WO2022065643A1 - 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 그를 이용하여 표적산물을 생산하는 방법 - Google Patents

분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 그를 이용하여 표적산물을 생산하는 방법 Download PDF

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binding protein
recombinant microorganism
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secretion signal
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손소희
김재응
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Definitions

  • It relates to a recombinant microorganism comprising a polynucleotide encoding a target product binding protein fused to a secretion signal sequence, a composition comprising the same, and a method for producing a target product using the same.
  • One aspect provides a recombinant microorganism comprising a polynucleotide encoding a target product binding protein fused to a secretion signal sequence.
  • compositions for use in producing a target product comprising a recombinant microorganism comprising a polynucleotide encoding a target product binding protein fused to the secretion signal sequence and a carrier.
  • Another aspect provides a method for producing a target product, comprising culturing a recombinant microorganism comprising a polynucleotide encoding a target product binding protein fused to a secretion signal sequence in a medium.
  • One aspect provides a recombinant microorganism comprising a polynucleotide encoding a target product binding protein fused to a secretion signal sequence.
  • the polynucleotide may exist outside the genome or genome of the recombinant microorganism.
  • the polynucleotide may be operably linked to a regulatory sequence.
  • the regulatory sequence may be a sequence necessary for biosynthesis or production of the protein from the polynucleotide.
  • the control sequence may be a transcription control sequence, a translation control sequence, and a post-translational modification control sequence.
  • the regulatory sequence may be a promoter, an operator, a terminator, an enhancer, a ribosome binding site, or a combination thereof.
  • the control sequence may be an endogenous or exogenous control sequence before the recombinant microorganism is recombined.
  • the control sequence may be a control sequence of a gene encoding a naked target product binding protein to which the secretion signal sequence is not fused, or a control sequence of a gene encoding a different protein.
  • the polynucleotide may be included in the cell in multiple copies.
  • the polynucleotide is, for example, 2 or more, 5 or more, 10 or more, 50 or more, 100 or more, 2 to 1000, 2 to 500, 2 to 100, 2 to 50, 2 to 10, 2 to 5, 5 to 100 , 5 to 50, 5 to 10, 5 to 100, 5 to 10, 10 to 100, or 10 to 50 copies may be included in the cell.
  • the polynucleotide may be expressed so as to be linked to the control sequence.
  • the polynucleotide may be linked to a regulatory sequence that allows it to be expressed at an increased level compared to the expression of the endogenous polynucleotide.
  • the polynucleotide may be linked to a promoter having a stronger transcription initiation ability than an endogenous promoter.
  • the polynucleotide may also include a nucleotide sequence encoding a tag sequence for use in isolating the extracellularly secreted complex or dissociated target product binding protein.
  • the tag sequence may be an oligopeptide.
  • the tag sequence may include two or more amino acids, for example, 2 to 50, 2 to 30, 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 amino acid sequences.
  • the tag sequence may be, for example, a His tag sequence.
  • the His tag may be linked to the N-terminus or C-terminus of the target product binding protein.
  • the tag may be 6xHis.
  • the polynucleotide may encode an amino acid sequence in which a secretion signal sequence is fused to the N-terminus of the target product binding protein.
  • the polynucleotide may be introduced into a microbial cell before recombination by a genetic modification method known in the art.
  • the genetic modification may be by transformation, transduction, transfection, or electroporation.
  • the polynucleotide may be generated by gene editing of a gene in a microbial cell prior to recombination.
  • the gene correction may be performed by a known method such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) gene correction.
  • CRISPR clustered regularly interspaced short palindromic repeats
  • the recombinant microorganism may have the ability to secrete a target product binding protein fused to the secretion signal sequence.
  • the recombinant microorganism may have the ability to produce the target product.
  • the recombinant microorganism may have an increased target product production capacity.
  • the recombinant microorganism may be one capable of extracellular secretion in the form of a complex in which the target product and the target product-binding protein are bound. Formation of the complex may be made within a cell. Formation of the complex may be made by cells in the process of cellular metabolism without manipulation from the outside. In the complex, the binding between the target product and the target product-binding protein may be due to non-covalent bonding.
  • the non-covalent bond may include a hydrophobic bond, a hydrogen bond, or an ionic bond.
  • the complex may be dissociated under conditions suitable for dissociating the bond in a liquid medium to form a dissociated target product and the target product-binding protein, respectively.
  • the target product binding protein that is not fused to the secretion signal sequence may exist in a cell, for example, in the cytoplasm in a natural host cell, and thus may not be secreted out of the cell.
  • the target product binding protein that is not fused to the secretion signal sequence may not be linked to the secretion signal sequence in a native host cell.
  • the target product may be a metabolite.
  • the metabolite may be an endogenous metabolite or a metabolite synthesized by its synthetic pathway introduced by genetic modification.
  • the metabolite may be a lipid, a polysaccharide, a protein, or a small molecule compound.
  • the target product may be a lipid.
  • the lipid may be a terpenoid.
  • the term "terpenoid" may be a compound synthesized using isoprene as a unit. The terpenoid has 5 to 100, 10 to 100, 15 to 100, 30 to 100, 5 to 60, 10 to 60, 15 to 60, 30 to 60, 5 to 45, 10 to 45, 15 to 45 carbon atoms.
  • the terpenoid may include molecular oxygen.
  • the terpenoid may be a hydrocarbon that does not contain molecular oxygen.
  • the terpenoid may be monoterpene, diterpene, sesquiterpene, triterpene, or tetraterpene.
  • the terpenoid may be a cyclic or acyclic compound.
  • the terpenoids are the following 43 compounds, namely 2,3-oxidosqualene, myrcene, (z)-ocimene, linalool, geraniol, nerol, limonene, menthol, ⁇ -pinene, camphor, carvacrol, carvone, ⁇ -farnesene, nerolidol , ⁇ -bisabolene, valencene, amorphadiene, capsidiol, ⁇ -cedrane, artemisinin, phytane, phytol, camphorene, retinol, labdane, clerodane, pimarane, abietane, tigolliane, kaurane, taxane, ⁇ -amyrin, ⁇ -amyrin, ⁇ -amyrin , hopane, oleanolic acid, lycopene, rubixanthin, ⁇ -carotene, lutein,
  • the target product may be squalene or beta-carotene.
  • the recombinant microorganism may have an enhanced terpenoid biosynthesis pathway.
  • the recombinant microorganism may have an enhanced biosynthetic pathway of one or more of the 43 compounds.
  • the target product binding protein may bind to the metabolite.
  • the target product binding protein may specifically bind to the metabolite.
  • the target product binding protein may be a lipid binding protein.
  • the target product binding protein may be a cytoplasmic lipid binding protein.
  • the lipid binding protein is a supernatant protein factor (SPF), phosphatidylinositol transfer protein (Sec14), alpha-tocopherol transfer protein (alpha-tocopherol transfer protein, TTP), cellular retinal binding protein ( It may be selected from the group consisting of cellular retinal binding protein), squid retinal binding protein, or a fragment thereof having a target product binding ability.
  • the lipid binding protein may be of any cell origin.
  • the lipid binding protein may be derived from a mammalian cell.
  • the SPF and TTP may be derived from humans or mice.
  • Human-derived SPF has a 403 amino acid sequence, and has an N-terminal domain having lipid-binding ability and a C-terminal domain having a jelly-roll motif, that is, a Golgi dynamics domain (GOLD).
  • GOLD Golgi dynamics domain
  • SPF may be a truncated SPF (tSPF) having squalene-binding ability and in which the C-terminal domain, ie, amino acid sequences 276 to 403 are cleaved and removed. That is, tSPF may consist of amino acid sequences 1 to 275 of SPF.
  • SPF and tSPF may have amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the nucleotides encoding SPF and tSPF may have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3
  • the secretion signal sequence represents an amino acid sequence for extracellular secretion of a protein expressed in a cell.
  • the secretion signal sequence may be a secretion signal sequence derived from a eukaryotic cell or a prokaryotic cell.
  • the secretion signal sequence may be any amino acid sequence capable of extracellular secretion of the target product binding protein in the recombinant microorganism.
  • the secretion signal sequence may be derived from the same or a different cell from the recombinant microbial cell.
  • the secretion signal sequence may be an animal, plant, yeast, or bacterial-derived secretion signal sequence.
  • the secretion signal sequence may be at least one selected from the group consisting of Suc2, Pho5, MF ⁇ , Inu1, and Mel1 secretion signal sequence.
  • the Suc2, Pho5, and MF ⁇ secretion signal sequences may have the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5, 6 and 7, respectively.
  • the nucleotides encoding the Suc2, Pho5, and MF ⁇ secretion signal sequences may have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 8, 9, and 10.
  • the recombinant microorganism may be a eukaryotic cell or a prokaryotic cell.
  • the eukaryotic cell may be an animal, plant, or fungal cell.
  • the fungus may be yeast.
  • the yeast cell may be of the genus Saccharomyces.
  • the cell of the genus Saccharomyces may be Saccharomyces cerevisiae.
  • the prokaryotic cell may be a bacterium.
  • the bacteria may belong to the genus Escherichia , the genus Corynebacterium , or the genus Bacillus .
  • the bacteria may be lactic acid bacteria, for example, Lctobacillus , or belonging to the genus Lactococcus .
  • the bacteria may be Escherichia coli , Corynebacterium glutamicum , or Bacillus subtilus .
  • the recombinant microorganism may be a genetic modification that increases the expression of a polynucleotide encoding a target product or an enhanced metabolic pathway for producing the target product.
  • the recombinant microorganism may have an increased target product-producing ability compared to the cells before transformation.
  • the genetic modification may be an increase in the number of copies of the polynucleotide encoding the target product.
  • the genetic modification may be a modification of a regulatory sequence that increases the expression of a polynucleotide encoding a target product.
  • the recombinant microorganism may have an enhanced metabolic pathway for producing a target product.
  • the metabolic pathway for producing the target product may be enhanced by genetic modification to increase the expression of a polynucleotide encoding a factor such as a protein or enzyme involved in the biosynthesis of the target product.
  • the genetic modification may be an increase in the number of copies of a polynucleotide encoding a factor such as a protein or enzyme involved in the biosynthesis of a target product or modification of a regulatory sequence thereof.
  • the recombinant microorganism may also have a weakened metabolic pathway that inhibits the production of the target product.
  • the metabolic pathway may be, for example, a pathway that degrades a target product or a feedback inhibition pathway.
  • the target product binding protein may be SPF or a ligand binding fragment thereof.
  • the target product binding protein is L84, I103, L106, A108, L111, L112, L120, L121, K124, I151, Y153, C155, L158, H162, A167, V168, A170, Y171 in the amino acid sequence of SPF of SEQ ID NO: 1. , F174, L175, L186, L189, F198, A201, Y202, I205, L209, T213, and I217 amino acids.
  • the recombinant microorganism may be of the genus Saccharomyces , for example, Saccharomyces cerevisiae .
  • the recombinant microorganism may have enhanced mevalonic acid biosynthetic pathway or beta-carotene biosynthetic pathway.
  • the recombinant microorganism may include a genetic modification that increases the activity of one or more of HMG-CoA and ERG20.
  • the recombinant microorganism may include a genetic modification that increases the expression of a gene encoding HMG-CoA or ERG20.
  • the genetic modification may be an increase in the copy number of the gene.
  • the recombinant microorganism may be inactivated at least one of trp1, leu2, his3, and yp1062w. It includes not only completely eliminating but also reducing the expression of the inactivated gene.
  • the inactivation may be a deletion of one or more genes among trp1, leu2, his3 and yp1062w.
  • HMG-CoA, ERG20, trp1, leu2, his3 and yp1062w may have the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, and 16, respectively.
  • the HMG-CoA, ERG20, trp1, leu2, his3 and yp1062w genes may have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21, and 22.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a process of secreting squalene from yeast cells containing a polynucleotide encoding a Suc2-tSPF fusion protein.
  • a signal peptide located at the N-terminus is bound to a signal recognition particle, and the partially translated complex of the fusion protein and ribosome is transferred to the endoplasmic reticulum membrane.
  • step A When the nascent polypeptide of the fusion protein is synthesized in the ER and the signal peptide is cleaved by signal peptidase in the ER lumen, only tSPF, i.e., the polypeptide of the target product binding protein, remains (step A).
  • the polypeptide of the binding protein can be further modified by the endoplasmic reticulum chaperone protein, which then forms a mature protein (step B).
  • step B The mature squalene-specific binding protein forms a complex by specific binding with squalene accumulated in the cell. This process captures the target metabolite (step C).
  • the complex encapsulated by the transport vesicle can be transported to the Golgi apparatus (step D).
  • Complexes of squalene and binding proteins can be released into the extracellular space by secretory vesicles in the Golgi apparatus (step E).
  • compositions for use in producing a target product comprising a recombinant microorganism comprising a polynucleotide encoding a target product binding protein fused to the secretion signal sequence and a carrier.
  • a recombinant microorganism comprising a polynucleotide encoding a target product binding protein fused to a secretion signal sequence is as described above.
  • the carrier may be a medium, buffer, or stock solution used for culturing the microorganism.
  • Another aspect provides a method for producing a target product, comprising culturing a recombinant microorganism comprising a polynucleotide encoding a target product binding protein fused to a secretion signal sequence in a medium.
  • a recombinant microorganism comprising a polynucleotide encoding a target product binding protein fused to a secretion signal sequence is as described above.
  • the culturing includes incubating a mixture comprising the recombinant microorganism and the medium under conditions suitable for the recombinant microorganism to grow and to produce a target product binding protein fused to the secretion signal sequence.
  • the culture may be performed in a medium containing a carbon source, for example, glucose.
  • a carbon source for example, glucose.
  • the medium used for culturing the microorganism may be any conventional medium suitable for growth of the selected recombinant cells, such as minimal or complex medium with appropriate supplements. Suitable media are available from commercial vendors or can be prepared according to known recipes.
  • the medium may be a medium capable of satisfying the requirements of a specific microorganism according to the selected target product.
  • the medium may include a component selected from the group consisting of a carbon source, a nitrogen source, a salt, a trace element, and combinations thereof.
  • the conditions of the culture may be appropriately adjusted for the production of a selected target product, for example, a terpenoid such as squalene.
  • the culture may be performed under aerobic conditions for cell proliferation.
  • the incubation may be performed without or with agitation.
  • the culture may be a batch, a fed batch, or a continuous culture.
  • the continuous culture may be a continuous culture while replenishing the medium while removing a portion of the microorganism or supernatant from the culture.
  • the recombinant microorganism can secrete the target product extracellularly in the form of a complex with the target product-binding protein, and can be separated from the supernatant from which the cells are removed from the culture.
  • the culturing may be culturing in a medium containing a compound having high solubility for the target product.
  • the solubility may be higher than that of the medium or water.
  • the solubility is at least 1.2, 1.5, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, or 10 times, or 1.2 to 10, 1.5 to 10, 2.0 to 10, 3.0 to 10, 5.0 to 10, or 7.5 to 10 compared to the medium or water. It may have the solubility of a ship.
  • the target product may be a lipid, for example, a terpenoid
  • the compound having high solubility for the target product may be an oily compound having high solubility for a lipid, for example, a terpenoid.
  • the target product is extracellularly secreted in the form of a target product-target product binding protein complex during culture, and in the extracellular medium, the complex is dissociated into the target product and the target product binding protein and the complex is in a dynamic equilibrium state may exist. Accordingly, a portion of the target product dissociated in the dynamic equilibrium state may be distributed to the compound layer having high solubility for the target product.
  • the target product is a lipid, for example, a terpenoid
  • the culture is performed in a medium containing an oily compound
  • the target product is secreted out of the cell and then distributed to the oily compound layer in the medium.
  • the oily compound may be an alkane solvent, for example, a C1 to C60, C6 to C60, or C3 to C30 alkane.
  • the solvent may be hexane, heptane, decane, dodecane, or hexadecane.
  • the oily compound may be a vegetable oil.
  • the vegetable oil may be olive oil, canola oil, or essential oil.
  • the oily compound may be a compound that is easy to separate from each other due to a large difference in boiling point from the target product,
  • culture conditions means conditions for culturing microorganisms.
  • Such culture conditions may be, for example, a carbon source, a nitrogen source, or an oxygen condition used by the microorganism.
  • Carbon sources available to yeast may include monosaccharides, disaccharides or polysaccharides.
  • the carbon source is a magnetizable sugar and may include glucose, fructose, mannose, or galactose.
  • the nitrogen source may be an organic nitrogen compound or an inorganic nitrogen compound.
  • the nitrogen source may be an amino acid, an amide, an amine, a nitrate, or an ammonium salt.
  • the oxygen conditions for culturing microorganisms include aerobic conditions of normal oxygen partial pressure, hypoxic conditions containing 0.1% to 10% of oxygen in the atmosphere, or anaerobic conditions without oxygen.
  • the method may include isolating the target product.
  • the step of isolating the target product may not include the step of disrupting cells.
  • Separating the target product may include separating the supernatant from the culture.
  • the separating may include separating the target product from the supernatant.
  • Separating the target product may include separating the target product from the complex of the target product and the target product-binding protein.
  • the culture or supernatant containing the complex is incubated in a liquid medium under conditions suitable for dissociating the complex into the target product and the target product-binding protein. include that The conditions may be appropriately selected depending on the target product and target product-binding protein to be selected.
  • the target product is a terpenoid compound such as squalene or beta-carotene
  • the separating may include incubating the complex in a hydrophobic solvent, for example, an oily compound.
  • the solvent may be an alkane, for example, a C1 to C60, C6 to C60, or C3 to C30 alkane.
  • the solvent may be hexane, heptane, decane, dodecane, or hexadecane.
  • the separating step may be performed simultaneously with the culture.
  • the target product is 2,3-oxidosqualene, myrcene, (z)-ocimene, linalool, geraniol, nerol, limonene, menthol, ⁇ -pinene, camphor, carvacrol, carvone, ⁇ -farnesene, nerolidol, ⁇ -bisabolene, valencene, amorphadiene, capsidiol, ⁇ -cedrane, artemisinin, phytane, phytol, camphorene, retinol, labdane, clerodane, pimarane, abietane, tigliane, kaurane, taxane, squalene, hoposterane, ⁇ -amyrin, ⁇ -amyrin, , oleanolic acid, lycopene, rubixanthin, ⁇ -carotene, lutein, zeaxanthin,
  • the target product binding protein may be selected from the group consisting of SPF, Sec14, TTP, alpha-tocopherol transfer protein, cellular retinal binding protein, squid retinal binding protein, or a fragment thereof having a target product binding ability.
  • the recombinant microorganism may be a yeast cell, for example, of the genus Saccharomyces .
  • the microorganism of the genus Saccharomyces may be S. cerevisiae .
  • Recombinant microorganisms according to an aspect can be used to efficiently produce a target product.
  • composition for use in producing a target product according to an aspect may be used to efficiently produce a target product.
  • the target product can be efficiently produced.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a process of secreting squalene from yeast cells containing a polynucleotide encoding a Suc2-tSPF fusion protein.
  • Figure 2a is a diagram showing the extracellular squalene concentration produced by yeast cells comprising a polynucleotide encoding tSPF fused to a secretion signal sequence.
  • 2B is a diagram showing the intracellular squalene concentration produced by yeast cells containing a polynucleotide encoding tSPF fused to a secretion signal sequence.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of HPLC analysis of squalene secreted by SQ strains each transformed with Suc2-tSPF, Pho5-tSPF and MF ⁇ -tSPF fusion protein genes.
  • FIG. 4 is a view showing the results of culturing SQ strains transformed with Suc2-tSPF, Pho5-tSPF, and MF ⁇ -tSPF fusion protein genes, respectively, and Western blot analysis of cell lysates and culture supernatant.
  • Figure 5 shows the amount of beta-carotene produced by culturing CEN.PK2-1D yeast cells co-transformed with p415-BC vector and pSEC-tSPF or pSEC-Suc2-tSPF.
  • FIG. 6 is a view showing the results of HPLC analysis of extracellularly secreted beta-carotene produced by yeast cells transformed with the Suc2-tSPF fusion protein gene.
  • Example 1 Yeast cells with increased squalene secretion and squalene production using same
  • a recombinant yeast cell was prepared by introducing a target product binding protein fused to a secretion signal sequence into a yeast cell, and a target product was produced using the prepared recombinant yeast cell, and the secretory ability thereof was confirmed.
  • Yeast cells were Saccharomyces cerevisiae, and secretion signal sequences Suc2, Pho5, and MF ⁇ secretion signal sequences were used, respectively.
  • squalene was used as the target product
  • tSPF a cleaved fragment of SPF
  • tSPF is a squalene-binding protein corresponding to the N-terminal domain having lipid-binding ability of supernatant protein factor (SPF).
  • SPF supernatant protein factor
  • tSPF corresponds to amino acid sequences 1 to 275 in SPF having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Yeast cells were Saccharomyces cerevisiae , and wild-type strain CEN.PK2-1D [( MAT ⁇ ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3 ⁇ 1; MAL2-8; SUC2 ) (EUROSCARF accession number: 30000B) was used.
  • the strain is phosphoribosylanthranilate isomerase (trp1), 3-isopropylmalate dehydrogenase (3-isopropylmalate dehydrogenase, leu2) and imidazoleglycerol-phosphate dehydratase (imidazoleglycerol-phosphate)
  • the gene encoding dehydratase, his3) is inactivated.
  • trp1, leu2, and his3 may have the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13, 14, and 15, respectively.
  • the trp1, leu2, and his3 genes may have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 19, 20, and 21, respectively.
  • Squalene is a terpenoid and is synthesized through the mevalonic acid biosynthesis pathway in yeast cells. The following genetic modifications were introduced to increase the ability to produce squalene.
  • the tHMG1 gene encoding S. cerevisiae -derived HMG-CoA reductase ( ⁇ -Hydroxy ⁇ -methylglutaryl-CoA reductase) and S. cerevisiae -derived farnesyl pyrophosphate synthase are located in the deleted trp1, leu2 and his3 gene positions of the strain.
  • a gene encoding farnesyl pyrophosphate synthetase (ERG20) was introduced.
  • tHMG1 and ERG20 may have the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively.
  • the tHMG1 and ERG20 genes may have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 17 and 18, respectively.
  • HMG-CoA reductase is an enzyme that catalyzes the conversion of HMG-CoA to mevalonate.
  • ERG20 is an enzyme that catalyzes the conversion of GPP to FPP. Both HMG-CoA and FPP are precursors for squalene synthesis.
  • ypl062w was deleted in the genome of the strain, and the tHMG1 gene was introduced into the ypl062w site.
  • the ypl062w gene deletion may increase the level of acetyl-CoA, an initial substrate of the mevaloic acid biosynthetic pathway.
  • ypl062w may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the ypl062w gene may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22.
  • tSPF was used for the squalene binding protein.
  • a polynucleotide encoding a fusion protein was obtained in which three different signal peptides, namely, Suc2, Pho5, and MF ⁇ signal peptide, were fused to the N-terminus of tSPF, respectively.
  • the fusion protein contains a 6xHis tag sequence at the C terminus.
  • the Suc2, Pho5, and MF ⁇ signal peptides may have the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5, 6 and 7, respectively.
  • the nucleotides encoding the Suc2, Pho5, and MF ⁇ signal peptides may have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 8, 9, and 10.
  • Suc2, Pho5, and MF ⁇ signal peptides function as an N-terminal signal peptide to extracellularly secrete sucrose transport protein (Suc2), acid phosphatase (Pho5), and yeast ⁇ -mating factor (MF ⁇ ), respectively.
  • Suc2 Pho5, and MF ⁇ signal peptides function as an N-terminal signal peptide to extracellularly secrete sucrose transport protein (Suc2), acid phosphatase (Pho5), and yeast ⁇ -mating factor (MF ⁇ ), respectively.
  • is an amino acid sequence with tSPF has the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • tSPF
  • the obtained Suc2-tSPF, Pho5-tSPF, and MF ⁇ -tSPF fusion proteins may have the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24 and 25, respectively.
  • the nucleotides encoding the Suc2-tSPF, Pho5-tSPF, and MF ⁇ -tSPF fusion proteins may have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 26, 27, and 28.
  • the polynucleotide was introduced into the SpeI/XhoI restriction enzyme site of the p426-TEF1 (SEQ ID NO: 29) vector to obtain expression vectors pSEC-Suc2-tSPF, pSEC-Pho5-tSPF and pSEC-MF ⁇ -tSPF.
  • pSEC-tSPF vector in which a tSPF gene without a secretion signal sequence was introduced into p426-TEF1, and an empty p426-TEF1 vector were used.
  • p426-TEF1 is a high copy number plasmid containing the TEF1 promoter.
  • the fusion protein is operably linked by a TEF1 promoter, whereby transcription can be initiated.
  • the expression vector was introduced into the SQ strain by a heat shock transformation method to obtain an SQ strain transformed with three types of fusion protein genes, respectively.
  • the expression vector exists independently of the genome of the SQ strain.
  • the SQ strain transformed with pSEC-Suc2-tSPF, pSEC-Pho5-tSPF and pSEC-MF ⁇ -tSPF was transformed into YSC medium supplemented with 2% (w/v) glucose and 10% (v/v) dodecane; 250 containing 0.67% (w/v) yeast nitrogen base without amino acids (BD Difco, USA), 0.19% (w/v) yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil (Sigma-Aldrich, USA)) 50 mL It was incubated at 30° C. while stirring at 250 rpm in an L flask.
  • the culture was centrifuged at 4,000 rpm to separate cells, culture supernatant and dodecane layer.
  • concentration of squalene in the isolated cells and dodecane layer was measured.
  • the cells are resuspended in 600 ⁇ L of a 1:1 mixture of methanol and acetone, transferred to a tube containing lysing matrix C (glass bead, MP Biomedicals, USA), and placed in a FastPrep-24 5G homogenizer ( Cells were disrupted using MP Biomedicals, USA) and centrifuged at 13,000 rpm to separate the disrupted cells and intracellular metabolites including squalene dissolved from the disrupted cells.
  • lysing matrix C glass bead, MP Biomedicals, USA
  • the squalene concentration of the cell lysate was measured.
  • it was filtered with a 0.2 ⁇ m syringe filter, and then the concentration was measured using the Agilent HPLC system.
  • Table 1 shows the intracellular and extracellular squalene concentrations produced by yeast cells containing a polynucleotide encoding tSPF fused to a secretion signal sequence.
  • 2A and 2B show the extracellular and intracellular squalene concentrations produced by yeast cells comprising a polynucleotide encoding tSPF fused to a secretion signal sequence, respectively.
  • FIG. 3 is a view showing the results of HPLC analysis of squalene produced by the SQ strain transformed with the Suc2-tSPF, Pho5-tSPF, and MF ⁇ -tSPF fusion protein genes and secreted out of the cell, respectively.
  • the results in FIG. 3 correspond to the extracellularly secreted squalene data in Table 1.
  • FIG. 4 is a view showing the results of Western blot analysis of the cell lysate and culture supernatant obtained by culturing the SQ strain transformed with the Suc2-tSPF, Pho5-tSPF and MF ⁇ -tSPF fusion protein genes, respectively.
  • yeast cells were incubated for 2 days in 50 ml of YSC medium containing 2% (w/v) glucose (YSC medium; 0.67% (w/v) yeast nitrogen base without amino acids ( BD Difco, USA) and 0.19% (w/v) yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil (Sigma-Aldrich, USA)) were cultured in a 250 mL flask with stirring at 30°C. At this time, the minimal medium did not contain a dodecane layer.
  • YSC medium 2% (w/v) glucose
  • yeast nitrogen base without amino acids
  • yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil Sigma-Aldrich, USA
  • the precipitated protein was washed 3 times with 1 ml of cold acetone and resuspended in 50 ⁇ l of sterile water.
  • the resuspended protein was further concentrated using 30 kDa amicon ultra centrifugal filters.
  • the prepared protein sample ie, cell lysate
  • 5x SDS sample buffer was mixed with 5x SDS sample buffer and separated by 10% SDS-PAGE. Proteins separated from the SDS-PAGE gel were transferred to a PVDF membrane, and then blocked by incubation in TBST containing 4% skim milk for one day.
  • the PVDF membrane was reacted with a solution containing the primary antibody at room temperature for 1 hour, and then washed three times with a TBST solution.
  • As the primary antibody an anti-actin antibody or an anti-His tag antibody was used.
  • the fusion protein contains a 6xHis tag sequence at the C terminus.
  • the washed PVDF membrane was reacted again with a solution containing peroxidase-conjugated anti-IgG antibody at room temperature for 1 hour.
  • the PVDF membrane with the antibody-bound protein was visualized using the ChemiDoc imaging system.
  • FIG. 5 Western blot results are shown in FIG. 5 .
  • the bands of Suc2-tSPF and Pho5-tSPF hardly appeared, so the tSPF fused to the secretion signal sequence did not stay inside the cell but moved outside the cell.
  • tSPF not fused to the secretion signal sequence did not migrate to the outside of the cell when the secretion signal sequence was not fused, as a clear band appeared in the cell lysate.
  • tSPF not fused to the secretion signal sequence did not show a band. This indicates that tSPF not fused to the secretory signal sequence does not migrate extracellularly.
  • Example 2 Yeast cells with increased beta-carotene secretion and beta-carotene production using the same
  • a vector containing a beta-carotene biosynthesis gene was introduced into the CEN.PK2-1D yeast strain described in Section 1.1 of Example 1 to prepare yeast cells with increased beta-carotene-producing ability.
  • the crtE, crtYB, crtI and tHMG1 genes were amplified from the pMM494 vector (Addgene, Plasmid #100539) containing the expression cassettes of crtE, crtYB, crtI and tHMG1 of the beta-carotene biosynthetic pathway, and the p415-GPD vector ( SEQ ID NO: 30) was introduced into the site of restriction enzymes BamHI and SalI to construct a p415-BC vector containing expression cassettes for crtE, crtYB, crtI and tHMG1.
  • the p415-GPD vector (ATCC 87358) is a low copy number expression vector containing the GPD1 promoter.
  • crtE, crtYB, and crt have the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 31, 32 and 33, respectively.
  • the polynucleotides encoding crtE, crtYB, and crt have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 34, 35 and 36, respectively.
  • the crtE, crtYB, and crtI proteins are proteins derived from Xanthophyllomyces dendrohous and have the following activities.
  • crtE is a gene encoding geranylgeranyl diphosphate that catalyzes the conversion of farnesyl diphosphate to geranylgeranyl diphosphate.
  • crtYB is crtB, which encodes phytoene synthase, which catalyzes the reaction of converting geranylgeranyl diphosphate to phytoene, and lycopene beta-cyclase, which catalyzes the reaction of converting lycopene to beta-carotene. contains the gene crtY.
  • crtI is a gene encoding a phytoene desaturase that converts phytoene into lycopene.
  • the p415-BC vector prepared in section (1.2) and pSEC-tSPF or pSEC-Suc2-tSPF were co-transfected into the wild S. cerevisiae strain CEN.PK2-1D.
  • a transformed yeast cell was prepared with a vector expressing tSPF fused to a signal peptide by cotransformation.
  • CEN.PK2-1D yeast cells capable of over-producing beta-carotene by co-transformation with the p415-BC vector obtained in section (2.2) and pSEC-tSPF or pSEC-Suc2-tSPF were prepared as described in section (1.3) of Example 1 Incubated for 144 hours under the same conditions as the bar, the amount of intracellular and extracellular beta-carotene produced was measured. The amount of beta-carotene was measured by the same method as the cell disruption and dodecane layer separation methods used to measure the squalene concentration.
  • Table 2 and Figure 6 show the amount of beta-carotene produced by culturing CEN.PK2-1D yeast cells co-transformed with p415-BC vector and pSEC-tSPF or pSEC-Suc2-tSPF.
  • the yeast cells transformed with the Suc2-tSPF fusion protein gene significantly increased the amount of extracellular beta-carotene or the ratio of extracellular secretion compared to the control cells. Specifically, the extracellular secretion of beta-carotene was increased by about 23 times compared to the control group including the empty vector.
  • the results of Figure 6 correspond to the beta-carotene secreted extracellularly in Table 2, that is, beta-carotene secreted to the dodecane layer.
  • dodecane + 1 ppm beta-carotene and “dodecane + 1 ppm lycopene” are a standard mixture containing 1 ppm beta-carotene in dodecane and 1 ppm lycopene in dodecane as controls, respectively. indicates.
  • the three-dimensional crystallographic structure of tSPF (PDB ID: 4OMK) was obtained from the RCSB protein data bank.
  • PDB ID: 4OMK the A chain of 4ONK in which squalene and water molecules bound from the crystal structure were removed prior to simulation were used.
  • One possible structure was deliberately selected for each amino acid to construct a rigid protein structure in the crystallographic structure, and the squalene-binding active site of the A chain was determined using Computer Atlas of Surface Topology of protein (CASTp).
  • the identified residues necessary for squalene binding are L84, I103, L106, A108, L111, L112, L120, L121, K124, I151, Y153, C155, L158, H162, A167, V168, A170, Y171, F174, L175, L186, L189, F198, A201, Y202, I205, L209, T213, and I217. Accordingly, it is believed that the squalene binding site includes these residues.

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Abstract

분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 그를 이용하여 표적산물을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 그를 이용하여 표적산물을 생산하는 방법
분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 그를 이용하여 표적산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
재조합 미생물을 이용하여 많은 산물이 생산되고 있다. 예를 들면, 재조합 대장균 또는 S. cerevisiae를 포함한 효모 세포를 사용하여 여러 산물이 생산되고 있다.
그러나, 일부 산물은 재조합 미생물에서 생합성된 후 세포내에 존재한다. 세포내 존재하는 산물은 이를 분리하기 위하여 세포를 파쇄하는 추가의 단계를 필요로 한다.
따라서, 생합성된 후 세포내에 존재하는 산물에 대하여 세포외로 분비시킬 수 있는 재조합 미생물 및 그를 이용하여 산물을 생산하는 방법에 대한 요구가 있다.
일 양상은 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물 및 담체를 포함하는 표적산물을 생산하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물을 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 표적산물을 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 재조합 미생물의 게놈 또는 게놈 외에 존재하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 조절서열에 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 조절서열은 폴리뉴클레오티드로부터 상기 단백질을 생합성 또는 생산하는데 있어서 필요한 서열일 수 있다. 상기 조절서열은 전사 조절서열, 번역조절서열, 및 번역 후 수식 조절서열일 수 있다. 상기 조절서열은 프로모터, 오퍼레이터, 터미네이터, 인핸서, 리보좀 결합 자리, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 조절서열은 상기 재조합 미생물이 재조합되기 전에 내재적으로 존재하는 것 또는 외래 조절서열일 수 있다. 상기 조절서열은 상기 분비 신호서열이 융합되지 않은 네이키드 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 조절서열 또는 그와 다른 단백질을 코딩하는 유전자의 조절서열일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 복수 개의 카피로 상기 세포에 포함된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 2 이상, 5 이상, 10 이상, 50 이상, 100 이상, 2 내지 1000, 2 내지 500, 2 내지 100, 2 내지 50, 2 내지 10, 2 내지 5, 5 내지 100, 5 내지 50, 5 내지 10, 5 내지 100, 5 내지 10, 10 내지 100, 또는 10 내지 50 개 카피로 상기 세포에 포함된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 조절서열과 발현 가능하도록 연결된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 내재적 폴리뉴클레오티드 발현에 비하여 증가된 수준으로 발현되도록 하는 조절서열에 연결된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 내재적 프로모터에 비하여 더 강한 전사 개시능을 갖는 프로모터에 연결된 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 또한 세포외로 분비된 상기 복합체 또는 해리된 표적산물 결합 단백질을 분리하는데 사용하기 위한 태그(tag) 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 태그 서열은 올리고펩티드일 수 있다. 상기 태그 서열은 2 이상의 아미노산, 예를 들면, 2 내지 50, 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 10개 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 태그 서열은 예를 들면, His 태그 서열일 수 있다. 상기 His 태그는 상기 표적산물 결합 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 것일 수 있다. 상기 태그는 6xHis일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 표적산물 결합 단백질의 N 말단에 분비 신호서열이 융합된 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 유전적 변형(genetic modification) 방법에 의하여 재조합되기 전의 미생물 세포에 도입된 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 형질변환, 형질도입, 트란스펙션, 또는 전기충격(electroporation)에 의한 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 재조합되기 전의 미생물 세포내의 유전자를 유전자 교정(gene editing)하여 생성될 것일 수 있다. 상기 유전자 교정은 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 유전자 교정과 같은 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
상기 재조합 미생물은 상기 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질 분비능을 갖는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 상기 표적산물 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 증가된 표적산물 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 표적산물과 상기 표적산물 결합 단백질이 결합된 복합체의 형태로 세포외로 분비할 수 있는 것일 수 있다. 상기 복합체의 형성은 세포내에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 복합체의 형성은 외부로부터 조작없이 세포 대사 과정에서 세포에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 복합체에 있어서, 표적산물과 상기 표적산물 결합 단백질 사이의 결합은 비공유 결합에 의한 것일 수 있다. 상기 비공유 결합은 소수성 결합, 수소 결합, 또는 이온 결합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 복합체는 액체 매질 중에서 상기 결합을 해리시키기에 적합한 조건하에서 해리되어 해리된 표적산물과 상기 표적산물 결합 단백질을 각각 형성할 수 있다. 상기 분비 신호서열에 융합되지 않은 표적산물 결합 단백질은 자연적 숙주 세포내에서는 세포내, 예를 들면 세포질에 존재하고 있어서 세포외로 분비되지 않는 것일 수 있다. 상기 분비 신호서열에 융합되지 않은 표적산물 결합 단백질은 자연적 숙주 세포내에서는 분비 신호서열에 연결되어 있지 않은 것일 수 있다.
상기 표적산물은 대사산물(metabolite)일 수 있다. 상기 대사산물은 내재적 대사산물 또는 유전적 변형에 의하여 도입된 그의 합성경로에 의하여 합성되는 대사산물일 수 있다. 상기 대사산물은 리피드, 다당, 단백질 또는 소분자 화합물일 수 있다. 상기 표적산물은 리피드일 수 있다. 상기 리피드는 테르페이노이드일 수 있다. 용어 "테르페이노이드"는 이소프렌(isoprene)을 단위체로 하여 합성된 화합물일 수 있다. 상기 테르페이노이드는 탄소 수 5 내지 100, 10 내지 100, 15 내지 100, 30 내지 100, 5 내지 60, 10 내지 60, 15 내지 60, 30 내지 60, 5 내지 45, 10 내지 45, 15 내지 45, 30 내지 60, 5 내지 30, 10 내지 30, 15 내지 30, 또는 5 내지 45개를 갖는 것일 수 있다. 상기 테르페이노이드는 산소 분자를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 테르페이노이드는 산소 분자를 포함하지 않는 탄화수소(hydrocarbon)일 수 있다. 상기 테르페이노이드는 모노테르펜, 디테프펜, 세스퀴테르펜, 트리테르펜, 또는 테트라테르펜일 수 있다. 상기 테르페이노이드는 고리 또는 비고리 화합물일 수 있다. 상기 테르페이노이드는 하기 43개 화합물, 즉 2,3-oxidosqualene, myrcene, (z)-ocimene, linalool, geraniol, nerol, limonene, menthol, α-pinene, camphor, carvacrol, carvone, β-farnesene, nerolidol, β-bisabolene, valencene, amorphadiene, capsidiol, α-cedrane, artemisinin, phytane, phytol, camphorene, retinol, labdane, clerodane, pimarane, abietane, tigliane, kaurane, taxane, squalene, lanosterol, α-amyrin, β-amyrin, hopane, oleanolic acid, lycopene, rubixanthin, β-carotene, lutein, zeaxanthin, 및 astaxanthin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 표적산물은 스쿠알렌 또는 베타-카로틴일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 테르페이노이드 생합성 경로가 강화된 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 상기 43개 화합물 중 하나 이상의 화합물의 생합성 경로가 강화된 것일 수 있다.
상기 표적산물 결합 단백질은 상기 대사산물에 결합하는 것일 수 있다. 상기 표적산물 결합 단백질은 상기 대사산물에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 표적산물 결합 단백질은 리피드 결합 단백질일 수 있다. 상기 표적산물 결합 단백질은 세포질 리피드 결합 단백질일 수 있다. 상기 리피드 결합 단백질은 상등액 단백질 인자(supernatant protein factor, SPF), 포스파티딜이노시톨 전달 단백질(phosphatidylinositol transfer protein, Sec14), 알파-토코페롤 전달 단백질(alpha-tocopherol transfer protein, TTP), 세포성 레티날 결합 단백질(cellular retinal binding protein), 오징어 레티날 결합 단백질(squid retinal binding protein), 또는 표적산물 결합능을 갖는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 리피드 결합 단백질은 임의의 세포 유래의 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 리피드 결합 단백질은 포유동물 세포 유래의 것일 수 있다. 상기 SPF 및 TTP는 사람 또는 마우스 유래의 것일 수 있다. 사람 유래 SPF는403개 아미노산 서열을 갖는 것으로서, 리피드 결합능을 갖는 N 말단 도메인과 젤리-롤 모티프(jelly-roll motif)를 갖는 C 말단 도메인 즉, 골지 다이나믹스 도메인(Golgi dynamics domain, GOLD)을 갖는 것일 수 있다. SPF는 스쿠알렌 결합능을 갖고 C 말단 도메인, 즉 276번 내지 403번 아미노산 서열이 절단되어 제거된 절단된 SPF(tSPF)일 수 있다. 즉, tSPF는 SPF의 1번 내지 275번 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. SPF 및 tSPF는 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. SPF 및 tSPF를 코딩하는 뉴클레오티드는 각각 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
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상기 분비 신호서열은 세포에서 발현된 단백질을 세포외 분비시키는 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 분비 신호서열은 진핵세포 또는 원핵세포 유래의 분비 신호서열일 수 있다. 상기 분비 신호서열은 상기 재조합 미생물에서 표적산물 결합 단백질을 세포외로 분비하게 할 수 있는 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 분비 신호서열은 재조합 미생물 세포와 동일 또는 다른 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 분비 신호서열은 동물, 식물, 효모, 또는 박테리아 유래 분비 신호서열일 수 있다. 상기 분비 신호서열은 Suc2, Pho5, MFα, Inu1, 및 Mel1 분비 신호서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. Suc2, Pho5, 및 MFα분비 신호서열은 서열번호 5, 6 및 7의 아미노산 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. Suc2, Pho5, 및 MFα 분비 신호서열을 코딩하는 뉴클레오티드는 서열번호 8, 9, 및 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다. 상기 진핵 세포는 동물, 식물, 또는 균류 세포일 수 있다. 상기 균류는 효모일 수 있다. 상기 효모 세포는 Saccharomyces 속일 수 있다. Saccharomyces 속 세포는 Saccharomyces cerevisiae일 수 있다. 상기 원핵 세포는 박테리아일 수 있다. 상기 박테리아는 Escherichia 속, Corynebacterium 속, 또는 Bacillus 속에 속하는 것일 수 있다. 또한, 상기 박테리아는 유산균, 예를 들면, Lctobacillus, 또는 Lactococcus 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 박테리아는 Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, 또는 Bacillus subtilus일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 표적산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 유전적 변형 또는 표적산물을 생산하는 대사 경로가 강화된 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 변형되기 전의 세포에 비하여 증가된 표적산물 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 표적산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피 수의 증가일 수 있다. 상기 유전적 변형은 표적산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 조절서열의 변형일 수 있다. 또한, 상기 재조합 미생물은 표적산물을 생산하는 대사 경로가 강화된 것일 수 있다. 표적산물을 생산하는 대사 경로는 표적산물의 생합성에 관여하는 단백질 또는 효소와 같은 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 유전적 변형에 의하여 강화된 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 표적산물의 생합성에 관여하는 단백질 또는 효소와 같은 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피 수의 증가 또는 그 조절서열의 변형일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 또한 표적산물 생산을 저해하는 대사 경로가 약화된 것일 수 있다. 상기 대사 경로는 예를 들면, 표적산물을 분해하는 경로 또는 피드백 저해 경로일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 표적산물 결합 단백질은 SPF 또는 그의 리간드 결합 단편일 수 있다. 상기 표적산물 결합 단백질은 서열번호 1의 SPF의 아미노산 서열에서 L84, I103, L106, A108, L111, L112, L120, L121, K124, I151, Y153, C155, L158, H162, A167, V168, A170, Y171, F174, L175, L186, L189, F198, A201, Y202, I205, L209, T213, 및 I217 아미노산을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 Saccharomyces 속, 예를 들면, Saccharomyces cerevisiae일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 메발론산 생합성 경로 또는 베타 카로틴 생합성 경로가 강화된 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 HMG-CoA 및 ERG20 중 하나 이상의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 HMG-CoA 또는 ERG20를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 상기 유전자의 카피 수 증가일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 trp1, leu2, his3 및 yp1062w 중 하나 이상이 불활성화된 것일 수 있다. 상기 불활성화되는 유전자의 발현을 완전히 제거하는 것뿐만 아니라 감소시키는 것도 포함한다. 상기 불활성화는 trp1, leu2, his3 및 yp1062w 중 하나 이상의 유전자의 결실일 수 있다. HMG-CoA, ERG20, trp1, leu2, his3 및 yp1062w는 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 및 16의 아미노산 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. HMG-CoA, ERG20, trp1, leu2, his3 및 yp1062w 유전자는 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 및 22의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
도 1은 Suc2-tSPF 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포에서 스쿠알렌을 분비하는 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다. 상기 과정은 먼저, 세포내에서 상기 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 mRNA 번역이 이루어지는 동안 N-말단에 위치한 신호 펩티드는 신호 인식 입자(signal recognition particle)에 결합되고, 부분적으로 번역된 상기 융합 단백질 및 리보솜의 복합체가 소포체 막으로 전달된다. 소포체에서 융합 단백질의 초기 폴리펩티드(nascent polypeptide)가 합성되고, 신호 펩티드가 소포체 내강에서 신호 펩티다제에 의해 절단되면, tSPF 즉, 표적산물 결합 단백질의 폴리펩티드만이 남는다(단계 A). 상기 결합 단백질의 폴리펩티드는 소포체의 샤페론 단백질에 의해 추가적인 변형이 진행될 수 있으며, 이후 성숙한 단백질을 형성한다(단계 B). 성숙한 스쿠알렌-특이적 결합 단백질은 세포 내 축적되어 있던 스쿠알렌과 특이적 결합을 하여 복합체를 형성한다. 이 과정이 표적 대사 산물을 포획하는 과정이다(단계 C). 스쿠알렌이 결합 단백질과 복합체를 형성하면, 수송 소포(transport vesicle)에 의해 캡슐화된 복합체는 골지체로 수송될 수 있다(단계 D). 골지체에서 분비 소포에 의해 스쿠알렌 및 결합 단백질의 복합체는 세포 외 공간으로 방출될 수 있다(단계 E).
다른 양상은 상기한 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물 및 담체를 포함하는 표적산물을 생산하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 담체는 상기 미생물을 배양에 사용되는 배지, 버퍼, 또는 보관 용액일 수 있다.
다른 양상은 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물을 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 표적산물을 생산하는 방법을 제공한다.
분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 배양은 상기 재조합 미생물 및 배지를 포함하는 혼합물을 재조합 미생물이 성장하고 상기 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 생산하기에 적합한 조건에서 인큐베이션하는 것을 포함한다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 미생물 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 선택된 재조합 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.
상기 배지는 선택되는 표적산물에 따라 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 포함할 수 있다.
상기 배양의 조건은 선택되는 표적산물, 예를 들면, 스쿠알렌과 같은 테르페이노이드 생산에 적합하게 적절히 조절될 수 있다. 상기 배양은 세포 증식을 위하여 호기성 조건에서 이루어질 수 있다. 상기 배양은 교반 없이 또는 교반과 함께 수행될 수 있다. 상기 배양은 배치(batch), 페드 배치 또는 연속식적으로 배양되는 것일 수 있다. 연속식 배양은 배양물 중 미생물 또는 상등액의 일부를 제거하면서 배지를 보충하면서 연속적으로 배양하는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 표적산물을 표적산물 결합 단백질과의 복합체의 형태로 세포외로 분비될 수 있어, 배양물로부터 세포를 제거한 상등액으로부터 분리할 수 있다.
상기 배양은 표적산물에 대한 용해도가 높은 화합물을 포함하는 배지 중에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 용해도는 배지 또는 물에 비하여 높은 것일 수 있다. 상기 용해도는 배지 또는 물에 비하여 1.2, 1.5, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 또는 10배 이상, 또는 1.2 내지 10, 1.5 내지 10, 2.0 내지 10, 3.0 내지 10, 5.0 내지 10, 또는 7.5 내지 10배의 용해도를 갖는 것일 수 있다. 상기 표적산물은 리피드 예를 들면, 테르페이노이드이고, 표적산물에 대한 용해도가 높은 화합물은 리피드 예를 들면, 테르페이노이드에 대한 용해도가 높은 오일성 화합물일 수 있다. 상기 표적산물은 배양 중 세포외로 표적산물-표적산물 결합 단백질의 복합체의 형태로 세포외로 분비되고, 세포외 배지 중에서 상기 복합체는 표적산물과 표적산물 결합 단백질로 해리된 상태와 복합체가 동적 평형 상태로 존재하는 것일 수 있다. 그에 따라서, 상기 동적 평형 상태에서 해리된 표적산물의 일부는 상기 표적산물에 대한 용해도가 높은 화합물층으로 분배되는 것일 수 있다. 예를 들면, 표적산물은 리피드 예를 들면, 테르페이노이드이고, 상기 배양은 오일성 화합물을 포함하는 배지 중에서 이루어지는 경우, 상기 표적산물을 세포외로 분비된 후 배지 중의 오일성 화합물층으로 분배되는 것일 수 있다. 상기 오일성 화합물은 알칸 용매 예를 들면, C1 내지 C60, C6 내지 C60, 또는 C3 내지 C30의 알칸일 수 있다. 상기 용매는 헥산, 헵탄, 데칸, 도데칸, 또는 헥사데칸일 수 있다. 또한, 상기 오일성 화합물은 식물유일 수 있다. 상기 식물유는 올리브유, 카놀라 오일, 또는 정유일 수 있다. 상기 오일성 화합물은 상기 표적산물과 비점 차이가 커서 서로 분리하기에 용이한 화합물일 수 있다,
용어, "배양 조건"은 미생물을 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 미생물이 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 자화가능한 당으로서, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 또는 갈락토스를 포함할 수 있다. 상기 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다.
상기 방법은 상기 표적산물을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 표적산물을 분리하는 단계는 세포를 파쇄하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 표적산물을 분리하는 단계는 배양물로부터 상등액을 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리하는 단계는 상기 상등액으로부터 상기 표적산물을 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 표적산물을 분리하는 단계는 표적산물과 상기 표적산물 결합 단백질의 복합체로부터 표적산물을 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 표적산물과 상기 표적산물 결합 단백질의 복합체로부터 표적산물을 분리하는 단계는 상기 복합체를 포함하는 배양물 또는 상등액을 상기 복합체를 표적산물과 표적산물 결합 단백질로 해리하기에 적합한 조건하에서 액체 매질 중에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 상기 조건은 선택되는 표적산물과 표적산물 결합 단백질에 따라 적절히 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 표적산물은 스쿠알렌 또는 베타-카로틴과 같은 테르페이노이드 화합물이고, 상기 분리하는 단계는 상기 복합체를 소수성 용매, 예를 들면, 오일성 화합물 중에 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 상기 용매는 알칸 예를 들면, C1 내지 C60, C6 내지 C60, 또는 C3 내지 C30의 알칸일 수 있다. 상기 용매는 헥산, 헵탄, 데칸, 도데칸, 또는 헥사데칸일 수 있다. 상기 분리하는 단계는 상기 배양과 동시에 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 표적산물은 2,3-oxidosqualene, myrcene, (z)-ocimene, linalool, geraniol, nerol, limonene, menthol, α-pinene, camphor, carvacrol, carvone, β-farnesene, nerolidol, β-bisabolene, valencene, amorphadiene, capsidiol, α-cedrane, artemisinin, phytane, phytol, camphorene, retinol, labdane, clerodane, pimarane, abietane, tigliane, kaurane, taxane, squalene, lanosterol, α-amyrin, β-amyrin, hopane, oleanolic acid, lycopene, rubixanthin, β-carotene, lutein, zeaxanthin, 및 astaxanthin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물일 수 있다. 상기 표적산물 결합 단백질은 SPF, Sec14, TTP, 알파-토코페롤 전달 단백질, 세포성 레티날 결합 단백질, 오징어 레티날 결합 단백질, 또는 표적산물 결합능을 갖는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 효모 세포, 예를 들면, Saccharomyces 속인 것일 수 있다. Saccharomyces 속 미생물은 S. cerevisiae 일 수 있다.
일 양상에 따른 재조합 미생물은 표적산물을 효율적으로 생산하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 표적산물을 생산하는데 사용하기 위한 조성물은 표적산물을 효율적으로 생산하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 표적산물을 생산하는 방법에 의하면, 표적산물을 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 Suc2-tSPF 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포에서 스쿠알렌을 분비하는 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2a는 분비 신호서열에 융합된 tSPF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포에 의하여 생산된 세포외 스쿠알렌 농도를 나타낸 도면이다.
도 2b는 분비 신호서열에 융합된 tSPF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포에 의하여 생산된 세포내 스쿠알렌 농도를 나타낸 도면이다.
도 3은 Suc2-tSPF, Pho5-tSPF 및 MFα-tSPF 융합 단백질 유전자로 각각 형질전환된 SQ 균주에 의하여 세포외 분비된 스쿠알렌을 HPLC 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 Suc2-tSPF, Pho5-tSPF 및 MFα-tSPF 융합 단백질 유전자로 각각 형질전환된 SQ 균주를 배양하고 세포 파쇄물 및 배양 상등액에 대하여 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 p415-BC 벡터와 pSEC-tSPF 또는 pSEC-Suc2-tSPF로 공동 형질전환된 CEN.PK2-1D 효모 세포를 배양하고, 생산된 베타 카로틴의 양을 나타낸 것이다.
도 6은 Suc2-tSPF 융합 단백질 유전자로 형질전환된 효모 세포에 의하여 생산되어 세포외로 분비된 베타 카로틴을 HPLC 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1. 스쿠알렌 분비능이 증가된 효모 세포 및 그를 이용한 스쿠알렌 생산
본 실시예에서는 효모 세포에 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 도입하여 재조합 효모 세포를 만들고, 제조된 재조합 효모 세포를 이용하여 표적산물을 생산하고, 그 분비능을 확인하였다. 효모 세포는 Saccharomyces cerevisiae를 사용하였고, 분비 신호서열은 Suc2, Pho5, 및 MFα 분비 신호서열을 각각 사용하였다. 또한, 표적산물은 스쿠알렌을 사용하였고, 표적산물 결합 단백질은 SPF의 절단된 단편인 tSPF를 사용하였다. tSPF는 상등액 단백질 인자(supernatant protein factor, SPF)의 리피드 결합능을 갖는 N 말단 도메인에 해당하는 스쿠알렌-결합 단백질이다. tSPF는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 SPF에서 1번 내지 275번 아미노산 서열에 해당한다.
(1.1) 스쿠알렌 생합성 경로가 강화된 효모 세포 제작
효모 세포는 Saccharomyces cerevisiae로서, 야생형 균주인 CEN.PK2-1D [(MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3△ 1; MAL2-8; SUC2)(EUROSCARF 접근번호: 30000B)를 사용하였다. 상기 균주는 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라제(phosphoribosylanthranilate isomerase, trp1), 3-이소프로필말레이트 데히드로게나제(3-isopropylmalate dehydrogenase, leu2) 및 이미다졸글리세롤-포스페이트 데히드라타제(imidazoleglycerol-phosphate dehydratase, his3)를 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있다. trp1, leu2, 및 his3은 서열번호 13, 14, 및 15의 아미노산 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. trp1, leu2, 및 his3 유전자는 서열번호 19, 20, 및 21의 뉴클레오티드 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. 스쿠알렌은 테르페이노이드로서 효모 세포에서는 메발론산 생합성 경로를 통하여 합성된다. 스쿠알렌 생산능을 증가시키기 위하여 하기 유전적 변형을 도입하였다.
먼저, 상기 균주의 결실된 trp1, leu2 및 his3 유전자 위치에 S. cerevisiae 유래 HMG-CoA 레덕타제(β-Hydroxy β-methylglutaryl-CoA reductase)를 코딩하는 tHMG1 유전자 및 S. cerevisiae 유래 파르네실 피로포스페이트 신테타제(farnesyl pyrophosphate synthetase, ERG20)를 코딩하는 유전자를 도입하였다. tHMG1 및 ERG20은 서열번호 11 및 12의 아미노산 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. tHMG1 및 ERG20 유전자는 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. HMG-CoA 레덕타제는 HMG-CoA를 메발로네이트로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. ERG20은 GPP를 FPP로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. HMG-CoA와 FPP는 모두 스쿠알렌 합성의 전구체이다.
또한, 상기 균주의 게놈에서 ypl062w를 코딩하는 유전자를 결손시키는 동시에 ypl062w 자리에 상기 tHMG1 유전자를 도입하였다. ypl062w 유전자 결손에 의하여 메발로산 생합성 경로의 초기 기질인 아세틸-CoA 수준이 증가될 수 있다. ypl062w은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. ypl062w 유전자는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
그 결과, 재조합 S. cerevisiae 균주 SQ를 얻었다. SQ 균주를 제작하는 보다 상세한 과정은 한국등록특허공보 제10-2176555호에 개시되어 있으며, 그 내용은 원용에 의하여 본 명세서에 포함된다.
(1.2) 분비 신호서열에 융합된 스쿠알렌 결합 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 효모 세포 제작
분비 신호서열은 3 종의 다른 신호 펩티드를 사용하였고, 스쿠알렌 결합 단백질은 tSPF를 사용하였다. 구체적으로, 3 종의 다른 신호 펩티드 즉 Suc2, Pho5, 및 MFα 신호 펩티드를 각각 tSPF의 N-말단에 융합한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 얻었다. 상기 융합 단백질은 C 말단에서 6xHis 태그 서열을 포함한다.
Suc2, Pho5, 및 MFα 신호 펩티드는 서열번호 5, 6 및 7의 아미노산 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. Suc2, Pho5, 및 MFα 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열번호 8, 9, 및 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. Suc2, Pho5, 및 MFα 신호 펩티드는 각각 수크로스 수송 단백질(Suc2), 산 포스파타제(acid phosphatase, Pho5) 및 효모 α-메이팅 인자(α-mating factor, MFα)를 세포외로 분비하는 N 말단 신호 펩티드 기능을 갖는 아미노산 서열이다. tSPF는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. tSPF는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 그 결과, 얻어진 Suc2-tSPF, Pho5-tSPF, 및 MFα-tSPF 융합 단백질은 서열번호 23, 24 및 25의 아미노산 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. Suc2-tSPF, Pho5-tSPF, 및 MFα-tSPF 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 서열번호 26, 27, 및 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
다음으로, 상기 폴리뉴클레오티드를 p426-TEF1(서열번호 29) 벡터의 SpeI/XhoI 제한효소 부위에 도입하여 발현 벡터 pSEC-Suc2-tSPF, pSEC-Pho5-tSPF 및 pSEC-MFα-tSPF를 얻었다. 대조군으로서, 분비 신호서열이 없는 tSPF 유전자가 p426-TEF1에 도입된 pSEC-tSPF 벡터, 및 빈 p426-TEF1 벡터를 사용하였다. p426-TEF1은 TEF1 프로모터가 포함된 고 카피수 플라스미드(high copy number plasmid)이다. 상기 융합 단백질은 TEF1 프로모터에 의하여 작동가능하게 연결되어 있으며, 그에 의하여 전사개시될 수 있다.
상기 발현 벡터를 상기 SQ 균주에 열충격(heat shock) 형질전환 방법에 의하여 도입하여 3종 융합 단백질 유전자로 각각 형질전환된 SQ 균주를 얻었다. 상기 발현 벡터는 SQ 균주의 게놈과 독립적으로 밖에 존재한다.
(1.3) 재조합 효모 세포에 의한 스쿠알렌 생산 및 분비능의 확인
pSEC-Suc2-tSPF, pSEC-Pho5-tSPF 및 pSEC-MFα-tSPF로 형질전환 SQ 균주를 2%(w/v) 글루코스 및 10%(v/v) 도데칸이 보충된 최소 배지(YSC medium; 0.67% (w/v) yeast nitrogen base without amino acids (BD Difco, USA), 0.19% (w/v) yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil (Sigma-Aldrich, USA)) 50 mL를 포함하는 250 L 플라스크 내에서 250 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 배양하였다.
배양 72 시간 및 144 시간 후 배양물을 4,000 rpm으로 원심분리하여 세포, 배양 상등액 및 도데칸층으로 분리하였다. 분리된 세포 및 도데칸층 중의 스쿠알렌 농도를 측정하였다. 세포내 스쿠알렌 농도 측정을 위하여, 상기 세포를 메탄올과 아세톤의 1:1 혼합액 600 μL에 재현탁하여 lysing matrix C(glass bead, MP Biomedicals, USA)가 포함된 튜브에 옮겨 담고 FastPrep-24 5G homogenizer (MP Biomedicals, USA)를 이용하여 세포를 파쇄하고 13,000 rpm으로 원심분리하여 파쇄된 세포와 파쇄된 세포에서 용해되어 나온 스쿠알렌을 포함한 세포내 대사산물을 분리하였다.
다음으로, 세포 파쇄물에 대하여 스쿠알렌 농도를 측정하였다. 세포 파쇄물 내 스쿠알렌 농도 측정을 위해 0.2 μm 시린지 필터(syringe filter)로 여과한 후 Agilent HPLC system을 이용하여 농도를 측정하였다.
또한, 원심분리를 통해 층 분리된 도데칸층도 동일하게 여과한 후 HPLC 시스템을 이용하여 스쿠알렌 농도를 측정하였다. 표 1은 분비 신호서열에 융합된 tSPF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포에 의하여 생산된 세포내 및 세포외 스쿠알렌 농도를 나타낸다. 도 2a 및 도 2b는 분비 신호서열에 융합된 tSPF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포에 의하여 생산된 세포외 및 세포내 스쿠알렌 농도를 각각 나타낸다.
세포 72 시간 144 시간
세포성장
(OD600)		 세포내
(mg/L)		 세포내
(mg/g)		 세포외
(mg/L)		 세포성장
(OD600)		 세포내
(mg/L)		 세포내
(mg/g)		 세포외
(mg/L)
빈 벡터 20.23 574.98 69.32 3.99 23.92 648.03 66.07 8.73
tSPF 17.79 401.51 55.05 3.67 19.91 485.04 59.43 13.82
Suc2-tSPF 12.98 476.9 89.61 166.62 13.87 557.03 97.93 226.51
Pho5-tSPF 11.9 252.17 51.68 64.55 14.38 426.85 72.39 190.09
MFα-tSPF 11.44 210.52 44.88 4.21 17.16 551.64 78.42 43.25
표 1 및 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, Suc2-tSPF, Pho5-tSPF 및 MFα-tSPF 융합 단백질 유전자로 각각 형질전환된 SQ 균주는 세포외 스쿠알렌의 양 또는 세포외 분비 비율이 대조군 세포에 비하여 현저하게 증가하였다. 도 3은 Suc2-tSPF, Pho5-tSPF 및 MFα-tSPF 융합 단백질 유전자로 각각 형질전환된 SQ 균주에 의하여 생산되어 세포외로 분비된 스쿠알렌을 HPLC 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3의 결과는 표 1에서 세포외 분비된 스쿠알렌 데이터에 해당한다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 스쿠알렌 표준을 나타내는 피크와 동일한 체류 시간(retention time)에서 Suc2-tSPF, Pho5-tSPF 및 MFα-tSPF 융합 단백질에 의해 세포외로 분비된 스쿠알렌만의 뚜렷한 피크를 관찰할 수 있었다. 이는 이들 세포에서 스쿠알렌 특이적으로 세포외로 분비된다는 것을 나타낸다. 도 3에서, "dodecane" 및 "dodecane+100 ppm squalene"은 대조군으로서, 도데칸 단독, 및 도데칸 및 100ppm 스쿠알렌 표준을 혼합하여 얻어진 시료를 HPLC 분석한 것이다.
도 4는 Suc2-tSPF, Pho5-tSPF 및 MFα-tSPF 융합 단백질 유전자로 각각 형질전환된 SQ 균주를 배양하고 얻어진 세포 파쇄물 및 배양 상등액에 대하여 웨스턴 블롯 분석한 결과를 나타낸 도면이다. tSPF 융합 단백질의 세포외 분비를 확인하기 위하여, 효모 세포를 2일간 2%(w/v) 글루코스가 포함된 50 ㎖ 최소 배지(YSC medium; 0.67% (w/v) yeast nitrogen base without amino acids (BD Difco, USA), 0.19% (w/v) yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil (Sigma-Aldrich, USA))를 포함하는 250 mL 플라스크 내에서 30℃에서 교반하면서 배양하였다. 이때 상기 최소 배지는 도데칸 층을 포함하지 않았다. OD600 값이 100에 해당하는 양의 배양된 효모 세포에서 세포내 단백질을 추출하기 위해 단백질 분해효소 억제제(1xprotease inhibitor cocktail, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)가 포함된 1 ㎖의 세포 파쇄 버퍼(1 mL RIPA buffer, Thermo Scientific, MA, USA)에 재부유시켰다. 현탁액을 초음파 분쇄기를 이용하여 20% 진폭, 3초 간격으로 6분 동안 균질화하였다. 배양액의 상층액에 있는 세포외 단백질은 50ml 상층액에 트리클로로아세트산 용액이 25%가 되도록 첨가하고 30분 동안 인큐베이션하여 단백질을 침전시킨 뒤 4℃에서 40분 동안 원심분리하였다. 침전된 단백질을 차가운 아세톤 1 ㎖로 3회 세척하고 50 ㎕의 멸균수에 재현탁하였다. 재현탁된 단백질은 30kDa 아미콘 초원심 필터(amicon ultra centrifugal filters)를 사용하여 추가적으로 농축되었다.
준비된 단백질 샘플 즉, 세포 파쇄물은 5x SDS 샘플 버퍼와 혼합하여 10% SDS-PAGE에 의하여 분리하였다. SDS-PAGE 젤에서 분리된 단백질을 PVDF 막으로 옮긴 다음 4% 탈지유(skim milk) 함유 TBST 중에서 하루 동안 인큐베이션하여 차단시켰다. PVDF 막을 1차 항체가 포함된 용액에 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 TBST 용액으로 3회 세척해주었다. 1차 항체는 항-액틴 항체 또는 항-His 태그 항체를 사용하였다. 상기 융합 단백질은 C 말단에 6xHis 태그 서열을 포함한다. 세척된 PVDF 막을 다시 퍼옥시다제(peroxidase)가 결합된 항-IgG 항체가 포함된 용액에 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 항체가 결합된 단백질이 존재하는 PVDF 막을 ChemiDoc 이미징 시스템을 이용해서 시각화하였다.
웨스턴 블롯 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 세포 파쇄물의 경우 Suc2-tSPF 및 Pho5-tSPF의 밴드는 거의 나타나지 않는 것으로 보아 분비 신호서열에 융합된 tSPF는 세포내에 머무르지 않고 세포외부로 이동하였다. 또한 분비 신호서열에 융합되지 않은 tSPF는 세포 파쇄물에서 선명한 밴드가 나타난 것을 볼 때, 분비 신호서열이 융합되지 않은 경우 세포외부로 이동되지 않았다. 배양 상등액의 경우 분비 신호서열에 융합되지 않은 tSPF는 밴드가 나타나지 않았다. 이는 분비 신호서열에 융합되지 않은 tSPF는 세포외부로 이동하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 2. 베타-카로틴 분비능이 증가된 효모 세포 및 그를 이용한 베타-카로틴 생산
(2.1) 베타-카로틴 생합성 경로가 강화된 효모 세포 제작
실시예1의 1.1절에 기재된 CEN.PK2-1D 효모 균주에 베타 카로틴 생합성 유전자를 포함하는 벡터를 도입하여 베타 카로틴 생산능이 증가된 효모 세포를 제작하였다.
구체적으로, 베타 카로틴 생합성 경로의 crtE, crtYB, crtI 및 tHMG1의 발현 카세트를 포함하는 pMM494 벡터(Addgene 사, Plasmid #100539)로부터 crtE, crtYB, crtI 및 tHMG1 유전자를 증폭하고, 이를 p415-GPD 벡터(서열번호 30)의 제한효소 BamHI 및 SalI 자리에 도입하여 crtE, crtYB, crtI 및 tHMG1에 대한 발현 카세트를 포함하는 p415-BC 벡터를 제작하였다. p415-GPD 벡터(ATCC 87358)는 GPD1 프로모터를 포함하는 저 카피수 발현 벡터이다. crtE, crtYB, 및 crt는 서열번호 31, 32 및 33의 아미노산 서열을 각각 갖는다. crtE, crtYB, 및 crt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 34, 35 및 36의 뉴클레오티드 서열을 각각 갖는다. crtE, crtYB, 및 crtI 단백질은 Xanthophyllomyces dendrohous 유래의 단백질로서 다음 활성을 갖는다. crtE는 파르네실 디포스페이트를 제라닐제라닐 디포스페이트로 전환하는 반응을 촉매하는 제라닐제라닐 디포스페이트를 코딩하는 유전자이다. crtYB는 제라닐제라닐 디포스페이트를 피토엔(phytoene)으로 전환하는 반응을 촉매하는 피토엔 신타제를 코딩하는 crtB와 라이코펜을 베타 카로틴으로 전환하는 반응을 촉매하는 라이코펜 베타-사이클라제를 코딩하는 유전자 crtY를 포함한다. crtI는 피토엔을 라이코펜으로 전환하는 피토엔 데사투라제(phytoene desaturase)를 코딩하는 유전자이다.
(2.2) 분비 신호서열에 융합된 스쿠알렌 결합 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 효모 세포 제작
실시예1의 (1.2)절에서 기재된 바와 동일한 과정을 거쳐 S. cerevisiae 야생균주 CEN.PK2-1D에 (1.2)절에서 제작된 p415-BC 벡터와 pSEC-tSPF 또는 pSEC-Suc2-tSPF를 공동 형질전환(cotransformation)하여 신호 펩티드에 융합된 tSPF를 발현하는 벡터로 형질전환 효모 세포를 제작하였다.
(2.3) 재조합 효모 세포에 의한 베타 카로틴 생산 및 분비능의 확인
(2.2)절에서 얻어진 p415-BC 벡터와 pSEC-tSPF 또는 pSEC-Suc2-tSPF로 공동 형질전환되어 베타 카로틴을 과생산할 수 있는 CEN.PK2-1D 효모 세포를 실시예1의 (1.3)절에서 기재된 바와 동일한 조건에서 144 시간 동안 배양하고, 생산된 세포내 및 세포외 베타 카로틴의 양을 측정하였다. 베타 카로틴 양은 상기 스쿠알렌 농도 측정을 위해 사용한 세포 파쇄 및 도데칸층 분리 방법과 동일한 방법으로 측정하였다. 표 2 및 도 6은 p415-BC 벡터와 pSEC-tSPF 또는 pSEC-Suc2-tSPF로 공동 형질전환된 CEN.PK2-1D 효모 세포를 배양하고, 생산된 베타 카로틴의 양을 나타낸 것이다.
세포 144 시간
세포성장
(OD600)		 세포내
(mg/L)		 세포내
(mg/g)		 세포외
(mg/L)
빈 벡터 22.58 9.52 0.84 0.06
tSPF 20.36 7.04 0.69 0.23
Suc2-tSPF 18.66 7.65 0.82 1.4
표 2 및 도 6에 나타낸 바와 같이, Suc2-tSPF 융합 단백질 유전자로 형질전환된 효모 세포는 세포외 베타 카로틴의 양 또는 세포외 분비 비율이 대조군 세포에 비하여 현저하게 증가하였다. 구체적으로, 베타 카로틴 세포외 분비는 빈 벡터를 포함한 대조군에 비해서 약 23배 증가하였다.도 6은 Suc2-tSPF 융합 단백질 유전자로 형질전환된 효모 세포에 의하여 생산되어 세포외로 분비된 베타 카로틴을 HPLC 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 6의 결과는 표 2에서 세포외 분비된 베타 카로틴, 즉 도데칸 층에 분비된 베타 카로틴 데이터에 해당한다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 베타 카로틴 표준과 동일한 체류 시간에서 Suc2-tSPF 융합 단백질에 의해 세포외로 분비된 베타 카로틴피크를 관찰할 수 있었다. 이는 이들 세포에서 베타 카로틴이 특이적으로 세포외로 분비된다는 것을 나타낸다. 도 6에서, "도데칸 + 1ppm 베타 카로틴" 및 "도데칸 + 1ppm 라이코펜"은 대조군으로서, 도데칸에 1 ppm 베타 카로틴을 포함하는 표준 혼합물 및 도데칸에 1 ppm 라이코펜을 포함하는 표준 혼합물을 각각 나타낸다.
실시예 3. 다양한 테르페노이드계 물질에의 확대 가능성 예측 평가
tSPF의 리간드 결합 부위를 확인하기 위하여, tSPF (PDB ID: 4OMK)의 3차원 결정학 구조를 RCSB 단백질 데이터 뱅크에서 획득하였다. 분자의 도킹 분석에는 시뮬레이션 전에 결정 구조에서 결합된 스쿠알렌과 물 분자가 제거된 4ONK의 A체인이 사용되었다. 결정학 구조에서 단단한 단백질 구조를 구성하기 위해 각 아미노산에 대해 하나의 가능한 구조를 의도적으로 선택하였고, A 사슬의 스쿠알렌 결합 활성 부위는 Computer Atlas of Surface Topology of protein (CASTp)를 사용하여 결정하였다. 스쿠알렌 결합에 필요한 확인된 잔기는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로, L84, I103, L106, A108, L111, L112, L120, L121, K124, I151, Y153, C155, L158, H162, A167, V168, A170, Y171, F174, L175, L186, L189, F198, A201, Y202, I205, L209, T213, 및 I217이다. 따라서, 스쿠알렌 결합 부위를 상기 잔기들을 포함하는 것으로 여겨진다.
리간드 선택을 위해 PubChem 화합물 데이터베이스에서 sdf 형식으로 다음과 같은 43개의 테르페노이드를 선택하였다. 2,3-oxidosqualene, myrcene, (z)-ocimene, linalool, geraniol, nerol, limonene, menthol, α-pinene, camphor, carvacrol, carvone, β-farnesene, nerolidol, β-bisabolene, valencene, amorphadiene, capsidiol, α-cedrane, artemisinin, phytane, phytol, camphorene, retinol, labdane, clerodane, pimarane, abietane, tigliane, kaurane, taxane, squalene, lanosterol, α-amyrin, β-amyrin, hopane, oleanolic acid, lycopene, rubixanthin, β-carotene, lutein, zeaxanthin, 및 astaxanthin.
또한, 대조군 분자로서 글루타메이트와 피루베이트를 선택하였다. 다운로드된 sdf 파일은 PyRx 가상 도구의 OpenBabel 도구 상자에 의해 pdbqt 형식으로 변환되었다. 위와 같은 정보를 이용하여 AutoDock Vina로 분자 도킹하여 tSPF 및 다양한 테르페노이드계 물질 사이의 결합 에너지를 분석하였다. 그 결과는 표 3, 4, 5, 및 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2021008714-appb-T000001
Figure PCTKR2021008714-appb-T000002
Figure PCTKR2021008714-appb-T000003
Figure PCTKR2021008714-appb-T000004
표 3, 4, 5, 및 6에 나타낸 바와 같이, tSPF와 43개 테르페노이드계 화합물 사이의 각 결합 에너지 차이는 -10.7 kcal/mol 내지 -6.1 kcal/mol의 범위로서 스쿠알렌 및 베타 카로틴의 결합 에너지인 -10.5 kcal/mol 및 -7.7 kcal/mol와 각각 비교하여도 큰 차이가 나지 않았다. 이는 상기한 분비 신호서열에 융합된 tSPF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물은 다양한 테르페노이드계 화합물에 확대 적용될 수 있다는 것을 나타낸다.

Claims (20)

  1. 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질 분비능을 갖는 것인 재조합 미생물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 표적산물 결합 단백질은 리피드 결합 단백질인 것인 재조합 미생물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 리피드 결합 단백질은 SPF, Sec14, TTP, 알파-토코페롤 전달 단백질, 세포성 레티날 결합 단백질, 오징어 레티날 결합 단백질, 또는 표적산물 결합능을 갖는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 표적산물 생산능이 증가된 것인 재조합 미생물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 표적산물은 대사산물인 것인 재조합 미생물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 리피드는 테르페노이드 화합물인 것인 재조합 미생물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 표적산물은 2,3-oxidosqualene, myrcene, (z)-ocimene, linalool, geraniol, nerol, limonene, menthol, α-pinene, camphor, carvacrol, carvone, β-farnesene, nerolidol, β-bisabolene, valencene, amorphadiene, capsidiol, α-cedrane, artemisinin, phytane, phytol, camphorene, retinol, labdane, clerodane, pimarane, abietane, tigliane, kaurane, taxane, squalene, lanosterol, α-amyrin, β-amyrin, hopane, oleanolic acid, lycopene, rubixanthin, β-carotene, lutein, zeaxanthin, 및 astaxanthin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 것인 재조합 미생물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 분비 신호서열은 Suc2, Pho5, 및 MFα로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 재조합 미생물.
  10. 청구항 1에 있어서, 표적산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 유전적 변형 또는 표적산물을 생산하는 대사 경로를 강화시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 재조합 미생물.
  11. 청구항 1에 있어서, 효모 세포인 것인 재조합 미생물.
  12. 청구항 12에 있어서, Saccharomyces 속인 것인 재조합 미생물.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 표적산물은 2,3-oxidosqualene, myrcene, (z)-ocimene, linalool, geraniol, nerol, limonene, menthol, α-pinene, camphor, carvacrol, carvone, β-farnesene, nerolidol, β-bisabolene, valencene, amorphadiene, capsidiol, α-cedrane, artemisinin, phytane, phytol, camphorene, retinol, labdane, clerodane, pimarane, abietane, tigliane, kaurane, taxane, squalene, lanosterol, α-amyrin, β-amyrin, hopane, oleanolic acid, lycopene, rubixanthin, β-carotene, lutein, zeaxanthin, 및 astaxanthin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이고,
    상기 표적산물 결합 단백질은 SPF, Sec14, TTP, 알파-토코페롤 전달 단백질, 세포성 레티날 결합 단백질, 오징어 레티날 결합 단백질, 또는 표적산물 결합능을 갖는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고,
    효모 세포인 것인 재조합 미생물.
  14. 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물 및 담체를 포함하는 표적산물을 생산하는데 사용하기 위한 조성물.
  15. 분비 신호서열에 융합된 표적산물 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물을 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 표적산물을 생산하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 배양하는 단계는 배지 또는 물에 대한 표적산물의 용해도에 비하여 표적산물의 용해도가 높은 화합물을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 표적산물을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 표적산물을 분리하는 단계는 배양물로부터 상등액을 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 상등액으로부터 상기 표적산물을 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 16에 있어서, 배지 또는 물에 대한 표적산물의 용해도에 비하여 표적산물의 용해도가 높은 화합물층으로부터 표적산물을 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 표적산물은 2,3-oxidosqualene, myrcene, (z)-ocimene, linalool, geraniol, nerol, limonene, menthol, α-pinene, camphor, carvacrol, carvone, β-farnesene, nerolidol, β-bisabolene, valencene, amorphadiene, capsidiol, α-cedrane, artemisinin, phytane, phytol, camphorene, retinol, labdane, clerodane, pimarane, abietane, tigliane, kaurane, taxane, squalene, lanosterol, α-amyrin, β-amyrin, hopane, oleanolic acid, lycopene, rubixanthin, β-carotene, lutein, zeaxanthin, 및 astaxanthin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이고,
    상기 표적산물 결합 단백질은 SPF, Sec14, TTP, 알파-토코페롤 전달 단백질, 세포성 레티날 결합 단백질, 오징어 레티날 결합 단백질, 또는 표적산물 결합능을 갖는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고,
    상기 재조합 미생물인 효모 세포인 것인 방법.
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