KR101992345B1

KR101992345B1 - 프로모터 폴리뉴클레오티드, 신호 폴리펩티드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101992345B1
Application number: KR1020170184819A
Authority: KR
Inventors: 김용인; 송지윤; 윤지애; 조승기; 노현진
Original assignee: (주)메디톡스
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-09-27
Also published as: EP3732292A1; US20200339637A1; US11661445B2; US20230295249A1; KR101992345B9; JP2022180395A; WO2019132231A1; JP2022180396A; CN111601895A; JP7189218B2; JP2021508464A; EP3732292A4

Abstract

프로모터 폴리뉴클레오티드, 신호 폴리펩티드 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 용도에 관한 것이다. 프로모터 폴리뉴클레오티드, 및 신호 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주세포는 외래 단백질을 효율저으로 발현 및/또는 세포 외로 분비할 수 있다.

Description

프로모터 폴리뉴클레오티드, 신호 폴리펩티드 및 그의 용도{Promoter polynucleotide, signal polypeptide and use thereof}

프로모터 폴리뉴클레오티드, 신호 폴리펩티드 및 그의 용도에 관한 것이다.

박테리아, 효모 및 곰팡이와 같은 미생물은 재조합 발현을 위한 숙주로서 점점 중요해지고 있다.

Lactobacillus 또는 Streptococcus sp.와 같은 박테리아는 전달 도구로 유용할 수 있다. 일반적으로 안전한 것으로 생각되는 GRAS(Generally Recognized As Safe)-미생물은 사람 또는 동물에 투여될 수 있다.

유산균에서 외래 산물 발현을 높은 수준으로 달성하기 위하여는 유산균으로부터 분리되고 외래 산물 특히, 단백질을 높은 수준으로 발현하고 분비할 수 있는 새로운 프로모터 및 신호 폴리펩티드에 대한 요구가 있다.

일 양상은 분리된 프로모터를 제공한다.

다른 양상은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

다른 양상은 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

다른 양상은 상기 숙주세포를 사용하여 산물을 생산하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 분리된 신호 폴리펩티드 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

다른 양상은 분리된 신호 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

다른 양상은 분리된 신호 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

다른 양상은 분리된 신호 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 사용하여 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

일 양상은 서열번호 1(이하 'PR4 프로모터'라고도 한다.)의 뉴클레오티드 서열과 85 % 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 프로모터를 제공한다.

다른 양상은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 명세서에 있어서, "프로모터(promoter)"는 RNA 폴리머라제가 결합하고 전사를 개시하는 핵산 분자, 특히 DNA 분자 상의 영역을 나타낸다. 프로모터는 일반적으로 프로모터에 의하여 조절되는 전사되어지는 서열의 상류 즉, 5'에 위치한다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter)일 수 있다. 상기 프로모터는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상, 또는 100 % 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 프로모터는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 벡터일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "벡터(vector)"는 거기에 연결된 다른 핵산을 증식시킬(propagate) 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 상기 벡터는 도입되는 숙주 세포의 게놈에 삽입되는 벡터뿐만 아니라 자기-복제 핵산 구조(self-replicating nucleic acid structure)로서의 벡터를 포함한다. 발현 벡터(expression vector)는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 나타낸다. 상기 벡터에는 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터일 수 있다.

상기 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터는 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

상기 발현 벡터는 상기 프로모터, 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 산물은 제1 폴리뉴클레오티드의 발현에 의하여 생성될 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 산물은 폴리펩티드 또는 핵산일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 IL-10과 같은 시토킨, 또는 아밀라제와 같은 효소일 수 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 전사

또는 번역이 이루어져 기능적인 전사 또는 번역 산물을 생산할 수 있도록 하는 연

결을 나타낸다.

상기 벡터는 리보좀 결합 부위(ribosomal binding site: RBS), 클로닝 부위, 선발표지 유전자(selection marker gene), 전사 터미네이터, 및 번역 개시 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 클로닝 부위(cloning site)는 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 클로닝 부위는 다중 클로닝 부위일 수 있다.

상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2(이하 "SP4 신호 폴리펩티드"라고도 한다)의 아미노산 서열과 85 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 신호 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 상기 프로모터와 제1 폴리뉴클레오티드 사이에 작동가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하는 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, "신호 폴리펩티드(signal polypeptide)"는 분비 단백질 전구체의 N-말단 측에 존재하지만 자연적으로 존재하는 성숙한 단백질에는 없는 서열을 나타낸다. 상기 신호 폴리펩티드는 단백질 전구체로부터 잘려져 나갈 수 있다. 일반적으로, 신호 폴리펩티드는 세포 외로 분비될 때 프로테아제에 의하여 절단된다. 상기 프로테아제는 일반적으로, 신호 펩티다제(signal peptidase)라고도 한다. 상기 신호 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상, 또는 100 % 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 신호 폴리펩티드는 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 인 프레임으로 연결된 유전자 발현 산물을 세포 외로 분비될 수 있도록 하는 활성을 갖는다.

본 명세서에 있어서, 단백질 또는 폴리펩티드 분자의 "분비(secretion)"는 단백질 또는 폴리펩티드 분자의 박테리아 세포의 외부(outside)로 수송하는 것이고, 단백질 또는 폴리펩티드 분자가 배지 중에 완전하게 유리된 형태로 존재하는 것, 단백질 또는 폴리펩티드 분자의 일부분만이 박테리아 세포의 밖에 존재하는 것, 및 단백질 또는 폴리펩티드 분자가 박테리아 세포의 표면층 상에 존재하는 것을 포함한다.

상기 신호 폴리펩티드는 L. paracasei 유래의 것으로서, 분비 촉진능을 갖는 것일 수 있다. 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 박테리아 세포일 수 있다. 상기 박테리아 세포는 그람 양성 박테리아일 수 있다. 상기 박테리아 세포는 유산균 또는 에세리키아 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 비피도박테리아(bifidobacteria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 것일 수 있다.

상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 상기 숙주 세포에 통상의 핵산 도입 방법에 의하여 도입된 것일 수 있다. 핵산 도입 방법은 전기천공, 형질전환, 형질도입, 또는 형질감염을 포함한다.

다른 양상은 상기 숙주 세포를 배지 중에서 배양하여 산물을 생성하는 단계; 및 상기 산물 또는 그 대사 산물을 배양물로부터 분리하는 단계;를 포함하는 산물 또는 그의 대사 산물을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 산물은 제1 폴리뉴클레오티드의 발현에 의하여 생성될 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 산물은 폴리펩티드 또는 핵산일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 IL-10과 같은 시토킨, 또는 아밀라제와 같은 효소일 수 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 대사 산물은 상기 산물이 세포 내에서 그 활성을 발휘하여 만들어지는 물질일 수 있다. 예를 들면, 상기 산물이 효소인 경우, 그 효소 활성을 발휘하여 생성되는 직접적 산물 또는 그 효소가 속하여 있는 대사 경로로부터 만들어지는 물질일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 배양하는 단계는 선택되는 숙주 세포에 따라 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는, 당원으로서 예를 들면, 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프락토오스, 말토오스, 전분, 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 아세트산과 같은 유기산을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있다. 상기 배지는 질소원으로서 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있다. 상기 배지는 인원으로서 예를 들면, 인산수소칼륨, 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 포함할 수 있다. 상기 배지는 예를 들면, 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양에서 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질 또는 적절한 전구체가 배양물에 첨가될 수 있다. 상기 물질은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식으로 예를 들면, 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

상기 배양은 호기 조건에서 수행하는 것일 수 있다.

상기 방법은, 상기 산물을 배양물로부터 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리는 선택되는 산물의 종류에 따라 적절한 방법이 선택될 수 있다. 상기 산물이 단백질인 경우, 상기 분리는 배양액을 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액으로부터 단백질을 분리하거나, 세포를 회수하고 파쇄하여 단백질을 분리하는 것을 포함할 수 있다. 상기 분리는 염석, 침전, 크로마토그래피, 원심분리, 및 여과 중 하나 이상의 과정을 거칠 수 있다. 상기 크로마토그래피는 음이온 교환, 양이온 교환, 크기 배제, 및 친화성 크로마토그래피 중 하나 이상일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열과 85 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 신호 폴리펩티드를 제공한다. 상기 신호 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상, 또는 100 % 동일성을 갖는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 신호 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 신호 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있다.

다른 양상은 프로모터, 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 상기 신호 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2 폴리뉴클레오티드와 인 프레임으로 연결된 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

다른 양상은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 박테리아 세포일 수 있다. 상기 박테리아 세포는 그람 양성 박테리아일 수 있다. 상기 박테리아 세포는 유산균 또는 에세리키아 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 비피도박테리아(bifidobacteria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 숙주 세포를 배지 중에서 배양하여 단백질을 생성하는 단계; 및 상기 단백질을 배양물로부터 분리하는 단계;를 포함하는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양은 호기 조건에서 수행하는 것일 수 있다.

상기 방법은, 상기 단백질을 배양물로부터 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리는 배양액을 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액으로부터 단백질을 분리하거나, 세포를 회수하고 파쇄하여 단백질을 분리하는 것을 포함할 수 있다. 상기 분리는 염석, 침전, 크로마토그래피, 원심분리, 및 여과 중 하나 이상의 과정을 거칠 수 있다. 상기 크로마토그래피는 음이온 교환, 양이온 교환, 크기 배제, 및 친화성 크로마토그래피 중 하나 이상일 수 있다.

일 양상에 따른 분리된 프로모터 및 그를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하면, 외래 유전자를 효율적으로 발현하는데 사용할 수 있다.

다른 양상에 따른 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포에 의하면, 외래 유전자를 효율적으로 발현할 수 있다.

다른 양상에 따른 상기 숙주세포를 사용하여 산물을 생산하는 방법에 의하면, 산물을 효율적으로 생산할 수 있다.

다른 양상에 따른 분리된 신호 폴리펩티드, 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하면, 외래 단백질을 세포 외로 분비하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 분리된 신호 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포에 의하면, 외래 유전자의 산물을 세포 외로 효율적으로 분비할 수 있다.

다른 양상에 따른 상기 숙주세포를 사용하여 단백질을 생산하는 방법에 의하면, 단백질을 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 대장균과 유산균 사이의 셔틀벡터 pMT48의 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터의 구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터를 3개 종의 유산균에 형질전환하고 세포 외에 발현된 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 pMT54-PR4-amylase-SP4 벡터를 LMT1-21 균주에 형질전환하고 세포 외에 발현된 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 프로모터 강도 비교를 위해 pMT54-P11-IL10-SP4 및 pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터에서 IL-10의 mRNA 수준을 측정한 것이다.
도 6은 신호 펩티드 강도 비교를 위해 pMT54-PR4-IL10-SP4 및 pMT54-PR4-IL10-USP45로 형질전환된 LMT1-21로부터 분비되는 IL-10의 양을 확인한 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 프로모터 및 신호 폴리펩티드의 클로닝 및 그 효과의 확인

1. 프로모터 및 신호 폴리펩티드의 클로닝

프로모터와 신호 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 PCR에 의하여 증폭하였다. 구체적으로, Lactobacillus paracasei LMT1-21 (수탁번호 KCTC 13422BP)의 게놈을 주형으로 하고 프라이머를 사용한 PCR에서 593 kb 크기의 증폭 산물을 얻었다. 사용한 프라이머는 PS4_F/R(서열번호 4 및 5)이다.

상기 증폭 산물을 EcoRV와 SalI으로 절단된 pMT54 벡터와 Infusion cloning(Clontech)을 통하여 연결하였다. 그 후, 상기 벡터를 대장균 Top 10 균주(Invitrogen 사)에 삼브록 등의 방법(Sambrook et al. Molecular cloning: A laboratory Manual, 2nd edition, 1989)으로 형질전환시켰다. 그 후, 형질전환된 대장균을 10 μg/ml 클로람페니콜이 첨가된 LB 플레이트에 도말하여 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니로부터 pMT54 벡터를 회수하고 서열을 분석하였다. 그 결과, PR4(서열번호 1)-SP4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)을 포함하는 것을 확인하였다. 이하, 이 벡터를 각각 pMT54-PR4-SP4 벡터라 한다.

상기 pMT54 벡터는 pMT48 벡터의 HindIII 효소 및 XhoI 효소 부위에 다중 클로닝 부위(서열 번호 6)가 도입된 벡터이다. 상기 다중 클로닝 부위는 복수의 제한 효소 인지 부위뿐만 아니라 목적 단백질의 발현을 확인하기 위한 사람 인플루엔자 헤마글루티닌(human influenza hemagglutinin: HA)이 태그되어 있다. pMT48 벡터는 pUC19 (New England Biolabs)의 EcoRI 부위에 플라스미드 pLMT1-74의 복제 원점 서열인 Rep 유전자(서열번호 7)가 도입된 것이다. pMT48 벡터는 다음과 같이 제작되었다.

먼저, 김치에서 분리한 LMT1 -74 균주(Leuconostoc mesenteroides KCTC 13164BP)로부터 Plasmid midi kit(Qiagen, Inc., Valencia, CA)를 이용하여 잠정적 플라스미드 pLMT1-74를 분리하였다. 플라스미드 pLMT1-74를 주형으로 하고, 서열번호 8 및 9의 올리고뉴클레이티드를 프라이머로 한 PCR에 의하여 플라스미드 pLMT1-74의 복제 원점 서열인 Rep 유전자(서열번호 7)를 증폭하였다. 증폭된 산물을 EcoRI으로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 pUC19와 연결하여 pMT48 벡터를 얻었다. 또한, 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성될 수도 있다. 벡터 pUC19는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

도 1은 대장균과 유산균 사이의 셔틀벡터 pMT48의 구성을 나타낸 도면이다. 상기 벡터에 있어서, Rep은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로서, 광범위 유산균 숙주 벡터인 pLMT1-74의 복제 원점인 Rep origin 서열의 일부분 서열로서, 유산균에서 복제능을 부여한다. E.coli ori는 대장균의 DNA 복제 원점으로서 pUC19 ori, 즉 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. CM은 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제를 코딩하는 유전자로서, 클로람페니콜 저항성 유전자이다.

2. 목적 단백질 IL-10 클로닝

(1) 실험군 벡터 제작: pMT54 - PR4 - IL10 - SP4 벡터

IL-10 유전자(서열번호 12)는 외부에 의뢰하여 합성하였다(마크로젠사, 한국). 합성된 상기 유전자 단편과 상기 pMT54-PR4-SP4 벡터에 제한효소 SalI 및 XhoI을 처리하여 상기 벡터의 클로닝 부위를 절단하였다. 절단된 산물을 Gel purification kit(Bioneer사)를 사용하여 정제한 후 알칼리 포스파타제를 사용하여 탈인산화시켰다. 이렇게 준비한 상기 벡터 DNA 1 μl, 상기 유전자 (IL-10) 3 μl, T4 DNA 리가제 (Takara 사) 0.5 μl, 및 완충용액 1 μl의 혼합물에 증류수를 5.5 μl를 첨가하여 총 10 μl 반응 혼합물을 만들었다. 상기 반응 혼합물을 16 ℃에서 12 시간 인큐베이션하여, 상기 유전자를 상기 벡터의 클로닝 부위에 연결하였다. 얻어진 연결 산물을 상기한 바와 동일한 방법으로 대장균 Top 10 균주에 형질전환하고, 그 서열을 확인하였다. 그 결과, 상기 유전자가 도입된 것을 확인하였으며, 이들을 pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터라 명명하였다. 도 2는 pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터의 구조를 나타낸 도면이다. 도 2에서, promoter, signal peptide 및 target gene은 PR4, SP4 및 IL-10를 각각 나타낸다. 상기 벡터는 대장균과 유산균 셔틀벡터이며, 대장균 복제 원점(origin), 유산균 복제 원점(rep gene), 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함한다. 다중 클로닝 부위에 프로모터, 신호 펩티드, 표적 유전자, HA 태그, 및 His 태그가 연결되어 있다.

(2) 대조군1 벡터의 제작: pMT54 - PR4 - IL10 - USP45 벡터

신호 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 SP4를 USP45 폴리뉴클레오티드로 치환한 것을 제외하고 실험군 벡터와 동일한 벡터를 제작하였다. 이는 동일한 프로모터에서 다른 신호 폴리펩티드가 IL-10 단백질의 세포 외 분비에 미치는 영향을 확인하기 위한 것이다.

구체적으로, pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 상기 벡터 중 SP4가 제외된 부분을 증폭하였다. USP45를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 15)는 합성하였다(마크로젠사, 한국). 상기 증폭산물과 USP45를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 Infusion cloning 방법으로 연결하고, 대장균에 도입하여 pMT54-PR4-IL10-USP45 벡터를 클로닝하였다. USP45는 Lactococcus lactis 유래의 신호 폴리펩티드이며, 상동성 프로테나제(homologous proteinase: PrtP) 및 Bacillus stearothermophilus 유래의 알파-아밀라제와 같은 단백질 산물을 분비시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(van Asseldonk M1 등, Mol Gen Genet. 1993 Sep;240(3):428-34).

(3) 대조군2 벡터의 제작: pMT54 - P11 - IL10 - SP4 벡터

프로모터 PR4를 P11 프로모터로 치환한 것을 제외하고 실험군 벡터와 동일한 벡터를 제작하였다. 이는 신호 폴리펩티드에서 다른 프로모터가 IL-10 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위한 것이다. P11은 Lactobacillus plantarum에서 강력한 전사 개시 활성을 갖는 합성 프로모터이다(Lars Axelsson, Microbiology (2006), 152, 1011-019).

구체적으로, pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 16 및 17의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 상기 벡터 중 PR4가 제외된 부분을 증폭하였다. P11 프로모터(서열번호 18)는 합성하였다(마크로젠사). 상기 증폭산물과 P11 프로모터를 Infusion cloning 방법으로 연결하고, 대장균에 도입하여 pMT54-P11-IL10-SP4 벡터를 클로닝하였다.

3. 형질전환 및 IL-10 단백질 발현

(1) pMT54 - PR4 - IL10 - SP4 벡터의 IL-10 단백질 발현 확인

pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터와 pMT54-P11-IL10-SP4 벡터를 각각 3 종 유산균에 형질전환하였다. 3 종 유산균은 Lactobacillus paracasei KCTC 13422BP, Lactobacillus plantarum KCTC 13421BP, 및 Lactobacillus brevis KCTC 13423BP로서 모두 김치로부터 분리한 것이다. 이들 균주는 각각 LMT1-21, LMT1-9, 및 LMT1-46이라고도 한다.

상기 각 균주를 50 mL의 MRS 배지(Difco Co., USA) 중에서 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 배양한 후 4 ℃, 7,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 25 mL 냉 EPS(ice-cold EPS)(EPS: 1 mM K₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, pH 7.4, 1 m MgCl₂,및 0.5 M 수크로스 함유)로 2회 세척하였다.

세척 후 1 mL 냉 EPS에 세포를 재현탁하고 전기천공법에 사용될 컴피턴트 세포를 제조하고 -80 ℃ 저온 냉동고(deep freezer)에 보관하였다. 컴피턴트 세포 40 μl과 각 벡터 DNA (1 μg/μl) 1 μl를 큐벳에 넣고 5 분 동안 얼음에 방치하였다. 25 μF, 8 kV/cm, 400 ohms 조건에서 전기펄스를 준 후, 즉시 1 mL MRS 액체 배지에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양된 세포를 10 μg/ml 클로람페니콜이 포함된 MRS 배지에 도말하고 48 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다.

도 3은 pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터를 3개 종의 유산균에 형질전환하고 세포 외에 발현된 정도를 확인한 결과를 나타낸다. 도 3에서, 대조군은 벡터로서, pMT54-PR4-IL10-SP4 대신에 pMT54-P11-IL10-USP45를 사용한 것이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터는 3개 유산균에서 IL-10 단백질을 세포 외에 발현시켰으나, 대조군은 발현되지 않았다. 이는 PR4 프로모터가 작동하여 유전자를 발현시키고 SP4 신호 펩티드가 발현된 단백질을 세포 외부로 분비하게 하는 효과가 크다는 것을 나타낸다.

(2) mRNA 수준의 발현: 프로모터의 강도 확인

pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터와 pMT54-P11-IL10-SP4 벡터를 (1)절과 동일한 방법으로 Lactobacillus paracasei KCTC 13422BP (LMT1-21)유산균에 형질전환하였다.

이렇게 얻어진 상기 벡터가 도입된 균주를 MRS 액체 배지에서 37 ℃, 16 시간 동안 정치 배양하였다. 배양물 1 ml을 7,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리 후 상등액을 버리고 세포 펠렛을 취하였다. 이것을 RNA prep kit (Macherey-nagel, cat.no 740955.50)를 이용하여 제조사의 프로토콜대로 mRNA를 추출하였다. mRNA 100 ng을 주형으로 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 Bioneer의 Roketscript cycle RT premix를 이용하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하고, 서열번호 20과 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 실시간(Real time: RT)-PCR를 수행하였다. RT-PCR은 SYBR premix (takara, RR820B)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다.

도 5는 형질전환된 세포 유래 cDNA를 주형으로 한 RT-PCR를 나타낸 도면이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, pMT54-P11-IL10-SP4 벡터 즉 대조군 벡터가 형질전환된 L. paracasei KCTC13422BP 균주에 비하여 pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터가 형질전환된 균주에서 IL-10 mRNA 수준이 현저하게 높았다. 이는 PR4 프로모터가 P11 프로모터에 비하여 강력하게 전사를 구동한다는 것을 나타낸다. 도 5의 Y 축의 "2△△CT"는 상대적 전사 수준을 분석한 결과로 대조군 대비 증가한 전사수준을 나타낸다.

(3) 단백질 수준의 발현: 신호 펩티드의 강도 확인

상기 pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터 및 pMT54-PR4-IL10-USP45 벡터를 (1)절에서 동일한 방법으로 Lactobacillus paracasei KCTC 13422BP (LMT1-21) 유산균에 형질전환하였다.

이렇게 얻어진 각 벡터가 도입된 균주를 MRS 액체 배지에서 37 ℃, 16 시간 동안 정치 배양하였다. 배양물을 MRS 액체 배지에 3 (v/v)%가 되도록 접종한 후 8 시간 동안 동일한 온도에서 정치 배양하였다. 배양물 1 ml를 7,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상등액을 취하였다. 상등액 1 ml에 트리클로로아세트산 100 μl를 첨가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 정치하여, 배양 성분을 농축하였다. 반응물을 4 ℃, 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 펠렛을 1 ml 찬 아세톤으로 1 회 세척하고, 상온에서 10 분 동안 말린 후 Tris-HCl 버퍼(pH 8.8) 100 μl로 용출하였다.

용출액에 4x 로딩 버퍼(Thermo), 및 10x 환원제(Thermo)를 첨가한 후 SDS-PAGE 겔에서 전기영동하였다. 상기 겔을 Trans blot semi-dry cell (bio-rad)를 이용하여 니트로셀룰로오스 막에 전달하여, 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 구체적으로, 상기 막을 1 % 탈지우유(skim milk) 함유 TBST 버퍼로 1 시간 동안 차단하고 항-HA 항체(santa cruz)를 상온에서 2 시간 동안 반응시킨 후 TBST로 5 분씩 3번 세척 후 ECL로 검출하였다. pMT54-PR4-IL10-SP4 벡터에서, IL-10 유전자는 그의 3' 말단 측에 HA 유전자와 작동가능하게 연결되어 있어서, HA 태그된 상태로 발현된다.

도 6은 신호 펩티드 강도 비교를 위해 pMT54-PR4-IL10-SP4 및 pMT54-PR4-IL10-USP45로 형질전환된 LMT1-21로부터 분비되는 IL-10의 양을 확인한 것이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, USP45 신호 펩티드에 비하여 SP4 신호 펩티드가 발현된 단백질을 더 많이 분비시켰다.

실시예 2: PR4 프로모터 및 SP4 서열을 이용한 아밀라제 유전자의 발현

실시예 1의 2 및 3절에서 IL-10 유전자 대신 알파-아밀라제 유전자(서열번호 19) 및 프라이머 F/R(서열번호 22 및 23)을 사용한 것을 제외하고 동일한 과정을 거쳐 pMT54-PR4-amylase-SP4 벡터를 제조하고, 이를 유산균 L. paracasei LMT1-21에 형질전환하고 알파-아밀라제가 세포 외에 발현되는 정도를 확인하였다. 알파-아밀라제 유전자 증폭은 Lactobacillus amylovorus (KCTC3597)의 게놈 DNA를 사용하였다.

형질전환 LMT1-21 균주의 아밀라제 활성도는 요오드 시험을 사용하였다. 먼저, pMT54-PR4-amylase-SP4 벡터가 도입된 LMT1-21 균주를 MRS 액체 배지에서 37 ℃에서 12 시간 동안 정치 배양하였다. 그 후 배양물을 0.5 % 가용성 녹말과 10 mg/l의 클로람페니콜이 함유된 MRS 플레이트에 작은 점의 크기로 도포하였다. 이를 37 ℃에서 12 시간 동안 정치 배양하여, 아밀라제가 충분히 녹말을 분해할 수 있도록 하였다. 그 후, 상기 MRS 플레이트 위에 루골요오드 용액(요오드-요오드화 칼륨 용액을 고르게 도포하여 분해되지 않은 녹말과 반응이 되도록 하였다. 아밀라제 활성이 낮을수록 잔존 녹말의 양이 많아 요오드-녹말 반응이 강하게 일어나 보라색으로 변하는 반면, 아밀라제 활성이 높은 경우, 세포 주변의 잔존 녹말의 양이 적어 투명한 환이 생기게 된다.

도 4는 pMT54-PR4-amylase-SP4 벡터를 LMT1-21 균주에 형질전환하고 세포 외에 발현된 정도를 확인한 결과를 나타낸다. 도 4에서, 대조군은 벡터는 PR4 대신 P11 프로모터를 사용하고, SP4 대신에 USP45를 사용한 것을 제외하고 pMT54-PR4-amylase-SP4 벡터와 동일하다.

도 4에 나타낸 바와 같이, pMT54-PR4-amylase-SP4 벡터를 사용한 실험군은 LMT1-21 균주에서 알파-아밀라제를 세포 외에 발현시켜 큰 투명환을 형성한 반면, 대조군은 발현되지 않아 환이 작았다. 이는 PR4가 작동하여 아밀라제 유전자를 발현시키고, SP4에 의하여 세포 외로 분비하는 능력이 증가된다는 것을 나타낸다.

<110> Medytox Inc <120> Promotor polynucleotide, signal polypeptide and use thereof <130> PN119873KR <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei LMT1-21 <400> 1 tcgtcacggc gctgcttttt tcatacaaaa t 31 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Lactobacillus paracasei LMT1-21 <400> 2 Met Lys Phe Asn Lys Val Met Ile Thr Leu Val Ala Ala Val Thr Leu 1 5 10 15 Ala Gly Ser Ala Ser Ala Val Thr Pro Val Phe Ala Asp Thr Ser 20 25 30 <210> 3 <211> 93 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <400> 3 atgaaattca ataaagtcat gatcacgttg gttgctgcag ttaccttagc aggttctgct 60 agcgccgtaa caccagtttt cgctgataca agc 93 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tctgcaggat atccgatcgt ccacaatcaa ggtgcttgg 39 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttactggcag gtcgacgctt gtatcagcga aaactgg 37 <210> 6 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cloning site <400> 6 aagcttctgc aggatatcgt cgacgcggcc 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720 gggacgagct gttgcaaaaa tttttcagta tacaaaagtt gccaaaaatt tattgggcta 780 tgtacgttcg actgaagtga ctgttaatca tgaagcgggt cagccaatgt accaccatca 840 tatgcatgtt ttgctttttg tgaagaacca ttattttaag gggactgata actatatttc 900 acaagtagaa tggactggtt tttggcaacg ggcaatgaaa ttgacttatg taccaatggt 960 gaatgttgag gcagttaaac cgaatatgaa tcgccataaa aattcgttat tggctagtgc 1020 tcaagaaacg gctaaatatc aggtaaaatc taaagatatt ttgactaata atcaagaaca 1080 agacctacaa gtaattgatg atttggaacg agctttggct ggttcccggc aaattagcta 1140 tggcggtttg ctgaaagaaa ttcgcaagca gttgcaatta gaagacgttg agaatggtga 1200 tttgattaat acggatagtg atgatcaaaa ggttgaccaa gtggtacgcg agattgttgc 1260 taaatgggat tatcaaagaa aaaattattt tacattaaat gagttttgaa atctttaatg 1320 caaaataatt tttaggactt ttaatgtgca ataattttat gacacaatta ttttttgttt 1380 tgattctttt aatatttgac tttgtccctg gatacgccat tcattttttt ggggattccc 1440 aagaagggtt tgaattacta gataatataa tttcttttct gagttgtata attccacatt 1500 gtctattctt actgctaatg tttctgaata gtcaagttgt tttacttttt gttgtcttcc 1560 tgtttcttgc cactttggat ttgcttccat ttttaagatc tactcctttt gtttttattt 1620 gtgtaactgt gtttattata ctcttgttta gattcaatat ctgacgtttt tgcctcgcag 1680 agctcaaact ttacgaagta aagtatattg ggctatacct tgc 1723 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLMT1-74rep- For <400> 8 aattgaattc tctgcttttt ggggtttg 28 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLMT1-74rep- Rev <400> 9 aattgaattc gcaaggtata gcccaatata c 31 <210> 10 <211> 2686 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC19 vector <400> 10 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat 420 cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 480 gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 540 aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 600 gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 660 agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 720 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 780 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 840 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 900 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 960 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1020 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 1080 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1140 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1200 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 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gatttagctg ttatctttac cgatgggaca 2640 aagcaaacac cagcagctaa tgaggctggt tttaccttta cggctgatgc cacttatgat 2700 caaaatggtg tcgtaagaac ttctgattca agcagcacat caagcaattc gtaagccgat 2760 accagcagtt catc 2774 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 aggcgcttag cgaaatgata 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ccttggtcct gcaatttgtt 20 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tgatacaagc gtcgacgcta gtgatacgac atcaactg 38 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cggaggtacc ctcgagttat caatggtgat ggtgatggtg 40

Claims

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서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 프로모터를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드로서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터인 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
청구항 3에 있어서, 상기 발현 벡터는 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제1 폴리뉴클레오티드는 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
청구항 4에 있어서, 상기 산물은 폴리펩티드인 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
청구항 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 신호 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드가 상기 프로모터와 제1 폴리뉴클레오티드 사이에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
청구항 3 내지 5 중 어느 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
청구항 7에 있어서, 상기 숙주 세포는 유산균 또는 에세리키아 속에 속하는 것인 숙주 세포.
청구항 8에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 비피도박테리아(bifidobacteria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 것인 숙주 세포.
청구항 7의 숙주 세포를 배지 중에서 배양하여 산물을 생성하는 단계; 및
상기 산물 또는 그 대사 산물을 배양물로부터 분리하는 단계;를 포함하는 산물 또는 그 대사 산물을 생산하는 방법.
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프로모터, 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 신호 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2 폴리뉴클레오티드와 인 프레임으로 연결된 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 신호 폴리펩티드를 코딩하는 것인 벡터.
청구항 13의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
청구항 14에 있어서, 상기 숙주 세포는 유산균 또는 에세리키아 속에 속하는 것인 숙주 세포.
청구항 15에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 비피도박테리아(bifidobacteria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 것인 숙주 세포.
청구항 14 내지 16 중 어느 하나의 숙주 세포를 배지 중에서 배양하여 단백질을 생성하는 단계; 및
상기 단백질을 배양물로부터 분리하는 단계;를 포함하는 단백질을 생산하는 방법.
청구항 6의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
청구항 18에 있어서, 상기 숙주 세포는 유산균 또는 에세리키아 속에 속하는 것인 숙주 세포.
청구항 19에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 비피도박테리아(bifidobacteria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 것인 숙주 세포.
청구항 6의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배지 중에서 배양하여 산물을 생성하는 단계; 및
상기 산물 또는 그 대사 산물을 배양물로부터 분리하는 단계;를 포함하는 산물 또는 그 대사 산물을 생산하는 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 숙주 세포는 유산균 또는 에세리키아 속에 속하는 것인 방법.
청구항 22에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 비피도박테리아(bifidobacteria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 것인 방법.