WO2011053079A2 - 효모 변이주 및 이를 이용한 스쿠알렌의 생산 방법 - Google Patents

효모 변이주 및 이를 이용한 스쿠알렌의 생산 방법 Download PDF

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황제익
류희경
김선원
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)

Definitions

  • the present invention relates to a yeast mutant prepared by introducing a vector expressing HMG-CoA reductase (hydroxymethylglutaryl CoA reductase) and farnesyl pyrophosphate synthase and a method for producing squalene using the mutant strain.
  • the present invention relates to a method for producing high efficiency of squalene by culturing the Y2805 yeast mutant and the mutant strain in Saccharomyces cerevisiae transformed with a vector containing the HMG1 gene and the ispA or Erg20 gene.
  • Squalene (2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene, squalene) has six double bonds, as shown in the chemical structure of FIG.
  • Dehydrotriterpenic hydrocarbon of C 30 H 50 is a kind of terpenoid compound which is composed of various compound groups and is a precursor of all steroids of plants and animals.
  • Squalene has been shown to have an effective inhibitory effect on chemically induced skin cancer, lung cancer, and colorectal cancer in rats (Aioi A et al. , Int. J. Pharm . 113, 159-164 (1995)). It is known to activate immune function, affect cholesterol absorption, and reduce LDL (low-density lipoprotein) and triglyceride. Squalene is the main constituent of polyunsaturated fats on the surface of the skin and is used as an ingredient in cosmetics because it has the effect of antioxidant moisturizing. It has also recently been approved for drug delivery and especially as a vaccine adjuvant (Tritto E. et al., Vaccine 27, 3331-3334 (2009)).
  • the main commercial sources of squalene are oil from deep sea shark liver oil and plant seeds.
  • the supply of deep-sea shark liver oil is opaque due to heavy metal contamination and concern for international marine environmental protection, and oil from plant seeds (eg olive oil 7 mg / g, amaranthhus oil 0-5.64). mg / g) is also opaque due to seasonal changes and regional deviations.
  • Yeast Saccharomyces cerevisiae strain is widely used as a host cell of such metabolic engineering technology, and this yeast normally accumulates about 1% of ergosterol per cell building, depending on the strain or culture conditions. It is known to accumulate excess of up to 4.6% (Arnezeder C. et al . , Biotechnol. Lett . 12, 277-282 (1990)), which is suitable for the production of squalene, an intermediate of the ergosterol biosynthesis pathway. have. However, as described above, squalene is an intermediate of ergosterol biosynthesis, and it is known that a slight amount accumulates under normal growth conditions.
  • Saccharomyces cerevisiae and torulaspora delbruecki yeast squalene productivity was only 41.16 and 237.25 ⁇ g per gram of wet cells, respectively (Bhattacharjee P. et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 17, 811-816 (2001)), and another recent study found that Saccharomyces cerevisiae strains (BY4741 and EGY48 strains) were about 3 mg / l and 3.1 mg / l under semianaerobic conditions, respectively. Low productivity of L (Mantzouridou F. et al ., J. Agric. Food Chem . 57, 6189-6198 (2009).
  • Ergosterol and squalene belong to a compound of isoprenoid or terpenoid family.
  • the isoprenoid biosynthetic pathway is divided into two pathways, the mevalonate pathway and the non-mevalonate pathway. It is known to follow the nate route. Therefore, the yeast Saccharomyces cerevisiae strain is also a eukaryotic cell and follows the mevalonate pathway and looks at the ergosterol biosynthesis pathway as shown in FIG. 2.
  • the mevalonate biosynthesis pathway is known to be the most important rate-limiting step in the hydroxymethylglutaryl CoA reductase (HMG) step that produces mevalonate, and the step is under various regulatory mechanisms. Metabolic flow increases. Therefore, the overexpression of HMG enzyme gene for overproduction of various isoprenoids (farnesol, geranylgeraniol, amorphadiene, etc.) in Saccharomyces cerevisiae strain Many attempts have been made (WO2008039499; US Patent Application No. 20040235088; US Patent Application No. 20030092144; Tokuhiro K. et al. , Appl. Environ.Microbiol. 75, 5536-5543 (2009); Ohto C.
  • HMG hydroxymethylglutaryl CoA reductase
  • the HMG1 gene was overexpressed in the YPH499 strain in Saccharomyces cerevisiae using the GAPDH promoter. It has been reported that squalene productivity of / l (2.3-4.1 mg / g DCW) can be obtained.
  • ispA Phanelsil pyrophosphate synta derived from E. coli
  • ispA is known to enhance the productivity of prenyl alcohol in Escherichia coli by about 5-6 fold (Ohto C. et al. , Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 186-188 (2009)) .
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a yeast mutant strain for the high efficiency of squalene synthesis.
  • the promoter for the expression of the HMG1 gene is used in the product of the isoprenoid biosynthetic pathway by using a GAL10 promoter or an ADH1 promoter instead of its own promoter.
  • panesyl pyrophosphate synthase genes such as ispA and Erg20 together with the HMG1 gene
  • the present inventors have devised a method for overexpressing YPH499, which is known as a high squalene strain.
  • the present invention has been completed by developing the Y2805 mutant strain at several times to several orders of magnitude higher Saccharomyces cerevisiae.
  • One object of the present invention is to provide a yeast mutant prepared by introducing a vector expressing HMG-CoA reductase and faresyl pyrophosphate synthase.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing squalene by culturing the yeast mutant strain.
  • the present invention relates to a yeast mutant prepared by introducing a vector expressing HMG-CoA reductase (hydroxymethylglutaryl CoA reductase) and farnesyl pyrophosphate synthase (farnesyl pyrophosphate synthase) will be.
  • the yeast mutant is transformed into a vector expressing HMG-CoA reductase and hydroxymethylglutaryl CoA reductase and farnesyl pyrophosphate synthase to overexpress the genes, thereby accumulating squalene in the yeast in excess. do.
  • HMG-CoA reductase is an enzyme involved in metabolic pathways that produce cholesterol and other isoprenoids, and is known as an enzyme that determines important rate steps, particularly in the mevalonate pathway. .
  • the enzyme is an anchored protein embedded in the endoplasmic reticulum (ER) membrane and is known to have seven transmembrane domains.
  • a gene capable of expressing the activity of HMG-CoA reductase in yeast can be used without limitation, and preferably, the gene encoding the HMG-CoA reductase is an HMG1 gene.
  • the gene encoding the HMG-CoA reductase is an HMG1 gene.
  • the transmembrane domain and the catalytic region may be classified according to the function of the region encoded by the gene.
  • a gene full length, part or fragment including the expression of the catalytic region may be used without limitation.
  • the HMG1 gene of the present invention is a gene modified to express only a catalytic region without a transmembrane domain, and the modification may further increase the content of squalene by inhibiting feedback regulation by the ergosterol biosynthetic intermediate.
  • panesyl pyrophosphate synthase is an enzyme that catalyzes the synthesis of panesyl pyrophosphate from isopentenyl pyrophosphate and dimethylallyl pyrophosphate.
  • Panesyl pyrophosphate synthase is an important enzyme that provides C15 precursors to structurally important metabolites, particularly in the process of ergosterol biosynthesis, and is an enzyme that produces panesyl pyrophosphate, a preliminary step in squalene biosynthesis.
  • the farnesyl pyrophosphate synthase enzyme can be used without limitation so long as it is a gene capable of expressing the enzyme activity in yeast, for example, there is an ispA gene or Erg20 gene, but can be used in the present invention by the above examples Examples of phosphate synthase genes are not limited.
  • the ispA gene or Erg20 gene is not limited in its origin as long as it can have inherent activity in yeast.
  • the ispA gene may be from E. coli, and the Erg20 gene may be from Saccharomyces cerevisiae.
  • the term "ergosterol biosynthetic pathway” or “isoprenoid biosynthetic pathway” can be used interchangeably, said biosynthetic pathway producing squalene as an intermediate product, and the yeast variant of the present invention is HMG-CoA on the biosynthetic pathway By simultaneously overexpressing reductase and farnesyl pyrophosphate synthase, it is possible to produce squalene with high efficiency.
  • the term "squalene” belongs to a compound of a type of isoprenoid or terpenoid, and is C 30 H 50 having a structure of Formula 1 as a polyunsaturated fat having six double bonds.
  • vector refers to a gene construct, which is an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and which contains essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • Operative linkage with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation uses enzymes commonly known in the art and the like.
  • Vectors of the present invention include signal or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, enhancers, and can be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the expression vector includes a selectable marker for selecting a host cell containing the vector and, in the case of a replicable expression vector, a replication origin. Vectors can self replicate or integrate into host DNA.
  • Vectors include plasmid vectors, cosmid vectors, viral vectors, and the like, and any vector known in the art capable of expressing a gene of interest in yeast host cells can be used without limitation.
  • operably linked in the present invention means that when one nucleic acid fragment is combined with another nucleic acid fragment, its function or expression is affected by the other nucleic acid fragment, but each of the various possible combinations of these nucleic acid fragments It refers to a combination of states in which fragments have no detectable effect on their function. That is, the nucleic acid expression control sequence and the nucleic acid sequence encoding the protein of interest is functionally linked to perform a general function.
  • the expression cassette of the present invention may further comprise any transcription start regulatory sequence and transcription termination regulatory sequence for controlling transcription. Operable ligations can be made using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation can employ enzymes generally known in the art and the like.
  • introduction refers to the introduction of foreign DNA into the cell by transformation or transduction. Transformation was performed using the Hanahan method, electroporation, calcium phosphate precipitation method, plasma fusion method, and silicon carbide fiber, which improved efficiency by using reducing agent called DMSO (dimethyl sulfoxide) in CaCl 2 precipitation method and CaCl 2 method. It can be carried out by a variety of methods known in the art, such as agitation, Agro bacteria mediated transformation, transformation with PEG, dextran sulfate, lipofectamine and dry / inhibition mediated transformation. Transduction refers to the delivery of genes into cells using viral or viral vector particles by means of infection.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • an increase in the intracellular activity of the enzyme may be achieved, which may be achieved by overexpression of the gene.
  • Overexpression of the target gene can enhance protein expression by modifying the promoter region of the gene and the 5 'UTR region, and can enhance the expression by additionally introducing the target gene onto the chromosome.
  • the expression level of the protein can be enhanced by introducing into an autologous promoter or a separate enhanced promoter and transforming the strain. It can also be achieved by introducing mutations into the open reading frame (ORF) region of the gene of interest.
  • ORF open reading frame
  • Overexpression measurements indicate that the activity or concentration of the corresponding protein is generally at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150% based on activity or concentration in the wild-type protein or the initial microbial strain. , 200%, 300%, 400% or 500%, up to 1000% or 2000%.
  • a vector expressing the enzyme can be introduced to increase the intracellular activity of the enzyme.
  • the promoter operably linked with the gene encoding the HMG-CoA reductase enzyme and faresyl pyrophosphate synthase is such that a foreign promoter is introduced so that the activity of the HMG-CoA reductase enzyme is not inhibited.
  • the gene of the present invention may be used by operably linking a GAL10 promoter or an ADH1 promoter upstream thereof.
  • the vector expressing HMG-CoA reductase and farnesyl pyrophosphate synthase comprises an expression cassette operably linked to the GAL10 promoter and the HMG1 gene, and operably linked to the GAL10 promoter and the ispA gene.
  • FIG. 3 (pGal-ispA / HMG1, which is a vector having a cleavage map of FIG. 3 (e)), or an expression cassette operably linked to a GAL10 promoter and an HMG1 gene, and operably linked to a GAL10 promoter and an Erg20 gene.
  • pGal-Erg20 / HMG1 which is a vector having a cleavage map of i).
  • the mutant strain may introduce a vector expressing HMG-CoA reductase and faresyl pyrophosphate synthase to use yeast capable of producing squalene with high efficiency without limitation, for example, genus Saccharomyces , Preferably in Saccharomyces cerevisiae, more preferably in Saccharomyces cerevisiae.
  • the mutant strain is introduced into the Saccharomyces cerevisiae Y2805 by introducing the pGal-ispA / HMG1 vector (FIG. 3 (e)) into the Saccharomyces cerevisiae Y2805 / pGal-ispA / HMG1. Saccharomyces mutant strain, or pGal-Erg20 / HMG1 vector (FIG.
  • the mutant strain introduced pGAl-ispA / HMG1 produced 1.246 g / L of squalene
  • the mutant strain introduced pGal-Erg20 / HMG1 produced 0.886 g / L squalene.
  • This production amount was higher than the squalene production amount of 0.001 ⁇ 0.114 g / L of the strains in which other genes were introduced in addition to the vector (Table 4), which means that the HMG-CoA reductase and panesyl pyrophosphate synthase of the present invention This means that overexpressed yeast mutants can produce squalene at significantly higher levels.
  • the present invention relates to a method for producing squalene by culturing the mutant strain.
  • Yeast mutants overexpressing HMG-CoA reductase and panesyl pyrophosphate synthase can be cultured by various yeast culture methods known in the art, and as an example of the culture, initial culture using YNB medium After this, the present culture can be performed using YPGlu1% Gal1% medium, but the method of culturing yeast mutant strain is not limited. Accumulated squalene can also be obtained using conventional separation and extraction methods. In a preferred embodiment of the present invention, after crushing the cells, pentene is added to allow squalene to dissolve in the pentane layer. Was separated.
  • yeast mutant strain of the present invention When the yeast mutant strain of the present invention is used, it is possible to overcome various limitations of the current squalene source and to produce highly efficient squalene having various uses as a raw material of cosmetics or pharmaceuticals. In addition, the high price of squalene due to the lack of current sources and high production process costs can be expected.
  • 1 is a simplified illustration of the chemical structure of squalene.
  • FIG. 2 is a simplified illustration of the mevalonate biosynthetic pathway to yeast Saccharomyces cerbizi.
  • 3 is a simplified illustration of squalene biosynthetic vectors.
  • acetyl-CoA acetyltransferase / hydroxymethglutaryl (HMG) -CoA reductase activity derived from Enterococcus faecalis was synthesized to fit the yeast codon.
  • a gene (SEQ ID NO: 2) artificially synthesized by GenScript was used and was constructed to have restriction enzymes EcoR I and Sal I recognition sites at the 5'- and 3'- sites, respectively.
  • the gene was cut into EcoR I and Sal I and inserted into the expression vector YEG ⁇ -HIR525 cut with the same restriction enzyme.
  • the expression vector was a vector having a GAL10 promoter, and the target gene was cloned between the EcoR I site downstream of the promoter and the Sal I site upstream of the GAL7 terminator.
  • Amino-terminal transmembrane domain (597aa), known to cause degradation of enzyme proteins by regulatory mechanisms in hydroxymethylglutaryl CoA reductase, an enzyme that biosynthesizes mevalonate from HMG CoA HMG1 gene (SEQ ID NO: 1) derived from Saccharomyces cerevisiae having only a catalytic domain was used.
  • Geranyl pyrophosphate synthase (GPPS) gene was used GPPS (SEQ ID NO: 4) obtained from plant Abies grandis , and FPP (farnesyl pyrophosphate) synthase gene was ispA gene (SEQ ID NO: 3) obtained from Escherichia coli Erg20 gene (SEQ ID NO: 5) from Saccharomyces cerevisiae was used. These genes were inserted into the expression vector YEG ⁇ -HIR525 cut out with EcoR I and Sal I and digested with the same restriction enzyme, respectively, using PCR primers of each gene obtained using the primers of Table 1 below.
  • the ispA gene, Erg20 and GPPS genes were co-expressed with the HMG1 and MVAE genes, respectively.
  • the ADH1 promoter used the ADH1 promoter derived from Saccharomyces, and ScADH1-F (5'- GAGCT CTGTAGCCCTAGACTTGAT-3 ', SEQ ID NO: 14) and ScADH1-R (5'- GAATTC TGTATATGAGATAGTTGA-3', SEQ ID NO: 15)
  • a combination of primers (italic and bold mean restriction enzyme recognition sequences added) was amplified by PCR using genomic DNA of Y2805 strain in Saccharomyces cerevisiae as a template.
  • the nucleotide sequence was confirmed by subcloning the PCR reaction product into a pGEM-T easy vector, followed by digestion with Sac I and EcoR I restriction enzymes to remove the promoter-containing gene portion of the GAL10 promoter of the YEG ⁇ -HIR525 vector. Was used in place of.
  • Saccharomyces cerevisiae strains include Saccharomyces cerevisiae 2805 (Y2805) strains (Sohn JH et al., J Microbiol.
  • the strain which introduced the pGAl-ispA / HMG1 vector (FIG. 3 (e)) to Y2805 in Saccharomyces cerevisiae was named Y2805 / pGal-ispA / HMG1 in Saccharomyces cerevisiae, October 2009 It was deposited with KCTC 11577BP at the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea Institute of Bioscience and Biotechnology.
  • the strain which introduced the pGal-Erg20 / HMG1 vector (FIG.
  • YNB medium a medium to which 0.67% non-amino acid yeast nitrogen (Yeast Nitrogen Base W / O Amino Acids), 0.2% Casamino Acid, and 2% glucose (Glucose) was added was used.
  • YNB medium a medium to which 0.67% non-amino acid yeast nitrogen (Yeast Nitrogen Base W / O Amino Acids), 0.2% Casamino Acid, and 2% glucose (Glucose) was added was used.
  • a single colony was inoculated in 2 ml of YNB medium, and the main culture was performed after initial culture at 30 ° C. and 180 rpm.
  • the culture was used in YPGlu1% Gal1% medium (2% peptone, 1% yeast extract, 1% glucose, 1% galactose).
  • the initial cultured strain was inoculated so that the OD 600 is 0.1, and cultured with stirring at 30 ° C. and 180 rpm. After 72 hours, the squalene content produced in the cells was measured using gas chromatography (GC).
  • GC gas chromatography
  • Squalene was analyzed by the following method. 1 ml of the culture was taken and centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute to recover the cells. 600 ⁇ l of 50 mM Tric-Cl (pH 7.5) was added, and glass beads were added to resuspend the cells for 10 minutes. Next, 400 ⁇ l of pentane was added, and the suspension was sufficiently resuspended so that squalene dissolved in the pentane layer. After centrifugation for 5 minutes at 13,000rpm, only the pentane layer was taken and subjected to GC quantitative analysis. GC analysis conditions of squalene are shown in Table 2 below, and squalene showed a peak at 30.7 components as a result of GC analysis.
  • saccharomyces cerevisiae Y2805 strains and sacca which are widely used as host cells for gene expression, to investigate the possibility of the difference between strains and the promoter activity of expression vectors by the strains.
  • the W303 strain and YPH499 strain (Tokuhiro K. et al., Appl. Environ. Microbiol. 75, 5536-5543 (2009)) were used in Loryaces cerevisiae, and the effects were investigated in parallel with the GAL10 promoter as well as the ADH1 promoter. (Table 3).
  • the control strain that does not have the HMG1 gene overexpression vector was initially insignificant, but Y2805 showed somewhat higher values than other strains.
  • HMG1 gene overexpression significantly increased squalene productivity, but the effect of HMG1 gene overexpression was different between strains, and Y2805 strain showed significantly higher squalene productivity than W303 or YPH strain.
  • both the GAL10 promoter and the ADH1 promoter showed high squalene productivity
  • the GAL10 promoter showed significantly lower squalene productivity than the ADH1 promoter.
  • the W303 strain had very low productivity in both promoters.
  • Example 3 Using the Y2805 strain showing excellent squalene productivity in Example 3, the effects of the overexpression of various isoprenoid biosynthetic pathway genes were examined (Table 4). Almost no squalene was detected in the control Y2805 strain in which the isoprenoid biosynthetic gene was not expressed. Overexpression of the HMG1 gene was known to significantly increase the squalene productivity as known. However, the MMGE gene, an enzyme that produces acetoacetyl CoA, an early stage on the squalene-producing metabolic pathway and partially overlaps the HMG1 gene, has no effect of overexpression. In addition, MVAE was found to adversely affect productivity even when co-expression with other genes.
  • the GPPS gene producing GPP (geranyl pyrophosphate), a preliminary step of squalene production, was ineffective when overexpressed alone, and even when overexpressed simultaneously with HMG1, productivity was lowered than when overexpressing HMG1 alone. .
  • the control strain without the ispA / HMG1 gene overexpression vector showed a slight level of squalene production
  • the recombinant strain with the ispA / HMG1 gene overexpression vector showed a marked increase in squalene production.
  • the variation between strains showed a very severe tendency, among which the Y2805 strain was found to have a very high squalene productivity compared to the other strains compared.
  • These comparative strains were strains selected as the most excellent strains of isoprenoid productivity from about 40 ATCC strains in the recent report, it was confirmed that the Y2805 strain of the present invention shows excellent productivity.
  • yeast mutant strain of the present invention When the yeast mutant strain of the present invention is used, it is possible to overcome various limitations of the current squalene source and to produce high efficiency squalene having various uses as a raw material of cosmetics or pharmaceuticals. In addition, the high price of squalene due to the lack of current sources and high production process costs can be expected.

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Abstract

본 발명은 HMG-CoA 리덕타제 (hydroxymethylglutaryl CoA reductase) 및 파네실 파이로포스페이트 신타제 (farnesyl pyrophosphate synthase)를 발현하는 벡터를 도입시켜 제조된 효모 변이주 및 상기 변이주를 이용한 스쿠알렌의 생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 HMG1 유전자, 및 ispA 또는 Erg20 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환시킨 사카로마이세스 세레비지에 Y2805 효모 변이주 및 상기 변이주를 배양하여 스쿠알렌을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

효모 변이주 및 이를 이용한 스쿠알렌의 생산 방법
본 발명은 HMG-CoA 리덕타제 (hydroxymethylglutaryl CoA reductase) 및 파네실 파이로포스페이트 신타제 (farnesyl pyrophosphate synthase)를 발현하는 벡터를 도입시켜 제조된 효모 변이주 및 상기 변이주를 이용한 스쿠알렌의 생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 HMG1 유전자, 및 ispA 또는 Erg20 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환시킨 사카로마이세스 세레비지에 Y2805 효모 변이주 및 상기 변이주를 배양하여 스쿠알렌을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
스쿠알렌 (2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene, squalene)은 도 1의 화학구조식에 나타낸 바와 같이, 6개의 이중결합을 가지고 있는 C30H50의 디하이드로트리터펜 하이드로카본 (dehydrotriterpenic hydrocarbon)으로서 다양한 화합물군을 이루고 있는 터페노이드 화합물의 일종이며, 동식물의 모든 스테로이드의 전구물질이다.
스쿠알렌은 쥐에서 화학적으로 유발된 피부암, 폐암, 및 대장암에 대하여 유효한 저해효과를 보였으며 (Aioi A 등, Int. J. Pharm. 113, 159-164 (1995)), 식이 섭취한 스쿠알렌은 비특이적 면역기능을 활성화시키고, 콜레스테롤 흡수율에 영향을 주며, LDL (low-density lipoprotein)과 중성지방을 감소시키는 것으로 알려지고 있다. 스쿠알렌은 피부 표면의 다중 불포화 지방의 주요 구성성분으로서 항산화 보습 등의 효과를 가져 화장품 원료로도 사용된다. 또한 약물의 전달이나 특히 백신 애쥬번트 (adjuvant)로서 최근 사용이 허가되었다 (Tritto E. 등, Vaccine 27, 3331-3334 (2009)).
현재까지 스쿠알렌의 주된 상업적 공급원은 심해상어의 간유와 식물의 씨앗으로부터 얻는 오일이다. 그러나 심해상어 간유의 공급은 중금속 오염과 국제적인 해상 환경 보호에 대한 관심에 따라 원활한 공급이 불투명하고, 식물의 씨앗으로부터 얻는 오일 (예, 올리브 오일 7mg/g, 아마란트 (amaranthus) 오일 0-5.64 mg/g)도 계절적 변화와 지역별 편차 등으로 인하여 원활한 공급이 또한 불투명한 실정이다.
따라서 자연계로부터 스쿠알렌을 생산하는 효모인 슈도지마 (Pseudozyma) (Chang MH 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 78, 963-972 (2008)), 캔디다 파마타 (Candida famata) (JP 07,289,272), 토룰라스포라 델브루엑키 (Torulaspora delbruekii) (Bhattacharjee P. 등, World J. Microbiol. Biotechnol. 17, 811-816 (2001))등을 사용하는 방법, 유글레나 (Euglena)를 사용하는 방법 (JP 07,115,981), 보트리코커스 브라니 (Botrryococcus branii) (Okada S. 등, Arch. Biochem. Biophys. 373, 307-317 (2000)) 및 트라우스 토키트리드 (thraustochytrids) (Li Q 등, J. Agric. Food Chem. 57, 4267-4272 (2009))와 같은 미세조류 (microalgae) 등으로부터 스쿠알렌을 생산할 수 있는 방법에 관한 연구가 이루어져 왔다.
그러나 이러한 사례의 경우 균체 배양에 기간이 오래 걸리고 세포 생산성이 낮으며 균체 당 생산량이 저조한 등의 문제로 인하여 대부분 상업적 생산에 필요한 높은 생산성을 보여 주지 못하므로 대사공학적 기술을 사용하여 스쿠알렌 함량을 증가시키는 연구가 이루어져 왔다.
이러한 대사공학 기술의 숙주세포로서 효모 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 균주가 많이 사용되는데, 이 효모는 원래 에르고스테롤 (ergosterol)을 균체 건물 당 통상 1% 정도 축적하며 균주나 배양조건에 따라 약 4.6%에 이르는 과량을 축적하는 것으로 알려지고 있어 (Arnezeder C. 등, Biotechnol. Lett. 12, 277-282 (1990)), 에르고스테롤 생합성 경로의 중간물질인 스쿠알렌의 생산에도 적합한 균주로 볼 수 있다. 그러나 상기와 같이, 스쿠알렌은 에르고스테롤 생합성의 중간물질이어서 통상의 생육 조건에서는 미미한 양이 축적되는 것으로 알려지고 있다. 즉, 사카로마이세스 세레비지에 및 토룰라스포라 델브루엑키 효모의 경우 스쿠알렌 생산성이 각각 균체 (wet cell) g 당 41.16 및 237.25 ㎍에 그쳤으며 (Bhattacharjee P. 등, World J. Microbiol. Biotechnol. 17, 811-816 (2001)), 또 다른 최근 연구 결과에 의하면 사카로마이세스 세레비지에 균주의 경우 (BY4741 및 EGY48 균주) 준혐기적 (semianaerobic) 조건에서 각각 약 3 mg/ℓ 및 3.1 mg/ℓ의 낮은 생산성을 보였다 (Mantzouridou F. 등, J. Agric. Food Chem. 57, 6189-6198 (2009).
따라서 효모에서 스쿠알렌을 과량 축적 시키기 위해서는 대사공학 기술의 도입이 필요하다. 에르고스테롤 및 스쿠알렌 등은 이소프레노이드 혹은 터페노이드 계통의 화합물에 속하며 이소프레노이드 생합성 경로는 크게 메발로네이트 (mevalonate) 경로와 비-메발로네이트 경로의 2가지 경로로 나뉘는데 진핵세포는 주로 메발로네이트 경로를 따르는 것으로 알려져 있다. 따라서, 효모 사카로마이세스 세레비지에 균주도 진핵세포이므로 메발로네이트 경로를 따르며 에르고스테롤 생합성 경로를 살펴보면 도 2와 같다.
메발로네이트 생합성 경로는 메발로네이트를 생산하는 HMG (hydroxymethylglutaryl CoA reductase) 단계가 가장 중요한 율속 단계로 알려져 있고, 상기 단계는 여러 가지 조절 메카니즘 하에 놓여 있으므로, 상기 HMG 효소 유전자를 과발현시키면 이소프레노이드 생합성의 대사흐름이 증가하게 된다. 따라서, 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 다양한 이소프레노이드 (파네솔 (farnesol), 게라닐가라니올 (geranylgeraniol), 아모파디엔 (amorphadiene) 등)의 과생산을 위하여 HMG 효소 유전자의 과발현을 위한 많은 시도가 있어 왔다 (WO2008039499; 미국특허출원 제20040235088호; 미국특허출원 제20030092144호; Tokuhiro K. 등, Appl. Environ. Microbiol. 75, 5536-5543 (2009); Ohto C. 등, Appl. Micorbiol. Biotechnol. 82, 837-845 (2009)). 상기 방법은 스쿠알렌 생산에도 유용한 것으로 알려지고 있으며, HMG1 유전자를 과발현시켰을 때 효모 균체 건물 당 0.9% (Polakowski T. 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 66-71 (1998)), 혹은 2% (Donald KA등, Appl. Environ. Microbiol. 63, 3341-3344 (1997)) 까지 스쿠알렌을 축적하는 것으로 알려지고 있다. 또한 최근 연구에서 (Tokuhiro K. 등, Appl. Environ. Microbiol. 75, 5536-5543 (2009)) HMG1 유전자를 GAPDH 프로모터를 사용하여 사카로마이세스 세레비지에 YPH499 균주에서 과발현 시켰을 때 106 - 192 mg/ℓ (2.3 - 4.1 mg/g DCW)의 스쿠알렌 생산성을 얻을 수 있음이 보고된 바 있다.
한편 스쿠알렌을 축적시키기 위한 또 다른 방법으로서 스쿠알렌을 에르고스테롤로 전환하는 효소 경로를 상동재조합 방법으로 결손 시킴으로써 약 5 mg/g의 스쿠알렌을 축적시키는 방법도 알려진 바 있다 (Kamimura N. 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 353-357 (1994)). Ohto 등은 최근 (Ohto C. 등, Appl. Micorbiol. Biotechnol. 82, 837-845 (2009)) 사카로마이세스 세레비지에 균주를 사용하여 파네솔, 네롤리돌 (nerolidol), 게라닐게라니올 등의 프레닐 알코올 (prenyl alcohol)과 스쿠알렌을 생산하기 위해서 다양한 종류의 메발로네이트 경로 효소 유전자들 (ERG10, HMG 신타제, HMG1, ERG12, ERG8, ERG19, IDI1, idi, ERG20, ispA)을 과발현시켜서 이들 물질의 생산성에 대한 영향을 조사한 바 있는데, 그 중 HMG1이 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다. 그러나 대장균에서 프레닐 알코올의 생산성을 약 5-6배 증진시키는 것으로 알려진 (Ohto C. 등, Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 186-188 (2009)) ispA (대장균 유래의 파넬실 파이로포스페이트 신타제 (farnesyl pyrophosphate synthase) 유전자를 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 과발현시킨 경우 생산성 향상에 도움이 되지 않는 것으로 나타났다. 또한 효모 유래의 파네실 파이로포스페이트 신타제 유전자인 Erg20 유전자를 과발현시켰을 경우에도 그 효과는 미미하였다. 이는 아마도 진핵세포인 효모가 이소프레노이드 생합성 경로로 비-메발로네이트 경로를 사용하는 원핵세포인 대장균과는 달리 메발로네이트 경로를 사용하고 있으며, 또한 메발로네이트 경로 상에서 ispA나 Erg20 효소의 산물인 파네실 파이로포스페이트가 축적되면 전체 이소프레노이드 생합성 경로의 조절단계인 HMG1 유전자의 발현이나 HMG1 효소의 활성이 저해됨에 따른 것으로 본 발명자들은 추정하였다.
이에 본 발명자들은 스쿠알렌 합성을 고효율로 하기 위한 효모 변이주를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, HMG1 유전자의 발현을 위한 프로모터를 자체 프로모터가 아닌 GAL10 프로모터나 ADH1 프로모터 등을 사용함으로써 이소프레노이드 생합성 경로의 산물에 의한 HMG1 유전자 발현의 저해를 극복함과 동시에 HMG1 유전자와 함께 ispA나 Erg20과 같은 파네실 파이로포스페이트 신타제 유전자를 동시에 과발현하는 방법을 고안하게 되었고, 기존의 스쿠알렌 고생산성 균주로 알려진 YPH499등과 비교하여 수배 내지 수십배의 현저하게 높은 사카로마이세스 세레비지에 Y2805 변이주를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 HMG-CoA 리덕타제 및 파네실 파이로포스페이트 신타제를 발현하는 벡터를 도입시켜 제조된 효모 변이주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 효모 변이주를 배양하여 스쿠알렌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 HMG-CoA 리덕타제 (hydroxymethylglutaryl CoA reductase) 및 파네실 파이로포스페이트 신타제 (farnesyl pyrophosphate synthase)를 발현하는 벡터를 도입시켜 제조된 효모 변이주에 관한 것이다.
상기의 효모 변이주는 HMG-CoA 리덕타제 (hydroxymethylglutaryl CoA reductase) 및 파네실 파이로포스페이트 신타제 (farnesyl pyrophosphate synthase)를 발현하는 벡터로 형질전환시켜서 상기 유전자들을 과발현시킴으로 인하여 스쿠알렌을 과량으로 효모 내에 축적하게 된다.
본 발명에서 용어, "HMG-CoA 리덕타제"는 콜레스테롤 및 다른 이소프레노이드 (isoprenoid)를 생산하는 대사 경로에 관여하는 효소로서, 특히 메발로네이트 경로에 있어서 중요한 율속단계를 결정하는 효소로 알려져 있다.
상기 효소는 ER (endoplasmic reticulum) 막에 박혀있는 앵커 단백질 (anchored protein)이고, 7개의 막통과 도메인 (transmembrane domain)를 갖는다고 알려져 있다. 스쿠알렌 과량 생산을 위하여, 상기 HMG1 유전자 발현을 조절하고자 하는 시도가 일부 이루어진 바 있으나, 관련 경로의 복잡한 기전에 의해 유의적인 스쿠알렌 증가를 달성하지 못하거나, 발현 정도가 일정하지 않아 산업적 생산이 불가한 균주를 생산하는데 그쳤고, 안정적이고 고효율로 스쿠알렌을 생산하는 변이주에 대해서는 개발되지 못하였다.
바람직한 일 실시태양으로 HMG-CoA 리덕타제의 활성을 효모에서 나타낼 수 있는 유전자를 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게 상기 HMG-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자는 HMG1 유전자이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 HMG-CoA 리덕타제로서 사카로마이세스 세레비지에 유래의 HMG1 유전자로 형질전환된 효모 변이주로부터 고효율의 스쿠알렌을 수득할 수 있음을 확인하였다.
HMG1 유전자의 경우 유전자가 코딩하는 영역의 기능에 따라 막통과 도메인 및 촉매 영역으로 구분될 수 있는데, 본 발명에서 도입가능한 유전자는 촉매 영역의 발현을 포함하는 유전자 전장, 일부 또는 단편이 제한 없이 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게 본 발명의 HMG1 유전자는 막통과 도메인 없이 촉매 영역만이 발현되도록 변형된 유전자이며, 상기 변형은 에르고스테롤 생합성 중간체에 의한 피드백 조절을 억제함으로써 스쿠알렌의 함량을 더욱 높일 수 있게 한다.
본 발명에서 용어, "파네실 파이로포스페이트 신타제 (farnesyl pyrophosphate synthase)"는 이소펜테닐 파이로포스페이트 및 디메틸알릴 파이로포스페이트로부터 파네실 파이로포스페이트가 합성되는 반응을 촉매하는 효소이다. 파네실 파이로포스페이트 신타제는 특히 에르고스테롤 생합성 과정에서 구조상 다양한 중요 대사 산물들에 대한 C15 전구체를 제공하는 중요한 효소이며, 스쿠알렌 생합성의 전단계인 파네실 파이로포스페이트를 생산하는 효소이다.
상기 파네실 파이로포스페이트 신타제 효소는 상기 효소 활성을 효모에서 나타낼 수 있는 유전자라면 제한 없이 사용할 수 있고, 그 예로 ispA 유전자 또는 Erg20 유전자가 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용가능한 파네실 파이로포스페이트 신타제 유전자의 예가 제한되는 것은 아니다. 나아가 ispA 유전자 또는 Erg20 유전자는 효모 내에서 본래의 활성을 가질 수 있는 한 해당 유전자의 유래가 제한되지 않는다. 바람직하게 ispA 유전자의 경우 대장균 유래일 수 있고, Erg20 유전자는 사카로마이세스 세레비지에 유래일 수 있다.
본 발명에서 용어, "에르고스테롤 생합성 경로" 또는 "이소프레노이드 생합성 경로"는 혼용될 수 있으며, 상기 생합성 경로는 중간 산물로서 스쿠알렌을 생산하며, 본 발명의 효모 변이주는 상기 생합성 경로 상의 HMG-CoA 리덕타제 및 파네실 파이로포스페이트 신타제를 동시에 과발현시킴으로 인하여 스쿠알렌을 고효율로 생산할 수 있게 된다.
본 발명에서 용어, "스쿠알렌"은 일종의 이소프레노이드 혹은 터페노이드 계통의 화합물에 속하며, 6개의 이중 결합을 가지고 있는 다중 불포화 지방으로 하기 화학식 1의 구조를 가지고 있는 C30H50이다.
화학식 1
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본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하며, 효모 숙주세포 내에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 당업계에 공지된 벡터를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되면 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편의 영향을 받지만, 이들 핵산 단편의 여러 가능한 결합 조합 중에서 각 단편이 그 기능을 수행하는데 있어 검출할 만한 영향이 없는 상태의 결합을 의미한다. 즉, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 아울러, 본 발명의 발현 카세트는 전사를 조절하기 위한 임의의 전사 시작 조절 서열 및 전사 종결 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 작동가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"이란 형질전환 또는 형질도입에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질전환은 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염 (infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 효소를 발현하는 벡터를 도입함으로 인하여 효소의 세포 내 활성의 증가를 이룰 수 있으며, 이는 유전자의 과발현에 의해 이루어질 수 있다. 목적 유전자의 과발현은 상기 유전자의 프로모터 부위 및 5' UTR지역의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질 발현을 증진시킬 수 있으며, 목적 유전자를 염색체상에 추가 도입함으로써 발현을 강화시킬 수 있으며, 목적 유전자를 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 도입하여 균주에 형질전환시킴으로써 단백질의 발현량을 강화시킬 수 있다. 또한, 목적 유전자의 ORF (open reading frame) 지역에 돌연변이를 도입함으로써 이루어질 수 있다. 과발현의 측정에 따르면, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것을 알 수 있다. 바람직하게는 효소를 발현하는 벡터를 도입하여 효소의 세포 내 활성을 증가시킬 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 HMG-CoA 리덕타제 효소 및 파네실 파이로포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터는 HMG-CoA 리덕타제 효소의 활성이 저해되지 않도록 외래 프로모터가 도입되는 것이 바람직하며, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 유전자는 그 업스트림 (upstream)에 GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터를 작동가능하게 연결하여 사용할 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로, HMG-CoA 리덕타제 및 파네실 파이로포스페이트 신타제를 발현하는 벡터는 GAL10 프로모터 및 HMG1 유전자가 작동가능하게 연결되고, GAL10 프로모터 및 ispA 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 도 3(e)의 개열지도를 갖는 벡터인 pGal-ispA/HMG1, 또는 GAL10 프로모터 및 HMG1 유전자가 작동가능하게 연결되고, GAL10 프로모터 및 Erg20 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 도 3(i)의 개열지도를 갖는 벡터인 pGal-Erg20/HMG1일 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 변이주는 HMG-CoA 리덕타제 및 파네실 파이로포스페이트 신타제를 발현하는 벡터를 도입시켜서 스쿠알렌을 고효율로 생산할 수 있는 효모를 제한 없이 사용할 수 있으나, 그 예로 사카로마이세스 속, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에 Y2805일 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 변이주는 pGal-ispA/HMG1 벡터(도 3(e))를 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입하여, 사카로마이세스 세레비지에 Y2805/pGal-ispA/HMG1라고 명명하고 2009년 10월 19일에 한국생명공학연구원 생물자원센터 (대전시 유성구 과학로 111)에 기탁한 기탁번호 KCTC 11577BP인 변이주, 또는 pGal-Erg20/HMG1 벡터 (도 3(i))를 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입하여 사카로마이세스 세레비지에 Y2805/pGal-Erg20/HMG1로 명명하고, 2009년 10월 19일에 한국생명공학연구원 생물자원센터 (대전시 유성구 과학로 111)에 기탁한 기탁번호 KCTC 11578BP 변이주일 수 있다.
본 발명자들은 바람직한 일 실시예에서, 스쿠알렌을 합성하는 데 관여할 것으로 예상되는 다양한 이소프레노이드 생합성 경로의 유전자를 효모 발현 벡터에 클로닝하여 pGal-ispA, pGal-HMG1, pADH-HMG1, pGal-MVAE, pGAL-GPPS, pGAl-ispA/HMG1, pGAl-ispA/MVAE, pGal-GPPS/HMG1, pGal-GPPS/MVAE 및 pGal-Erg20/HMG1인 총 10 종류 (도 3)의 벡터를 제작하고, 상기 각각의 벡터를 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입하는 한편, 상기 변이주를 배양하여 스쿠알렌의 효모 변이주 내의 축적량을 가스 크로마토그래피로 분석하였다. 그 결과, pGAl-ispA/HMG1를 도입한 변이주는 스쿠알렌을 1.246 g/ℓ을 생산하고, pGal-Erg20/HMG1를 도입한 변이주는 스쿠알렌을 0.886 g/ℓ을 생산함을 확인하였다. 이러한 생산량은 상기 벡터외에 다른 유전자가 도입된 균주들의 스쿠알렌 생산량인 0.001~0.114 g/ℓ보다 높은 수치 (표 4)였으며, 이는 본 발명의 HMG-CoA 리덕타제 및 파네실 파이로포스페이트 신타제를 동시에 과발현시킨 효모 변이주가 현저히 높은 수준으로 스쿠알렌을 생산할 수 있음을 의미한다.
또한, 효모 균주에 따른 HMG1 유전자와 ispA 유전자의 동시 과발현이 스쿠알렌 생산성에 미치는 영향을 관찰한 결과, 최근 이소프레노이드 생산성이 우수한 균주로 알려진 ATCC 201741, ATCC 201238, ATCC 200589와 비교하여 Y2805에서 1.004 g/ℓ로 수십배로 매우 높은 스쿠알렌을 생산하는 것을 확인하였다 (표 5).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이주를 배양하여 스쿠알렌을 생산하는 방법에 관한 것이다.
HMG-CoA 리덕타제 및 파네실 파이로포스페이트 신타제를 과발현시킨 효모 변이주를 당업계에 공지된 다양한 효모의 배양 방법에 의해 배양을 수행할 수 있으며, 배양의 예로서, YNB 배지를 사용하여 초기 배양한 후, YPGlu1%Gal1% 배지를 사용하여 본 배양을 수행할 수 있으나, 상기 방법으로 효모 변이주의 배양 방법이 제한되는 것은 아니다. 또한 축적된 스쿠알렌은 통상적인 분리 및 추출 방법을 사용하여 수득할 수 있는데, 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 균체를 파쇄시킨 후, 펜탄 (pentene)을 첨가하여 스쿠알렌이 펜탄 층에 녹아나오도록 하여 스쿠알렌을 분리하였다.
본 발명의 효모 변이주를 사용하는 경우, 현재의 스쿠알렌 공급원이 가지는 여러가지 한계를 극복할 수 있음과 동시에 화장품이나 의약품의 원료로서 다양한 용도를 가지고 있는 스쿠알렌을 고효율로 생산할 수 있다. 또한, 현재 공급원의 부족과 높은 생산 공정비용으로 인한 스쿠알렌의 높은 가격을 낮출 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 스쿠알렌의 화학구조를 간략히 도시화한 것이다.
도 2는 효모 사카로마이세스 세르비지에의 메발로네이트 생합성 경로를 간략히 도시화한 것이다.
도 3은 스쿠알렌 생합성 벡터를 간략히 도시화한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1 : 스쿠알렌 생산 균주의 구축
효모 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 스쿠알렌을 고효율로 생산하기 위해서는 HMG CoA 리덕타제를 비롯한 이소프레노이드 생합성 경로 유전자의 과발현이 필요하다. 따라서 스쿠알렌을 합성하는데 관여할 것으로 예상되는 다양한 이소프레노이드 생합성 경로의 유전자를 효모 발현 벡터에 클로닝하였다 (도 3).
먼저 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제/하이드록시메티글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제 활성을 동시에 가지고 있는 (bifunctional enzyme) MVAE 유전자를 효모 코돈에 맞도록 젠스크립트 (GenScript) 사에서 인공합성한 유전자 (서열번호 2)를 사용하였으며, 5'- 및 3'-부위에 각각 제한효소 EcoRI 및 SalI 인지부위를 가지도록 제작하였다. 상기 유전자를 EcoRI 및 SalI으로 잘라내고 동일한 제한효소로 절단한 발현벡터 YEGα-HIR525에 삽입하였다. 상기 발현벡터는 GAL10 프로모터를 가지는 벡터로서 프로모터 다운스트림 (downstream)의 EcoRI 부위와 GAL7 종결인자 (terminator) 업스트림의 SalI 부위 사이에 목표 유전자를 클로닝하였다.
HMG CoA로부터 메발로네이트를 생합성하는 효소인 하이드록시메틸글루타릴 CoA 리덕타제 중 조절 메커니즘에 의한 효소 단백질의 분해를 유발하는 것으로 알려져 있는 아미노 말단의 막통과 도메인 (trans-membrane domain (597aa))을 제거하여 촉매 도메인 (catalytic domain)만을 가지고 있는 사카로마이세스 세레비지에 유래의 HMG1 유전자 (서열번호 1)를 사용하였다. GPPS (Geranyl pyrophosphate synthase) 유전자는 식물체 에이비즈 그랜디스 (Abies grandis)에서 확보한 GPPS (서열번호 4)를 사용하였고, FPP (farnesyl pyrophosphate) 신타제 유전자는 대장균에서 확보한 ispA 유전자 (서열번호 3)와 사카로마이세스 세레비지에 유래의 Erg20 유전자 (서열번호 5)를 사용하였다. 이들 유전자는 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 얻은 각 유전자의 PCR 반응산물을 각각 EcoRI 및 SalI으로 잘라내고 동일한 제한효소로 절단한 발현벡터 YEGα-HIR525에 삽입하였다.
표 1 <유전자 클로닝에 이용한 프라이머 서열 및 제한효소>
유전자 프라이머 서열 서열번호 제한효소
HMG1 F 5'-AAAAGAATTCATGGACCAATTGGTGAAA-3' 6 EcoRISalI
R 5'-AAAAGTCGACTTAGGATTTAATGCAGGT-3' 7
ispA F 5'-ATGGAATTCAAAAATGGACTTTCCGCAGCAACTCGAA-3’ 8 EcoRISalI
R 5'-CGGACTACATCATCCAGCGTAATAAATAAGTCGACCTC-3’ 9
GPPS F 5'-ATGGAATTCAAAAATGTACATGGATTCCAAGGCAATG-3' 10 EcoRISalI
R 5'-GAGGTCGACTTAATTTTGTCTGAATGCCACGTAATC-3' 11
Erg20 F 5'-ATGGAATTCAAAAATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGAGAGAG-3’ 12 EcoRIXhoI
R 5'-CTTGAACAAAGTTTACAAGAGAAGCAAATAACTCGAGCTC-3' 13
스쿠알렌을 효율적으로 생산할 수 있도록 동시발현 벡터를 구축하기 위해서, ispA 유전자, Erg20 및 GPPS 유전자를 HMG1 및 MVAE 유전자와 각각 동시발현 (co-expression)시켰다.
ADH1 프로모터는 사카로마이세스 유래의 ADH1 프로모터를 사용하였으며, ScADH1-F (5'- GAGCT CTGTAGCCCTAGACTTGAT-3', 서열번호 14)와 ScADH1-R (5'- GAATTC TGTATATGAGATAGTTGA-3', 서열번호 15) 프라이머의 조합 (이택릭체 및 볼드체는 첨가된 제한효소인식서열을 의미함)으로 사카로마이세스 세레비지에 Y2805 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 통하여　증폭하였다. PCR 반응산물을 pGEM-T 이지 벡터 (easy vector)에 서브클로닝하여 염기서열을 확인하였고, 그 후 SacI과 EcoRI 제한효소로 절단하여 프로모터를 함유한 유전자 부분을, YEGα-HIR525 벡터의 GAL10 프로모터를 대체하여 사용하였다.
상기와 같이 제조된 pGal-ispA, pGal-HMG1, pADH-HMG1, pGal-MVAE, pGAL-GPPS, pGAl-ispA/HMG1, pGAl-ispA/MVAE, pGal-GPPS/HMG1, pGal-GPPS/MVAE 및 pGal-Erg20/HMG1인 총 10 종류 (도 3)의 벡터를 각각 사카로마이세스 세레비지에 균주 Y2805 균주에 도입하였다. 사카로미세스 세레비지에 균주는 미국 국립보건원으로부터 입수한 사카로미세스 세레비지에 2805 (Y2805) 균주(Sohn JH 등, J Microbiol. Biotechnol. 1, 266-273 (1991); Choi ES 등, Appl. Microbiol. Biotechnol 42, 587-594 (1994))를 사용하였다. pGAl-ispA/HMG1 벡터(도 3(e))를 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입한 균주를 사카로마이세스 세레비지에 Y2805/pGal-ispA/HMG1라고 명명하고, 2009년 10월 19일에 한국생명공학연구원 생물자원센터 (대전시 유성구 과학로 111)에 기탁번호 KCTC 11577BP로 기탁하였다. 또한, pGal-Erg20/HMG1 벡터 (도 3(i))를 사카로마이세스 세레비지에 Y2805에 도입한 균주를 사카로마이세스 세레비지에 Y2805/pGal-Erg20/HMG1로 명명하고, 2009년 10월 19일에 한국생명공학연구원 생물자원센터 (대전시 유성구 과학로 111)에 기탁번호 KCTC 11578BP로 기탁하였다.
실시예 2 : 균주 배양 및 스쿠알렌 분석 방법
배양은 초기배양과 본 배양으로 구분하며, 초기배양에는 YNB 배지를 사용하였다. YNB 배지는 0.67% 무아미노산 효모질소원 (Yeast Nitrogen Base W/O Amino Acids), 0.2% 카사미노산 (Casamino Acid), 2% 글루코스 (Glucose)가 첨가된 배지를 사용하였다. YNB 배지 2 ㎖에 단일 집락을 접종하였고, 30 ℃, 180rpm에서 초기배양한 후, 본 배양을 수행하였다. 본 배양은 YPGlu1%Gal1% 배지 (2% 펜톤 (peptone), 1% 효모추출물 (yeast extract), 1% 글루코스, 1% 갈락토스 (galactose))를 이용하였다. 배양은 YPGlu1%Gal1% 배지를 250 ㎖ 배플 플라스크 (baffled flask)에 25 ㎖씩 분주한 뒤, 초기 배양한 균주를 OD600가 0.1이 되도록 접종하였고, 30℃, 180rpm에서 교반하면서 배양하였다. 72시간 후, GC (gas chromatography)를 이용하여 균체 내에 생산된 스쿠알렌 함량을 측정하였다.
스쿠알렌은 다음의 방법으로 분석하였다. 배양액 1 ㎖을 취하여 13,000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 50 mM Tric-Cl (pH 7.5) 600 ㎕를 첨가하였고, 여기에 글라스 비드 (glass bead)를 첨가하여 상기 균체를 10분 동안 재현탁 시켰다. 다음으로, 펜탄 (pentane) 400 ㎕를 첨가하였고, 스쿠알렌이 펜탄층에 녹아 나오도록 충분히 재현탁 시켰다. 그 후 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리 하였고, 펜탄 층만을 취하여, GC 정량 분석을 실시하였다. 스쿠알렌의 GC 분석 조건은 하기 표 2와 같으며 스쿠알렌은 GC분석 결과 30.7분대에 피크로 나타났다.
표 2
품목 조건
GC모델 Varian star 3400 cx
칼럼 19091J-413 HP-5 (30 m × 0.32 mm × 0.25 ㎛)
주입 부피 2 ㎕
온도 40℃ 3 분, 10℃/분 240℃ 5 분, 10℃/분 300℃ 1분
시간 35분
실시예 3 : HMG1 유전자 과발현이 스쿠알렌 생산성에 미치는 영향
먼저 스쿠알렌 등 이소프레노이드의 생합성에 가장 중요한 율속 단계로서 과발현 효과가 알려진 HMG1 유전자의 과발현이 스쿠알렌의 생산성에 미치는 영향을 알아보았다.
스쿠알렌 생산성에 대한 영향과 관련하여, 균주 간의 차이 및 발현 벡터의 프로모터 활성이 균주 간에 차이에 의한 가능성도 조사하기 위하여 사카로마이세스 세레비지에 Y2805 균주와 아울러 유전자 발현의 숙주세포로서 많이 사용되는 사카로마이세스 세레비지에 W303 균주 및 YPH499 균주 (Tokuhiro K. 등, Appl. Environ. Microbiol. 75, 5536-5543 (2009))를 사용하였고, GAL10 프로모터 뿐만 아니라 ADH1 프로모터도 병행하여 그 효과를 조사하였다 (표 3).
표 3 <HMG1 유전자의 과발현이 스쿠알렌 생산성에 미치는 영향>
균주 벡터 스쿠알렌 (g/ℓ) OD600 DCW (Dry cell weight, g/ℓ) 스쿠알렌 (mg/g DCW)
Y2805 - 0.0032 29.1 8.47 0.4
Y2805 pGal-HMG1 0.450 21.6 6.26 71.9
Y2805 pADH1-HMG1 0.484 19.4 5.63 86.0
W303 - 0.0001 21.1 6.12 0.0
W303 pGal-HMG1 0.006 14.3 4.15 1.4
W303 pADH1-HMG1 0.0012 19.0 5.51 0.2
YPH499 - 0.0012 19.3 5.60 0.2
YPH499 pGal-HMG1 0.023 8.9 2.58 8.9
YPH499 pADH1-HMG1 0.092 11.7 3.39 27.1
그 결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이 먼저 HMG1 유전자 과발현 벡터를 가지지 않는 대조군 균주의 경우 전체적으로 미미한 수준이었지만 Y2805가 다른 균주보다 다소 높은 값을 보였다. 재조합 균주의 경우 HMG1 유전자 과발현이 스쿠알렌 생산성을 크게 증가 시키는 것으로 나타났으나 HMG1 유전자 과발현의 효과가 균주 간에 달리 나타나, Y2805 균주의 경우 W303이나 YPH 균주에 비하여 스쿠알렌 생산성이 현저히 높은 것이 나타났다. Y2805 균주의 경우 GAL10 프로모터와 ADH1 프로모터 모두 스쿠알렌 생산성이 높은 것으로 나타난 반면, YPH 균주의 경우 ADH1 프로모터에 비하여 GAL10 프로모터는 상당히 저조한 스쿠알렌 생산성을 보여 주었다. 한편 W303 균주는 상기 2가지 프로모터 모두 생산성이 매우 낮았다.
실시예 4 : 다양한 이소프레노이드 생합성 경로 유전자의 과발현이 스쿠알렌 생산에 미치는 영향
상기 실시예 3에서 우수한 스쿠알렌 생산성을 보인 Y2805 균주를 사용하여 다양한 이소프레노이드 생합성 경로 유전자들을 과발현시켜 그 영향을 살펴보았다 (표 4). 이소프레노이드 생합성 유전자가 발현되지 않는 대조군 Y2805 균주의 경우 스쿠알렌이 거의 검출되지 않았다. HMG1 유전자를 과발현시킨 경우 알려진 바와 같이 스쿠알렌 생산성이 현저히 증가됨을 알 수 있었다. 그러나, HMG1 유전자와 그 기능이 일부 중복되며 스쿠알렌 생산 대사 경로 상의 초기 단계인 아세토아세틸 CoA를 생산하는 효소인 MVAE 유전자의 경우는 과발현의 효과가 없는 것으로 나타났다. 또한 MVAE는 다른 유전자와 동시발현의 경우에도 생산성에 오히려 좋지 않은 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 스쿠알렌 생산의 전 전단계인 GPP (geranyl pyrophosphate)를 생산하는 GPPS 유전자의 경우 단독적으로 과발현하는 경우 효과가 없었고, HMG1과 동시에 과발현하는 경우도 HMG1만을 단독적으로 과발현하는 경우보다 오히려 생산성이 낮아지는 현상을 보였다.
스쿠알렌 생합성의 전단계인 FPP (farnesyl pyrophosphate)를 생산하는 FPP 신타제 유전자인 ispA 및 Erg20 유전자를 단독으로 과발현시킨 경우, 스쿠알렌 생산에 전혀 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 이는 대장균에서 ispA 유전자를 과발현시키는 경우 프레닐 알코올 (prenyl alcohol)의 생산성을 약 5-6배 증진시키는 것으로 알려진 이전 연구결과 (Ohto C. 등, Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 186-188 (2009))를 고려할 때 전혀 예상치 못한 결과로서, 대장균과 효모는 각각 비-메발로네이트 및 메발로네이트 경로를 사용하고, 그에 따라 각 유전자의 조절 메카니즘이 다른 것에 기인하는 것으로 추즉된다.
한편, ispA 및 Erg20 유전자를 HMG1과 동시에 과발현시킨 경우 스쿠알렌 생산성이 현저히 증가되었고, HMG1 유전자만을 단독적으로 과발현시킨 경우보다 약 2배 이상의 생산성 향상을 나타내었다. 또한 분석결과 대장균 유래의 ispA 유전자가 효모 유래의 Erg20 유전자보다 효과가 더욱 우수하였다.
상기와 같은 하기 표 4의 결과로 미루어 보아 스쿠알렌 생합성 경로의 유전자 2개 이상을 조합하는 경우, 스쿠알렌 생산이 증가하는 경우와 오히려 감소하는 경우로 그 결과를 예단할 수 없고 다양한 조합을 시도하여야 함을 알 수 있었다.
표 4 <사카로마이세스 세레비지에 2805 균주에서 이소프레노이드 생합성 경로 유전자들의 과발현이 스쿠알렌 생산에 미치는 영향>
번호 벡터 스쿠알렌 (g/ℓ) OD600 DCW (Dry cell weight, g/ℓ) 스쿠알렌 (mg/g DCW)
1 - 0.003 29.1 8.47 0.4
2 pGal-HMG1 0.492 31.0 8.98 54.8
3 pGal-MVAE 0.003 19.5 5.64 0.5
4 pGal-ispA 0.001 34.4 9.96 0.1
5 pGal-ispA/HMG1 1.246 30.0 8.69 143.4
6 pGal-ispA/MVAE 0.005 33.5 9.70 0.5
7 pGal-GPPS 0.002 28.1 8.15 0.2
8 pGal-GPPS/HMG1 0.114 33.3 9.66 11.8
9 pGal-GPPS/MVAE 0.004 34.8 10.08 0.4
10 pGal-Erg20 0.004 36.5 10.60 0.4
11 pGal-Erg20/HMG1 0.886 35.6 10.31 85.9
상기 표 4의 결과에서 가장 우수한 스쿠알렌 생산성을 보인 ispA/HMG1 조합을 사용하여 Y2805 균주와 최근에 이소프레노이드 생산성이 우수한 균주로 보고된 바 있는 사카로마이세스 세레비지에 균주 몇 가지 종류에 대하여 스쿠알렌 생산성에 대한 영향을 조사하였다 (표 5).
표 5 <효모 균주에 따른 HMG1과 ispA 유전자의 동시 과발현이 스쿠알렌 생산성에 미치는 영향>
균주 벡터 스쿠알렌 (g/ℓ) OD600 DCW (Dry cell weight, g/ℓ) 스쿠알렌 (mg/g DCW)
Y2805 - 0.0032 29.1 8.47 0.4
Y2805 isp/HMG1 1.004 36.9 10.69 93.9
ATCC 201741 - 0.0008 17.0 4.93 0.2
ATCC 201741 isp/HMG1 0.032 16.7 4.84 6.6
ATCC 201238 - 0.0003 18.6 5.39 0.1
ATCC 201238 isp/HMG1 0.001 9.75 2.83 0.4
ATCC 200589 - 0.0023 27.0 7.83 0.3
ATCC 200589 isp/HMG1 0.013 18.9 5.47 2.4
상기 표 5에 나타난 바와 같이 ispA/HMG1 유전자 과발현 벡터를 가지지 않는 대조군 균주에서는 전반적으로 스쿠알렌 생산이 미미한 수준을 보인 반면 ispA/HMG1 유전자 과발현 벡터를 가지는 재조합 균주의 경우 스쿠알렌 생산이 현저히 증가함을 보여 주었으나 균주 간의 편차가 매우 심한 경향을 보여 주었고, 그 중 Y2805 균주가 비교한 다른 균주에 비하여 매우 높은 스쿠알렌 생산성을 가짐을 알 수 있었다. 이들 비교 균주는 최근 보고에서 약 40여종의 ATCC 균주로부터 이소프레노이드 생산성이 가장 우수한 균주로 선별된 균주들이므로, 이로부터 본 발명의 Y2805 균주가 우수한 생산성을 보여주는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 효모 변이주를 사용하는 경우, 현재의 스쿠알렌 공급원이 가지는 여러가지 한계를 극복할 수 있음과 동시에 화장품이나 의약품의 원료로서 다양한 용도를 가지고 있는 스쿠알렌을 고효율로 생산할 수 있다. 또한, 현재 공급원의 부족과 높은 생산 공정비용으로 인한 스쿠알렌의 높은 가격을 낮출 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
Figure PCTKR2010007621-appb-I000001
Figure PCTKR2010007621-appb-I000002

Claims (9)

  1. HMG-CoA 리덕타제 (hydroxymethylglutaryl CoA reductase) 및 파네실 파이로포스페이트 신타제 (farnesyl pyrophosphate synthase)를 발현하는 벡터를 도입시켜 제조된 효모 변이주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HMG-CoA 리덕타제는 HMG1 유전자인 효모 변이주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 파네실 파이로포스페이트 신타제는 ispA 유전자 또는 Erg20 유전자인 효모 변이주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자의 프로모터는 GAL10 프로모터 또는 ADH1 프로모터인 효모 변이주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 도 3(e) 또는 3(i)에 기재된 개열지도를 갖는 효모 변이주.
  6. 제4항에 있어서, 상기 스쿠알렌 생산 변이주는 사카로마이세스 세레비지에 Y2805인 효모 변이주.
  7. 제6항에 있어서, 상기 변이주는 기탁번호 KCTC 11577BP인 효모 변이주.
  8. 제6항에 있어서, 상기 변이주는 기탁번호 KCTC 11578BP인 효모 변이주.
  9. 제1항 내지 제8항의 변이주를 배양하여 스쿠알렌을 생산하는 방법.
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