KR102543061B1 - 사카로미세스 세레비시아에서 브라제인을 고발현하기 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명자들은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에서 브라제인을 고발현하기 위한 브라제인 발현용 재조합 벡터를 제조하고, S. cerevisiae 균주 Y2805를 상기 재조합 벡터로 형질전환하였을 때 브라제인 발현량이 특히 높은 것을 확인하여, 브라제인을 대량 생산 하기 위한 최적의 발현계를 완성하였다. 또한, 본 발명에 따른 최적 배양조건에서 상기 브라제인 발현계를 배양하는 경우 브라제인 생산량이 더욱 증가하며, 정제과정이 간편하고 비용이 적게 든다. 따라서, 본 발명에 따른 브라제인 발현계는 감미단백질인 브라제인을 대량 생산하여 상용화하는데 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

사카로미세스 세레비시아에서 브라제인을 고발현하기 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산방법{A recombinant expression vector for the high expression of brazzein in Saccharomyces cerevisiae and a method for the mass production of brazzein using the same}

본 발명은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에서 브라제인을 대량 생산하기 위한 브라제인 발현용 재조합 벡터 등에 관한 것이다.

브라제인은 서아프리카에서 자생하는 열대 과일인 Oubli(Pentadiplandra braazzena Baillon)의 열매의 펄프 조직에서 1994년 미국의 University of Wisconsion, Madison 동물과학과인 Hellekant 그룹에서 처음으로 발견한 천연 단백질이다(Ming & Hellekant, 1994). 브라제인은 54개의 아미노산 잔기로 구성된 단량체(monomer)로 감미 단백질 중 가장 작은 6.5 kDa 분자량을 가지며 감미 단백질 중에서 설탕과 가장 유사한 단맛(B. G. Hellekant & Ming, 1998)을 나타내고 있을 뿐만 아니라 2% 설탕 용액의 단맛 대비 분자량 기준으로 약 2000배, 몰 기준으로 9500배 높은 당도를 지니고 있다. 브라제인은 하나의 α-helix, 3개의 β-sheet를 가지고 있으며 내부에 8개의 시스테인(cysteine) 잔기를 포함한다. NMR spectroscropy 분석에서 메르캅토기(surfhydryl)는 없고 3개의 β-sheet들이 수소결합과 4개의 이황화결합(disulfide bond)으로 연결되어 있는 고차 구조가 밝혀졌다(Caldwell et al., 1998).

브라제인은 Major 형태와 Minor 형태로 존재한다. Major 형태는 N-말단에 pyro-glutamic acid(pGlu)가 있어 54개의 아미노산으로 이루어져 있고 야생형의 80%를 차지하고 있으며, Minor 형태는 N-말단에 pGlu가 없는 53개의 아미노산으로 구성되며 야생형의 20%를 차지한다. Minor 형태가 Major 형태보다 2배 더 강한 단맛을 나타낸다(Assadi-Porter, Aceti, Cheng, & Markley, 2000). 뿐만 아니라 서아프리카 원주민들이 Pentadiplandra brazzzeana Baillon 열매를 통해 수백 년 동안 브라제인을 장기간 섭취하여 왔기 때문에 식품 첨가물로 안전하다고 여겨진다.

위와 같은 특징을 가지고 있는 브라제인은 다른 감미 단백질보다 식품 첨가물로서의 그 가능성 및 활용성이 매우 크다. 그러나 Pentadiplandra braazzena Baillon는 자연 환경에서 재배하기 어려운 열대 식물이기 때문에 상업적 가능성은 매우 낮다. 따라서, 천연 공급원으로부터 생산되는 브라제인의 대안으로서 다양한 균주에서 재조합 브라제인을 생산하려는 시도가 있어왔다. 그러나, 브라제인을 고순도 및 고수율로 대량생산할 수 있는 효과적인 발현 시스템은 여전히 발굴되지 않은 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1356914호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 Saccharomyces 균주에서 브라제인을 고발현하기 위한 발현 벡터 및 이를 이용한 브라제인의 대량 생산방법을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 브라제인(brazzein) 암호화 유전자 및 알파-메이팅 인자(α-mating factor) 암호화 유전자가 삽입된 pESC-URA 벡터를 포함하는, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에서의 브라제인 발현용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된, 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 (1) 제1항의 브라제인 발현용 벡터를 사카로미세스 세레비시아 균주에 형질전환시키는 단계; (2) 단계 (1)에서 형질전환된 균주를 배양하는 단계; (3) 단계 (2)에서 배양된 형질전환 균주의 배양물을 수득하는 단계; 및 (4) 단계 (3)의 배양물로부터 브라제인을 정제하는 단계를 포함하는, 브라제인의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 브라제인(brazzein) 암호화 유전자 및 알파-메이팅 인자(α-mating factor) 암호화 유전자가 삽입된 pESC-URA 벡터를 포함하는, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에서의 브라제인 발현용 재조합 벡터를 제공한다.

일 구현예에서, 상기 브라제인 암호화 유전자는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

다른 구현예에서, 상기 알파-메이팅 인자 암호화 유전자는 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또다른 구현예에서, 상기 브라제인 암호화 유전자는 상기 알파-메이팅 인자 암호화 유전자와 연결되어 있고, 상기 브라제인 암호화 유전자 및 알파-메이팅 인자 암호화 유전자 사이에는 알파-메이팅 절단 부위(α-mating cleavage site)가 존재하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또다른 구현예에서, 상기 pESC-URA 벡터는 서열번호 8로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 7 또는 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된, 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주를 제공한다.

일 구현예에서, 상기 사카로미세스 세레비시아 균주는 INVSc1, Y2805, 또는 BY4741일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된, 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주의 배양물을 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 제1항의 브라제인 발현용 벡터를 사카로미세스 세레비시아 균주에 형질전환시키는 단계;

(2) 단계 (1)에서 형질전환된 균주를 배양하는 단계;

(3) 단계 (2)에서 배양된 형질전환 균주의 배양물을 수득하는 단계; 및

(4) 단계 (3)의 배양물로부터 브라제인을 정제하는 단계를 포함하는, 브라제인의 대량 생산방법을 제공한다.

일 구현예에서, 단계(2)의 배양은 하기 조건 중 하나 이상을 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:

(a) 사카로미세스 세레비시아 균주 내에 도입된 브라제인 발현용 재조합 벡터의 복제 개수(copy number)는 5 내지 60임;

(b) 상기 배양은 복합배지 또는 제한배지에서 이루어짐;

(c) 상기 배양은 pH 4.5 내지 6.5에서 이루어짐;

(d) 상기 배양은 20℃ 내지 35℃에서 이루어짐; 또는

(e) 상기 배양은 6 내지 120 시간 동안 이루어짐.

다른 구현예에서, 단계(2)의 배양이 제한배지에서 이루어지는 경우, 하기 조건 중 하나 이상을 더 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:

(a) 상기 제한배지 내의 탄소원(C)/질소원(N)의 몰비율은 0.1 내지 10임;

(b) 상기 배양은 pH 5 내지 8에서 이루어지는 것으로서, 상기 pH는 아세트산 또는 완충용액으로 조절됨;

(c) 상기 제한배지는 미량원소를 1 내지 4(w/w)%의 농도로 더 포함함; 또는

(d) 상기 제한배지는 비타민을 1 내지 4(w/w)%의 농도로 더 포함함.

또다른 구현예에서, 단계 (2)의 배양 단계는 형질전환된 균주를 고체 배지에 도말하여 배양하는 단계; 상기 고체 배지에 형성된 콜로니(colony)를 채취해 액체 배지에서 전배양하여 전배양액을 제조하는 단계; 및 상기 전배양액을 본배양액에 접종하여 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 전배양액의 접종 농도는 본배양액의 1 내지 5(v/v)% 이며, 상기 전배양액이 접종된 본배양액의 OD₆₀₀은 0.05 내지 0.25일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또다른 구현예에서, 단계 (2)의 배양 단계는 형질전환된 균주의 브라제인 발현을 유도하기 위해 유도제를 첨가하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 유도제는 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 또는 이들의 조합 중에서 선택되고, 상기 유도제는 전체 배지의 1 내지 2(w/w)%의 농도로 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또다른 구현예에서, 상기 유도제를 첨가하는 단계는 하기 조건 중 하나 이상을 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:

(a) 글루코스/갈락토스 비율은 0.1 내지 2임; 또는

(b) 상기 유도제는 지수기(log phase) 또는 정체기(stationary phase)에 첨가됨.

또다른 구현예에서, 단계(4)의 정제 단계는 한외여과법 (ultrafiltration)으로 브라제인을 정제하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 브라제인 대량생산용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명자들은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에서 브라제인을 고발현하기 위한 브라제인 발현용 재조합 벡터를 제조하고, S. cerevisiae 균주 Y2805를 상기 재조합 벡터로 형질전환하였을 때 브라제인 발현량이 특히 높은 것을 확인하여, 브라제인을 대량 생산하기 위한 최적의 발현계를 완성하였다. 또한, 본 발명에 따른 최적 배양조건에서 상기 브라제인 발현계를 배양하는 경우 브라제인 생산량이 더욱 증가하며, 정제과정이 간편하고 비용이 적게 든다. 따라서, 본 발명에 따른 브라제인 발현계는 감미단백질인 브라제인을 대량 생산하여 상용화하는데 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 야생형 브라제인(상단) 및 사카로미세스 세레비시아 균주에서의 발현에 최적화된 브라제인(하단)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 브라제인 암호화 유전자 등이 삽입된 pESC 벡터(pESC-Brazzein) 및 브라제인 암호화 유전자 등을 삽입한 pD1214 벡터(pD1214-Brazzein)의 구조를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 재조합 브라제인의 단맛을 테스트하기 위한 평가표를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환되어 30℃에서 배양한 INVSc1, Y2805, 및 BY4741 균주의 성장곡선을 나타낸다.
도 5는 INVSc1, Y2805, 또는 BY4741 균주를 pD1214-Brazzein 벡터로 형질전환한 후 유도제(글루코스 및 갈락토스)를 첨가하여 배양하였을 때, 전체 배지 대비 글루코스 농도(w/w)% : 갈락토스 농도(w/w)%에 따른 브라제인 발현량을 비교한 결과이다. M열, BlUelf prestrained protein ladder; 1열, 1:0(glucose(w/w)% : glactose(w/w)%, 이하 동일); 2열, 1:1; 3열, 1:2; 4열, 2:0; 5열, 2:1; 6열, 2:2.
도 6은 INVSc1, Y2805, 또는 BY4741 균주를 pESC-Brazzein 벡터로 형질전환한 후 유도제(글루코스 및 갈락토스)를 첨가하여 배양하였을 때, 전체 배지 대비 글루코스 농도(w/w)% : 갈락토스 농도(w/w)%에 따른 브라제인 발현량을 비교한 결과이다. M열, BlUelf prestrained protein ladder; 1열, 0:1; 2열, 1:1; 3열, 2:1; 4열, 0:2; 5열, 1:2; 6열, 2:2.
도 7은 발현계별 브라제인 발현량을 비교한 결과이다: M열, BlUelf prestrained protein ladder; 1열, pD1214-Brazzein/INVSc1; 2열, pESC-Brazzein/INVSc1; 3열, pD1214-Brazzein/Y2805; 4열, pESC-Brazzein/Y2805; 5열, pD1214-Brazzein/BY4741; 6열, pESC-Brazzein/BY4741.
도 8은 발현계별 브라제인 발현량을 정량화하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 9은 pESC-Brazzein/Y2805 발현계의 재조합 벡터의 복제 개수(copy number)에 따른 브라제인 발현량을 비교한 결과이다: M열, BlUelf prestrained protein ladder; 1열, 복제 개수=5; 2열, 복제 개수=10; 3열, 복제 개수=20; 4열, 복제 개수=30; 5열, 복제 개수=40; 6열, 복제 개수=50; 7열, 복제 개수=60.
도 10은 pESC-Brazzein/Y2805 발현계의 재조합 벡터의 복제 개수에 따른 브라제인 발현량을 정량화하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 11은 pESC-Brazzein/Y2805 발현계에서 전배양액의 접종농도에 따른 브라제인의 발현량을 비교한 결과이다.
도 12는 pESC-Brazzein/Y2805 발현계에서 전배양액의 접종농도에 따른 브라제인의 발현량을 정량화하여 비교한 결과이다.
도 13은 배지의 pH에 따른 사카로미세스 세레비시아 균주의 성장곡선을 나타낸다.
도 14는 pESC-Brazzein/Y2805 발현계에서 배지의 pH에 따른 브라제인의 발현량을 비교한 결과이다.
도 15은 pESC-Brazzein/Y2805 발현계에서 배양온도 및 배양시간에 따른 브라제인의 발현량을 비교한 결과이다. M열, Triple color protein marker; 1열, 6시간 배양; 2열, 12시간 배양; 3열, 24시간 배양; 4열, 48시간 배양; 5열, 72시간 배양; 6열, 96시간 배양; 7열, 120시간 배양.
도 16는 pESC-Brazzein/Y2805 발현계에서 배양온도 및 배양시간에 따른 브라제인의 상대적 발현량을 비교한 결과이다.
도 17는 pESC-Brazzein/Y2805 발현계에서 유도제 첨가시기에 따른 브레제인 발현량을 비교한 결과이다.
도 18는 pESC-Brazzein/Y2805 발현계에서 유도제 첨가시기에 따른 브레제인의 상대적 발현량을 비교한 결과이다.
도 19는 pESC-Brazzein/Y2805 발현계를 제한배지에서 배양했을 때 제한배지의 C/N 비율에 따른 브라제인 발현량을 비교한 결과이다(1열 내지 10열, 왼쪽부터 순서대로 C/N 몰비율 = 0.1, 0.3, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 6, 8, 10).
도 20은 pESC-Brazzein/Y2805 발현계를 제한배지에서 배양했을 때 제한배지의 C/N 비율에 따른 브라제인의 상대적 발현량을 비교한 결과이다.
도 21은 pESC-Brazzein/Y2805 발현계를 제한배지에서 배양했을 때 pH에 따른 브라제인의 발현량을 비교한 결과이다. 좌측 M열: BlUelf prestrained protein ladder; 좌측 1열, pH 4.5; 좌측 2열, pH 5.0; 좌측 3열, pH 5.5; 좌측 4열, pH 6.0; 5열 pH 6.5. 우측 M열: BlUelf prestrained protein ladder; 우측 1열, pH 5.0; 우측 2열, pH 5.5; 우측 3열, pH 6.0; 우측 4열, pH 6.5; 우측 5열, pH 7.0; 우측 6열, pH 8.0.
도 22는 pESC-Brazzein/Y2805 발현계를 제한배지에서 배양했을 때 pH에 따른 브라제인의 상대적 발현량을 비교한 결과이다.
도 23은 다양한 배양조건에서 pESC-Brazzein/Y2805 발현계를 배양하여 브라제인 발현량을 비교한 결과이다. M열: BLUelf prestrained protein marker ; 1열: 0.1 C/N ratio ; 2열: optimized C/N ratio ; 3열: optimized C/N ratio + vitamin + trace metal ; 4열: optimized C/N ratio + vitamin + pH ; 5열: optimized C/N ratio + trace metal + pH ; 6열 optimized C/N ratio + vitamin + trace metal + pH.
도 24는 브라제인을 CM Sepharose 크로마토그래피로 분석했을 때의 용출 패턴(elution pattern)을 나타낸다.
도 25는 브라제인을 CM Sepharose 크로마토그래피로 용출한 후 분획별로 브라제인 발현량을 확인한 결과를 나타낸다. 좌측 M열, BLUelf prestrained protein marker ; 좌측 1열. fraction 26; 좌측 2열, fraction 27; 좌측 3열, fraction 28; 좌측 4열, fraction 29; 좌측 5열, fraction 30; 좌측 6열, fraction 31; 좌측 7열, fraction 32; 좌측 8열, fraction 33; 좌측 9열, fraction 34. 우측 M열, BLUelf prestrained protein marker ; 우측 1열, fraction 35 ; 우측 2열, fraction 36 ; 우측 3열, fraction 37 ; 우측 4열, fraction 38 ; 우측 5열, fraction 39.
도 26은 제한배지에서 발현된 후 정제된 브라제인의 순수도를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명은 브라제인(brazzein) 암호화 유전자 및 알파-메이팅 인자(α-mating factor) 암호화 유전자가 삽입된 pESC-URA 벡터를 포함하는, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에서의 브라제인 발현용 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에 있어서, "브라제인(brazzein)"은 단맛을 내는 감미 단백질인 브라제인을 지칭하며, major 형태의 브라제인 및 minor 형태의 브라제인 모두를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명에 있어서 "브라제인"은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

"브라제인(brazzein) 암호화 유전자"는 브라제인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 브라제인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드라면 제한없이 포함될 수 있다.

예를 들어, 브라제인 암호화 유전자는 Pentadiplandra brazzeana Baillon의 브라제인 DNA 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로는, 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

그러나 바람직하게는, 상기 브라제인 암호화 유전자는 형질전환 균주에서의 발현에 최적화된 코돈을 갖도록 변형된 유전자일 수 있다. 예를 들어, 상기 브라제인 암호화 유전자는 사카로미세스 세레비시아 균주에서의 발현에 최적화된 코돈을 갖도록 변형된 유전자일 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 브라제인 암호화 유전자는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것이나, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.

본 명세서 전반에 있어서, 특정 서열번호로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자란, 해당 서열번호로 표시되는 뉴클레오티드 서열은 물론, 이의 작용성 등가물, 예를 들어, 일부 뉴클레오티드 서열이 결실(deletion), 치환(substitution), 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었으나, 발현 산물이 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이(variant) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 특정 서열번호로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자란, 해당 서열번호로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의　서열　상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,　99%, 또는 100%의　서열　상동성을　갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열　상동성 %”은 두 개의 최적으로 배열된　서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드　서열의 일부는 두　서열의 최적 배열에 대한 참고　서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

"알파-메이팅 인자(α-mating factor)"는 단백질의 세포 밖으로 분비발현되게 하는 신호서열을 지칭한다. 구체적으로는, 본 발명에 있어서 "알파-메이팅 인자"는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

"알파-메이팅 인자(α-mating factor) 암호화 유전자"는 상기 알파-메이팅 인자를 암호화하는 유전자를 의미하며, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 알파-메이팅 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드라면 제한없이 포함될 수 있다.

예를 들어, 알파-메이팅 인자 암호화 유전자는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 알파-메이팅 인자, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 알파-메이팅 인자, KT 신호서열[Tokunaga et al., Yeast, 13: 699--706, 1997), 또는 Saccharomyces cerevisiae pre-SUC2 신호서열(Bergkampet al., Curr Genet, 21:365-370]의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 알파-메이팅 인자 암호화 유전자는 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

그러나 바람직하게는, 상기 알파-메이팅 인자 암호화 유전자는 형질전환 균주에서의 발현에 최적화된 코돈을 갖도록 변형된 변이체 유전자일 수 있다. 예를 들어, 상기 알파-메이팅 인자 암호화 유전자는 사카로미세스 세레비시아 균주에서의 발현에 최적화된 코돈을 갖도록 변형된 유전자일 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 알파-메이팅 인자 암호화 유전자는 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것이나, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 디옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들면 뉴클레오티드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 "골격" 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩티드 결합(펩티드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 브라제인 암호화 유전자는 상기 알파-메이팅 인자 암호화 유전자와 연결된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 브라제인 암호화 유전자는 상기 알파-메이팅 인자 암호화 유전자의 뒤(downstream)에 연결된 것일 수 있다. 또한, 상기 브라제인 암호화 유전자 앞에 있는 알파-메이팅 인자 암호화 유전자에는 알파-메이팅 절단 부위(α-mating cleavage site)가 존재할 수 있다. 이는 단백질 발현 후 브라제인이 세포 외로 분비발현할 때 단백질분해효소 등에 의해 알파-메이팅 인자 암호화 유전자와 분리되는 위치를 의미한다.

본 명세서에 있어서, 브라제인 발현을 위한 "벡터(vector)"는 적절한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 적절하게 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물(예를 들어, 브라제인 암호화 유전자 또는 알파-메이팅 인자 암호화 유전자 등)이 발현되도록 작동가능하게 연결된(operatively linked) 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 적당한 숙주에 형질전환되면, 벡터는 숙주의 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 용어 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 형질전환된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있으며, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제기원을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 벡터는 효모에서의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 pESC 벡터 또는 pD1214 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 벡터는 pESC-URA 벡터 또는 pD1214-FAks 벡터일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 벡터는 서열번호 8로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pESC-URA 벡터 또는 서열번호 9로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pD1214-FAks 벡터일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 브라제인 암호화 서열이 삽입된 pESC 벡터를 포함하는 재조합 벡터는 "pESC-Brazzein"로, 브라제인 암호화 서열이 삽입된 pD1214 벡터를 포함하는 재조합 벡터는 "pD1214-Brazzein"로 지칭될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 브라제인 발현용 재조합 벡터는 상기 브라제인 암호화 유전자 및 상기 알파-메이팅 인자 암호화 유전자가 작동가능하게 연결된 프로모터(promoter)를 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "프로모터(promoter)"란 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 조절하는 DNA 염기서열부위를 의미하며, 구성성(Constitutive) 프로모터와 유도성(Inducible) 프로모터 모두를 포함한다. 예를 들어, 상기 프로모터는 LAC, GAL, KlADH4, PGK1 프로모터, 또는 말타아제/말토오스 퍼메아제 바이-디렉션널 프로모터 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 GAL 프로모터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 GAL1 및/또는 GAL10일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "작동가능하게 연결(operatively linked)"된다는 것은 특정 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 연결되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향 받는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 브라제인 발현용 재조합 벡터는 서열번호 7 또는 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 브라제인 발현용 재조합 벡터는 사카로미세스 세레비시아에서의 브라제인 발현에 특히 최적화된 것이나, 상기 벡터로 형질전환될 수 있는 균주의 종류는 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된, 브라제인 발현용 균주를 제공한다.

본 명세서에 있어서, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 숙주 염색체 외의 인자로서 또는 숙주 염색체에 통합되어 복제가 가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 브라제인 발현용 재조합 벡터에 의해 형질전환될 수 있는 숙주 세포 또는 균주는 원핵 또는 진핵 세포를 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 단세포 진핵 미생물인 효모(yeast)일 수 있다. 구체적으로, 상기 균주는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 또는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris), 또는 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는, 상기 균주는 사카로미세스 세레비시아일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 균주는 INVSc1, Y2805, 또는 BY4741일 수 있다.

본 발명에 있어서 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에 공지된 표준 기술 중 숙주세포에 적합한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 형질전환 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합법, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전법, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전법, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아-매개 형질전환, PEG(polyethylene glycol), 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 입자 충격법(particle bombardment) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 균주의 배양물을 제공한다. 본 명세서에 있어서 "배양물"이란 배양액 및/또는 배양된 세포를 포함하는 물질을 말한다. "배양액"이란 세포를 배양시킨 다음, 세포를 제외하고 남은 세포 배양 용액을 의미한다. 상기 배양액에는 본 발명에 따른 형질전환 균주에 의해 분비발현된 브라제인이 포함되어 있다.

또한, 본 발명은 (1) 제1항의 브라제인 발현용 벡터를 사카로미세스 세레비시아 균주에 형질전환시키는 단계; (2) 단계 (1)에서 형질전환된 균주를 배양하는 단계; (3) 단계 (2)에서 배양된 형질전환 균주의 배양물을 수득하는 단계; 및 (4) 단계 (3)의 배양물로부터 브라제인을 정제하는 단계를 포함하는, 브라제인의 대량 생산방법을 제공한다.

상기 형질전환 균주를 배양하면 균주 내에 도입된 브라제인 발현용 벡터에 의해 알파-메이팅 신호서열과 연결된 브라제인이 발현되며, 이때 브라제인의 발현은 유도성 프로모터의 발현을 촉진하는 유도제에 의해 촉진될 수 있다. 알파-메이팅 신호서열과 연결된 브라제인은 소포체로 이동하며, signal peptidase 또는 Kex peptidase 등의 단백질분해효소에 의해 알파-메이팅 신호서열이 브라제인으로부터 절단될 수 있다.

본 발명자들은 상기 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 사카로미세스 세레비시아 균주에서 브라제인이 최적의 효율로 발현될 수 있도록 배양 조건을 최적화 하였다.

먼저, 본 발명자들은 사카로미세스 세레비시아 균주 내에 도입된 브라제인 발현용 재조합 벡터의 복제 개수(copy number)를 최적화하였다. 본 명세서에 있어서, "복제 개수(copy number)"란 형질전환된 숙주 세포에 있어서, 단일세포 내에 존재하는 벡터 분자의 수를 의미한다. 본 발명에 있어서 균주 내에 주입된 브라제인 발현용 재조합 벡터의 복제 개수는 5 내지 60일 수 있다. 바람직하게는, 상기 복제 개수는 30 내지 60일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 복제 개수는 40 내지 60 또는 40 내지 50일 수 있다.

또한, 단계 (2)의 배양은 적절한 배지에서 이루어질 수 있으며, 상기 배지는 복합배지 및 제한배지를 포함한다. 예를 들어, 상기 배지는 YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) 또는 YNB(0.67% yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulfate, 0.2% glucose)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 형질전환 균주의 배양은 제한배지에서 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명자들은 배양의 pH 조건을 최적화하였다. 본 발명에 있어서 상기 배양은 pH 4.5 내지 6.5에서 이루어지는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양은 pH 5 내지 6.5에서 이루어지는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 배양은 pH 5.5 내지 6.5에서 이루어지는 것일 수 있다.

또한 본 발명자들은 배양의 온도 조건을 최적화하였다. 본 발명에 있어서, 상기 배양은 20 내지 35℃에서 이루어지는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양은 23 내지 35℃ 또는 25 내지 33℃에서 이루어지는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 배양은 27 내지 33℃에서, 가장 바람직하게는 27 내지 30℃에서 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명자들은 배양 시간을 최적화하였다. 본 발명에 있어서, 상기 배양은 6 내지 120시간 동안 이루어지는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양은 48 내지 96시간 동안 이루어지는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 배양은 60 내지 80시간 동안, 가장 바람직하게는 70 내지 75시간 동안 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명자들은 배양이 제한배지에서 이루어지는 경우의 제한배지 내의 탄소원(C)/질소원(N)의 몰비율을 최적화하였다. 본 발명에 있어서 상기 배양이 제한배지에서 이루어지는 경우, 제한배지 내의 탄소원(C)/질소원(N)의 몰비율은 0.1 내지 10일 수 있다. 바람직하게는, C/N의 몰비율은 2 내지 8일 수 있다. 더욱 바람직하게는, C/N 몰비율은 4 내지 8, 가장 바람직하게는 5 내지 7일 수 있다.

또한, 본 발명자들은 배양이 제한배지에서 이루어지는 경우의 제한배지의 pH를 최적화하였다. 본 발명에 있어서, 상기 배양이 제한배지에서 이루어지는 경우, 상기 배양은 초기 pH 4.5 내지 6.5에서 이루어지는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양은 초기 pH 5 내지 6.5에서 이루어지는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 배양은 초기 pH 5.5 내지 6.5에서 이루어지는 것일 수 있다. 여기서, 상기 pH는 아세트산으로 조절되는 것일 수 있다.

또는, 본 발명에 있어서, 상기 배양이 제한배지에서 이루어지는 경우, 상기 배양은 pH 5 내지 8에서 이루어지는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양은 pH 5.5 내지 7에서 이루어지는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 배양은 pH 5.5 내지 6.5에서 이루어지는 것일 수 있다. 여기서, 상기 pH는 완충용액으로 조절되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 potassium phosphate으로 조절되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 배양이 제한배지에서 이루어지는 경우, 상기 제한배지는 미량원소를 1 내지 4(w/w)%의 농도로 더 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제한배지는 5 내지 30 mg/L × Trace metal의 미량원소를 더 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는, 10 내지 25 mg/L × Trace metal의 미량원소를 더 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 15 내지 25 mg/L × Trace metal의 미량원소를 더 포함하는 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 제한배지는 20 mg/L × Trace metal의 미량원소를 더 포함한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 배양이 제한배지에서 이루어지는 경우, 상기 제한배지는 비타민을 1 내지 4(w/w)%의 농도로 더 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제한배지는 5 내지 40 mg/L × vitamin의 비타민을 더 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는, 20 내지 40 mg/L × vitamin의 비타민을 더 포함하는 것일 수 있고. 더욱 바람직하게는, 25 내지 35 mg/L × vitamin의 비타민을 더 포함하는 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 제한배지는 30 mg/L × vitamin의 비타민을 더 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 단계 (2)의 배양 단계는 형질전환된 균주를 고체 배지에 도말하여 배양하는 단계; 상기 고체 배지에 형성된 콜로니(colony)를 채취해 액체 배지에서 전배양하여 전배양액을 제조하는 단계; 및 상기 전배양액을 본배양액에 접종하여 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 전배양액의 접종 농도는 본배양액의 1 내지 5(v/v)%일 수 있다. 바람직하게는, 상기 전배양액의 접종 농도는 본배양액의 2 내지 4(v/v)%일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 전배양액의 접종 농도는 본배양액의 2.5 내지 3.5(v/v)%일 수 있다. 또한, 상기 전배양액이 접종된 본배양액의 OD₆₀₀은 0.05 내지 0.25일 수 있다. 바람직하게는, 상기 전배양액이 접종된 본배양액의 OD₆₀₀은 0.05 내지 0.2일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 전배양액이 접종된 본배양액의 OD₆₀₀은 0.1 내지 0.2일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 단계 (2)의 배양 단계는 형질전환된 균주의 브라제인 발현을 유도하기 위해 유도제를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 유도제는 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한, 상기 유도제는 전체 배지의 1 내지 2(w/w)%의 농도로 첨가되는 것일 수 있다.

이때, 브라제인 발현용 재조합 벡터가 pD1214-FAKS백터를 포함하는 것인 경우, 배지에 첨가되는 글루코스:갈락토스의 비율은 1 내지 2 : 0 내지 2일 수 있다. 또는, 브라제인 발현용 재조합 벡터가 pESC-URA 벡터인 경우, 배지에 첨가되는 글루코스:갈락토스의 비율은 0 내지 2 : 1 내지 2일 수 있다. 바람직하게는, 배지에 첨가되는 글루코스:갈락토스의 비율은 0.5 내지 1.5 : 1.5 내지 2일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 배지에 첨가되는 글루코스:갈락토스의 비율은 1 : 2일 수 있다. 달리 말하면, 브라제인 발현용 재조합 벡터가 pESC-URA 벡터인 경우, 배지에 첨가되는 글루코스/갈락토스의 비율은 0.1 내지 2일 수 있고, 바람직하게는 글루코스/갈락토스의 비율은 0.1 내지 1일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 글루코스/갈락토스의 비율은 0.2 내지 0.7일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 유도제는 지연기(lag phase), 지수기(log phase), 또는 정체기(stationary phase)에 첨가되는 것일 수 있다. "지연기(lag phase)"란, 일반적으로 균주를 배양액에 접종한 후 균주가 적응하는 시기를 의미하고, "지수기(log phase)"란 일반적으로 균주가 가장 활발히 성장 및 분열하는 시기를 의미하며, "정체기(stationary phase)"란 일반적으로 균주의 성장이 정지한 시기를 의미한다. 바람직하게는, 상기 유도제는 지수기 또는 정체기에 첨가될 수 있고, 더욱 바람직하게는 지수기에 첨가될 수 있다.

형질전환 균주의 배양물로부터 본 발명에 따른 브라제인을 분리하는 방법은 당업계에서 사용되는 다양한 분리 및 정제방법을 통해 분리 가능하다. 즉, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 브라제인을 분리할 수 있으며, 이외에 본 기술분야에 알려진 단백질 정제방법이라면 제한없이 적용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 있어서, 단계(4)의 정제 단계는 양이온 교환수지 크로마토그래피로 브라제인을 정제하는 것일 수 있다. 또는, 단계(4)의 정제 단계는 형질전환된 균주의 배양액의 pH를 4으로 맞춘 후 양이온 교환수지 크로마토그래피로 브라제인을 정제하는 것일 수 있다. 상기 양이온 교환수지 크로마토그래피는 CM-Sepharose chromatography일 수 있다.

그러나 바람직하게는, 단계(4)의 정제 단계는 한외여과법(ultrafiltration)으로 브라제인을 정제하는 것일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 브라제인의 정제 방법은 CM Sepharose 크로마토그래피와 같은 양이온 크로마토그래피, 음이온크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 또는 겔 여과(gel filtration) 등의 단백질 정제 방법들을 사용해서 정제하는 것도 가능하나, 바람직하게는 한외여과법으로 더 간단히 정제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 브라제인 대량 생산방법은, 정제과정에서 고가의 CM Sepharose 크로마토그래피를 사용하지 않으므로 경제적이고 효율적인 브라제인 대량 생산 및 정제가 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 브라제인을 정제하는 단계는 한외여과법으로 브라제인을 정제하기 전에 탈염과정을 수행하는 것일 수 있으며, 탈염 과정을 거친 배양물을 한외여과법으로 정제하면 더 높은 순수도와 수율을 가진 브라제인을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 브라제인 대량생산용 조성물, 식품 조성물, 건강기능식품, 화장료 조성물 및/또는 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 브라제인 발현용 형질전환 균주 또는 이의 배양물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 명세서에 있어서, "건강기능식품"이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 미스트, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 핸드로션, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 클렌징오일, 클렌징밤, 바디로션 또는 바디클렌저의 형태일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 0.01-5% 중량 백분율 또는 0.01-3% 중량 백분율로 배합될 수 있다.

본 발명의 제형이 로션, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 건강기능식품은 이너뷰티 푸드(inner beauty) 형태로 섭취함으로써 더욱 우수한 효과를 갖는 장점을 가진다. 상기 이너뷰티(inner beauty)는 '먹는 화장품 또는 뷰티 푸드'로 일컬어지는 푸드로, 피부에 좋은 여러 가지 성분을 몸속으로 흡수시켜 피부 체질을 건강하게 바꾸는 식품을 지칭하며, 피부 타입에 맞는 화장품을 고르듯 피부 컨디션과 라이프스타일을 고려해 개개인에게 맞는 이너 뷰티 푸드를 선택하여 섭취할 수 있다. 예를 들면, 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품과 상기 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주, 이의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 이너뷰티 푸드를 혼용할 경우, 화장품 또는 약제만 사용하는 것에 비해 효과가 월등히 높아져 더욱 효과적인 피부 미용효과를 볼 수 있는 장점을 가질 수 있다.

본 명세서에 있어서, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 있어서, "사료 첨가제"는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 생균제를 포함할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[기기 및 시약]

1. 기기

고압 멸균과 균을 다루기 위한 무균작업대는 비전 Biotech(Incheon, Korea)의 VB-125A60 Autoclave와 VB-700H1 Clean bench를 각각 이용하였고, 균을 배양하기 위해 Vision Scientific(Gyeonggi, Korea)사의 Shaking incubator를 이용하였으며, 균체 집균을 위한 원심분리기는 한일사(Seoul, Korea)의 Micro-12, Smart-R17, Supra R30을 이용하였다. 균체를 분쇄하기 위한 초음파파쇄기(sonicator)는 Sonics & Materials사(Danbury, USA)의 VCX 400를 사용하였고, Vortex Mixer는 Vision Scientific(Gyeonggi, Korea)사의 KMC-1300V를 이용하였다.

pH meter기는 Thermo Scientific(Pittsburgh, PA, USA)사의 Orion Star A211를 사용하였고, 교반기는 MTOPS사의 MS300 Hotplate & Magnetic Stirrer를 이용하였으며, 단백질 정량을 위해서 Hitachi사(Tokyo, Japan)의 U-2000 UV/VIS Spectrophotometer를 이용하였다. 단백질 정제를 위한 연동펌프로는 Pharmacia Biotech. (Uppsala, Sweden) Pump P-1를 사용하였고, 분별 수집기는 Fraction Collector FRAC-100를 이용하였다. 동결건조기와 초저온 냉장고는 Ilshin Lab Co. (Gyeonggi, Korea)의 TFD5505 Freeze Dryer와 DF8503S Ultra Low Temperature Freezer를 이용하였다. 단백질 전기영동 장치는 EIDO(Tokyo, Japan) NA-1010 Protein Electrophoresis를 이용하였다.

실시간 중합효소연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction; qRT-PCR) 기기는 Thermo(Waltham, USA)사의 QuantStudio 3를 이용하였다. DNA 합성은 ㈜CosmoGentech(Seoul, Korea)과 ㈜Bionics(Seoul, Korea)에 의뢰하였고, 염기 서열 분석은 ㈜Bionics(Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였다.

2. 시약

균주 배양을 위한 bacto yeast extract, bacto tryptone, bacto agar, bacto peptone은 Difco laboratories(Sparks, USA) 제품을 구입하여 사용하였고, 형질전환 후 선택배지를 위한 'yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate'는 Difco Laboratories(Sparks, MD)사에서 구입하였다.

DNA 정제를 위한 Plasmid miniprep kit는 Cosmo Genetech(Seoul, Korea)사를 이용하였고, total DNA extract kit는 ㈜Bionics(Seoul, Korea)사를 이용하였다. 그 외 agarose, N,N,N'N'-tetramethylethylenediamine(TEMED), sodium lauryl sulfate(SDS), glycerol는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, USA) 제품을, 30% acryl amide solution, polypeptide protein marker, coomassie brilliant blue R-250은 Bio-Rad사(Herculues, USA)의 제품을 이용하였다. Potassium phosphate(monobasic), potassium phosphate(dibasic)은 Kanto Chemical Co. (Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다. Real-time PCR에 사용되는 SYBR는 Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA USA)사의 SYBR® Green Real-Time PCR Master Mixes를 사용하였다.

단백질 정제 시 사용한 CM Sepharose resin 은 GE healthcare (Buckinghamshire, UK)의 제품을 사용하였다. BCA 정량을 위한 BSA protein assay kit 는 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA)사의 제품을 사용하였다. 그 외 완충용액(buffer)을 만들기 위한 시약과 사용한 모든 시약은 일급 및 특급 시약을 사용하였다.

3. 발현벡터 및 균주

벡터를 복제하기 위한 균주로 다중 복제 플라스미드 효율이 높은 One shot TOP10 E. coli를 Invitrogen^TM (California, USA)사에서 구입하였다.

본 발명자들은 재조합 브라제인 발현량을 높이기 위하여 yeast episomal plasmid로 구성된 발현벡터 2종류를 3가지 발현용 균주에 형질전환하여 총 6종류의 발현계를 작성하였다. 균주로 식품 및 대량생산에 사용되는 INVSc1, Y2805, BY4741의 세 종류를 사용하였으며(표 1), 벡터는 GAL 프로모터(promoter)를 포함하고 있는 pESC-URA와 TEF 프로모터(promoter)를 포함하는 pD1214-FAKs를 사용하였다(표 2). 모든 S. cerevisiae의 INVSc1, Y2805, BY4741 균주는 모두 uracil 영양요구성 변이주(ura3-52, ura3△0)이다. 벡터 pESC-URA는 BamH Ⅰ과 Hind Ⅲ의 제한효소를 이용하였고, 벡터 pD1214-FAKS는 XhoⅠ을 제한효소로 이용하여 브라제인 야생형(wild type)과 변이체(variant 3M-K5R)의 유전자를 삽입하여 발현벡터를 작성하였다. 플라스미드(plasmid) 구축 및 증폭을 위한 대장균(E. coli) 숙주세포는 TOP10을 사용하였다.

또한, Quantitative RT-PCR을 이용하여 형질변환체의 copy number를 비교하기 위해 genomic DNA에 URA3 유전자가 one-copy number 삽입되어 있는 숙주세포(host)를 이용하였다(Yoo, Sohn, Jeong, & Kang, 2020).

4. 배지

대장균의 배양에는 LB(1% trypton, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) 배지를 사용하였고, Ampicillin을 사용할 경우에는 50 mg/L의 농도를 사용하였다.

효모의 배양에는 복합배지인 YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)나 synthetic 배지인 YNB(0.67% yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulfate, 0.2% glucose)를 사용하였다.

대장균의 형질전환(transformation)에는 LB amp plate(LB 배지에 1.5% agar 및 50 mg/L ampicillin)를 사용하였고, 효모의 형질변환에는 YNB plate(YNB 배지에 1.5% agar)를 사용하였다.

[실험예]

실험예 1. 발현벡터 설계 및 발현균주의 선정

1-1. 발현벡터 설계

재조합 브라제인 발현량을 비교하기 위해 프로모터(promoter)가 다른 두 종류의 발현 벡터를 구축하였다. 이 때, S. cerevisiae에서 재조합 브라제인의 발현 효율을 높이기 위해 S. cerevisiae에 최적화된 브라제인 유전자를 제조하였는 바, Pentadiplandra brazzeana Baillon의 브라제인 DNA 서열을 기반으로 아미노산 서열에는 변화를 주지 않는 범위 내에서 S. cerevisiae에 적합한 codon usage를 고려하여 DNA를 합성하였으며, DNA 서열은 서열번호 2로 나타냈다(도 1).

또한, 효율적인 정제를 위해 α-mating factor 신호 서열을 브라제인 서열에 연결하여, 재조합 브라제인이 군체 밖으로 분비발현 되도록 디자인하였다. pESC-URA 벡터에는 α-mating factor가 존재하지 않기 때문에 선행연구(Jo et al., 2013)에서 사용하였던 K. lactis의 pKLAC2의 α-mating factor 서열을 S. cerevisiae에 해당하는 코돈으로 최적화한 후, ㈜Bionics(Seoul, Korea) 에서 합성하여 Kex cleavage site 뒤에 브라제인을 삽입하였으며(도 2 좌측), pD1214-FAKS 발현벡터(expression vector)에는 α-mating factor가 존재하기 때문에 Xho Ⅰ 제한효소로 절단한 후 코돈 최적화된 브라제인 서열을 삽입하였다(도 2 우측). S. cerevisiae에 최적화된 α-mating factor 신호 서열의 DNA 서열은 서열번호 5로, 아미노산 서열은 서열번호 6으로 나타냈다.

결과적으로, pESC-URA 벡터에 재조합 브라제인 유전자 및 α-mating factor를 삽입한 pESC-Brazzein 플라스미드(서열번호 10) 및 pD1214-FAKs 벡터에 재조합 브라제인 유전자 및 α-mating factor를 삽입한 pD1214-Brazzein 플라스미드(서열번호 11)를 제조하였다.

1-2. 발현벡터 증폭을 위한 대장균 TOP 10으로의 형질전환

합성된 브라제인 서열이 삽입된 pD1214-FAKS-Brazzein 와 pESC-URA-Brazzein 발현벡터를 다량으로 얻기 위하여 고효율의 안정적인 복제가 가능한 대장균 TOP 10으로 형질전환 하였다. 방법은 하기와 같다:

TOP 10 균을 LB 액체 배지에서 37℃에서 overnight 배양한 후 그 배양액을 새로운 LB 액체 배지에 1/100 부피만큼 접종하고 37℃에서 4-7×10 cells/ml이 될 때까지 배양하였다. 10-15분간 얼음에서 식힌 후, 3,000g에서 15분 원심분리하여 집균하고 50 mM CaCl₂를 사용하여 competent cell을 제조하였다. pD1214-FAKS와 pESC-URA 발현벡터를 1 μl 첨가하여 42℃에서 2분간 열충격을 주고 S.O.C(super optimal broth) 배지(Yeast extract 0.5%, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM Glucose)에서 회복단계를 가진 후 ampicillin 50 μl/ml를 함유한 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 12시간 배양하였다. 단일 콜로니를 취하여 항생제 ampicillin을 포함하고 있는 LB 액체 배지에 배양하고 Plasmid miniprep kit (cosmo genetech, Korea)를 이용하여 DNA를 정제하였다.

1-3. 사카로미세스 세레비시아 균주로의 형질전환

S. cerevisiae균주인 INVSc1, Y2805, BY474에 앞에서 작성한 발현벡터로 형질전환하기 위해 competent cell을 제작하였다. 형질전환은 YPD 배지, OD₆₀₀에서 0.7이 되도록 키운 효모 세포들은 lithium acetate를 이용하는 방법으로 실시하였다(Gietz & Schiestl, 2007). 형질 전환이 이루어진 세포들은 균주가 가진 영양요구성 마커(auxhotrophic marker)인 uracil이 들어있지 않는 synthetic complete 배지(SC-Ura)(0.67 g/L Yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulfate, 0.77 g/L of Complete supplement mixture, 5 g/L Ammonium sulfate and 2% Glucose)의 고체 배지에 도말하여 30℃에서 3일 동안 배양하였다.

형질전환 효모 균주로는 S. cerevisiae의 숙주 균주(host strain) 중에서 식품 분야에 많이 사용되고 있는 BY4741, INVSc1 및 Y2805를 사용했다. 이 균주들은 우라실(uracil)의 합성에 필요한 유전자가 결손 또는 변이 되어있다. 그러나 발현 벡터들은 우라실을 합성할 수 있는 URA3 유전자를 포함하므로, S. cerevisiae genome에 목적유전자가 성공적으로 삽입된 형질전환체는 우라실 결핍배지에서 자랄 수 있다.

1-4. 형질전환된 S. cerevisiae 로부터의 total DNA 추출

S. cerevisiae SC-Ura agar plate에 자란 콜로니(colony)를 10~20개 선택하여 YPD(1% Yeast extract, 2% Bacto Peptone, 2% Glucose) 액체 배지에 30℃에서 16-18시간 배양하였다. 장기 보관을 위해 각각의 콜로니를 액체 배양한 샘플을 20% glycerol stock 상태로 만들어 -70℃에서 냉동 보관하였다. 1 ml 씩 따로 분취하고 원심분리하여 균만 취한 후, glass bead로 균체를 분쇄한 후 total DNA kit를 이용하여 total DNA를 추출하였다.

1-5. 정량적 실시간 PCR(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)

효모 세포는 원하는 유전자를 형질전환 시에는 세포마다, 그리고 형질전환하는 방법에 따라 삽입되는 유전자의 수가 각각 다르다. 예를 들어, YIp의 경우는 최대 10개, YEp는 50에서 100 copy number 이상 삽입될 수 있다(Gnugge & Rudolf, 2017). 따라서, S. cerevisiae균주에 삽입된 브라제인의 유전자의 copy number를 파악하기 위해 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 수행하였다.

형질전환 된 균에서 total DNA를 추출하면 genomic DNA와 plasmid DNA가 함께 존재하게 된다. 균주에 삽입한 벡터에는 모두 marker gene인 URA3와 원하는 유전자 브라제인의 서열이 각각 한 유전자 삽입되어 있기 때문에 브라제인의 프라이머(primer) 대신 URA3의 프라이머를 사용하였다. 브라제인이 one copy만큼 들어있는 세포를 가지고 있지 않기 때문에 염색체 안에 URA3 유전자를 one copy만큼 가지고 있는 Scmet4△::ScMET4를 사용하여 형질전환 효모에 들어있는 브라제인 유전자의 copy number를 정량하고자 하였다. 이 때, housekeeping gene으로는 ACT1 유전자를 사용하였다. 사용한 프라이머의 서열은 표 3에 나타냈다.

Polymerase Chain Reaction (PCR)은 다음의 조건으로 진행하였다(표 4): 95℃에서 10초, 52℃에서 15초, 72℃에서 15초로 진행되었으며, 각 PCR 샘플은 세 번 반복하여 진행하였다. Melting point analysis는 65℃에서 시작하여 5초당 0.5℃씩 95℃까지 올리며 진행하였다. 사용한 프라이머의 Tm값이 ACT1 forward primer 55℃, ACT1 reverse primer 60.5℃, URA3 forward primer 58.9℃, URA3 reverse primer 59.4℃이기 때문에 annealing 온도는 가장 낮은 Tm값인 55℃보다 2-3℃ 낮은 52℃에서 진행하였다.

Total DNA의 농도는 UV로 정량하여 동일하게 맞추는데 RT-PCR (Real-Time PCR)이 가능한 10-100 ng/μl 농도 범위를 벗어나지 않게 하였다. PCR tube에 SYBR® Green Real-Time master Mixes 7 μl, primer forward, reverse primer를 각 1 μl씩, 증류수 5 μl, total DNA 1 μl를 넣어 최종부피 15 μl를 만들었다. Bio-Rad CFX 96 Real Time PCR로 PCR반응을 실시하였다. 유전자의 상대적 발현량 분석을 위해 comparative CT (△△CT) 방법을 사용하였다(Livak & Schmittgen, 2001).

1-6. 균체농도 및 플라스미드 안정성 확인

삽입한 플라스미드가 배양에 따라 얼마만큼 탈락하는지를 나타내는 플라스미드 안정성은 YPD와 SD-Ura 고체 배지에 각각 계대배양하여 콜로니의 수를 측정하는 방법;과 qRT-PCR로 분석하여 plasmid의 탈락율을 정량하는 방법; 두가지를 사용하여 확인하였다.

계대배양을 통한 확인 방법의 경우 형질전환된 균체를 YPD에 접종한 뒤 24시간마다 채취한 배양액을 소량 분취한 뒤 균체 농도를 맞추기 위하여 적당한 비율로 희석하여 분광광도계를 사용하여 600nm에서의 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하였으며, 이를 도말한 후 3일 뒤에 형성된 콜로니의 수를 측정하였다. qRT-PCR을 이용한 방법은 실험예 1-5와 동일한 방법을 사용하였다.

1-7. 발현벡터 및 균주 선정

본 발명자들은 구성성(Constitutive) 프로모터인 pD1214-Brazzein과 유도성(Inducible) 프로모터인 pESC-Brazzein인 두가지 발현벡터를 3가지의 균주에 형질전환하여 pD1214-Brazzein/INVSc1, pESC-Brazzein/INVSc1, pD1214-Brazzein/Y2805, pESC-Brazzein/Y2805, pD1214-Brazzein/BY4741, pESC-Brazzein/BY4741 개의 발현계를 제조하였으며, 이들 발현계에서 가장 많은 발현량을 나타내는 벡터 및 균주의 조합을 선정하고자 하였다. 각 균주마다 배양시간에 따른 cell density가 다르기 때문에 growth curve를 그린 후, 각 균주의 상태가 유사하게 진행하였다.

본 발명에 사용되는 벡터 pD1214-FAKs와 pESC-URA는 프로모터가 상이하다. 구체적으로, pD1214-FAKs의 경우 유전자 발현이 균체증식과 비례하여 일어나는(growth-associated expression) 구성적(constitutive) 프로모터를 사용하며, pESC-URA의 경우, 유전자의 발현이 유도제를 첨가함으로써 일어나는 유도성(inducible) 프로모터를 사용한다. 따라서, 재조합 효모들의 각 배지의 탄소원 및 유도제의 조건을 다르게 배양하고, 각 프로모터의 강도를 비교함으로써 브라제인의 과발현, 분비, 생산을 하는 최적의 프로모터를 선택하고자 하였다.

배양된 배양액을 8,000g에서 30분으로 원심 분리하여 집균을 한 후, 증류수로 초기에는 1-2시간, 그 후 8시간씩 3번 투석을 진행하여 염을 제외하고 SDS-PAGE로 발현량을 비교하였다.

실험예 2. 복합배지에서의 재조합 브라제인의 최적 발현조건 선별

2-1. 최적 접종(seeding) 농도의 확인

발현배지에 접종하기 위한 세포는 브라제인 유전자가 형질전환된 S. cerevisiae 세포의 glycerol stock에서 백금선을 이용하여 YPD 고체배지(10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 20 g/L glucose, 20 g/L agar)에 도말하고 30℃에서 72시간동안 incubator에서 배양을 하여 준비하였다. 이후, 고체배지에 자란 세포를 백금선을 이용하여 시험관안에 YPD 3 mL에 접종한 후 16~18시간, 30℃, 200rpm 조건으로 shaking incubator에서 OD₆₀₀ = 5~6 이 될 때까지 배양하고, inoculation할 전배양액 농도에 맞게 접종하여 본배양을 진행하였다.

접종균의 농도가 발현량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 접종균 농도를 달리하면서 발현량을 측정하였다. 발현배지로 복합배지인 YPDG (10 g/L Yeast extract, 20 g/L Peptone, 10 g/L Glucose, 10 g/L Galactose)를 이용하였으며, 250 mL 삼각플라스크에 YPDG 50 mL(pH 5.0)를 넣어 30℃, 200rpm 조건으로 72시간 배양을 진행하였다. 접종액의 농도는 본배양액의 1%, 2%, 3%, 4%, 5(v/v)% 농도로 본배양액에 투여하여 최종 OD₆₀₀이 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25가 되도록 진행하였다. 유도제인 갈락토오스(galactose)는 지연기(lag phase)에 첨가하여 배양을 진행하였다. 배양이 종료된 시료는 8,000g, 30분 동안 원심분리를 하여 균을 집균한 후 상층액을 취하였다. 이후, 시료를 16.5% Tris-Tricine gel을 이용한 SDS-PAGE를 통해 브라제인의 발현량을 확인하였다.

2-2. 발현배지의 최적 초기 pH 확인

발현배지에 접종하기 위한 세포는 브라제인 유전자가 형질전환된 S. cerevisiae 세포의 glycerol stock에서 백금선을 이용하여 YPD 고체배지에 도말하고 30℃에서 72시간동안 incubator에서 배양을 진행하였다. 이 후, 고체배지에 자란 세포를 백금선을 이용하여 시험관 안에 YPD 3 mL에 접종한 후 16~18시간, 30℃, 200rpm 조건으로 shaking incubator에서 OD₆₀₀ = 5~6 이 될 때까지 배양하고, 발현배지에 2% 접종하여 본배양을 진행하였다.

발현배지로 YPDG를 이용하였으며, 250 mL 삼각플라스크를 이용하여 YPDG 50 mL에 72시간, 30℃, 200rpm 조건으로 shaking incubator에서 배양을 진행하였다. 최적 pH를 선별하기 위해 아세트산으로 pH을 조절하여, pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5의 총 다섯 가지 배양 조건을 확립하였다. 유도제인 galactose는 지연기(lag phase)에 첨가하여 배양을 진행하였다. 배양이 종료된 시료는 8,000g, 30분 동안 원심분리를 진행해 형질전환된 균체로부터 생성된 브라제인이 포함된 상층액을 취하였다. 이후, 브라제인이 포함된 상층액을 16.5% Tris-Tricine gel을 이용해 SDS-PAGE로 전기영동하여 브라제인 발현량을 확인함으로써, 브라제인이 최대로 발현되는 조건을 확인하였다.

2-3. 최적 배양온도 및 배양시간 확인

발현배지로 YPDG를 이용하였으며, 250 mL 삼각플라스크를 이용하여 YPDG 50 mL에 pH 5.0, 200rpm 조건으로 shaking incubator에서 배양을 진행하였다. 최적 배양온도를 선별하기 위해 23℃, 27℃, 30℃ 세 가지 온도 조건을 조사하였으며, 최적 배양시간을 선별하기 위해 배양 시작 시간부터 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 시간마다 시료를 채취하여 8,000g로 30분 동안 원심분리를 진행해 형질전환된 균체로부터 생성된 브라제인이 포함된 상층액을 취하였다. 이후, 브라제인이 포함된 상층액을 16.5% Tris-Tricine gel을 이용해 SDS-PAGE로 전기영동하여 브라제인 발현량을 확인함으로써, 브라제인이 최대로 발현되는 시간을 확인하였다. 유도제인 galactose는 지연기(lag phase)에 첨가하여 배양을 진행하였다.

2-4. 최적 유도제 농도 및 첨가 시기 확인

발현배지는 YPDG를 이용하였으며, 250 mL 삼각플라스크를 이용하여 YPDG 50 mL에 pH 5.0, 72시간, 30℃, 200rpm 조건으로 shaking incubator에서 배양을 진행하였다.

구체적으로, 유도제의 최적 농도는 발현계를 선별하는 과정에서 확인하였다. 기본 YPDG 배지에서 glucose와 galactose를 전체 배지의 1 내지 2(w/w)%의 농도로 첨가하여 유도제의 농도에 따른 브라제인 발현량을 확인하였다. 특히 TEF promoter의 경우 glucose(%):galactose(%) = 1:0, 1:1, 1:2, 2:0, 2:1, 2:2가 되도록 첨가한 후 발현량을 비교하였다. 또한, 유도제의 최적 첨가 시기를 확인하기 위해 유도제를 지연기(lag phase), 지수기(log phase), 또는 정체기(stationary phase)에 첨가하여 배양을 진행하였다. 배양이 종료된 시료는 8,000g로 30분 동안 원심분리를 진행해 형질전환된 균체로부터 생성된 브라제인이 포함된 상층액을 취하였다. 이후, 브라제인이 포함된 상층액을 16.5% Tris-Tricine gel을 이용하여 SDS-PAGE로 브라제인이 최대로 발현되는 조건을 확인하였다.

실험예 3. 제한배지에서의 재조합 브라제인의 최적 발현조건 선별

3-1. 발현배지의 최적 탄소원(C)/질소원(N) 몰비율 확인

제한배지(defined medium)의 조성은 기본적으로 세포의 구성 요소를 기반으로 결정하였다. 효모 균주를 제한배지에서 배양하여 재조합 단백질을 생산한 연구결과를 참고하여 배지 조성을 결정하였다.

구체적으로, 제한배지를 이용한 발현배지의 조성으로 20 g/L glucose, 1 g/L magnesium sulfate, 0.1 g/L sodium chloride, 0.2 g/L EDTA, 2.54 mg/L manganese chloride, 0.088 mg/L sodium molybdate, 1 mg/L zinc chloride, 129.4 mg/L calcium chloride, 222 mg/L iron(Ⅲ) chloride, 2.84 mg/L copper(Ⅱ) chloride, 0.6 mg/L calcium pantothenate, 0.6 mg/L thiamine, 0.6 mg/L inositol, 0.6 mg/L pyridoxine, 0.6 mg/L nicotinic acid, 0.02 mg/L biotin 이 기본적으로 사용되었으며, 질소원은 ammonium sulfate로 탄소원과의 몰 농도비에 따라 계산하여 첨가하였다. 탄소원으로 계산하는 물질은 glucose와 galactose를 고려하였다. 배양은 250 mL 삼각플라스크를 이용하여 발현배지 50 mL에 pH 5.0, 72시간, 30℃, 200rpm 조건으로 shaking incubator에서 배양을 진행하였다.

발현배지 내의 최적의 C/N 몰비율을 확인하기 위해, C/N 몰비율을 0.1, 0.3, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 6, 8, 10으로 맞추어 배양을 진행하였다. 유도제인 galactose는 2 g/L의 농도로 지연기(lag phase)에 첨가하여 배양을 진행하였다. 배양이 종료된 시료는 8,000g로 30분 동안 원심분리를 하여 형질전환된 균체로부터 생성된 브라제인이 포함된 상층액을 취하였다. 이후, 브라제인이 포함된 상층액을 16.5% Tris-Tricine gel을 이용한 SDS-PAGE에서 브라제인이 최대로 발현량을 확인하였다.

발현배지에 접종하기 위한 세포는 브라제인 유전자가 형질전환된 S. cereviaie 세포의 glycerol stock에서 백금선을 이용하여 YPD 고체배지에 도말하고 30℃에서 72시간동안 incubator에서 배양을 진행하였다. 이 후, 고체배지에 자란 세포를 백금선을 이용하여 시험관안의 YPD 3 mL에 접종한 후 18시간, 30℃, 200rpm 조건으로 shaking incubator에서 OD₆₀₀ = 5~6이 될 때까지 배양하였으며, 본배양액의 최종 OD₆₀₀이 0.1이 되도록 전배양액을 접종한 후, 5,000g, 10분, 20℃ 조건에서 원심분리하여 복합배지 성분을 제거한 후에 발현배지로 재현탁하여 접종하였다.

3-2. 발현배지의 최적 pH 확인

발현배지는 20 g/L glucose, 12.1 g/L ammonium sulfate, 1 g/L magnesium sulfate, 0.1 g/L sodium chloride, 0.2 g/L EDTA, 2.54 mg/L manganese chloride, 0.088 mg/L sodium molybdate, 1 mg/L zinc chloride, 129.4 mg/L calcium chloride, 222 mg/L iron(Ⅲ) chloride, 2.84 mg/L copper(Ⅱ) chloride, 0.6 mg/L calcium pantothenate, 0.6 mg/L thiamine, 0.6 mg/L inositol, 0.6 mg/L pyridoxine, 0.6 mg/L nicotinic acid, 0.02 mg/L biotin를 첨가하여 제작하였다. 배양은 250 mL 삼각플라스크에 발현배지 50 mL를 넣고 72시간, 30℃, 200 rpm 조건으로 shaking incubator에서 배양을 진행하였다.

발현배지의 최적 pH를 확인하기 위해, pH 조건은 크게 2가지 방법으로 나누어 진행하였다: 아세트산으로 초기 pH만을 맞추어 진행하는 것과 potassium phosphate 완충용액을 사용하여 전 과정에서의 배지의 pH 변화를 최소화하여 진행하는 것이다.

아세트산으로 초기 pH를 pH 4.5부터 pH 6.5까지의 총 다섯 가지 pH로 맞추어 비교하였으며, potassium phosphate 완충용액으로는 pH 5.0부터 pH 8.0까지의 총 여섯 가지 pH로 나누어 진행하였다. 유도제인 galactose는 2 g/L의 농도로 지연기(lag phase)에 첨가하여 배양을 진행하였다. 배양이 종료된 시료는 8,000g로 30분 동안 원심분리를 하여 형질전환된 균체로부터 생성된 브라제인이 포함된 상층액을 취하였다. 이후, 브라제인이 포함된 상층액을 16.5% Tris-Tricine gel을 이용하여 SDS-PAGE에서 브라제인의 발현량을 확인하였다.

발현배지에 접종하기 위한 세포는 브라제인 유전자가 형질전환된 S. cereviaie 세포의 glycerol stock에서 백금선을 이용하여 YPD 고체배지에 도말하고 30℃에서 72시간동안 incubator에서 배양을 진행하였다. 이 후, 고체배지에 자란 세포를 백금선을 이용하여 시험관안의 YPD 3 mL에 접종한 후 18시간, 30℃, 200rpm 조건으로 shaking incubator에서 OD₆₀₀ = 5~6이 될 때까지 배양하였으며, 본배양액의 최종 OD₆₀₀이 0.1이 되도록 전배양액을 접종한 후, 5,000g, 10분, 20℃ 조건에서 원심분리하여 복합배지 성분을 제거한 후에 발현배지로 재현탁하여 접종하였다.

3-3. 최적 미량원소 농도 및 최적 비타민 농도 확인

미량원소 및 비타민 등 제한배지와 관련된 최적화 조건은 선행 연구결과를 참고하여 진행하였다. 본 연구에서는 미량원소(trace metal)과 비타민(vitamin)의 농도가 제한배지에서의 브라제인의 발현량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 미량원소 및 비타민을 각각 1%, 2%, 또는 4%의 농도로 첨가하여 실험을 진행하였다. 배양이 종료된 시료는 8,000g로 30분 동안 원심분리를 하여 형질전환된 균체로부터 생성된 브라제인이 포함된 상층액을 취하였다. 이후, 브라제인이 포함된 상층액을 16.5% Tris-Tricine gel을 이용하여 SDS-PAGE에서 브라제인이 최대로 발현되는 조건을 확인하였다. 그 결과, 브라제인 발현을 위한 최적의 미량원소 농도는 20 mg/L 100 × Trace metal이고, 최적의 비타민 농도는 30 mg/mL 100 × Vitamin인 것으로 확인되었다.

상기 연구에서, 발현배지에 접종하기 위한 세포는 브라제인 유전자가 형질전환된 S. cereviaie 세포의 glycerol stock에서 백금선을 이용하여 YPD 고체배지에 도말하고 30℃에서 72시간동안 incubator에서 배양을 진행하였다. 이 후, 고체배지에 자란 세포를 백금선을 이용하여 시험관 안의 YPD 3 mL에 접종한 후 18시간, 30℃, 200rpm 조건으로 shaking incubator에서 OD₆₀₀ = 5~6이 될 때까지 배양하였으며, 본배양액의 최종 OD₆₀₀이 0.1이 되도록 전배양액을 접종한 후, 5,000g, 10분, 20℃ 조건에서 원심분리하여 복합배지 성분을 제거한 후에 발현배지로 재현탁하여 접종하였다.

실험예 4. 발현된 재조합 브라제인의 정제

4-1. 분비발현되지 않은 균체 내 브라제인 양 확인

본 발명에 따른 브라제인 발현 벡터는 유전자 서열 내에 α-mating factor signal 서열이 포함되어 있어 생성된 브라제인 단백질이 세포 밖으로 분비발현된다. 그럼에도 불구하고 분비발현 되지 못하고 균체 내에 남아있는 브라제인이 있는지 확인하기 위해 효모 균체 내에서 브라제인 단백질을 추출하였다.

효모 균체를 분쇄하는 방법으로 200 mM NaOH를 이용하는 방법(Kushnirov, 2000)과 초음파 파쇄기(sonicator)를 이용하여 분쇄하는 방법을 사용하였으며, 균체 내의 단백질을 추출한 후 원심분리기에서 8,000g 에서 3분 원심분리 한 후, 4배 희석한 후 SDS-PAGE를 수행하여 균체 내 남아있는 브라제인 양을 분석하였다.

그 결과, 복합배지 및 제한배지 모두에서 브라제인이 약 92% 이상 분비발현된 것으로 확인되었다. 즉, 균주가 발현한 브라제인의 대부분이 배양액으로 분비되므로, 이하의 실험 과정에서 브라제인의 정제는 배양액 내에 존재하는 브라제인을 대상으로 실시하였다.

4-2. 복합배지에서 발현된 브라제인의 정제

형질전환된 균주의 배양을 마친 후, 균체(pellet)는 제거하고 상층액(supernatant)을 얻기 위해 8,000g, 4℃, 30분 원심 분리한 후 양이온 교환수지로 정제하였다. 이 때, 브라제인의 pI 값이 5.4 이기 때문에 이보다 낮은 pH 4를 맞추기 위해 아세트산을 이용하였다. CM Sepharose Fast flow 비드(bead)를 컬럼에 충진하고 비드 부피 20배 정도의 평형완충용액(50 mM NaOAc, pH 4)을 흘려 평형시킨 컬럼에 브라제인 배양액을 1 ml/min 유속으로 로딩(loading)하였다. 로딩 후 세척완충용액 (0.05 M NaOAc, 50 mM NaCl, pH 4)을 흘려 OD₂₈₀가 변하지 않을 때까지 세척을 진행한 후, 용출완충용액(50 mM NaOAc, 400 mM NaCl, pH 4)으로 교환하여 5 ml씩 분획 용출을 받았다. 이 후 분획은 OD₂₈₀을 측정하여 예측되는 브라제인 용출 구간을 이차 증류수로 투석하여 완충용액에 포함된 염을 제거한 후 동결건조 하였다.

4-3. 제한배지에서 발현된 브라제인의 정제

형질전환된 균주의 배양을 마친 후, 배양 배지를 8,000g, 4℃, 30분 원심 분리한 후 균체(pellet)과 상층액을 분리하였다. 이어서 3.5 kDa 투석막을 사용하여 증류수로 상층액을 투석하여 배지성분 중 저분자량 물질들과 염을 제거하였다. 투석은 첫 투석액은 1시간 내에 교체하고, 그 후 8시간씩 3회 교체하여 실시하였다. 투석 된 샘플을 Amicon® ultra-15 10k (Merck Millipore co., Ltd, Billeerica, Mass., USA)을 이용하여 상층액에 남아있는 브라제인 외의 단백질을 분리하고, 다시 Amicon® ultra-15 3k 를 사용하여 상층부에 남아있는 정제되고 농축된 브라제인을 얻었다.

실험예 5. 단백질 전기영동

브라제인의 순수도는 Schagger and von Jagow(1987) 방법에 따라 전기영동하여 확인하였다. 브라제인은 6.5 kDa 크기의 작은 단백질이기 때문에 전기영동으로 확인하기 위해 16.5% 겔(gel)을 제조하여 SDS-PAGE를 실시하였다. Separating gel(40% Acrylamide 2.18 ml, 3 M Tris-HCl/SDS 2.165 ml, D.W. 0.6 ml, 10% APS 85 μl, TEMED 4μl)과 Stacking gel(30% Acrylamide 0.335 ml, 3 M Tris-HCl/SDS 0.625 ml, D.W. 1.5 ml, 10% APS 30 μl, TEMED 2 μl)를 이용하여 겔을 제조하였다. 시료는 1 well당 20 μl를 주입하였고, 5 x Tricine loading buffer를 이용하여 95℃에서 3분간 heat block에서 열을 가해 변성과정을 거친 후 진행하였다.

단백질 Marker는 Dokdo-Mark^TM broad-range protein marker(EBM-1032, ELPiS, Daejeon, Korea), Bio-FACT 사의 Triple color protein marker와 BLUelf pre-strained protein ladder(Gene DireX, Taiwan)을 사용하였다. 50V로 전기영동하였고, 전기영동 후 gel은 Coomassie brillant blue R-250으로 염색하고, 메탄올 10%와 아세트산 10%를 첨가한 탈염색약을 이용하여 염색된 겔을 탈색하였다.

실험예 6. 재조합 브라제인에 대한 정제표

6-1 UV 정량법

대부분의 단백질은 205 nm에서의 고유의 흡광 계수를 가지고 있기 때문에, 정제된 브라제인을 205 nm에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다(Scopes, 1974).

UV/Vis 흡광 광도계의 기준 흡광도는 브라제인 샘플을 용해시킨 용매로 측정하여 고정하였다. 각 단백질 샘플은 미광 효과(stray effect)를 최소화시키기 위해 205 nm 에서의 흡광도 값이 0.3~0.4범위에 근접할 때까지 점차적으로 희석하여 측정하였다. 희석시킨 단백질 용액은 205 nm 와 280 nm 에서의 흡광도를 각각 3회 측정하여 평균값을 구하였다. 그 후, 식 : ε₂₀₅ ^{1.0 mg/mL} = 27.0 + 120 (A₂₈₀/A₂₀₅) 을 이용하여 각 단백질 샘플의 고유 몰 흡광계수를 구하였다(Ide, Masuda, & Kitabatake, 2007).

본 단백질의 농도는 Concentration(mg/mL) = A205/ε205 ^1mg/mL의 식을 이용하여 구한 값에 희석배수를 곱하여 구하였다.

6-2 BCA 정량법

BCA 정량법은 단백질이나 펩타이드의 존재를 확인하는 정색반응(colorimetric assay) 중 하나이다. 2개의 펩타이드 결합을 가진 화합물은 알칼리 용액에서 묽은 황산구리 용액을 처리하면 구리(copper) 이온의 환원 반응 (Cu²⁺→Cu¹⁺)이 일어나 보라색 또는 자주색을 띠는 착화합물을 생성한다. 이 때 단백질의 농도에 따라 형성되는 착화합물의 양이 달라지기 때문에 농도를 다르게 한 표준단백질용액을 알칼리성 황산구리와 반응시킨 후 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성한다.

BCA protein assay kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA)를 이용해 진행하였고, 표준 물질로는 Bovine Serum Albumin (BSA)를 이용하였다. BCA를 측정하기 위해 Reagent A와 Reagent B를 50:1 비율로 혼합하여 Working Reagent(WR)를 제작하였다. Microplate well에 시료를 25 ㎕ 넣고 Working Reagent(WR)를 200 ㎕ 혼합한 후, Plate를 호일로 감싸 빛을 차단하고 Shaking incubator에서 37℃, 30분 동안 incubation 하고, 상온에서 plate를 식혔다. 그 후 OD₅₆₂를 측정하여 표준곡선에 값을 대입해 정량하였다.

실험예 7. Ascending 시험법에 의한 브라제인 단맛 활성 측정

브라제인은 당이 아닌 단백질이기 때문에 당도계를 이용하여 단맛을 측정할 수 없다. 따라서, 사람이 직접 맛을 봄으로써 브라제인의 활성을 측정하는 맛 test를 이용하여 활성 측정을 진행하였다.

먼저 브라제인을 증류수에 최종농도가 1.0 mg/mL가 되도록 녹인 뒤, 30~0.05 ng/mL가 되게 시험 농도를 달리 하여 시료를 만들어 용액의 단맛을 보고 최초로 단맛을 느끼는 역치값을 구하였으며, 야생형 브라제인에 대한 상대활성으로 나타내었다. 구체적인 활성 측정방법은 다음과 같이 진행하였다.

단맛 테스트에 훈련된 남성 10명, 여성 10명으로 총 20명의 패널을 구성하였다. 활성 측정 전 미리 피실험자에게 테스트 진행 날짜와 시간을 공고하여 최상의 컨디션에서 맛을 보게 하였으며, 테스트 전날 음주 및 테스트 직전 음식 섭취 및 흡연 등을 금하였다. 피실험자는 사전에 훈련된 피실험자는 준비된 2차 증류수로 입안을 헹군 후 각 종류별 농도에 따른 샘플을 500 μl씩 저농도에서 고농도 순으로 맛을 보면서 단맛을 최초로 느끼는 농도를 역치값으로 하였다. 각 샘플을 테스트하기 전에 2차 증류수로 10초 동안 입을 헹구도록 하였다. 결과 데이터는 Q 테스트를 통해 의심스러운 값은 버리고 표준편차를 최소화하였으며 평균을 통해 데이터를 얻었다. 재조합 브라제인의 단맛 활성 측정을 위한 평가표는 도 3에 나타냈다.

단맛 테스트 결과, S. cerevisiae 야생형 브라제인의 단맛활성은 Sucrose 질량 대비 약 2,260(±5.9%) 배의 단맛 활성을 나타내었으며, 이는 K.lactis 야생형 브라제인 단맛활성[2,309(±6.8%) 배]과 거의 비슷함을 알 수 있었다.

[실시예]

실시예 1. 발현 균주 및 벡터 선정

감미단백질 브라제인에 대한 최적의 발현계를 만들기 위해, 실험예 1-1 내지 1-3에 따라 2가지 발현벡터를 준비한 후 3종류의 S. cerevisiae 균주에 형질전환하여 6종류의 발현계를 제조하였다. 균주의 세포밀도(density)와 상태(phase)가 브라제인 발현에 미치는 영향을 줄이기 위하여 각 균주의 세포성장곡선(cell growth curve)을 작성하였다(도 4). INVSc1, Y2805, BY4741 균주 모두 16~18시간 배양을 진행하였을 때, log phase에 도달하였으며, UV로 OD₆₀₀을 측정하여 cell 농도를 OD₆₀₀ = 0.2로 맞추어 본배양을 진행하였다.

이어서 브라제인 발현을 위한 최적의 발현계를 선별하기 위해 실험예 1-7에 따라 브라제인 발현량을 비교하였다. 또한, 발현벡터에 따른 목적 단백질인 브라제인의 최대 발현량을 알아보기 위해 유도제의 농도를 변화시켰다. pD1214-FAKS백터로 형질전환된 균주는 glucose(w/w)% : galactose(w/w)%를 1:0, 1:1, 1:2, 2:0, 2:1, 또는 2:2 로 첨가하여(도 5), pESC-URA 벡터는 glucose(w/w)% : galactose(w/w)%를 0:1, 1:1, 2:1, 0:2, 1:2, 또는 2:2로 첨가하여 발현을 진행한 후, 생성된 브라제인의 양을 비교했다(도 6). 이로부터 각각의 균주와 벡터에서 브라제인이 가장 발현된 유도제의 농도를 확인하여 최적 유도제 농도를 설정하였으며, 이어서 최적 농도의 유도제를 처리하였을 때의 각 발현계에 의한 브라제인 발현량을 SDS-PAGE로 비교했다. 그 결과, 브라제인 발현량은 glucose(w/w)% : galactose(w/w)% = 1:2일 때 가장 높았으며, pESC-Brazzein/Y2805 발현계에서 재조합 브라제인의 발현량이 가장 높은 것을 알 수 있었다(도 7 및 도 8). 반면에 가장 발현량이 적은 발현계는 pD1214-Brazzein/BY4741이었으며, 특히 glucose(w/w)% : galactose(w/w)% = 1:0일 때 가장 발현량이 낮았다는 것도 알 수 있었다.

일반적으로 plasmid high copy number는 고발현을 유도하지만(gene dosage effect), copy number가 너무 높거나 과발현 되는 경우 숙주 세포에 대사적 불균형을 초래하여 균체 증식속도나 증식율을 감소시키고 plasmid의 불안정을 유발하여 재조합 단백질 전체 생산성을 감소시키는 원인이 되기도 한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 유도성(inducible) 프로모터(promoter)를 도입하여 균체 증식과 유전자 발현을 분리하여 조절한다(Lim, Chung, Nam, & Chang, 1996). 효모 S. cerevisiae에서 사용되는 유도성 promoter인 GAL promoter는 포도당 존재 시 전사가 억제되며, 포도당 고갈 후 galactose에 의해 전사가 되는 catabolite repression 조절을 받는다. 따라서, TEF Promoter를 가진 pD1214-FAKS보다 GAL promoter를 가진 pESC-URA 벡터가 브라제인 발현량이 높다고 판단된다.

따라서, pESC-Brazzein/Y2805 발현계를 브라제인 발현에 최적화된 발현계로 선정하고, 이하 pESC-Brazzein/Y2805 발현계에 의한 브라제인 발현의 최적 조건 및 최적 정제 조건을 확인하였다.

실시예 2. 복합배지에서 pESC-Brazzein/Y2805 발현계에 의한 브라제인 발현의 최적 조건

pESC-Brazzein/Y2805 발현계를 복합배지에서 배양하는 경우 브라제인의 발현에 최적화된 조건을 확인하기 위해, 실험예 2에 따라 다양한 조건에 따른 브라제인 발현량을 비교하였다.

2-1. 복합배지에서의 브라제인 발현을 위한 최적 copy number

브라제인이 가장 적절하게 발현되게 하는, 형질전환된 플라스미드의 균주 내 copy number를 파악하기 위해 copy number에 따른 브라제인 발현량을 비교하였다. 플라스미드의 copy number는 실시예 1-5에 따라qRT-PCR로 측정하였으며, copy number는 5, 20, 30, 40, 50, 또는 60이었다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 효모 S. cerevisiae에 삽입된 발현벡터의 copy number에 따라 브라제인의 발현량이 다르게 나타났다. copy number가 40 내지 60일 때 브라제인의 발현량이 최대인 것으로 나타났으며, 특히 copy number 40 이상부터는 발현량이 크게 변화하지 않았다(도 10).

2-2. 복합배지에서의 브라제인 발현을 위한 최적 전배양액 농도

다음으로 실험예 2-1에 따라 접종하는 전배양의 농도에 따른 브라제인 발현량을 비교하여 최적의 전배양액 농도를 확인하였다. 고체 배지에서 자라난 콜로니(colony)를 채취하여 액체 배지에 접종하여 16 ~ 18시간 동안 전배양을 진행한 후, 전배양액을 미리 만들어 놓은 대량 발현 배지에 접종하여 배양하였다. 이 때에 접종하는 전배양의 농도는 본배양액의 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%로 조절하였고, 접종 후 본배양액의 OD₆₀₀은 각각 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 또는 0.25였다.

배양 후 SDS-PAGE로 Tris-tricine gel 상에서 브라제인 발현 양상을 비교한 결과, 전배양액 농도가 3%, 본배양 OD₆₀₀이 0.15일 때 브라제인 발현량이 최대였으며, 5%의 전배양액 농도의 발현량보다 158% 높았다(도 11 및 도 12). OD₆₀₀이 0.05 또는 0.1인 경우, 브라제인을 발현할 수 있는 세포의 수가 OD₆₀₀이 0.15일 때보다 적어 브라제인 발현이 낮은 것으로 보이며, OD₆₀₀이 0.2 또는 0.25인 경우 세포의 양이 많아지면서 산화적 스트레스 등과 세포의 성장의 문제로 단백질의 발현이 낮은 것으로 생각되며 적절한 양의 세포밀도가 필요한 것으로 보인다.

따라서, inoculation을 위한 최적 전배양액 농도는 OD₆₀₀이 0.15일 때인 것으로 확인되었다.

2-3. 복합배지에서의 브라제인 발현을 위한 최적 초기 pH

다음으로 실험예 2-2에 따라 발현배지의 초기 pH에 따른 브라제인 발현량을 비교하여 최적의 초기 pH를 선별하였다. 초기 pH는 pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 또는 6.5로 조절하여 비교하였다.

그 결과, 발현배지의 pH가 달라지더라도 세포의 수에는 큰 차이가 없었으나(도 13), 배양이 종료된 후 배지 내의 브라제인 발현량을 SDS-PAGE로 비교했을 때 배지의 초기 pH에 따라 브라제인의 발현량에 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다(도 14). 구체적으로, 초기 pH가 pH 6.0일 때 브라제인의 발현량이 최대를 나타냈으며, 이는 pH 4.5 일 때의 브라제인 발현량에 비해 약 180% 높은 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 복합배지에서의 브라제인 발현을 위한 최적의 초기 pH는 pH 6.0으로 선별하였다.

2-4. 복합배지에서의 브라제인 발현을 위한 최적 배양온도 및 배양시간

세포의 배양온도에 따라 세포 내 에너지 대사, 산화적 스트레스, 단백질 접힘, 아미노산 대사, RNA와 리보솜의 생합성 등의 영향을 받기 때문에 본 발명에 따른 형질전환된 세포가 재조합 브라제인을 적절히 발현할 수 있도록 최적의 온도 조건을 확립할 필요가 있었다. 따라서 실험예 2-3에 따라 배양온도 및 시간에 따른 브라제인 발현량을 비교하여 최적의 배양온도 및 시간을 확인하였다. 배양온도는 23℃, 27℃, 30℃ 세 가지 온도 조건을 비교하였으며, 배양시간은 6, 12, 24, 48, 72, 96, 및 120 시간으로 나누어 비교하였다.

그 결과, 23℃ 및 27℃의 배양온도의 경우 96시간 배양하였을 때 브라제인 발현량이 높았으며, 30℃에서는 72시간 배양하였을 때 최대 브라제인 발현량을 나타내었다(도 15). 종합적으로는, 30℃의 배양온도에서 72시간 동안 배양했을 때 최대의 브라제인 발현량을 나타냈다(도 16). 배양시간이 72시간을 넘어도 브라제인 발현량은 크게 변하지 않았는데, 이는 해당 시점부터 유도제가 모두 사용된 것으로 추측된다. 또한, 72시간 이후의 배양은 브라제인 외의 단백질의 발현이 늘어날 수 있어 오히려 정제에 악영향을 미칠 수 있을 것으로 보인다. 따라서, 최적 배양온도는 30℃이고, 최적 배양시간은 72시간인 것으로 확인하였다.

2-5. 복합배지에서의 브라제인 발현을 위한 최적 유도제 농도 및 유도제 첨가 시기

마지막으로, 실험예 2-4에 따라 유도제 첨가 시기에 따른 브라제인 발현량을 비교하여 최적의 유도제 농도 및 유도제 첨가 시기를 확인하였다. 전술한 바와 같이, 최적 유도제 농도는 발현계를 선별하는 과정에서 확인하였다. glucose와 galactose의 농도를 pD1214-FAKS백터는 glucose(w/w)% : galactose(w/w)% = 1:0, 1:1, 1:2, 2:0, 2:1, 또는 2:2가 되도록 첨가하였으며, pESC-URA 벡터는 glucose(w/w)% : galactose(w/w)% = 0:1, 1:1, 2:1, 0:2, 1:2, 또는 2:2가 되도록 첨가한 후 균주를 배양하여 브라제인 발현량을 비교하였다. 또한, 유도제를 lag phase, log phase, 또는 stationary phase에 첨가한 후 브라제인 발현량을 비교했다.

그 결과, 도 6에서 확인한 바와 같이 pESC-URA vector의 발현량은 유도제로 glucose(w/w)% : galactose(w/w)%가 1:2로 첨가되었을 때 가장 높은 것으로 나타났다. 따라서, 복합배지와 제한배지 모두 최적 유도제 농도는 glucose(w/w)% : galactose(w/w)% = 1:2인 것으로 확인하였다.

또한 log phase일 때 유도제를 첨가한 배지에서 브라제인이 최대로 발현한 것을 확인하였다(도 17). 구체적으로, log phase에서 유도제를 첨가하였을 때가 stationary phase에서 첨가하였을 때에 비해 브라제인의 발현량이 78% 정도 더 높았다(도 18). log phase 또는 stationary phase에 유도제를 첨가하는 것이 lag phase에 첨가할 때보다 브라제인 발현량이 높은 이유는, lag phase는 세포 성장과 단백질 발현이 동시에 일어나는 시기로서 첨가된 유도제가 세포 성장에 소비될 수 있는 반면, log phase 또는 stationary phase는 세포의 성장이 어느정도 완료된 시기로서 유도제가 온전히 단백질 발현에만 사용될 수 있기 때문인 것으로 생각된다.

실시예 3. 제한배지에서 pESC-Brazzein/Y2805 발현계에 의한 브라제인 발현의 최적 조건

pESC-Brazzein/Y2805 발현계를 제한배지에서 배양하는 경우 브라제인의 발현에 최적화된 조건을 확인하기 위해, 실험예 3에 따라 다양한 조건에 따른 브라제인 발현량을 비교하였다. 제한배지에서의 브라제인 발현은 복합배지 배양에서 확인한 최적 조건인 30℃, 72시간의 배양시간, 및 glucose(w/w)% : galactose(w/w)% = 1:2의 유도제 첨가 등의 조건으로 진행했고, 최적의 배지 조성을 추가로 확인하였다.

3-1. 제한배지에서의 브라제인 발현을 위한 최적 C/N 몰비율

실험예 3-1에 따라 배지 내 탄소원(C)/질소원(N)의 몰비율에 따른 브라제인 발현량을 비교하여 최적의 C/N 몰비율을 확인하였다. 구체적으로, 0.1, 0.3, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 6, 8, 10의 10가지 C/N 몰비율을 비교하였다.

그 결과, C/N 몰 비율이 6:1일 때 브라제인의 발현량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다(도 19 및 20).

3-2. 제한배지에서의 브라제인 발현을 위한 최적 pH

다음으로, 실험예 3-2에 따라 제한배지의 pH에 따른 브라제인 발현량을 비교하여 최적 pH를 확인하였다. 복합배지에서는 양이온 교환 수지를 사용하여 정제를 진행하기 때문에 완충용액을 이용한 pH 조절이 제한되지만, 제한배지의 경우 정제를 분자의 크기로 분리하는 amicon filter 로 진행하기 때문에 완충용액 사용이 가능하므로, 아세트산 또는 potassium phosphate 완충용액으로 pH를 조절했다. 구체적으로는 전술한 바와 같이 아세트산(acetic acid)으로 초기 pH를 조절하거나, 또는 potassium phosphate 완충용액으로 전 과정에서 pH를 최대한 일정하게 조절하였다.

아세트산으로는 pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 및 6.5의 총 다섯 가지 초기 pH를 확립하여 브라제인 발현량을 비교하고, potassium phosphate 완충용액으로는 pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 및 8.0의 총 여섯 가지 pH를 확립하여 브라제인 발현량을 비교하였다.

그 결과, 아세트산 또는 potassium phosphate 완충용액으로 pH를 조절한 두 경우 모두 pH 6.0일 때 브라제인의 발현량이 가장 높았다(도 21 및 22). 또한, 아세트산으로 배양 초기에 배지 pH를 조절한 것보다, 전체 배양시기에 걸쳐 potassium phosphate 완충용액으로 pH를 유지했을 때 전체적으로 브라제인 발현량이 높은 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 제한배지에서의 브라제인 발현을 위해서는 potassium phosphate 완충용액으로 pH를 6.0을 유지하는 것이 가장 최적인 것으로 확인되었다.

3-3. 제한배지에서의 브라제인 발현을 위한 최적 조건

마지막으로, 제한배지에서 브라제인을 발현시키기 위한 최적 조건을 확인하기 위해, 다양한 배양 조건(C/N 비율, pH, 미량원소, 비타민)을 조합한 후 브라제인 발현량을 비교하였다. 실험예 3-3에서 기술한 바와 같이, 미량원소 및 비타민 등 제한배지와 관련된 최적화 조건은 선행 연구결과를 참고하여 진행하였으며, 브라제인 발현을 위한 최적의 미량원소 농도는 20 mg/L 100 × Trace metal이고, 최적의 비타민 농도는 30 mg/mL 100 × Vitamin인 것으로 진행하였다.

그 결과, 실시예 3-1 및 3-2에서 확인한 최적 C/N 비율(6:1) 및 pH(pH 6)를 맞춰주고, 상기 최적 농도의 미량원소 및/또는 최적 농도의 비타민을 함께 배지에 첨가했을 때 브라제인 발현량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다(도 23).

실시예 4. 재조합 브라제의 정제 조건

실시예 2 및 3에서 선별한 최적 조건으로 복합배지 또는 제한배지에서 형질전환 균주를 배양한 후, 분비발현된 브라제인을 정제하기 위한 최적 조건을 실험예 4에 따라 진행하였다.

4-1. 복합배지에서 발현된 재조합 브라제인의 정제

복합배지에서 발현된 재조합 브라제인은 실험예 4-2에 따라 정제하였다. 구체적으로, 분비발현된 브라제인은 CM-Sepharose chromatography (양이온 교환수지 크로마토그래피)를 이용하여 배지로부터 정제하였다. 배양액을 8,000g로 30분 동안 원심분리하여 균을 제거한 상층액으로부터 브라제인을 정제하였다. 아세트산으로 상층액의 pH를 pH 4.0이 되도록 맞춘 후, CM beads 부피의 약 6배가 되는 상층액을 로딩(loading)하였다. 이 때, 발현된 브라제인의 손실을 줄이기 위해, 즉 수율을 높이기 위해 상층액의 여액을 2번 반복하여 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후 세척완충용액 (50 mM NaOAc, 50 mM NaCl, pH 4)으로 OD₂₈₀이 변화가 없을 때까지 세척을 진행하였다. 즉 컬럼부피의 약 13배 이상의 용액으로 세척을 진행하였으며, 용출(elution)은 용출완충용액(50 mM NaOAc, 400 mM NaCl, pH 4)으로 1 ml씩 분획하였다. 용출된 분획은 OD₂₈₀을 측정하여 단백질이 있다고 예상되는 분획들에 대해 이차 증류수로 3회 투석하여 동결건조 하였다. 정제된 브라제인의 순수도는 SDS-PAGE로 확인하였다(도 24 및 도 25).

한편, 세척용액의 NaCl 농도를 정하기 위해 여러 농도에서 실험한 결과, 50 mM NaCl을 포함하는 세척용액 (wash buffer)으로 세척했을 때 최대의 순수한 브라제인을 얻을 수 있었다.

4-2. 제한배지에서 발현된 재조합 브라제인의 정제

제한배지에서 발현된 재조합 브라제인은 실험예 4-3에 따라 정제하였다. 구체적으로, 제한배지에서의 분비발현된 브라제인의 정제는 다음과 같이 수행하였다. 배양이 종료된 배지를 8,000g, 30분, 4℃ 조건에서 원심분리를 진행하여 세포와 상층액을 분리한 후, 3.5 kDa cut off 투석막을 이용하여 증류수로 투석하였다. 증류수는 24시간 동안 8시간마다 교체를 하였다. 투석이 끝난 샘플은 Amicon^® ultra-15 10k (Merck Millipore co., Ltd, Billeerica, Mass., USA)를 사용하여 8,000g 에서 20분간 진행하여 브라제인을 정제하였다. 정제된 브라제인의 순수도는 SDS-PAGE로 확인하였다(도 26).

4-3. 재조합 브라제인에 대한 정제표(브라제인의 수율 확인)

최종적으로 발현 및 정제조건을 최적화 했을 때, 브라제인의 수율은 실험예 6에 따라 BCA 정량법, 205 nm에서의 흡광도 측정 및 동결건조 후 질량 측정하는 방법을 통해 계산하였다.

최적화된 발현조건에서 생산된 재조합 브라제인의 순도를 SDS-PAGE를 밀도 분석하여 브라제인의 발현량을 계산하였다. 그 결과, 복합배지에서 분비발현된 브라제인의 발현량은 분비발현된 전체 단백질 중 32% 정도가 브라제인에 해당하며, 1리터 배양했을 때 약 290 mg이 분비발현된 것을 확인할 수 있었다(표 5).

제한배지에서는 분비발현된 전체 단백질 중 44% 정도가 브라제인에 해당하여 약 270 mg이 분비발현된 것으로 확인되었으며(표 6), 따라서 분비발현된 양은 제한배지에서 보다 복합배지에서 더 많은 양의 브라제인이 발현된 것을 알 수 있었다.

그러나 제한배지에서는 분비발현된 브라제인 외의 다른 단백질 양이 적어서 정제과정에서 정제수율이 더 좋은 것으로 나타났다. 복합배지와 제한배지는 각각 36%와 43%의 정제 효율을 나타내었으며, 복합배지와 제한배지에서 각각 103 mg과 114 mg의 순수한 브라제인을 얻을 수 있었다(표 5 및 6). 따라서 복합배지보다 생산단가가 저렴한 제한배지에서 더 많은 정제된 브라제인을 얻을 수 있어 제한배지를 이용하는 발현계가 효율적인 생산계라고 판단된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> A recombinant expression vector for the high expression of brazzein in Saccharomyces cerevisiae and a method for the mass production of brazzein using the same <130> MP20-254 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Brazzein <400> 1 gacaagtgca agaaggtcta cgagaactac cccgtgtcca actgtcaact ggctaatcag 60 tgcaactacg attgcaagct cgacaagcac gctcgctccg gcgaatgctt ctacgatgag 120 aagcgcaacc tgcagtgcat ttgcgactac tgcgagtac 159 <210> 2 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized DNA sequence of Brazzein <400> 2 gacaagtgca gaaaagtata cgagaattat ccggtgtcaa agtgtcagtt agcaaatcag 60 tgtaattatg actgcaagtt ggataaacga gcacgttccg gagactgttt ttatgacaag 120 aagaggaatt tacaatgcat atgcgactat tgtgagtat 159 <210> 3 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Brazzein <400> 3 Asp Lys Cys Lys Lys Val Tyr Glu Asn 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accataccac agcttttcaa ttcaattcat catttttttt ttattctttt ttttgatttc 240 ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa cgaaggaagg 300 agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtagtgt tgaagaaaca tgaaattgcc 360 cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatcatgt 420 cgaaagctac atataaggaa cgtgctgcta ctcatcctag tcctgttgct gccaagctat 480 ttaatatcat gcacgaaaag caaacaaact tgtgtgcttc attggatgtt cgtaccacca 540 aggaattact ggagttagtt gaagcattag gtcccaaaat ttgtttacta aaaacacatg 600 tggatatctt gactgatttt tccatggagg gcacagttaa gccgctaaag gcattatccg 660 ccaagtacaa ttttttactc ttcgaagaca gaaaatttgc tgacattggt aatacagtca 720 aattgcagta ctctgcgggt gtatacagaa tagcagaatg ggcagacatt acgaatgcac 780 acggtgtggt gggcccaggt attgttagcg gtttgaagca ggcggcagaa gaagtaacaa 840 aggaacctag aggccttttg atgttagcag aattgtcatg caagggctcc ctatctactg 900 gagaatatac taagggtact gttgacattg cgaagagcga caaagatttt gttatcggct 960 ttattgctca aagagacatg ggtggaagag atgaaggtta cgattggttg attatgacac 1020 ccggtgtggg tttagatgac aagggagacg cattgggtca acagtataga accgtggatg 1080 atgtggtctc tacaggatct gacattatta ttgttggaag aggactattt gcaaagggaa 1140 gggatgctaa ggtagagggt gaacgttaca gaaaagcagg ctgggaagca tatttgagaa 1200 gatgcggcca gcaaaactaa aaaactgtat tataagtaaa tgcatgtata ctaaactcac 1260 aaattagagc ttcaatttaa ttatatcagt tattacccta tgcggtgtga aataccgcac 1320 agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat 1380 tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa 1440 tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca 1500 agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg 1560 gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta 1620 aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg 1680 cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa 1740 gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg 1800 gcgcgtccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc 1860 ttcgctatta cgccagctga attggagcga cctcatgcta tacctgagaa agcaacctga 1920 cctacaggaa agagttactc aagaataaga attttcgttt taaaacctaa gagtcacttt 1980 aaaatttgta tacacttatt ttttttataa cttatttaat aataaaaatc ataaatcata 2040 agaaattcgc ttatttagaa gtgtcaacaa cgtatctacc aacgatttga cccttttcca 2100 tcttttcgta aatttctggc aaggtagaca agccgacaac cttgattgga gacttgacca 2160 aacctctggc gaagaattgt taattaagag ctcagatctt atcgtcgtca tccttgtaat 2220 ccatcgatac tagtgcggcc gccctttagt gagggttgaa ttcgaatttt caaaaattct 2280 tacttttttt ttggatggac gcaaagaagt ttaataatca tattacatgg cattaccacc 2340 atatacatat ccatatacat atccatatct aatcttactt atatgttgtg gaaatgtaaa 2400 gagccccatt atcttagcct aaaaaaacct tctctttgga actttcagta atacgcttaa 2460 ctgctcattg ctatattgaa gtacggatta gaagccgccg agcgggtgac agccctccga 2520 aggaagactc tcctccgtgc gtcctcgtct tcaccggtcg cgttcctgaa acgcagatgt 2580 gcctcgcgcc gcactgctcc gaacaataaa gattctacaa tactagcttt tatggttatg 2640 aagaggaaaa attggcagta acctggcccc acaaaccttc aaatgaacga atcaaattaa 2700 caaccatagg 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cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg agaaggtttt 3600 gggacgctcg aagatccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 3660 gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 3720 gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 3780 taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 3840 cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 3900 ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 3960 aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 4020 tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 4080 gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 4140 cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 4200 ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 4260 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 4320 gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 4380 cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 4440 tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 4500 ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 4560 aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 4620 atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 4680 ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 4740 tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 4800 agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 4860 taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 4920 tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 4980 cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 5040 ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 5100 tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 5160 tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 5220 cccggcgtca 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cgtttactga ttactagcga agctgcgggt gcattttttc aagataaagg 6120 catccccgat tatattctat accgatgtgg attgcgcata ctttgtgaac agaaagtgat 6180 agcgttgatg attcttcatt ggtcagaaaa ttatgaacgg tttcttctat tttgtctcta 6240 tatactacgt ataggaaatg tttacatttt cgtattgttt tcgattcact ctatgaatag 6300 ttcttactac aatttttttg tctaaagagt aatactagag ataaacataa aaaatgtaga 6360 ggtcgagttt agatgcaagt tcaaggagcg aaaggtggat gggtaggtta tatagggata 6420 tagcacagag atatatagca aagagatact tttgagcaat gtttgtggaa gcggtattcg 6480 caatatttta gtagctcgtt acagtccggt gcgtttttgg ttttttgaaa gtgcgtcttc 6540 agagcgcttt tggttttcaa aagcgctctg aagttcctat actttctaga gaataggaac 6600 ttcggaatag gaacttcaaa gcgtttccga aaacgagcgc ttccgaaaat gcaacgcgag 6660 ctgcgcacat acagctcact gttcacgtcg cacctatatc tgcgtgttgc ctgtatatat 6720 atatacatga gaagaacggc atagtgcgtg tttatgctta aatgcgtact tatatgcgtc 6780 tatttatgta ggatgaaagg tagtctagta cctcctgtga tattatccca ttccatgcgg 6840 ggtatcgtat gcttccttca gcactaccct ttagctgttc tatatgctgc cactcctcaa 6900 ttggattagt 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ccaaacgacg agcgtgacac 660 cacgatgcct gtagcgatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 720 tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 780 tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatccggag ccggtgagcg 840 tggttctcgc ggtatcatcg cagcgctggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 900 tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 960 aggtgcctca ctgattaagc attggtaact catgaccaaa atcccttaac gtgagttacg 1020 cgcgcgtcgt tcactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 1080 ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 1140 tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggt tcagcagagc 1200 gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta gcccaccact tcaagaactc 1260 tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 1320 cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 1380 gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 1440 actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 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gaccttgagg 2340 gtgatttcga cgtcgctgtt ttgcctttct ctaactccac taacaacggt ttgttgttca 2400 ttaacaccac tatcgcttcc attgctgcta aggaagaggg tgtctctctc gagaaaagag 2460 ataagtgtaa gaaggtttac gaaaattacc cagtttctaa gtgtcaattg gctaaccaat 2520 gtaattacga ttgtaagttg gataagcatg ctagatctgg tgaatgtttt tacgatgaaa 2580 agagaaactt gcaatgtatt tgtgattact gtgaatacta atgataatcc aggtaacagt 2640 ctcgagtggt tgaatcatgt aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctccccccac 2700 atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt 2760 ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 2820 gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgttgagaa ggttttggga 2880 cgctcgaagg ctttaatttg cggcccctca cctgcacgca aaaagctttt caattcaatt 2940 catcattttt tttttattct tttttttgat ttcggtttct ttgaaatttt tttgattcgg 3000 taatctccga acagaaggaa gaacgaagga aggagcacag acttagattg gtatatatac 3060 gcatatatag tgttgaagaa acatgaaatt gcccagtatt ttaacccaac tgcacagaac 3120 aaaaaccagc aggaaacgaa gataaatcat gtcgaaagct acatataagg aacgtgctgc 3180 tactcatcct agtcctgttg ctgccaagct atttaatatc atgcacgaaa agcaaacaaa 3240 cttgtgtgct tcattggatg ttgtaccacc aaggaattac tggagttagt tgaagcatta 3300 ggtcccaaaa tttgtttact aaaaacacat gtggatatct tgactgattt ttccatggag 3360 ggcacagtta agccgctaaa ggcattatcc gccaagtaca attttttact cttcgaagat 3420 agaaaatttg ctgacattgg taatacagtc aaattgcagt acccagaata gcagaatggg 3480 cagacattac gaatgcacac ggtgtggtgg gcccaggtat tgttagcggt ttgaagcagg 3540 cggcagaaga agtaacaaag gaacctagag gccttttgat gttagcagaa ttgtcatgca 3600 agggctccct atctactgga gaatatacta agggtactgt tgacattgcg aaaagcgaca 3660 aagattttgt tatcggcttt attgctcaaa gagacatggg tggaagagat gaaggttacg 3720 attggttgat tatgacaccc ggtgtgggtt tagatgacaa gggagatgca ttgggtcaac 3780 agtatagaac cgtggatgat gttgtctcta caggatctga cattattatt gttggaagag 3840 gactatttgc aaagggaagg gatgctaagg tagagggtga acgttacaga aaagcaggct 3900 gggaagcata tttgagaaga tgcggcagca aaactaaaaa actgtattat aagtaaatgc 3960 atgtatacta aactcacaaa ttagagcttc aatttaatta tatcagttat tacccacgct 4020 atgatccaat atcaaaggaa atgatagcat tgaaggatga gactaatcca attgaggagt 4080 ggcagcatat agaacagcta aagggtagtg ctgaaggaag catacgatac cccgcatgga 4140 atgggataat atcacaggag gtactagact acctttcatc ctacataaat agacgcatat 4200 aagtacgcat ttaagcataa acacgcacta tgccgttctt ctcatgtata tatatataca 4260 ggcaacacgc agatataggt gcgacgtgaa cagtgagctg tatgtgcgca gctcgcgttg 4320 cattttcgga agcgctcgtt ttcggaaacg ctttgaagtt cctattccga agttcctatt 4380 ctctagaaag tataggaact tcagagcgct tttgaaaacc aaaagcgctc tgaagtcgca 4440 ctttcaaaaa accaaaaacg caccggactg taacgagcta ctaaaatatt ggaataccgc 4500 ttccacaaac attgctcaaa agtatctctt tgctatatat ctctgtgcta tatccctata 4560 taacctaccc atccaccttt cgctccttga acttgcatct aaactcgacc tctacatttt 4620 ttatgtttat ctctagtatt actctttaga caaaaaaatt gtagtaagaa ctattcatag 4680 agtgaatcga aaacaatacg aaaatgtaaa catttcctat acgtagtata tagagacaaa 4740 atagaagaaa ccgttcataa ttttctgacc aatgaagaat catcaacgct atcactttct 4800 gttcacaaag tatgcgcaat ccacatcggt atagaatata atcggggatg cctttatctt 4860 gaaaaaatgc acccgcagct tcgctagtaa tcagtaaacg cgggaagtgg agtcaggctt 4920 tttttatgga agagaaaata gacaccaaag tagccttctt ctaaccttaa cggacctaca 4980 gtgcaaaaag ttatcaagag actgcattat agagcgcaca aaggagaaaa aaagtaatct 5040 aagatgcttt gttagaaaaa tagcgctctc gggatgcatt tttgtagaac aaaaaagaag 5100 tatagattct ttgttggtaa aatagcgctc tcgcgttgca tttctgttct gtaaaaatgc 5160 agctcagatt ctttgtttga aaaattagcg ctctcgcgtt gcatttttgt tttacaaaaa 5220 tgaagcacag attcttcgtt ggtaaaatag cgctttcgcg ttgcatttct gttctgtaaa 5280 aatgcagctc agattctttg tttgaaaaat tagcgctctc gcgttgcatt tttgttctac 5340 aaaatgaagc acagatgctt cgttcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 5400 ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 5460 gatattgg 5468

Claims (21)

1. 브라제인(brazzein) 암호화 유전자; 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 유래 알파-메이팅 인자(α-mating factor)를 암호화하는 유전자가 삽입된 pESC-URA 벡터를 포함하는, 사카로미세스 세레비시아에서의 브라제인 발현용 재조합 벡터로서,
   상기 재조합 벡터는 사카로미세스 세레비시아 Y2805에서 발현되는 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아에서의 브라제인 발현용 재조합 벡터.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 브라제인 암호화 유전자는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아에서의 브라제인 발현용 재조합 벡터.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 알파-메이팅 인자 암호화 유전자는 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아에서의 브라제인 발현용 재조합 벡터.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 브라제인 암호화 유전자는 상기 알파-메이팅 인자 암호화 유전자와 연결되어 있고, 상기 브라제인 암호화 유전자 및 알파-메이팅 인자 암호화 유전자 사이에는 알파-메이팅 절단 부위(α-mating cleavage site)가 존재하는 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아에서의 브라제인 발현용 재조합 벡터.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 pESC-URA 벡터는 서열번호 8로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아에서의 브라제인 발현용 재조합 벡터.
   
6. 제1항에 있어서,
   서열번호 7 또는 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아에서의 브라제인 발현용 재조합 벡터.
   
7. 제1항의 브라제인 발현용 재조합 벡터로 형질전환된, 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주로서,
   상기 사카로미세스 세레비시아 균주는 사카로미세스 세레비시아 Y2805인 것을 특징으로 하는, 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주.
   
8. 삭제
9. 제7항의 브라제인 발현용 사카로미세스 세레비시아 균주의 배양물.
   
10. (1) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 브라제인 발현용 벡터를 사카로미세스 세레비시아 균주에 형질전환시키는 단계;
    (2) 단계 (1)에서 형질전환된 균주를 배양하는 단계;
    (3) 단계 (2)에서 배양된 형질전환 균주의 배양물을 수득하는 단계; 및
    (4) 단계 (3)의 배양물로부터 브라제인을 정제하는 단계를 포함하고,
    상기 사카로미세스 세레비시아 균주는 사카로미세스 세레비시아 Y2805인 것을 특징으로 하는, 브라제인의 대량 생산방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    단계(2)의 배양은 하기 조건 중 하나 이상을 만족하는 것인, 브라제인의 대량 생산방법:
    (a) 사카로미세스 세레비시아 균주 내에 도입된 브라제인 발현용 재조합 벡터의 복제 개수(copy number)는 5 내지 60임;
    (b) 상기 배양은 복합배지 또는 제한배지에서 이루어짐;
    (c) 상기 배양은 pH 4.5 내지 6.5에서 이루어짐;
    (d) 상기 배양은 20℃ 내지 35℃에서 이루어짐; 또는
    (e) 상기 배양은 6 내지 120 시간 동안 이루어짐.
    
12. 제11항에 있어서,
    단계(2)의 배양이 제한배지에서 이루어지는 경우, 하기 조건 중 하나 이상을 더 만족하는 것인, 브라제인의 대량 생산 방법:
    (a) 상기 제한배지 내의 탄소원(C)/질소원(N)의 몰비율(M/M)은 0.1 내지 10임;
    (b) 상기 배양은 pH 5 내지 8에서 이루어지는 것으로서, 상기 pH는 아세트산 또는 완충용액으로 조절됨;
    (c) 상기 제한배지는 미량원소를 1 내지 4(w/w)%의 농도로 더 포함함; 또는
    (d) 상기 제한배지는 비타민을 1 내지 4(w/w)%의 농도로 더 포함함.
    
13. 제10항에 있어서,
    단계 (2)의 배양 단계는 형질전환된 균주를 고체 배지에 도말하여 배양하는 단계;
    상기 고체 배지에 형성된 콜로니(colony)를 채취해 액체 배지에서 전배양하여 전배양액을 제조하는 단계; 및
    상기 전배양액을 본배양액에 접종하여 배양하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 전배양액의 접종 농도는 본배양액의 1 내지 5(v/v)% 이며,
    상기 전배양액이 접종된 본배양액의 OD₆₀₀은 0.05 내지 0.25인 것을 특징으로 하는, 브라제인의 대량 생산방법.
    
14. 제10항에 있어서,
    단계 (2)의 배양 단계는 형질전환된 균주의 브라제인 발현을 유도하기 위해 유도제를 첨가하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 유도제는 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 또는 이들의 조합 중에서 선택되고, 상기 유도제는 전체 배지의 1 내지 2(w/w)%의 농도로 첨가되는 것인, 브라제인의 대량 생산방법.
    
15. 제14항에 있어서,
    상기 유도제를 첨가하는 단계는 하기 조건 중 하나 이상을 만족하는 것인, 브라제인의 대량 생산방법:
    (a) 글루코스/갈락토스 비율은 0.1 내지 2임; 또는
    (b) 상기 유도제는 지수기(log phase) 또는 정체기(stationary phase)에 첨가됨.
    
16. 제10항에 있어서,
    단계(4)의 정제 단계는 한외여과법(ultrafiltration)으로 브라제인을 정제하는 것인, 브라제인의 대량 생산방법.
    
17. 제7항의 형질전환된 균주, 제9항의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 브라제인 대량생산용 조성물.
    
18. 제7항의 형질전환된 균주, 제9항의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 식품 조성물.
    
19. 제7항의 형질전환된 균주, 제9항의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 건강기능식품.
    
20. 제7항의 형질전환된 균주, 제9항의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 화장료 조성물.
    
21. 제7항의 형질전환된 균주, 제9항의 배양물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 사료 첨가제.
    

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