaacattcg ttatgcgatt gttcatcttg atgagagtac 420 gccccatatg catatgggaa ttgttccatt tgatgatgag tataaattat cggctaaacg 480 ggtgtttaat cgtgcggctt tgcaaaacgt tcaagatcaa ttgccagttt atttacgaca 540 acacggattt gatgttgaac gtggtattca agaatcgcaa cataaaagtt taacggtacc 600 agaatacaaa gctatgcggg aagacttgaa aaaggcgacg cttcaaaaac gagaaataca 660 agctgaactt gaagatgcca gaaaacgcct tgctgaactt aaacctcgtg atcagcagga 720 aattgagagc aaacctactc ttttaagcaa ggataaagtg gttgttagaa aaagtgatct 780 tcatgactta gaatctcgag cagctgtcag tgatatttat aatcaacaac agaaccgttt 840 aaaacttgat aatcaaagct taaattatca actgcttgaa gttaaagaca ataattatga 900 tttaagcaag aaaaatgaga agctccaaaa attagtggat acgttacaag gaattgttcg 960 gagcgttgac cggttcttac agcgcaaatt aggtgttggc ttaccaagtg agtggctaga 1020 acgagctgga ctaaaagaac cgtctaaaaa agcccctcag aggccacagg aacgttcaga 1080 gagacagcat gatgaattag atggtccaag tctttgaact tggcctatgg ctttaattta 1140 cccgctgatg atcattgaag ctggttaatg gccgtcagtc aacggtaaat cgaattaaag 1200 ggacttactg ctttagcagt tagtcccttt ttgaggcttt aaggagttga ttgactcact 1260 agaccaagac acttttgcgc atgcaaagaa aagcacacct gctttttttg cctgcctcac 1320 ggcgagtgcg gggtgagttt gagcgggggc tcccgctcat ttatggggtc cagctggttc 1380 agctggtcag tatggctgaa agccatggtc ttaaaaagca gttcggcgat ttttgctgat 1440 ctgctttttg gggtttgaaa ccgtcgtttt ttcgacggtt tcttcttatc ttgatactat 1500 tagaaacaac gtcattttca aaaagtgagg taaacccttg acacaactgg gtttaggcgt 1560 attattgtgg tataaaataa atataaaaaa aacccacgtg agcttcgaaa gtttgccgac 1620 ctcgaacgcg tgagttaatc ttgtaaaaat cgtatttgga tttactagac atagtttaaa 1680 gcttgaaccc tttgccgtca agccttctga ctgatttaag tgaagcaagt acataacaga 1740 ttaactcttc tcacgtggtt ggtgagggga gtttttattt tggctaatga aaaagtcttg 1800 gttgatcggt caaagtcagg gaaagttcgg ccgtggcggg agcgcaagtt ggagaacttg 1860 cagtatggtg actatttaca aatattgcat tataagaaag ctcatcgagt taaagaatgt 1920 ggcgaagttt tgcgttttgt ggaagataaa aatggtcaca agaaattggc gcagacttgg 1980 ttttgccatt ctcgtttgtg tccgttatgt aattggcggc gggcaatgaa gcaatccaat 2040 cagttaacac agattttgac ggaagctgtt aaacaacgaa agacgggccg gttcttattt 2100 ttaacgttga cggttgagaa tacaactggt gatcaattga agagtgagtt acgtcaaatg 2160 ggacgagctg ttgcaaaaat ttttcagtat acaaaagttg ccaaaaattt attgggctat 2220 gtacgttcga ctgaagtgac tgttaatcat gaagcgggtc agccaatgta ccaccatcat 2280 atgcatgttt tgctttttgt gaagaaccat tattttaagg ggactgataa ctatatttca 2340 caagtagaat ggactggttt ttggcaacgg gcaatgaaat tgacttatgt accaatggtg 2400 aatgttgagg cagttaaacc gaatatgaat cgccataaaa attcgttatt ggctagtgct 2460 caagaaacgg ctaaatatca ggtaaaatct aaagatattt tgactaataa tcaagaacaa 2520 gacctacaag taattgatga tttggaacga gctttggctg gttcccggca aattagctat 2580 ggcggtttgc tgaaagaaat tcgcaagcag ttgcaattag aagacgttga gaatggtgat 2640 ttgattaata cggatagtga tgatcaaaag gttgaccaag tggtacgcga gattgttgct 2700 aaatgggatt atcaaagaaa aaattatttt acattaaatg agttttgaaa tctttaatgc 2760 aaaataattt ttaggacttt taatgtgcaa taattttatg acacaattat tttttgtttt 2820 gattctttta atatttgact ttgtccctgg atacgccatt catttttttg gggattccca 2880 agaagggttt gaattactag ataatataat ttcttttctg agttgtataa ttccacattg 2940 tctattctta ctgctaatgt ttctgaatag tcaagttgtt ttactttttg ttgtcttcct 3000 gtttcttgcc actttggatt tgcttccatt tttaagatct actccttttg tttttatttg 3060 tgtaactgtg tttattatac tcttgtttag attcaatatc tgacgttttt gcctcgcaga 3120 gctcaaactt tacgaagtaa agtatattgg gctatacctt gcatggaggt tttcg 3175 <210> 2 <211> 1723 <212> DNA <213> Leuconostoc mesenteroides KCTC 13164BP <400> 2 tctgcttttt ggggtttgaa accgtcgttt tttcgacggt ttcttcttat cttgatacta 60 ttagaaacaa cgtcattttc aaaaagtgag gtaaaccctt gacacaactg ggtttaggcg 120 tattattgtg gtataaaata aatataaaaa aaacccacgt gagcttcgaa agtttgccga 180 cctcgaacgc gtgagttaat cttgtaaaaa tcgtatttgg atttactaga catagtttaa 240 agcttgaacc ctttgccgtc aagccttctg actgatttaa gtgaagcaag tacataacag 300 attaactctt ctcacgtggt tggtgagggg agtttttatt ttggctaatg aaaaagtctt 360 ggttgatcgg tcaaagtcag ggaaagttcg gccgtggcgg gagcgcaagt tggagaactt 420 gcagtatggt gactatttac aaatattgca ttataagaaa gctcatcgag ttaaagaatg 480 tggcgaagtt ttgcgttttg tggaagataa aaatggtcac aagaaattgg cgcagacttg 540 gttttgccat tctcgtttgt gtccgttatg taattggcgg cgggcaatga agcaatccaa 600 tcagttaaca cagattttga cggaagctgt taaacaacga aagacgggcc ggttcttatt 660 tttaacgttg acggttgaga atacaactgg tgatcaattg aagagtgagt tacgtcaaat 720 gggacgagct gttgcaaaaa tttttcagta tacaaaagtt gccaaaaatt tattgggcta 780 tgtacgttcg actgaagtga ctgttaatca tgaagcgggt cagccaatgt accaccatca 840 tatgcatgtt ttgctttttg tgaagaacca ttattttaag gggactgata actatatttc 900 acaagtagaa tggactggtt tttggcaacg ggcaatgaaa ttgacttatg taccaatggt 960 gaatgttgag gcagttaaac cgaatatgaa tcgccataaa aattcgttat tggctagtgc 1020 tcaagaaacg gctaaatatc aggtaaaatc taaagatatt ttgactaata atcaagaaca 1080 agacctacaa gtaattgatg atttggaacg agctttggct ggttcccggc aaattagcta 1140 tggcggtttg ctgaaagaaa ttcgcaagca gttgcaatta gaagacgttg agaatggtga 1200 tttgattaat acggatagtg atgatcaaaa ggttgaccaa gtggtacgcg agattgttgc 1260 taaatgggat tatcaaagaa aaaattattt tacattaaat gagttttgaa atctttaatg 1320 caaaataatt tttaggactt ttaatgtgca ataattttat gacacaatta ttttttgttt 1380 tgattctttt aatatttgac tttgtccctg gatacgccat tcattttttt ggggattccc 1440 aagaagggtt tgaattacta gataatataa tttcttttct gagttgtata attccacatt 1500 gtctattctt actgctaatg tttctgaata gtcaagttgt tttacttttt gttgtcttcc 1560 tgtttcttgc cactttggat ttgcttccat ttttaagatc tactcctttt gtttttattt 1620 gtgtaactgt gtttattata ctcttgttta gattcaatat ctgacgtttt tgcctcgcag 1680 agctcaaact ttacgaagta aagtatattg ggctatacct tgc 1723 <210> 3 <211> 589 <212> DNA <213> E.coli <400> 3 tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 60 gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 120 ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 180 cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 240 caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 300 ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 360 taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 420 taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 480 cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 540 tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaa 589 <210> 4 <211> 651 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 4 atgaacttta ataaaattga tttagacaat tggaagagaa aagagatatt taatcattat 60 ttgaaccaac aaacgacttt tagtataacc acagaaattg atattagtgt tttataccga 120 aacataaaac aagaaggata taaattttac cctgcattta ttttcttagt gacaagggtg 180 ataaactcaa atacagcttt tagaactggt tacaatagcg acggagagtt aggttattgg 240 gataagttag agccacttta tacaattttt gatggtgtat ctaaaacatt ctctggtatt 300 tggactcctg taaagaatga cttcaaagag ttttatgatt tatacctttc tgatgtagag 360 aaatataatg gttcggggaa attgtttccc aaaacaccta tacctgaaaa tgctttttct 420 ctttctatta ttccatggac ttcatttact gggtttaact taaatatcaa taataatagt 480 aattaccttc tacccattat tacagcagga aaattcatta ataaaggtaa ttcaatatat 540 ttaccgctat ctttacaggt acatcattct gtttgtgatg gttatcatgc aggattgttt 600 atgaactcta ttcaggaatt gtcagatagg cctaatgact ggcttttata a 651 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter sequence <400> 5 agatctagcg ctatagttgt tgacagaatg gacatactat gatatattgt tgctatagcg 60 60 <210> 6 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS sequence <400> 6 agga 4 <210> 7 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCS sequence <400> 7 aagcttctgc aggatatcgt cgacgcggcc gcagatctca tatggagctc cccgggggat 60 cctctagaac tagtgcatgc cgatcggcta gcctcgag 98 <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Transcriptional terminator sequence <400> 8 cctgacaaga accagtctgc tattgataga ctatttttgt ccgt 44 <210> 9 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TNF-alpha VHH gene sequence <400> 9 caagttcaat tagttgaatc aggtggtggt ttagttcaac caggtggttc attacgttta 60 tcatgtgctg cttcaggttt cactttctca gattactgga tgtactgggt tcgtcaagct 120 ccaggtaagg gtttagaatg ggtttcagaa attaacacta acggtttaat tactaagtac 180 ccagattcag ttaagggtcg tttcactatt tcacgtgata acgctaagaa cactttatac 240 ttacaaatga actcattaaa gccagaagat actgctttat actactgtgc tcgttcacca 300 tcaggtttca accgtggtca aggtactcaa gttactgttt catca 345 <210> 10 <211> 2686 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC19 <400> 10 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat 420 cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 480 gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 540 aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 600 gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 660 agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 720 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 780 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 840 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 900 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 960 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1020 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 1080 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1140 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1200 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1260 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt 1320 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1380 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1440 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1500 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1560 cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 1620 gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1680 tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 1740 ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 1800 ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 1860 atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 1920 cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 1980 tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 2040 aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 2100 tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2160 ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 2220 agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 2280 gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 2340 agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 2400 accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 2460 gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 2520 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 2580 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 2640 atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 2686 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aattgaattc tctgcttttt ggggtttg 28 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aattgaattc gcaaggtata gcccaatata c 31

Claims (7)

1. 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 유산균의 DNA 복제 원점 pLMT1-74 ReP, 및 대장균의 DNA 복제 원점을 포함하는, 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터.
2. 청구항 1에 있어서, 도 2에 나타낸 벡터 지도를 갖는 pMT47, 또는 도 3에 나타낸 벡터 지도를 갖는 pMT48인 것인 벡터.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 것인 벡터.
4. 청구항 1에 있어서, 프로모터, 리보좀 결합 부위(ribosomal binding site: RBS), 다중클로닝 부위, 선발표지 유전자(selection marker gene), 및 전사 터미네이터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것인 벡터.
5. 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 유산균의 DNA 복제 원점 pLMT1-74 ReP, 및 대장균의 DNA 복제 원점을 포함하고, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 목적 산물을 코딩하는 유전자, 및 전사 터미네이터가 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 대장균 및 유산균에서 복제가능한 벡터를 포함하는 유산균을 배지 중에서 배양하여 배양물을 얻는 단계;를 포함하는 유산균으로부터 목적 산물을 생산하는 방법.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 목적 산물은 단백질인 것인 방법.
7. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 벡터 pLMT1-74.

Images